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Neuroscience

एक साधारण कोशिका आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख रक्त में एन मिथाइल-डी-Aspartate (एनएमडीए) रिसेप्टर के खिलाफ Autoantibody का पता लगाने के लिए

Published: January 9, 2018 doi: 10.3791/56676
Automatic Translation
1,2, 1
1Department of Psychiatry, Chang Gung Memorial Hospital-Linkou, 2Department and Graduate Institute of Biomedical Sciences, Chang Gung University

Summary

हम ectopically एनएमडीए रिसेप्टर की NR1 उपइकाई मानव भ्रूण कोशिकाओं में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग (HEK293) प्रतिजन के रूप में व्यक्त करने के लिए एनएमडीए रिसेप्टर के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ संदिग्ध रोगियों के रक्त में स्व-प्रतिरक्षित इन्सेफेलाइटिस. इस सरल विधि नैदानिक सेटिंग्स में स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए उपयुक्त हो सकता है ।

Abstract

विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर autoantibody की उपस्थिति प्रभावित रोगियों में विभिन्न neuropsychiatric लक्षण पैदा कर सकता है, विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर स्व-प्रतिरक्षित इन्सेफेलाइटिस. रक्त या मस्तिष्कमेरु द्रव में एनएमडीए रिसेप्टर के खिलाफ विशिष्ट autoantibody का पता लगाने (सीएसएफ) इस हालत का सही निदान के लिए आवश्यक है. एनएमडीए रिसेप्टर एक आयन चैनल प्रोटीन जटिल है कि चार उपइकाईयों में शामिल है, सहित दो अनिवार्य एनएमडीए रिसेप्टर उपइकाई 1 (NR1) और एक या दो एनएमडीए रिसेप्टर उपइकाई 2a (NR2A), एनएमडीए रिसेप्टर उपइकाई 2 बी (NR2B), एनएमडीए रिसेप्टर उपइकाई 2c (NR2C), या एनएमडीए रिसेप्टर उपइकाई 2d (NR2D) । एंटी-एनएमडीए रिसेप्टर autoantibody के epitope को NR1 रिसेप्टर के एनएमडीए उपइकाई के extracellular एन-टर्मिनल डोमेन पर उपस्थित होने की सूचना मिली थी. इस अध्ययन के लक्ष्य के लिए एक सरल सेल आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख है कि एक स्क्रीनिंग परीक्षण के लिए रक्त में एनएमडीए रिसेप्टर की NR1 उपइकाई के खिलाफ एंटीबॉडी की उपस्थिति का पता लगाने के नैदानिक और बुनियादी अनुसंधान की सुविधा के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है विकसित करने के लिए है विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर स्व-प्रतिरक्षित इन्सेफेलाइटिस.

Introduction

विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर स्व-प्रतिरक्षित इन्सेफेलाइटिस एक नव मांयता प्राप्त रोग इकाई है कि सभी उंर के रोगियों में हो सकता है, और मुख्य रूप से महिला रोगियों को प्रभावित करता है1,2। यह इन्सेफेलाइटिस3के प्रारंभिक अज्ञात एटियलजि के साथ रोगियों के बीच सबसे अक्सर निदान इन्सेफेलाइटिस में से एक है । विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर इन्सेफेलाइटिस के साथ प्रभावित रोगियों आमतौर पर एक सिर दर्द या बुखार के prodromal लक्षण है, चेतना के स्तर को बदलने के त्वरित विकास और तीव्र neuropsychiatric लक्षण की एक किस्म के द्वारा पीछा किया, सहित आंदोलन, चिड़चिड़ापन , चिंता, अनिद्रा, मतिभ्रम, भ्रम, आक्रामकता, विचित्र व्यवहार, आंदोलन विषमता, स्वायत्त dysregulation, और बरामदगी हमलों4,5. इस हालत और immunotherapy के साथ समय पर उपचार के प्रारंभिक मांयता एक बेहतर परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है और भी प्रभावित रोगियों में पूर्ण वसूली6। इसलिए, यह सुझाव दिया है कि विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर स्व-प्रतिरक्षित इन्सेफेलाइटिस तीव्र या नई शुरुआत मानसिक सुविधाओं के साथ पेश रोगियों के एक महत्वपूर्ण विभेदक निदान के रूप में माना जाना चाहिए7,8.

