Summary
Her presenterer vi en protokoll for ikke-invasiv vurdering av oocyte utviklingsmessige kompetanse utført under deres i vitro modning fra germinal vesicle på metaphase II scenen. Denne metoden kombinerer tidsinnstilt bildebehandling med partikkel bilde velocimetry (PIV) og nettverk analyser.
Abstract
Ufruktbarhet klinikker ville ha nytte av muligheten til å velge developmentally kompetent vs inkompetente oocytes bruker ikke-invasiv prosedyrer, dermed forbedre den generelle svangerskapsutfall. Vi har nylig utviklet en klassifisering metode basert på mikroskopisk live observasjoner av musen oocytes under deres i vitro modning fra germinal vesicle (GV) til metaphase II scenen, etterfulgt av analyse av cytoplasmatiske bevegelser forekommer i denne time-lapse perioden. Her presenterer vi detaljerte protokoller av denne prosedyren. Oocytes er isolert fra fully-grown Boas follicles og kultivert 15 h i mikroskop utstyrt for time-lapse analyse på 37 ° C og 5% CO2. Bildene er tatt på 8 min intervaller. Bildene analyseres ved hjelp av metoden partikkel bilde Velocimetry (PIV) som beregner, for hver oocyte, profilen til cytoplasmatiske bevegelsen fart (CMVs) oppstår i hele kultur perioden. Til slutt, CMVs av hver enkelt oocyte fôres gjennom en matematisk klassifisering verktøyet (Feed-forward kunstige nevrale nettverk, FANN), som anslår sannsynligheten for en Kjønnscelle developmentally kompetent eller inkompetente med en nøyaktighet på 91.03%. Denne protokollen, satt opp for musen, kan nå testes på oocytes av andre arter, inkludert mennesker.
Introduction
Kvinnelig ufruktbarhet er en patologi som påvirker et økende antall kvinner. Ifølge Verdens helseorganisasjon er rundt 20% av par ufruktbare, 40% på grunn av kvinnelig ufruktbarhet. I tillegg en tredjedel av kvinner som gjennomgår kreft behandlinger (300.000/år og 30.000 i året i USA eller Italia, henholdsvis) utvikle prematur eggstokksvikt.
En strategi for å hindre ufruktbarhet i kreftpasienter er isolasjon og kryonisk bevaring av eggstokkene follicles før oncological behandling, etterfulgt av i vitro modning (IVM) av GV oocytes til MII scenen (GV å MII overgang). Tilgjengeligheten av ikke-invasiv markører oocyte utviklingsmessige kompetanse ville forbedre befruktning og utviklingsprosesser og generelle graviditet suksess1,2.
Basert på deres chromatin konfigurasjon observert etter farging med den supravital fluorochrome Hoechst 33342, pattedyr fully-grown oocytes klassifiseres enten som en omgitt kjerne (SN) eller en ikke omgitt kjerne (NSN)3. Foruten deres ulike chromatin organisasjon vise disse to typer oocytes mange morfologiske og funksjonelle forskjeller3,4,5,6,7,8 ,9, inkludert deres meiotic og utviklingsmessige kompetanse. Når isolert fra eggstokken og modnet i vitro, både type oocytes rekkevidde MII scenen, og etter sperm inseminasjon, utvikle til 2-celle scenen, men bare de med en SN chromatin organisasjon kan utvikle til begrepet9. Selv om det er bra som en klassifisering metode for valg av kompetente vs inkompetente oocytes, er den største ulempen mutagene effekten som fluorochrome seg og, fremfor alt, UV-lyset brukes for oppdagelsen kan ha på cellene.
For alle disse grunner søkte vi på andre ikke-invasiv markører forbundet med SN eller NSN chromatin konformasjon som kan erstatte bruken av Hoechst samtidig opprettholde samme høye klassifisering nøyaktighet. Time-lapse observasjon av cytoplasmatiske bevegelsen fart (CMVs) fremstår som en funksjon karakteristiske celle status. For eksempel vist studier tilknytningen mellom CMVs registrert på tidspunktet for befruktning og kapasiteten til mus og menneskelig zygotes å fullstendig preimplantation og full sikt utvikling10,11.
Basert på disse tidligere studier, beskriver vi her en plattform for anerkjennelse av developmentally kompetent eller inkompetent musen fully-grown oocytes5,6,7,8. Plattformen er basert på tre hovedtrinn: 1) Oocytes isolert fra Boas follikler klassifiseres først basert på deres chromatin konfigurasjon enten som en omgitt kjerne (SN) eller en ikke-omgitt kjerne (NSN); 2) time-Lapse bilder av CMVs forekommer under GV å MII overgangen til hver enkelt oocyte tatt og analysert med partikkel bilde velocimetry (PIV); og 3) innhentet med PIV analyseres med en Feed-forward kunstige nevrale nettverk (FANN) for blinde klassifisering12,13. Vi gir detaljer om de viktigste trinnene i fremgangsmåten designet for musen for å gjøre den klar tilgjengelig testet og brukes for andre pattedyrarter (f.eks storfe, ape og mennesker).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av de institusjonelle Animal Care og bruk og etiske komiteer på Universitetet i Pavia. Dyrene var holdt under forhold med 22 ° C, 60% luftfuktighet og en lys/mørke syklus av 12:12 h.
