Dissezione e cultura Explant della Allantois murino per l'analisi In Vitro di allantoico allegato

Summary

Descriviamo un test in vitro per allegato corio-allantoidea di modello, il primo passo nella formazione della placenta. Il protocollo dimostra la cultura dissezione ed espianto di murino allantoides su integrina α4β1 immobilizzato. Allegato allantoide viene valutato microscopicamente a intervalli di tempo predeterminati.

Abstract

La placenta è essenziale per la crescita e lo sviluppo degli embrioni dei mammiferi. Per questo motivo, numerose alterazioni genetiche e probabili insulti anche ambientali che disturbano lo sviluppo della placenta o funzione possono causare perdita iniziale di gravidanza nei topi e nell'uomo. Tuttavia, mancano semplice in vitro test per lo screening per i potenziali effetti sulla formazione della placenta. Qui, ci concentriamo sulla modellazione il primo e fondamentale passo nella formazione della placenta, che consiste dell'attaccamento del allantois di chorion. Descriviamo un metodo per valutare rapidamente l'attaccamento degli espianti allantoico su integrina α4β1 immobilizzato, che funge da un substrato chorio-mimetici. Questo approccio in vitro consente una valutazione qualitativa dell'allegato e diffondendo il comportamento di più allantoide espianti in diversi momenti consecutivi. Il protocollo può essere utilizzato per studiare l'effetto di mutazioni mirate del mouse, droghe o vari fattori ambientali che sono stati collegati alle complicanze della gravidanza o perdita fetale su allantoide allegato ex vivo.

Introduction

La placenta è indispensabile per la crescita embrionale e sviluppo nell'ambiente uterino. Esso costituisce l'interfaccia per ossigeno, metabolita e scambio di nutrienti tra la circolazione fetale e materna e anche funzioni come un organo endocrino e immunologico. Qualsiasi insulto endogena o esogena che altera lo sviluppo placenta può portare a ritardo di sviluppo intrauterino, perdita fetale o complicazioni di gravidanza, sia in topi ed in esseri umani¹. Mentre il numero di mutazioni mirate del mouse che causano fisiologia placenta anormale continua ad aumentare di², con 219 genotipi attualmente elencati nel sito Web del Mouse Genome Informatics (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), molti di questi fenotipi non sono ben compresi da un punto di vista meccanicistico. Oltre alle alterazioni genetiche, anticorpi monoclonali, farmaci, tossine, agenti patogeni, metaboliti in eccesso o vari agenti ambientali possono influenzare lo sviluppo della placenta e funzione^{3,4,5 , 6 , 7}. ancora, semplice in vitro dosaggi che modello passaggi critici nello sviluppo della placenta sono scarse.

Murino sviluppo placenta è iniziato nella prima metà, quando l'allantoide (il precursore dello sviluppo del cordone ombelicale) emerge dalla parte posteriore dell'embrione come un germoglio che cresce verso il corion⁸. Chorioadhesive cellule nello strato esterno del germoglio allantoico mediano l'allegato e la diffusione della allantois sulla superficie del corion (corio-allantoidea "fusione"). Il corion successivamente piega in villi in cui il sistema vascolare della allantois cresce per formare il labirinto, lo strato interno placenta, dove le sostanze nutrienti e l'ossigeno vengono scambiati tra sangue materno strettamente giustapposti sinusoidi e vasi embrionali^{9 ,10}.