नैदानिक सुविधाओं के अलावा, रक्त या सीएसएफ में एनएमडीए रिसेप्टर के खिलाफ autoantibody का पता लगाने विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर स्व-प्रतिरक्षित इन्सेफेलाइटिस के सही निदान के लिए आवश्यक है9. प्रतिरक्षा परीक्षण के अधिकांश विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर autoantibody का पता लगाने के लिए कुछ अनुसंधान प्रयोगशालाओं में उपलब्ध हैं10,11, और वहाँ केवल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल-स्क्रीनिंग के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख आधारित है विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर12एंटीबॉडी. इस अध्ययन के लक्ष्य के लिए एक सरल घर में सेल-आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख है कि आसानी से प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया जा सकता विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर एंटीबॉडी की उपस्थिति के लिए विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर के नैदानिक अनुसंधान की सुविधा के लिए विकसित करने के लिए है स्व-प्रतिरक्षित इन्सेफेलाइटिस । एनएमडीए रिसेप्टर एक heterotetramer आयन चैनल प्रोटीन जटिल विशेष रूप से मस्तिष्क में व्यक्त की है. यह दो अनिवार्य NR1 उपइकाईयों से बना है, और NR2A, NR2B, NR2C, या NR2D13के एक या दो उपइकाईयों का संयोजन है । एक पिछले अध्ययन ने बताया कि मुख्य epitope एंटीबॉडी द्वारा लक्षित NR1 उपइकाई5के extracellular एन टर्मिनल डोमेन पर था. इसलिए, इस प्रोटोकॉल में, हम मानव भ्रूण गुर्दे की उपकला कोशिका लाइन (HEK293) में ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ टैग एनएमडीए रिसेप्टर की मानवीय संयोजक NR1-यूनिट प्रोटीन व्यक्त करते हैं, और एक सेल आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख का पता लगाने के लिए विकसित विरोधी के आईजीजी वर्ग एनएमडीए रिसेप्टर रक्त में एंटीबॉडी.

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Protocol

अध्ययन Linkuo, ताओयुआन, ताइवान (102-2577A3) में चांग गुंग मेमोरियल अस्पताल के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. NR1-GFP अभिव्यक्ति की तैयारी प्लाज्मिड