1. eggstokk isolasjon
- Injiser intraperitoneally 2 fire-til-elleve uke gamle CD1 kvinnelige mus med 10 U av follicle stimulerende hormone med en bakteriefri 1 mL insulinsprøyte.
- Vent 46-48 h.
- Veie musen og bedøve med en intramuskulær injeksjon av 50 mg/kg av Zoletil (Tiletamina og Zolazepan cloridrate). Euthanize av cervical forvridning.
- Forstå huden dekke bukveggen med en disseksjon tang. Kutt huden og kroppen veggen med et par saks og trekke åpne innsnitt med tang.
- Med en pinsett, flytte guts til side, finne livmor hornene og lokalisere eggstokkene på deres extremity.
- Forsiktig holder eggstokken bruker urmaker tang og bruk saks til å kutte sin ligament til livmoren. Gjenta med andre eggstokken.
- Overføre samlet eggstokkene til en 35 mm celle kultur Petri parabol med 1 mL av M2 isolasjon medium pre varmet ved 37 ° C, 5% CO2 i luften.
- Fjerne fett og oviduct med fine saks under en stereomicroscope.
2. isolering av Cumulus Oocyte komplekser
- Punktering eggstokkene overflaten med sterilt pinsetter og en 1G sterilt insulin nål til Boas cumulus oocyte komplekser (COCs) utgis passivt.
- Samle COCs med mer enn tre lag av cumulus celler ved hjelp av munn-kontrollerte håndtappet Pasteur brønnene (200 μm i diameter) og overføre dem til en 300 µL dråpe friskt M2 medium.
- Fjerne cumulus cellene rundt oocytes bruker håndtappet Pasteur brønnene (80 µm i diameter) ved forsiktig pipettering ut par sekunder,
- Gjentatte ganger overføre oocytes fra en 20 µL dråpe M2 medium til en annen, helt cumulus celler er helt eliminert.
3. chromatin organisasjon-baserte Oocyte klassifisering
- Forberede Hoechst 33342 flekker løsning på en siste konsentrasjon av 0,05 µg/mL M2 middels starte fra en mor løsning av 5 mg/mL fortynnet i 1 x PBS.
- Plass 3,5 µL mikro dråper av Hoechst flekker løsning nederst på 35 mm Petriskål lokk.
- Overføre hver enkelt oocyte til en Hoechst flekker slipp, plasser rett på en forvarmes (37 ° C) oppvarming plate og dekke det med mørk lokk for å unngå lys exposition.
- Etter 10 min med inkubering ved romtemperatur, observere oocytes med fluorescens mikroskop på 10 X forstørrelse under UV-lys (330-385 nm), for mer enn 1-2 s.
- Klassifisere oocytes som en omgitt kjerne (SN) (figur 1A), hvis de presenterer en ring av Hoechst-positive chromatin rundt kjerne.
- Klassifisere oocytes som en ikke omgitt kjerne (NSN), hvis deres kjerne ikke er omgitt av Hoechst-positive chromatin og viser spre heterochromatic steder innenfor kjernen (figur 1B).
4. nevrale nettverk-basert Oocyte klassifisering
- Forberede fire 2 µL dråper α-MEM middels med 5% inaktivert fosterets bovin serum, 2 L-glutamin, 5 mM taurine, 100 U/mL penicillin, 75 µg/mL streptomycin og 23,5 µg/µL natrium pyruvate i en 35 mm glass bunn Petriskål og dekke dem med forvarmes (37 ° C) og pre equilibrated mineralolje å unngå middels fordampning.
Merk: Hvis bruker en levende celle-screening system, holde dråper på en bestemt avstand ved hjelp av en trukket rutenett av 7 x 7 mm som en retningslinje. - Overføre 3 - 4 oocytes til hver dråpe.
- Plasser glass bunnen Petriskål i en levende celle-screening system, utstyrt med tid-lapse innspillingen programvare (se Tabell for materiale), som tillater observasjon av oocyte modning i et miljø med stabil temperatur (37 ° C) og CO2 konsentrasjon (5%).
- Åpne tid-lapse innspillingen programvare. På skjermen vises et vindu med et levende bilde av oocyte på venstre side og alle innstillingen knappene på høyre side.
- Velg midten av oocyte å plassere den på skjermen sentrum. Juster fokus.