L'attaccamento della allantois al corion è il passo iniziale e fondamentale nella formazione del labirinto, e difetti di questo processo sono tra le cause più comuni di mortalità embrionale in midgestation¹. Anche se un numero di mutanti del topo con stato descritto dove chorioallantoic allegato non riesce a verificarsi¹⁰, e il database MGI attualmente elenca 108 mutanti del topo che sono caratterizzati dalla fusione di corio-allantoidea anormale (http:// www.Informatics.Jax.org/Vocab/mp_ontology/MP:0002824), l'interazione intercellulare tra vascolare delle cellule adesione molecule-1 (VCAM-1, espressa il mesoderma allantoico) e integrina α4β1 (espressa su corionico mesotelio, che è derivato da mesoderm extraembryonic) sembra essere indispensabile per chorioallantoic allegato e fusione^11,12,13. La macchiatura di Immunohistochemical di embrioni di selvaggio-tipo intero-monta ha dimostrato che VCAM-1 è espresso all'interno di due terzi distali del gambo allantoico al giorno circa embrionale (E) 7.5¹³ (1-4 fase somite), e che la sua espressione rimane elevato durante il collegamento corio-allantoidea e - fusion^11,12. Fallimento di allantoico attaccamento al corion viene in genere rilevata dalle analisi istologiche dei germogli di utero. Tuttavia, allantoide dimensioni sono fisiologicamente altamente variabile in mezzo e anche all'interno di cucciolate della stessa fase inerente allo sviluppo¹⁴e allantois possibile collegare solo il corion quando ha raggiunto una dimensione sufficiente per rendere il contatto fisico. Riflettendo questa variabilità naturale, corio-allantoidea allegato si svolge qualche tempo tra ~ E 8.0 e 9.0 E nell'uteroe una valutazione statisticamente affidabile di questo processo dall'istologia dipende pertanto l'analisi di un gran numero di conceptuses per ottenere abbastanza campioni presso lo stadio di sviluppo appropriato.

Qui, descriviamo un metodo per valutare allantoico allegato ex utero che è meno dipendente dalle dimensioni allantoide. Dimostriamo la dissezione di embrioni di topo e loro allantoides dalla uterina di topi incinta ~ 8 giorni post coitum del (dpc; dpc 0,5 indica il rilevamento di un plug vaginale), e la successiva cultura di allantoide espianti su α4β1 immobilizzato integrine. Questo metodo consente una valutazione rapida e funzionale l'allegato e diffondendo il comportamento degli espianti di allantoide multipli in parallelo e in diversi momenti successivi. Il protocollo può essere utilizzato per schermare per gli effetti di vari fattori ambientali, farmaci o mutazioni mirate su allantoide allegato ex vivo.

Protocol

Allevamento del mouse è stato approvato dalla Regierung Unterfranken, e tutte le analisi sono state effettuate in conformità con tutti i tedesco e Unione europea leggi e normative applicabili relative alla cura e utilizzo degli animali da laboratorio.

1. rivestimento di microtitolo piastre con integrina α4β1 per Ex Utero Allantois Explant cultura

1. Ricostituire l'integrina α4β1 murino liofilizzato a 200 µ g/mL in soluzione fisiologica sterile di tampone fosfato (PBS). Diluire a una concentrazione finale di 10 µ g/mL in pre-riscaldato (37 ° C) PBS. Pipettare 20 µ l/pozzetto di soluzione integrina α4β1 diluito nel numero necessario di pozzetti di una piastra microtiter (1 allantoide/pozzetto).
   Nota: Evitare la formazione di bolle d'aria quando rivestimento dei pozzetti di micropiastre.
2. Incubare le piastre di microtitolazione per 60 min a 37 ° C mettendoli in un incubatore umidificato coltura del tessuto.
3. Aspirare accuratamente il surnatante con una pipetta. Utilizzare aspirazione delicata e inclinare il piatto per evitare di toccare il fondo con la punta della pipetta. Lavare i pozzetti due volte aggiungendo 50 µ l di terreno di coltura pre-riscaldata (37 ° C) come di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) e rimuovere il mezzo di lavaggio di aspirazione delicata.
4. Passaggio critico: blocco siti di legame con l'aggiunta di 50 µ l/pozzetto di 0,1% (p/v) albumina di siero bovino (BSA) / DMEM ed incubare per 30 min a 37 ° C ≥ inserendo le piastre di microtitolazione in un'incubatrice umidificata tessuto coltura.
   Nota: Espianti Allantois possono allegare a varie superfici in presenza di siero. È quindi imperativo per bloccare i siti di legame non specifico, dopo la verniciatura i pozzetti con integrina e prima di aggiungere l'allantoide sezionati per explant cultura nel liquido contenente siero medio (Vedi punto 4.4).
5. Tenere i pozzetti coattati la soluzione bloccante a 37 ° C fino a quando necessario al punto 4.4.

2. utero dissezione da un Mouse incinta al Dpc 8

Nota: Ridurre i tassi di gravidanza falso positivo da peso guadagno discriminazione¹⁵.