  1. मिश्रण 10 NR1 के एनजी-GFP प्लाज्मिड के साथ १०० µ एल की ई कोलाई सक्षम कोशिकाओं में तनाव DH5α एक बाँझ १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब, प्लास्टिक मिश्रण धीरे ऊपर और नीचे 4-6 बार, और 20 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब मशीन ।
  2. एक पानी के स्नान में 1 मिनट के लिए ४२ ° c पर ट्यूब मशीन, पानी स्नान से ट्यूब हटाने, ट्यूब में 1 मिलीलीटर lysogeny शोरबा (पौंड) मध्यम जोड़ें, और 1 ज के लिए मिलाते के साथ एक मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब मशीन ।
  3. फैले ५० एक पौंड आगर एम्पीसिलीन युक्त प्लेट पर मिश्रण के µ एल (०.१ मिलीग्राम/एमएल), और एक मशीन में रात भर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर पौंड आगर प्लेट गर्मी ।
  4. रातोंरात पौंड आगर एक बाँझ टिप का उपयोग कर प्लेट से एक भी कॉलोनी उठाओ, और एक बैक्टीरियल संस्कृति ट्यूब में एक पौंड मध्यम और एम्पीसिलीन (०.१ मिलीग्राम/एमएल) के 5 मिलीलीटर युक्त में टिप घूमता । रात भर मिलाते के साथ एक मशीन में ३७ ° c पर ट्यूब मशीन ।
  5. Aliquot एक ५०० मिलीलीटर कुप्पी में रातोंरात बैक्टीरियल संस्कृति के 3 मिलीलीटर है कि २५० मिलीलीटर बाँझ पौंड मध्यम और एम्पीसिलीन (०.१ मिलीग्राम/एमएल) शामिल हैं । मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर कुप्पी मशीन । एक स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर ६०० एनएम के तरंग दैर्ध्य में बैक्टीरियल संस्कृति के नियमित रूप से ऑप्टिक घनत्व (आयुध डिपो) की जांच करें जब तक OD600 0.6-1.0 पहुंचता है ।
    नोट: ग्लिसरॉल शेयर तैयार करने के लिए २०० µ l ग्लिसरॉल के साथ रातोंरात बैक्टीरियल कल्चर के ८०० µ l को अच्छी तरह मिक्स करें, और भविष्य के उपयोग के लिए ग्लिसरॉल शेयर को अंडर-८० ° c स्टोर करें ।
  6. २५० मिलीलीटर बैक्टीरियल संस्कृति से NR1-GFP अभिव्यक्ति प्लाज्मिड तैयार करें
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ६,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा ।
    2. RNase A युक्त 10 मिलीलीटर reसस्पेंशन बफर में बैक्टीरिया गोली reसस्पेंड; भंवर अच्छी तरह से जब तक कोई झुरमुट देखा है ।
    3. जीवाणु निलंबन करने के लिए 10 मिलीलीटर lysis बफर जोड़ें, धीरे मिश्रण पलटना 4-6 बार, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) में lysate की मशीन ।
    4. lysate के लिए 10 मिलीलीटर पूर्व ठंडा वर्षा बफर जोड़ें, धीरे मिश्रण 4-6 बार पलटना ।
    5. पर टोपी के साथ एक फिल्टर कारतूस के बैरल में lysate डालो; आरटी पर 10 मिनट के लिए रुको ।
    6. कारतूस आउटलेट नोक से टोपी निकालें, कारतूस में एक सवार डालें, और धीरे सवार दबाएं । एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में फ़िल्टर्ड lysate लीजिए ।
    7. निर्माता से २.५ मिलीलीटर मालिकाना बफर जोड़ें फ़िल्टर्ड lysate के लिए, ट्यूब लगभग 10 बार पलटने से मिश्रण मिश्रण, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण गर्मी ।
    8. फ़िल्टर किए गए lysate मिश्रण को 10 मिलीलीटर equilibration बफ़र के साथ pre-equilibrated किया गया था जो एक फिल्टर स्तंभ पर लागू होते हैं । स्तंभ गुरुत्वाकर्षण से पलायन करने की अनुमति दें ।
    9. 30 एमएल वॉश बफर के साथ कॉलम को दो बार धोएं, फिर 15 एमएल रेफरेंस बफर का प्रयोग कर कॉलम से डीएनए elute ।
    10. eluted डीएनए बफर करने के लिए isopropanol १०.५ मिलीलीटर (०.७ मात्रा) जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए २०,००० x जी में मिश्रण केंद्रापसारक ।
    11. supernatant सावधानी से, 5 मिलीलीटर endotoxin मुक्त ७०% इथेनॉल एक बार के साथ डीएनए गोली धो, और 10 मिनट के लिए २०,००० x g पर केंद्रापसारक ।
    12. supernatant खिचड़ी भाषा, एक रासायनिक डाकू में 5-10 मिनट के लिए गोली सूखी, और endotoxin के 300-500 µ एल में गोली भंग-मुक्त बफर ।
    13. एक spectrophotometer का उपयोग यूवी 260/280 एनएम में समाधान के अवशोषण को मापने के द्वारा प्लाज्मिड एकाग्रता का निर्धारण ।
      नोट: एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर GFP व्यंजक प्लाज्मिड तैयार करें ।