- Velg knappen Ph og satt DIA lampe til 192; den eksponeringstid til 1/125 s; de få til 1,99; og oppløsningen til 1600 x 1200.
- Velg FL2 og angi DIA lampe til 5; den eksponeringstid å 3 s; de få til 2.37; og oppløsningen til 1600 x 1200.
- Velg knappen ny peker for å registrere oocyte posisjonen innen kultur drop. Gjenta den samme rutinen for hver oocyte innen kultur drop.
- Velg tid og angi oppkjøpet sykle 8 min og totaltiden til 15 h.
- Velg Start time-lapse starte innspillingen syklusen.
- Åpne MATLAB programvare og skrive >>cell_piv; og velg PIV-verktøyet.
- Velg mappen som inneholder den innspilte filmen og velg JPEG filene laste inn hele bildesekvens. Velg området rundt (ROI) ved å klikke Velg områdeverktøyetfor hver oocyte.
- Velg Prosessen PIV i fil-menyen. Velg Leser verktøy .
Merk: Programmet vil beregne hastighet vektorer i Avkastningen og produserer automatisk en datafil, lagret som en .mat fil. - Velg .mat filen du vil åpne. Klikk Velg ROI tool og tegne en sirkel rundt konturene av oocyte. Klikk Lagre på Fil-menyen.
Merk: Vektorer i dette området vises nå og mener omfanget dataene i vinduet diagrammet oppdateres for denne nye avkastning. - Åpne datatypen samlet mener omfanget av hele time-lapse rammer inn i et regneark, med rader, ramme sekvensen og, på kolonnene, hver enkelt oocyte analysert.
- Organisere data både NSN og SN oocytes 10 undergrupper.
- Bruke 9 undergrupper for å trene feed-forward kunstig nettverk iterativt (FANN) og 1 undergruppe for blinde tester.
- Gjenta en annen 9 ganger, endre blind testing prøven (10 ganger kryss-validering).
- Åpne MATLAB, kjører skreddersydd script største og, på forespørsel, setter du inn navnet på filen med treningsdataene (train.txt), antall NSN og SN oocytes brukt til trening og time-lapse intervallet som skal analyseres (vanligvis fra ramme 1-2 å ramme # 112-113).
- Trykk Angi å utføre trening.
- Sett inn navnet på filen med testingen data (test.txt).
- Åpne vektor test_outputs_cyt i MATLAB arbeidsområde.
Merk: Et vindu vises på skjermen som viser, i den første raden, sannsynligheten for å få ekte positive (TP eller sann NSN) og falske positiver (FP eller falske NSN) for NSN og SN oocytes, henholdsvis; i stedet i den andre raden, sannsynligheten for å få feilaktige negativer (FN eller falske SN) og sanne negative (TN eller sann SN) for NSN og SN oocytes, henholdsvis. - Bruk formel: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), beregne FANN nøyaktigheten, uttrykt i prosent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser et representativt developmentally kompetente og inkompetente oocyte, henholdsvis i begynnelsen (GV) og slutten (MII) av IVM prosedyren. IVM av fully-grown musen oocytes oppstår under 15t kultur. Time-Lapse observasjon registrerer progresjon av meiose og oppdager store meiotic arrangementer, inkludert GVBD og byggesystemer i første polar kroppen.
Analyse og sammenligning av mer enn to hundre developmentally kompetent vs inkompetente oocytes viste tidsforskjeller i utviklingen av meiose. Spesielt i NSN oocytes, er GVBD betydelig forsinket av 1-2 time-lapse rammer, mens PB1 byggesystemer oppstår med en 15 bilder forsinkelse. Disse forskjellene er variasjon for høy til å tillate ett-oocyte klassifisering. Derfor ble prosedyren gjennomført med en matematisk klassifisering verktøyet.
Figur 3 viser en ordning av matematiske klassifisering verktøyet brukes, navngitt Feed-forward kunstige nevrale nettverk (FANN). For hver oocyte synges, gir FANN samtidig sannsynligheten for at Kjønnscelle er en utviklingsmessig kompetent og sannsynligheten for at det er en inkompetent oocyte. I vårt forsøk, FANN klassifisert musen oocytes med en gjennomsnittlig nøyaktighet på 91.03%.
