Summary
이 프로토콜에는 출생 후 쥐 새끼에서 청각 brainstem 응답을 기록 하는 방법을 설명 합니다. 외부 머리 세포의 기능 개발 조사, 고립 된 외부 머리 세포에 기록 하는 전체 셀 패치 클램프 실험 절차 단계별 설명 합니다.
Abstract
외부 머리 세포 포유류 달팽이 관의 감각 세포의 두 종류 중 하나입니다. 그들은 약한 진동의 저수준 사운드 신호를 증폭 하는 잠재적인 수용 체와 그들의 셀 길이 변경 합니다. 형태학 및 electrophysiological 속성 외부 머리 세포 (OHCs)의 이른 출생 후 년에 발전 한다. 외부 머리 세포의 성숙 청각 시스템의 발전에 기여할 수 있습니다. 그러나, OHCs 개발의 과정은 잘 공부 하지. 이 부분적으로 electrophysiological 접근 하 여 그들의 기능을 측정 하는 데 어려움입니다. 위의 문제를 해결 하는 간단한 방법을 개발, 목적 여기 우리가 출생 후 쥐에서 심하게 천연된 달팽이 관에서 OHCs의 기능을 공부 하는 단계별로 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법으로 순수 톤 자극에 인공 응답을 평가 하 고 식 수준 및 OHCs에 모터 단백질 prestin의 기능 검사 수 있습니다. 이 메서드는 또한 내부 세포 (IHCs) 조사를 사용할 수 있습니다.
Introduction
달팽이 관의 감각 세포의 두 가지 기능 포유류 청각을 위해 필수적입니다: mechanoelectric 변환 (메트로) 및 electromotility1,2. 메트로 채널 머리 번들, IHCs (IHCs) 및 막 잠재적인 변경으로 OHCs 변환 사운드 진동 뿐만 아니라 innervated 나선형 ganglion 신경의 전기 신호에 의해 OHCs 막 잠재력과 셀 길이 변경 하 고 낮은 수준의 소리의 진동 증폭. Electromotility 나이 활동 OHCs3의 측면 벽에 있는 모터 단백질 prestin에 의해 파생 됩니다.
많은 종의 설치류를 포함 하 여, 청각 기능 초기 산 후 신 기원4,5에 성숙 하지 않습니다. 사운드 신호에 대응에서 행동 잠재력 심리 발병6,7전에 청각 피 질에서 검출 될 수 있습니다. 형태학의 개발 및 달팽이 관의 기능 마우스, 햄스터, 쥐4,5,8에서 널리 공부 되었습니다 했다. Mechanotransduction 및 electromotility 세포의 또한 개발 초기 생명 시대5.
다른 산 후 나가에 쥐의 청각 감도 평가 하기 위해 청각 brainstem 응답 (ABR) 쥐 새끼에 기록 하는 방법을 개발 했습니다. 전체 셀 패치 클램프 electrophysiologically는 OHCs를 조사 하는 이상적인 기술입니다. 그러나, 전체 셀 씰링의 저속 절연된 OHCs의 electromotility의 조사 제한 된 신경 세포와 다른 상피 세포에서 수행 하는 패치 클램프와 비교.
여기는 산 후 쥐에서 심하게 천연된 달팽이 관에 형태학 상으로 electrophysiologically는 OHCs을 조사 하는 절차에 설명 합니다. 이 메서드는 내부 머리 전지 개발 및 기능을 조절 하는 분자 메커니즘 연구를 수정할 수 있습니다.
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Protocol
동물 주제와 관련 된 모든 실험 프로토콜 남부 의과대학의 동물 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 실험에 대 한 솔루션을 준비 합니다.
- 마 취 준비 ( 재료의 표참조): 1.5 %pentobarbital 나트륨 ddH2오에에서 녹아
- 해 부 솔루션 준비 ( 재료의 표참조): 1 M NaOH와 ddH2O. 조절 pH 7.3 1 리터에 Leiboviz의 L-15 분말의 1 개의 부 대를 해산. 300-330 mOsm osmolarity osmometer를 사용 하기 전에 10 mM HEPES 사용 하 여 조정 합니다.
- 2 mg/mL 콜라 IV 해산 ( 재료의 표참조) 해 부 솔루션 단계 1.2 준비.