2. NR1 के साथ HEK293 कोशिकाओं की अभिकर्मक-GFP अभिव्यक्ति प्लाज्मिड

  1. Aliquot २०० µ एल के 2% एक ४८ के एक अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के लिए जिलेटिन समाधान और ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली मशीन कम से कम 30 मिनट के लिए ।
  2. महाप्राण से जिलेटिन समाधान, और बीज 5 x 104 HEK293 सेल संस्कृति मध्यम के २०० µ एल में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (प्रत्येक अच्छी तरह से FBS) युक्त में कोशिकाओं । एक humidified मशीन में ३७ ° c पर थाली मशीन 5% CO2 रातोंरात के साथ आपूर्ति की ।
    नोट: कक्ष किसी hemocytometer का उपयोग करके गिने जाते थे ।
  3. अगले दिन, एक अच्छी तरह से प्रति 10% FBS युक्त ताजा संस्कृति माध्यम के २०० µ एल के साथ बिताया संस्कृति माध्यम की जगह ।
  4. प्रत्येक एक अच्छी तरह के लिए, 20 µ एल संस्कृति माध्यम के साथ NR1-tGFP प्लाज्मिड के १०० एनजी मिश्रण से एक समाधान तैयार है, और 20 µ एल संस्कृति माध्यम के साथ ०.८ अभिकर्मक एल µ रिएजेंट मिश्रण से समाधान बी । प्रत्येक प्रयोग के लिए कुल मात्रा तैयार करने के लिए आवश्यक कुओं की संख्या गुणा करें ।
  5. समाधान एक और समाधान बी मिश्रण द्वारा सी तैयार है, और 20-30 मिनट के लिए आर टी पर मिश्रण गर्मी ।
  6. Aliquot ४० µ समाधान सी के एल HEK293 कोशिकाओं से युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से, थाली धीरे भंवर, और एक humidified मशीन में ३७ ° c पर थाली मशीन 5% CO2 रातोंरात के साथ आपूर्ति की ।
  7. 40X-200X आवर्धन (उत्तेजना/उत्सर्जन: 482/502 एनएम) के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत मेजबान कोशिकाओं में NR1-GFP संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति की जांच करें, और सेल के लिए आगे बढ़ें इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख आधारित है ।
    नोट: Transfect प्लाज्मिड GFP HEK293 कक्षों में समान प्रोटोकॉल का उपयोग कर ।

3. सेल आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख

  1. महाप्राण कुओं से खर्च मध्यम, तो एक अच्छी तरह से धोने के २०० µ एल के साथ फास्फेट बफर खारा (पंजाब) तीन बार.
  2. प्रत्येक कुआं के लिए 4% paraformaldehyde समाधान के २०० µ जोड़ें; 15 मिनट के लिए आर टी पर थाली मशीन ।
  3. महाप्राण कुओं से paraformaldehyde समाधान, और तीन बार पंजाब के २०० µ एल के साथ एक अच्छी तरह से धो लें ।
  4. जोड़ें २०० µ 10% के एल PBST में दूध स्किम (०.१% के बीच-पंजाब में 20) समाधान के लिए एक अच्छी तरह से, और 1 के लिए आरटी पर थाली मशीन कोमल मिलाते के साथ एच ।
  5. महाप्राण से PBST समाधान में १०% स्किम्ड मिल्क, फिर २०० µ l PBST के साथ कुएँ को एक बार धो लें ।
  6. पतला प्लाज्मा के साथ कुओं मशीन (PBST में 1:100) 1 एच के लिए आरटी पर कोमल मिलाते के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में ।
    नोट: प्लाज्मा रोगियों के रक्त से प्राप्त होता है संदिग्ध को स्व-प्रतिरक्षित इन्सेफेलाइटिस है ।
  7. महाप्राण कुओं से पतला प्लाज्मा, और तीन बार PBST के २०० µ एल के साथ एक अच्छी तरह से धो लें ।
  8. जोड़ें २०० µ बकरी विरोधी के एल मानव आईजीजी संयुग्मित Alexa Fluor ५९४ के साथ (1: PBST में 1000 कमजोर पड़ने) के लिए एक अच्छी तरह से, और 1 ज के लिए कोमल मिलाते के साथ आर टी पर संस्कृति की थाली मशीन ।
  9. महाप्राण बकरी विरोधी मानव आईजीजी संयुग्मित Alexa Fluor ५९४ समाधान के साथ, और µ के २०० PBST एल के साथ एक अच्छी तरह से धो तीन बार ।
  10. जोड़ें १०० µ l ग्लिसरॉल समाधान (५०% ग्लिसरॉल में और 1:100000 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)) के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से ।
  11. निरीक्षण और एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की छवि एक 10x ऐपिस, और 4x, 10x, और 20X उद्देश्यों का उपयोग कर ।
    नोट: प्रत्येक डाई के लिए सही फिल्टर का प्रयोग करें: NR1-GFP के लिए (उत्तेजना/उत्सर्जन = 482/502 एनएम), Alexa Fluor ५९४ के लिए (उत्तेजना/उत्सर्जन = 561/594 एनएम), DAPI के लिए (उत्तेजना/उत्सर्जन = 358/461 एनएम) । एक ही तरीके से GFP व्यक्त HEK कोशिकाओं का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण आचरण ।