Figur 1 . Representant SN og NSN oocytes farget med Hoechst 33342. Etter isolasjon og flekker med fluorochrome Hoechst 33342, fully-grown oocytes er klassifisert som omgitt kjerne (SN) (A) eller ikke omgitt kjerne (NSN) (B), avhengig av tilstedeværelse (pil) eller fravær, henholdsvis av en ring av Hoechst-positive heterochromatin rundt kjerne. Skala bar: 5 µm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Partikkel bilde Velocimetry analyse av Time-Lapse bilder. Resultatene av PIV analysen vises under lyse-feltet bildet for hver av de 113 time-lapse rammene analysert. Figuren viser begynnelsen (GV) og slutten (MII) av innspillingsprosessen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Skjematisk fremstilling av Feed-forward kunstig nettverk. FANN er matematisk verktøyet brukes til å klassifisere oocytes developmentally kompetent eller inkompetent. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere viktige skritt man bør ta vare på mens de utfører denne protokollen med musen oocytes og de andre arter. Isolerte fra deres hårsekker oocytes bør umiddelbart overføres til opptak dråper, som separasjon fra følgesvenn cumulus celler utløsere begynnelsen av GV å MII overgangen. En mulig endring til stede protokollen kan være tillegg av 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) til M2 mediet som brukes for COCs isolasjon. IBMX forhindrer umiddelbar følge av GV å MII overgangen og tillater en synkronisering av hele forsøksgruppen av oocytes.
Live celle-screening systemet vårt forsøk (se Tabell for materiale) begrenser antall modning synker til 4 med 4 oocytes per slipp, dermed til totalt 16 oocytes per forsøk. Denne begrensningen kan overvinnes med andre time-lapse live celle-screening systemer, kommersielt tilgjengelig og utstyrt med flere kultur kamre.
Basert på vår erfaring, er innspillingen intervallet mellom en ramme og følgende et kritisk punkt. Etter en rekke foreløpige eksperimenter tok vi bilder hver 8 min fordi dette var vinduet Minimumstid som tillot klart observasjon av de store hendelsene som germinal vescicle sammenbrudd og byggesystemer i overgangsperioden GV å MII av første polar kroppen. Dette tidsvinduet må være revaluated når observere oocytes av andre arter.
En ulempe med denne metoden er kulturen i oocytes i fravær av omkringliggende cumulus celler, som sistnevnte er kjent for å forbedre GV å MII overgangen. Til denne forbindelse tester vårt laboratorium nå en liten endring i rapporterte protokollen ved kultur cumulus-gratis oocytes på en cumulus celler mater lag.
Etter sin art, FANN har et fast antall både inndata (antall analysert CMV moduler) og utgang (enten en utviklingsmessig kompetent eller inkompetent oocyte) neurons, men antall skjulte nevroner velges av utprøver gjennom en prøve og korrigering tilnærming for å oppnå best prediksjon ytelse. I vårt tilfelle vi eksperimenterte med forskjellige antall skjulte nevroner og fant at tre ga best resultat. Også krever FANN analyser et stort antall inndata (i våre eksperimenter 112 CMV moduler) for å få en robust statistikk. En mulig forbedring kan redusere antallet nødvendige inndata er bruk av alternativ klassifisering verktøy, for eksempel støtte vektor maskin, Tree-bag eller KNN klassifiserere. Når FANN analyse viser sin robusthet, kan trinn1 elimineres fra prosedyren.
Denne protokollen, satt opp for musen, kunne bli testet på oocytes av andre arter inkludert mennesker. Videre innspillingen kombinasjonen av tid-lapse med PIV og nettverk analyser kan utnyttes for observasjon av CMVs zygotes10,11 og preimplantation embryo for vurdering av deres videre utviklingsmessige potensiale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble gjort mulig takket være støtte av: Universitetet i Pavia FRG 2016; Universitetet i Parma FIL 2014, 2016; og Kinesis for å forsyne plasticware nødvendig å gjennomføre denne studien. Vi takker Dr. Shane Windsor (avdeling for ingeniørutdanning, University of Bristol, UK) for å gi Cell_PIV programvaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Folligon | Intervet | A201A02 | Hormonal treatment |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | For oocyte heterochromatin staining |
| Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm | Corning | 430165 | For COCs isolation |
| EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red | Merck-Millipore | MR-015-D | For COCs isolation |
| MEM Alpha medium (1X) + Glutamax | Sigma-Aldrich | M4526 | For oocyte in vitro maturation |
| Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom | WillCo | GWSt-3522 | For imaging experiments |
| BioStation IM-LM | Nikon | MFA91001 | Live cell screening system |
| Pasteur pipette | Delchimica Scientific Glassware | 6709230 | For follicles manipulation |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | To prevent contamination and medium evaporation |
| Penicillin / Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | To prevent medium contamination |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | ML16141079 | For making up αMEM medium |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030 | For making up αMEM medium |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | For making up αMEM medium |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3310 | For making up αMEM media |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P4562 | For making up αMEM media |
| Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate) | Virbac Srl | QN01AX9 | For mice anesthesia |
| Cell_PIV sofware | Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK | - | - |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | - | For multi-paradigm numerical computing |
References
- Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
- Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
- Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380 (2013).
- Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
- Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
- Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg? Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
- Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
- Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417 (2011).
- Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
- Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
- Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).