- ( 재료의 표참조) immunostaining 솔루션 준비: 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 4 %paraformaldehyde 해산.
주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 보호를 착용 하십시오. - 0.3% 침투성 에이전트 PBS에 희석. 블로킹 버퍼 PBS에 10% 정상 염소 혈 청을 희석. 블로킹 버퍼에서 prestin 항 체 1: 200을 희석. 블로킹 버퍼에 Alexa488 활용 된 항 체 1:600 희석. Phalloidin Tetramethylrhodamine B isothiocyanate 1: 200 PBS에 희석.
- Extracellular 솔루션 준비 ( 재료의 표참조): (1.2 단계) 위에서 설명한 대로 Leiboviz의 L-15 매체를 준비.
- 세포내 솔루션 준비 ( 재료의 표참조).
2. ABR 기록
참고: ABR 녹음 이전 설명 하고있다9우리의 이전 연구 자세히.
- Sprague Dawley (SD) 쥐 (1-14 주 오래 된 강아지와 2 개월 된 성인, 남녀) 1.5% 나트륨 pentobarbital (새끼에 대 한 22 mg/kg과 30 mg/kg 성인, 복 (i.p.))의 단일 주사로 anesthetize.
- 동물의 신체를 고정 하는 폴 리 에틸렌 거품 형에 마 취 동물을 배치 합니다. 동물 소리 약하게 방에 방진 테이블에 놓습니다. 생리대와 37.5 ° C에서 동물의 체온을 유지.
- 70% (vol/vol) 에탄올과 머리 영역을 닦으십시오. 좋은 위를 사용 하 여에 게 1-2 m m 절 개를 ventrolateral 참조 전극 또는 지상에 외부 pinna. 쳇 바늘 전극 (기록 전극)는 두개골 꼭지점 (그림 1A)에 있습니다.
- 다양 한 주파수의 보정된 음색 파열 (1 ms 상승/하강, 3 ms 고원) 생성 함수 발생기를 사용 하 여 (2, 4, 8, 16, 24 및 32 kHz)와 강도 (dB 5 단계에서 10 dB SPL 85에서 감소). 주파수와 진폭을 수동으로 다 또는 컴퓨터를 사용 하 여. 동물의 머리 쪽으로 떨어져 10 cm에 있는 정전기 스피커를 통해 소리 자극을 제공 합니다.
- (100-1000 Hz)를 필터링 하 고 증폭 (256 회) 사운드 이끌려 잠재력에 Abr를 다기능 프로세서를 사용 하 여 평균. 온라인 및 오프 라인 분석을 위해 저장 된 ABR 추적 모니터링 됩니다. 그것은 하나의 동물에서 녹음 하는 ABR을 완료 하는 데 약 40 분 걸립니다.
참고: 일반적으로, 3 ~ 7 봉우리 (파 나 파 7 세) 대기 시간은 15 ms 수 보다 적게 식별 (그림 1B). ABR 임계값 어느 파에 I와 II는 검출 될 수 있는 최소 소리 수준으로 정의 됩니다. - 안락사 (0.3 mL 1.5% 나트륨 pentobarbital 복 주사)와 마 취에서 깨어 동물 전에.
3. 장기의 Corti (OC) 해 부
- 쥐 새끼 anesthetize 쥐 보다 6 일 이전에 대 한 (< P6), 100 mm 문화 접시에 있는 동물을 유지 하 고 10 분 동안 얼음 접시 커버. 쥐를 위해 > P6, 1.5% 나트륨 pentobarbital (22 mg/kg, i.p.)의 단일 주입으로 동물을 anesthetize. 마 취 후 쥐 새끼를 목을 벨.
- 70% (vol/vol) 에탄올을 분사 하 여 머리를 소독.
- 가 위; 화살 중간에 따라 두개골을 열으십시오 내가 폭로 뇌를 제거 합니다.
- 얼음 처럼 차가운 L-15 (그림 2A)의 3 mL 가득 35 mm 페 트리 접시로 내가 전송 합니다.
- 해 부 현미경 미세 집게를 사용 하 여 달팽이 관 (그림 2B)의 뼈 캡슐을 제거 하.