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Representative Results

औसत पर, हम 200-300 µ जी endotoxin मुक्त अभिव्यक्ति प्लाज्मिड NR1-GFP और GFP से २५० मिलीलीटर बैक्टीरियल संस्कृति प्रोटोकॉल के खंड 1 में वर्णित प्रक्रियाओं के बाद प्राप्त कर सका । एक राशि की १०० एनजी/अच्छी तरह से HEK293 कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए उपयोग किया गया था के रूप में ४८-well थाली में वर्णित के रूप में प्रोटोकॉल की धारा 2 में वर्णन किया गया प्लाज्मिड । 24-30 एच अभिकर्मक के बाद, कोशिकाओं NR1-GFP व्यक्त की है, और GFP संयोजक प्रोटीन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत पता लगाया जा सकता है । चित्र 1a NR1-GFP व्यक्त करने वाले होस्ट कक्षों की छवि दिखाता है, जबकि चित्र 1 d GFP व्यक्त करने वाले कक्षों को दिखाता है । ग्रीन सिग्नल परख के एक गुणवत्ता नियंत्रक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है: कोशिकाओं के लगभग 30% फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत हरे रंग का संकेत था । चित्र 1a और 1 d NR1-GFP एक्सप्रेस कि होस्ट कक्षों की छवि दिखाएं । ग्रीन सिग्नल परख के एक गुणवत्ता नियंत्रक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है: कोशिकाओं के लगभग 30% फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत हरे रंग का संकेत था । NR1 व्यक्त कोशिकाओं-GFP मानव प्लाज्मा नमूने में विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर एंटीबॉडी की उपस्थिति को परखने के लिए इस्तेमाल किया गया.

सेल में आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख के रूप में प्रोटोकॉल की धारा 3 में वर्णित है, सकारात्मक नियंत्रण नमूना (एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त की, सामग्री की तालिकादेखें) के अनुसार 1:10 कमजोर पड़ने में परित प्लाज्मा को जोड़ा गया था निर्माता के निर्देश । परित प्लाज्मा 5 वयस्क पुरुषों और 5 वयस्क महिलाओं से तैयार किया गया था । चित्रा 1b NR1-GFP कोशिकाओं के साथ गर्मी के बाद सकारात्मक नियंत्रण नमूना के alexa Fluor-५९४ छवि है, जबकि चित्रा 1E है alexa Fluor-५९४ कोशिकाओं अभिव्यक्ति GFP के साथ मशीन के बाद सकारात्मक नियंत्रण नमूना की छवि है । चित्रा 1C चित्रा 1a और चित्र 1bकी मर्ज की गई छवि है: एक ही सेल में हरे रंग के संकेतों और लाल संकेतों के महत्वपूर्ण ओवरलैप, NR1-GFP के सह-स्थानीयकरण और एनएमडीए के NR1 उपइकाई के खिलाफ एंटीबॉडी का संकेत है रिसेप्टर (तीर). एक प्लाज्मा नमूना है कि अधिक से अधिक 30% से पता चलता है हरे और लाल संकेतों के ओवरलैप इस मामले में सकारात्मक रूप में व्याख्या की जाएगी । चित्रा 1F चित्रा 1 डी और चित्रा 1E है कि चित्रा 1Cके लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है से विलय छवि है । कमजोर लाल रंग Alexa Fluor की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति-५९४ छवि है । वहां थोड़ा हरे और लाल संकेतों के ओवरलैप, संयोजक प्रोटीन के खिलाफ विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर autoantibody का कोई बंधन का संकेत है ।