1. Sacrificare il mouse di dislocazione cervicale. Disinfettare il cappotto nella zona addominale spruzzando con etanolo al 70% (v/v).
   Nota: Indossare guanti durante la manipolazione di topi. Eutanasia di dislocazione cervicale senza anestetici previene la contaminazione chimica dei allantois, che può interferire con allegato allantoide.
2. Aprire la pelle dell'addome facendo una piccola incisione al midline con le forbici. Utilizzare le dita guantate per tenere la pelle sopra e sotto l'incisione e tirare la pelle verso il petto e la coda del mouse.
3. Afferrare il peritoneo con la pinzetta. Con l'altra mano, fare un'incisione a forma di V da anteriore verso posteriore usando le forbici e spostare il tessuto via per esporre la cavità addominale. Utilizzare le pinze per spingere l'intestino da un lato al fine di ottenere l'accesso all'utero.
4. Individuare i due corni uterini. Tenere il collo dell'utero (il segmento caudale) con il forcipe e tagliare i legamenti con forbice. Quindi scollegare entrambi i corni uterini da recidere ovidotti con le forbici.
5. Utilizzare pinze per trasferire l'utero in un piatto di 10cm sterile contenente sterile, PBS a temperatura ambiente (TA). Rimuovere il tessuto adiposo, vasi e nervi che circondano i corni uterini con una pinzetta e/o forbici (Figura 1A).

3. embrione dissezione

Nota: Eseguire la procedura seguente sotto uno stereomicroscopio dotato di una gamma di zoom 8:1.

1. Separare gli embrioni di taglio tra i siti di impianto con le forbici. Afferrare il rivestimento uterino muscolare dei germogli dell'utero con la pinzetta e tirare lo distingue per esporre la decidua (Figura 1B).
2. Usando il forcipe, trasferire i germogli di utero in un nuovo piatto di 10 cm contenente sterile, RT PBS.
3. Difficoltà decidua intorno l'embrione con le punte delle pinze.
4. Praticare un'incisione sul lato anti-mesometrial della decidua con una pinzetta (Figura 1) e togliere la decidua con pinze per esporre l'embrione (Figura 1).
   Nota: Il Polo di mesometrial della decidua è altamente vascolarizzato e può essere maggiore alla sua base la parte anti-mesometrial, che contiene l'embrione e appare più pallido.
5. Sezionare l'embrione con il forcipe (Figura 1E, F).
6. Utilizzando un micro-cucchiaio, trasferire l'embrione in una goccia di PBS sterile contenuta in un piatto sterile cm 3,5.
7. Trasferire l'embrione in una fresca goccia di PBS nello stesso piatto 3,5 cm utilizzando un micro-cucchiaio e sezionare l'embrione dal sacco vitellino usando il forcipe (Figura 1, H).
8. Facoltativamente, se necessario (ad es., per la genotipizzazione mediante polymerase chain reaction), trasferire il sacco vitellino in una provetta sterile aspirando con ~ 5 µ l PBS in punta di una pipetta di grande orifizio 200 µ l. Conservare a-20 ° C.
   Nota: Tessuto materno (cioè, il sacco vitellino parietale tra cui membrana di Reichert e il cono di ectoplacental) che potrebbe contaminare la preparazione del sacco vitellino può portare a risultati erronei genotipizzazione. Rimozione di questi tessuti è più semplice prima della dissezione dell'embrione dal sacco vitellino.