- OC를 풀 다 및 관련 흔 vascularis (SV)는 modiolus에서.
- 개최 하 여 집게와 SV의 기저 부분 구분 OC SV에서 완전히 기지에 정점 (그림 2C)에서 천천히 해제 합니다.
- 잘라 OC 균등 하 게 3 개의 조각으로 고급가 위 (그림 2D)를 사용 하 여.
4. 면역 형광 염색
- 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 유리 슬라이드에 OC (3.8 단계)의 세그먼트를 전송 하 고 적어도 4 h 4 ° c.에 대 한 4 %paraformaldehyde 100 µ L로 수정
주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 보호를 착용 하십시오. - 신선한 PBS의 100 µ L로 paraformaldehyde 여 조직을 씻어. 워시 3 시간 10 분 대 한 조직.
- 실 온에서 30 분 PBS에 0.3% 침투성 에이전트 조직 품 어.
- PBS에 침투성 에이전트를 삭제 하 고 세 번 PBS 가진 조직 씻어.
- 10% 정상 염소 혈 청 PBS에 실 온에서 1 h와 함께 차단 합니다.
- 하룻밤 실 온에서 또는 4 ° C에서 2 시간에 대 한 솔루션을 차단에 안티-prestin-C-말단 항 체 (1: 200)로 품 어.
- 5 분에 대 한 PBS 세 번 씻어.
- Alexa488 활용 된 이차 항 체 (1:600)와 함께 어둠 속에서 실 온에서 1 h에 대 한 차단 솔루션에서 품 어.
- 어둠 속에서 5 분에 대 한 PBS 세 번 씻어.
- 어둠 속에서 실 온에서 10 분 동안 rhodamine-phalloidin (1: 200)으로 품 어.
- 어둠 속에서 5 분에 대 한 PBS 세 번 씻어.
- 장착 매체 (DAPI 포함) 유리 슬라이드에 탑재 합니다. Confocal 현미경 검사 법 405를 사용 하 여 이미지 nm, 488 nm, 그리고 594 nm 레이저. 0.1-0.5에서 레이저 전원 설정 mW 및 스캔 속도 0.5 프레임/s에서.
5. 패치 클램프 격리 OHCs의 기록
- 피펫은 끌어당기는 사람을 사용 하 고 마이크로-위조 패치를 pipettes 팁 직경 2-3 µ m. 다시 채우기 세포내 솔루션 펫. 일반적으로, 패치 피 펫의 초기 저항 2.5-3.5 m ω 목욕 솔루션에서 이었다.
- 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 (단계 3.8)에서 OC의 조각 35 mm 페 트리 접시에 전송 합니다. 소화 효소 소화 매체의 100 µ L와 조직 (콜라 4, 참조 테이블의 재료) 실 온에서 5 분.
- 효소 소화 매체 L-15의 100 µ L로 치환 조직에서 세포를 분리 하는 마이크로 메스를 사용 하 여 작은 조각으로 잘라.
- 부드러운 pipetting 후 만든 작은 플라스틱 챔버로 셀 전송 (직경 ~ 1.5 c m) 효소 무료 목욕 솔루션으로 가득 (~ 1.5 mL 재료의 표참조).
- 챔버는 거꾸로 한 현미경의 스테이지에 배치 합니다. 건강 한 나타나는 독방 OHCs 찾아.
- 700B 앰프의 헤드 단계에 패치 피 펫을 로드 합니다. micromanipulator에 의해 패치 피 펫을 신중 하 게 이동 하 고 외부 머리 세포 (그림 3A)의 바닥의 주위에 위치.
- 전체 셀 패치 클램프 세포 체의 측면 벽을 씰링 하 여 OHC 세포 막 파열까지 가벼운 흡입을 적용 합니다. 개최 잠재적인 설정-70 mV. 셀 액세스 저항 10에서 17 m ω에 배열 했다와 막 저항 500 m ω, 100에서 배열 했다 그리고 성공적인 전체 셀 구성으로 간주 됩니다.
- Hyperpolarizing 및 depolarizing 전압 적용 컴퓨터 제어를 사용 하 여 (250 ms 기간 및 −140에서 +94에 이르기까지 13 mV 단계에 mV) 전체 셀 전류를 유도 하는 셀.