प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं की स्थापना के दौरान, हम एक कम संकेत करने वाली-शोर अनुपात Alexa Fluor-५९४ छवि जब प्लाज्मा नमूनों का परीक्षण किया गया था मनाया । हम करने के लिए संकेत-शोर अनुपात का अनुकूलन करने के लिए प्लाज्मा फार्म 1:10, 1:50, 1:100, और 1:200 के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने का आयोजन करने का प्रयास किया, और एलेक्स Fluor के विभिंन सांद्रता-५९४ लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी 1:500 से 1:2000 के परीक्षण । हमने पाया है कि प्लाज्मा के 1:100 कमजोर पड़ने और 1:1000 या 1: Alexa Fluor-५९४ के 2000 कमजोर पड़ने डेटा की व्याख्या के लिए इष्टतम शर्तों थे ।

Figure 1
चित्रा 1: सेल के प्रतिनिधि छवियों-आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर autoantibody का पता लगाने के लिए. (क) HEK293 कोशिकाओं की छवि जो NR1-GFP व्यक्त करती है. (ख) Alexa Fluor-५९४ छवि सकारात्मक नियंत्रण नमूना के साथ एक के बाद मशीन के एक ही क्षेत्र से लिया । लाल सिग्नल विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त NR1 को एंटीबॉडी के बंधन को इंगित करता है । (ग) A और Bकी मर्ज की गई छवि । पीला रंग NR1 (ग्रीन सिग्नल) और एंटी-एनएमडीए रिसेप्टर एंटीबॉडी (लाल सिग्नल) के सह-स्थानीयकरण को इंगित करता है । तीर NR1-GFP और विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर एंटीबॉडी के सह स्थानीयकरण दिखा कुछ प्रमुख कोशिकाओं के उदाहरणों का संकेत है. (D) NR1-GFP व्यक्त HEK293 कक्षों की छवि । (ई) Alexa Fluor-५९४ छवि सकारात्मक नियंत्रण नमूना के साथ मशीन के बाद डी के एक ही क्षेत्र से लिया । कमजोर लाल संकेत Alexa Fluor की पृष्ठभूमि शोर-५९४ छवि को इंगित करता है । (च) D और Eकी मर्ज की गई छवि । यह छवि एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, के रूप में वहाँ थोड़ा पीला संकेत मनाया जाता है । नकारात्मक नियंत्रण छवि विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर एंटीबॉडी के विशिष्ट बंधन NR1-परख में GFP को दर्शाता है । सभी छवियों 10x नेत्र लेंस और 20X लेंस उद्देश्य के तहत लिया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

वहां कई सेल आधारित प्रतिरक्षा परख रहे है एनएमडीए रिसेप्टर के खिलाफ एंटीबॉडी की उपस्थिति के लिए स्क्रीन पर रहते है सेल सहित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख11, फिक्स्ड सेल आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख9 , और प्रवाह cytometry-परख14आधारित है । लाइव सेल आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख शीघ्र ही NR1 प्रोटीन व्यक्त ectopically कोशिकाओं की तैयारी के बाद किया जाना चाहिए, जबकि प्रवाह cytometry आधारित परख प्रशिक्षित कर्मियों और विशेष उपकरणों की आवश्यकता है । एक निश्चित सेल आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख एक अधिक सुविधाजनक परख कि नैदानिक सेटिंग्स के लिए आयोजित किया जा सकता है । इसलिए, कई अध्ययनों वाणिज्यिक अप्रत्यक्ष तय सेल आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख के लिए स्क्रीन विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर autoantibody सीरम और सीएसएफ नमूनों में12,15इस्तेमाल किया । किट का इस्तेमाल किया (सामग्री की मेज देखें) फिक्स्ड HEK293 कोशिकाओं है कि ectopically एनएमडीए रिसेप्टर के संयोजक NR1 उपइकाई व्यक्त. परख विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर आईजीजी सीरम और सीएसएफ नमूनों में एंटीबॉडी12का पता लगाने में उत्कृष्ट प्रदर्शन किया है मूल्यांकन किया गया है । हमारे प्रोटोकॉल में, हम किट निर्माता द्वारा अनुशंसित है कि के रूप में एक ही दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया, सिवाय इसके कि हम NR1-GFP अभिव्यक्ति प्लाज्मिड का उपयोग करें । NR1-GFP प्रोटीन का इस्तेमाल प्रत्येक प्रयोग में अभिकर्मक दक्षता और NR1 प्रोटीन के वितरण पर नजर रखने के लिए किया जा सकता है । इसलिए, यह परख के एक गुणवत्ता आश्वासन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