4. allantois dissezione e cultura Ex Utero su integrina α4β1 immobilizzato

1. Tagliare l'allantoide dal suo sito di inserimento basale all'estremità posteriore dell'embrione utilizzando una pinzetta (Figura 1 H).
2. Facoltativamente, se è necessaria la messa in scena dello sviluppo, è possibile contare le coppie somite dell'embrione mediante ispezione visiva utilizzando un microscopio dotato di ottica di contrasto di fase e un 5 × e 10 × obiettivo.
   Nota: L'embrione può essere esteso con pinze per facilitare il conteggio del somite. Fusione e corio-allantoidea allegato si verificano tra E 8.0 e 9.0 E embrioni con coppie di ≥ 6 somite. Tornitura comincia negli embrioni con 6-8 coppie di somite.
3. Dispensare 40 µ l/pozzetto di DMEM completati con 10% (v/v) di siero bovino fetale, L-Glutammina e antibiotici nel numero necessario di pozzetti di piastra prepatinato necessari (vedere sezione 1).
4. Raccogliere l'allantoide galleggiante aspirando con ~ 5 µ l PBS in un grande orifizio della punta di una pipetta 200 µ l. Trasferire 1 allantoide/pozzetto.
5. Incubare il allantoides inserendo le piastre di microtitolazione in un incubatore umidificato coltura tissutale (37 ° C, 5% CO₂) per es., 6, 12 e 24 h. Al fine di evitare interferenze con allegato allantoide, non spostare le piastre di microtitolazione tra questi intervalli di tempo.
6. In ogni punto del tempo, Punteggio allegato allantoide (ad es., nessun allantoide galleggiante e allegato; parzialmente o completamente annesso allantoide; completamente diffusione allantoide) utilizzando un microscopio dotato di fase contrasto o differenziale interferenze ottiche di contrasto e un × 5 o 10 × obiettivo (Figura 2).
   Nota: Gli esempi rappresentativi di recente isolate e completamente attaccato allantoides sono mostrati nella Figura 2. Ex utero, la punta distale del allantoides isolate da topi C57BL/6J wildtype attribuisce all'interno di 4-6 h (questo si riferisce a come parziale allegato della allantois), e allegato completo della allantois intero viene raggiunto entro ~ 12 h di cultura. Da 18-24 h, explant ha appiattito e assume una forma circolare (di cui per come completamente diffondere allantoide) con un plesso vascolare di CD31-positivo^9,16.

5. conferma la macchiatura della Allantois espiantati per il CD31 marcatore delle cellule endoteliali

1. Aspirare il terreno di coltura di espianti di diffusione completamente e fissare le cellule con l'aggiunta di 40 µ l/pozzetto di paraformaldeide 4% (p/v) / PBS.
   Nota: Paraformaldeide è tossico. Indossare guanti e occhiali di sicurezza per evitare il contatto dell'occhio e della pelle.
2. Incubare per 10 min a RT, quindi aspirare il supernatante. Lavare tre volte con l'aggiunta di 40 µ l/pozzetto di PBS e togliere la soluzione di lavaggio di aspirazione delicata.
3. Permeabilize le cellule e bloccare i siti di legame non specifico aggiungendo 40 µ l/pozzetto di 0.1% (v/v) del siero di capra normale Triton X-100/0.1% (w/v) BSA/10% (v/v) in PBS per 30 min a RT. Wash due volte con l'aggiunta di 40 µ l/pozzetto di PBS e togliere la soluzione di lavaggio di aspirazione delicata.
   Nota: Il protocollo può essere sospesa durante la notte a questo punto.
4. Macchia le cellule con l'aggiunta di 20 µ l/pozzetto di anticorpi anti-CD31 primario diluito 01:50 in 0,1% (p/v) BSA/PBS durante la notte a 4 ° C. Lavare tre volte con l'aggiunta di 40 µ l/pozzetto di PBS e togliere la soluzione di lavaggio di aspirazione delicata.
5. Rilevare gli anticorpi primari legati con l'aggiunta di 20 µ l/pozzetto di fluorescente-etichetta secondaria capra gli anticorpi anti-ratto diluito 1: 200 in 0,1% (p/v) BSA/PBS per 1h a RT. Protect di microtitolo dalla luce avvolgendo in carta stagnola o inserendo in una camera oscura. Lavare tre volte con l'aggiunta di 40 µ l/pozzetto di PBS e togliere la soluzione di lavaggio di aspirazione delicata.
6. Incorporare le cellule con l'aggiunta di 20 µ l/pozzetto di mezzo di montaggio. Incubare per ~ 1h a RT fino a quando il mezzo di montaggio ha solidificato. Conservare le piastre di microtitolazione a temperatura ambiente o a 4 ° C, al riparo dalla luce.
7. Immagine del plesso vascolare della allantois espianti sotto un microscopio a fluorescenza dotato di un × 5 o 10 × obiettivo e filtri di fluorescenza adatto.
   Nota: Immagini rappresentative del plesso vascolare CD31-positivi di un allantoide completamente diffusione sono mostrati nella Figura 3. Altri marcatori per il plesso vascolare, quali gli anticorpi diretti contro Flk-1, Flt, Tie-1 o Tie-2 può essere utilizzato come ben¹⁶.