- 전체 셀 전류를 증폭, 700B 증폭기 (5 kHz의 코너 주파수) 필터링. 1440A 컨버터 및 오프 라인 분석에 대 한 저장소로 데이터를 변환 합니다.
- 패치 클램프 소프트웨어에 의해 제어 하는 두 개의 사인파 전압 자극 프로토콜을 사용 하 여 OHCs의 막 커패시턴스를 측정 합니다. 110-140에서 stimulate 전압 범위 설정 mV. 오프 라인 분석을 위해 데이터를 저장 합니다.
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Representative Results
ABR에서 마 취 쥐 새끼 산 후 제 7 일 보다 오래 된 (P7) 순수한 톤 버스트 (그림 1A)를 사용 하 여 elicited 될 수 있습니다. 그림 1B같이 ABR 파형 쥐 새끼만 3 ~ 4 가지 파도 작은 진폭 보여준에서 얻은. 일반적으로, 7 개의 봉우리까지 성인 동물 (그림 1B)의 ABR 파형에서 관찰 되었다.
다음 immunostaining 및 electrophysiological 측정, 쥐 귀 갓 측 뼈에서 해 부 했다. 우리는 SV를 modiolus (그림 2A-2 C) OC을 조직 해 부의 연속 단계를 보여줍니다. OC는 마이크로-가 위 (그림 2D)를 균일 하 게 3 개의 조각으로 잘라 했다. 머리 세포의 형태를 표시 하려면 세그먼트 phalloidin, prestin 항 체와 DAPI (그림 2E) 얼룩이 있었다. 반면는 OHCs의 셀 시체 prestin (녹색)에 의해 표시 되었다 (빨간색)으로 머리 묶음 머리 세포의 꼭대기 표면을 나타냅니다. 핵 (파란색)에 DAPI OHCs 및 IHCs의 아래 지역에 위치한로 분류 됐다. 그림 2E같이 아무 prestin P5에 달팽이 관의 OHCs에 발견 되었다. Prestin은 OHCs 기저 달팽이 관에 있는 p 7에서 처음 관찰 되었다.
부드러운 소화 후는 OHCs OC (그림 3A)에서 분리 했다. 전체 셀 전압 클램프 녹음 OHCs 심하게 쥐 달팽이 관에서 고립에서 수행 했다. 전체 셀 전류의 대표적인 예는 격리 P9 OHC에 막 잠재력에 −140에서 +107으로 변경에서 기록 mV를 그림 3B에 표시 됩니다. K캘리포니아 현재 OHCs의 독특한 응답의 존재를 나타내는 I-v 곡선의 N-모양 지역을 note 하시기 바랍니다. 막 전압에 의해 구동, 세포내 Cl- 와 결합 prestin, 비선형 막 커패시턴스 (NLC) 전체 셀 패치 클램프 모드 변경 게재. 성숙한 OHC의 전형적인 NLC 종 모양의 막 잠재력에 대 한 의존에 의해 특징입니다. NLC는 2-상태 볼츠만 함수와 맞을 수 있다 고 OHCs의 electromotility 기능을 반영할 수 있다. 커패시턴스 피팅 볼츠만 기능 설명입니다.
방정식 및 매개 변수는 우리의 이전 종이9에 설명 했다. 2 개의 대표 NLCs 그림 3C에 표시 됩니다.