HEK293 कोशिकाओं में NR1-GFP अभिव्यक्ति प्लाज्मिड की अभिकर्मक क्षमता लगभग 30% यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में है, जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख के लिए पर्याप्त है । हालांकि, हमने पाया है कि हरी प्रतिदीप्ति की तीव्रता transfected कोशिकाओं के बीच समान रूप से वितरित नहीं है, अभिकर्मक या व्यक्तिगत कोशिकाओं की अभिव्यक्ति की क्षमता की क्षमता में मतभेद का सुझाव । विभिंन कोशिकाओं में संयोजक NR1-GFP के अलग अभिव्यक्ति स्तर heterogenous तीव्रता के कारण जब हरे रंग की छवि Alexa Fluor ५९४ के लाल छवि के साथ विलय किया गया था । बकरी विरोधी मानव आईजीजी संयुग्मित Alexa Fluor ५९४ के साथ मानव autoantibody आईजीजी वर्ग की उपस्थिति का पता लगाने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया गया था । हमने पाया है कि Alexa Fluor ५९४ की चमक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की तुलना में अपेक्षाकृत कमजोर है । हम विरोधी की एकाग्रता बढ़ाने के द्वारा संकेत तीव्रता का अनुकूलन करने की कोशिश की एलेक्स Fluor ५९४ के साथ मानव आईजीजी संयुग्मित, तथापि, पृष्ठभूमि के रूप में अच्छी तरह से वृद्धि हुई । इसलिए, विरोधी के लिए इष्टतम एकाग्रता-एलेक्स Fluor ५९४ के साथ मानव आईजीजी संयुग्मित इस प्रयोगशाला में 1:1000 है । इसके अलावा, कुछ प्लाज्मा नमूने Alexa Fluor ५९४ छवि में एक काफी उच्च पृष्ठभूमि संकेत था । प्लाज्मा के विभिन्न कमजोर पड़ने का परीक्षण किया गया, और यह पाया गया कि 1:100 के एक न्यूनतम कमजोर पड़ने के नमूनों के अधिकांश के लिए एक स्वच्छ पृष्ठभूमि प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. इसलिए, हम इस प्रोटोकॉल में मानक कदम के रूप में प्लाज्मा के 1:100 कमजोर पड़ने की सलाह देते हैं । अन्य सेल के साथ तुलना में-परख है कि 1:10 में सीरम का नमूना पता लगा सकते हैं और 1:20 कमजोर पड़ने का नमूना11,16, इस मौजूदा प्रोटोकॉल के लिए पर्याप्त कम titer विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता नहीं है, जो प्रोटोकॉल की एक सीमा है ।

वर्तमान प्रोटोकॉल एक निश्चित सेल आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख है । संस्कृति की थाली में 1 महीने के लिए बाद में उपयोग के लिए निर्धारण के बाद 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में संग्रहित किया जा सकता है, जी सेल की तुलना में परख है कि एक लंबे समय के लिए नहीं संग्रहित किया जा सकता है आधारित है । हालांकि, NR1 प्रोटीन विकृत हो जाएगा और निर्धारण प्रक्रिया है, जो विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर एंटीबॉडी को बांधता epitope की रचना को प्रभावित कर सकता है के दौरान अपनी प्राकृतिक अनुरूपता खो देते हैं । इसलिए, कुछ अध्ययनों ने लाइव सेल-आधारित immunofluorescene11,17को अपनाया । हमारे प्रोटोकॉल वैकल्पिक रूप से एक जीवित सेल बनने के लिए संशोधित किया जा सकता है इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख आधारित NR1 प्रोटीन के प्राकृतिक अनुरूप बनाए रखने के लिए, यदि हम पहले जीवित कोशिकाओं के साथ प्लाज्मा नमूना गर्मी, और कोशिकाओं को ठीक बाद में । इस प्रकार, प्रयोग की आवश्यकता को पूरा करने के लिए प्रोटोकॉल में लचीलापन है ।