그림 1입니다. 청각 brainstem 응답 녹음. (A) 기록 전극 두 귀 사이 두 피에 삽입 했다. 지상 및 기준 전극은 각각 왼쪽 및 오른쪽 pinna 아래 두었다. 오픈 필드 스피커는 쥐의 코 끝에서 10cm은 배치 했다. (B) 두 개의 대표적인 ABR 파형 16 kHz, 80 dB에 대 한 응답에서 SPL 음색 파열. 위의 추적 P8 강아지에서 기록. 성인 쥐에서 하단 추적 기록. 숫자는 파형의 다른 봉우리를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 오르간의 Corti 해 부. (A) 내가 P9 쥐 강아지에서 해 부. 달팽이 관 및 vestibular 지역 표시 됩니다. (B) 달팽이 관의 구조는 골 질 벽의 제거 후 노출 되었다. (C) 코트 (OC)와 흔의 기관 vascularis (SV)는 modiolus에서 분리 했다. (D) 장기의 Corti는 균등 하 게 3 개의 조각으로 잘라 했다. 스케일 바 A d에서 1000 µ m. (E) 공초점 이미지 쇼를 머리 세포 달팽이 관을 따라 다른 세그먼트 (기저, 중간, 그리고 꼭대기)에 위치를 나타냅니다. Rhodamine-phalloidin (레드) 꼭대기는 세포 표면에 있는 머리 번들을 나타냅니다. DAPI (파란색) 세포의 중간 아래 부분에 있는 핵을 나타냅니다. (녹색에서 표시) prestin 외부 머리 세포의 측면 벽에만 표현 했다. P7에 중간과 기저 세그먼트, 녹색 채널 OHCs에 prestin의 식을 설명 하기 위해 표시 됩니다. 눈금 막대 나타냅니다 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 고립 된 외부 머리 세포의 전체 셀 패치 클램프 기록. (A) 고립 된 외부 머리 세포 전체 셀 모드에서 밀봉 되었다. 눈금 막대는 10 µ m. (B) A 대표적인 I-v 곡선을 P9 외부 머리 세포에서 기록 된 나타냅니다. (C) 비선형 막 커패시턴스 (NLC) 다른 연령대에서 2 개의 외부 머리 세포에서 얻은. 커패시턴스-전압 응답 (오픈 원) (두꺼운 선으로 표시 된) 볼츠만 함수에 장착 했다. NLC는 해당 선형 커패시턴스 (Clin)로 정규화 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
쥐 날 11 미만, 청각 피 질6,7소리 자극에 대 한 응답에서 행동 잠재력을 관찰 수 있었다. 따라서, 출생 후 하루 11 "청각 발병"10로 설명 되어 있습니다. 청각 기능 공부 하기 전에 청력 발병은 하지 잘 아직 개발. 성인 ABR 녹음에 대 한 유사한 방법을 사용 하 여, Abr P11 보다 젊은 쥐 새끼에서 순수한 톤 버스트 여 elicited 될 수 보여 줍니다 (그림 1). 그러나, 쥐 새끼에서 얻은 ABR 파형 성인 동물의 몇 가지 다른 기능을 보여주었다. ABR 응답은 상대적으로 높은 임계값과 진폭에 작은. 이 결과 개발 청각 시스템 사운드 신호를 낮은 감도 것을 의미 합니다. 중요 한 차이 쥐 새끼에서 기록 하는 ABR 파형에서 관찰 되었다. 일반적으로, 7 개의 봉우리까지 성인 ABR 파형9에서 관찰 되었다. 다른 대기 시간으로이 봉우리는 청각 통로11에 따라 다른 brainstem 핵에 의해 생성 됩니다. 우리의 결과 I-IV를 파도 쥐 새끼 (그림 1B)에서 ABR에서 감지 했다 나타냅니다. 파도가 I 및 II 달팽이 관 및 청각 신경11에서 응답을 나타냅니다. 따라서, 결과 높은 수준의 청각 핵 개발 중 음향 자극에 응답 하지 못했습니다 나타냅니다. 이러한 데이터는 달팽이 관 범위 기능 성숙 이전 보다 중앙 청각 시스템 제안. 우리는 여기에 설명 하는 방법 달팽이 관 개발 및 머리 세포 기능을 조절 하는 분자 메커니즘의 연구에 대 한 중요 하다.
OC의 해 부 고품질 immunostaining, 더 럽 히기, 양과 electrophysiological 측정을 포함 하 여 추가 실험을 위해 중요 하다. 이러한 실험 성인 SD 쥐와 쥐 새끼 1 ~ 14 일 오래 된 사용 하 여 수행 되었습니다. 쥐 새끼는 인공 뼈 소프트 하 고 제거할 수 있습니다 쉽게 집게는 OC. 손상 없이 정밀한 해 부에 이상적 성인 쥐에 대 한 특정 주의 뼈 하드 캡슐을 제거 하는 동안 OC 파열을 방지 해야 합니다. 미세 집게를 사용 하 여 OC 및 관련된 SV 수 해제는 modiolus에서. 분리 된 OC와 SV는 다른 텍스처 (그림 2C). 쥐 새끼, OC 800-1200 µ m의 길이 가진 3 개의 세그먼트로 잘라 될 수 있습니다. 제발 note, 얼음 처럼 차가운 L-15 저하 및 조직의 열화를 최소화 하기 위해 가능한 한 빨리에서 모든 단계를 수행 해야 합니다.
OC의 고립 된 세그먼트는 immunostaining, 더 럽 히기, 양과 RNA 분석을 위한 좋은 준비. 여기 우리가 immunostaining에 의해 OC에서 감각 머리 세포의 형태로 보여줍니다. OHCs가지고 머리 번들 꼭대기 그들의 표면에 핵에 있는 basally12. 모터 단백질 prestin OHCs의 측면 멤브레인에 표시 됩니다. Confocal 영상 데이터 표시는 prestin 되었다 처음 P6-P7에 표현 하 고 (그림 2E) 다음 주 동안 지속적인된 증가 보였다. 추가 실험에서 서 부 럽 고 q PCR prestin의 관찰 된 식 수준 변경 개발 (데이터 표시 되지 않음) 척도를 수행 했다. 머리 세포는 OC에 소수 이기 때문에, 6 ~ 10 cochleae는 강력한 신호를 달성 하는 하나의 실험에 권장 됩니다.
OHCs의 패치 클램프 기록에 대 한 가벼운 효소 소화는 OHCs 별도로 수행 되었습니다. 머리 세포는 약, 그리고이 단계에서 특별 한 주의 필요. 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 조직과 분리 된 세포를 전송. OC의 고립 된 세그먼트 콜라 솔루션 방울 전근 (~ 100 µ L) 실 온에서 약 5 분 동안 배양 접시에서. OHCs의 세포 막 손상 것입니다 긴 소화 시간을 하지 마십시오. 현미경, 건강 찾고 OHCs 패치 클램프 기록에 대 한 선정 됐다. 수축, 팽창의 어떤 표시도 보여주고 세포 손상, 또는 핵의 전 좌는 다음 실험에서 제외 했다. 건강 한 독방 나타나는 OHCs 및 IHCs은 그들의 형태학 적 차이 의해 식별 하기 쉽다. OHCs 반면 IHCs 플라스 크 모양의 꽉 목12원통형 모양 및 더 큰 축 직경 비율을 표시 합니다. OHCs에 전체 셀 패치 클램프는 그 신경 세포와 다른 상피 세포에서 다소 어렵습니다. 성공적인 셀 전체 구성에 대 한 패치 피펫으로 prestin 입자 (그림 3A)의 높은 밀도 포함 하는 상단 측면 막 멀리 핵 근처 일반적으로 위치 했다. 후 막 파열 했다, 2 개의 사인파 전압 자극 프로토콜 OHCs의 막 커패시턴스를 얻으려면 셀에 적용 되었습니다. 동일한 기술에 전압 단계를 사용 하 여 가능 하다 전체 셀 전류를 유도.
이 메서드는 OHCs 생체 외에서9,13의 electromotility 기능을 조사 하는 좋은 도구. 이 방법은 또한 이온 채널의 기능 뿐만 아니라 OHCs 및 IHCs14수용 체의 약리학 속성 조사 사용 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 973 프로그램 (2014CB943002), 국립 자연 과학 재단의 중국 (11534013, 31500841)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic | |||
| Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 1.5% in water |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | 2 mg/mL in L-15 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PH 7.3 |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% in PBS |
| Triton X-100 | Amresco | ZS-0694 | 0.3% in PBS |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 10% in PBS |
| prestin antibody | Santa Cruz | SC-22694 | dil 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | dil 1:600 |
| Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | dil 1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | dil 1:20 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extracellular solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Osmometer | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| Forcep | WPI | 14095 | Tweezers dumont |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
| Micro Forge | Narishigen | MF-830 | |
| Mini Operating System | Sutter Instrument | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| Low-Noise Data Acquisition System | Axon | 1440A | |
| ES1 speaker | Tucker-Davis Technologies | ||
| TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| SD rat | Experimental Animal Center of Southern Medical University |
References
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