एनएमडीए रिसेप्टर एक heterotetramer जटिल NR1, NR2A, NR2B, NR2C, और NR2D से मिलकर प्रोटीन है । वर्तमान प्रोटोकॉल एनएमडीए रिसेप्टर के NR1 उपइकाई के खिलाफ autoantibody के आईजीजी वर्ग का पता लगाने के लिए बनाया गया था. प्रोटोकॉल भी एंटीबॉडी के विभिंन isotypes का पता लगाने के लिए संशोधित किया जा सकता है, जब तक विरोधी मानव आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी माध्यमिक एंटीबॉडी के अंय विशिष्ट वर्ग द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं । इसके अलावा, वर्तमान प्रोटोकॉल NR2A, NR2B, NR2C, और NR2D, के खिलाफ एंटीबॉडी की उपस्थिति का पता लगाने के लिए संशोधित किया जा सकता है अगर NR1 GFP अभिव्यक्ति प्लाज्मिड इसी अभिव्यक्ति प्लाज्मिड, क्रमशः के साथ बदल दिया है ।

हम नियमित रूप से विभिन्न अध्ययन प्रयोजनों के लिए विरोधी कौयगुलांट के साथ रक्त का नमूना इकट्ठा, क्योंकि इस प्रोटोकॉल में, हम बजाय सीरम के एक प्लाज्मा नमूना इस्तेमाल किया, लेकिन प्रोटोकॉल सीरम या सीएसएफ नमूनों के लिए लागू कर सकते हैं. titer के प्लाज्मा में एंटीबॉडी के नमूने के सीरियल कमजोर पड़ने से मात्रा जा सकता है. प्रयोगशाला में, हम भी एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग मेजबान कोशिकाओं के रूप में अफ्रीकी हरी बंदर गुर्दा fibroblast-सेल लाइन (COS1) की तरह परीक्षण किया । परिणाम HEK293 कक्षों का उपयोग करने वालों के समान हैं, सिवाय इसके कि COS1 कक्षों में HEK293 कक्षों की तुलना में थोड़ा कम अभिकर्मक दक्षता होती है.

विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर एंटीबॉडी की उपस्थिति का पता लगाने के लिए, यह सुझाव दिया है कि इस तरह के immunohistochemistry परख के रूप में अतिरिक्त प्रयोगों का उपयोग कर कुतर मस्तिष्क के ऊतकों और immunocytochemistry का उपयोग कर प्राथमिक कल्चरल कुतर न्यूरॉन्स प्रदर्शन किया जा5 ,9. इसलिए, वर्तमान प्रोटोकॉल केवल एक स्क्रीनिंग परख के रूप में माना जा सकता है । हालांकि इसकी प्रायोगिक वैधता इस अध्ययन में सकारात्मक नियंत्रण नमूना का उपयोग कर सत्यापित किया गया था, संवेदनशीलता और नैदानिक सेटिंग्स में इस परख की विशिष्टता भविष्य के अध्ययन में स्थापित करने की आवश्यकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को चांग गुंग मेडिकल फाउंडेशन (ग्रांट नंबर CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632, और CMRPG3E0633) ने सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1 Origene (Rockville, MD, USA) RG219368 NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences
pCMV6-AC-GFP Origene (Rockville, MD, USA) PS100010 mammalian vector with C-terminal tGFP tag
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen (Hilden Germany) 12362
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 11668-019
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher 31985-070
DMEM, High Glucose, Pyruvate Thermo Fisher 11995-065
Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin GE Healthcare Life Sciences SH30071.01
Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher A-11014
Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA) Euroimmun AG, Lübeck, Germany CA 112d-0101
Euroimmun Assay Kit

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३१ विरोधी एनएमडीए रिसेप्टर autoantibody NR1 उपइकाई ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन स्व-प्रतिरक्षित इन्सेफेलाइटिस सेल आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख विभेदक निदान neuropsychiatric लक्षण
एक साधारण कोशिका आधारित इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख रक्त में एन मिथाइल-डी-Aspartate (एनएमडीए) रिसेप्टर के खिलाफ Autoantibody का पता लगाने के लिए
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Chen, C. H., Chang, Y. S. A Simple… More

Chen, C. H., Chang, Y. S. A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood. J. Vis. Exp. (131), e56676, doi:10.3791/56676 (2018).

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