Representative Results

Questo protocollo descrive un metodo per isolare ed explant allantoides murino ex vivoe la valutazione qualitativa dell'allantoide attaccamento di integrina α4β1, un processo critico durante in vivo chorioallantoic fusione di dettagli. I risultati rappresentativi mostrati in Figura 1A–H illustrano i passaggi successivi di isolamento allantoide a partire dall'utero incinto. Tessuti materni che circondano i corni uterini, come tessuto adiposo e vasi (Figura 1A) vengono rimossi e gli embrioni vengono sezionati dall'endometrio in modo graduale dopo apertura dello strato muscolare dell'utero (Figura 1B- E). Successivamente, vengono rimossi altri tessuti materni come il sacco vitellino parietale e il cono di ectoplacental (Figura 1E, F). Figura 1 - H indica che la tecnica comprende la dissezione della allantois extraembryonic lontano il sacco vitellino, un altro dei tessuti extraembryonic e altamente vascularized. Così, allantoides isolato secondo questo protocollo sono in gran parte privi di contaminanti tessuti materni o (extra) embrionali diversi allantois.

Nella figura 2 viene illustrato che la dimensione e la forma del allantoides da embrioni appena sezionati in una sola cucciolata può variare considerevolmente¹⁴. Allantoides di C57BL/6J wildtype embrioni sezionati a 8,5 E aveva una morfologia allungata nel 74% dei casi (45 di 61 embrioni analizzati), come mostrato in Figura 2 e Figura 1 H. Tuttavia, nel 15% (9/61) degli embrioni, il allantoides erano notevolmente più piccoli e più arrotondato (Vedi riferimento¹⁴) e l'11% (7/61) degli embrioni non aveva ancora formato un allantoide visibili al momento della dissezione. Nonostante le forme eterogenee e dimensioni al punto di partenza tempo di allantoide explant cultura (Figura 2,h-pannelli un–), allegato allantoide e piena diffusione su integrina α4β1 immobilizzato è stata osservata entro 12 h in tutte le del 54 allantoides di recente isolate sezionato dagli embrioni dei sette cucciolate. Tuttavia, le forme e dimensioni degli espianti dopo 12 h di cultura erano alquanto eterogenei (Figura 2), che riflettono le diverse morfologie allantoico presso il punto di partenza del dosaggio.

La figura 3 Mostra una macchiatura immunocytochemical per le cellule endoteliali CD31-positivi in allantoides pienamente associata dopo 24 h di cultura explant, che conferma che gli espianti avevano elaborato un plesso vascolare da questo punto di tempo, come previsto^{9 , 16}. tali culture allantoide aderente possono essere utilizzate per studiare la formazione di vasi sanguigni in vitro⁹. Quindi, gli espianti di allantoide rendimenti presentato metodologia che possono essere facilmente colta ex vivo, d'accordo con precedentemente pubblicato studi sperimentali^9,16.

Il protocollo definisce il quadro per la valutazione di base di microscopia di attaccamento allantoide in intervalli di tempo predeterminati, come dopo 12h o 24h della cultura explant. I risultati possono essere valutati in maniera qualitativa (parziale/completo allegato o diffusione completo in un punto determinato momento – sì/no). Poiché l'espianto stesso può essere visualizzato ripetutamente e segnato, questa analisi riflette che le caratteristiche dei singoli allantoide explant culture nel corso del tempo. Inoltre, la formazione di un plesso vascolare in espianti fissi e macchiati può essere valutata (Figura 3).

Figura 1: rappresentante passi nella dissezione allantoide. (A) dettaglio Mostra di un corno uterino isolato. Germogli di utero contenente gli embrioni sono contrassegnati da stelle; tessuto adiposo e vasi che circondano il corno uterino sono visti sul lato sinistro. (B) vista del decidua (l'endometrio) dopo la rimozione dello strato muscolare dell'utero. Altamente vascularized, mesometrial palo della decidua è orientato a sinistra, la parte di anti-mesometrial (contrassegnata con una stella) che contiene l'embrione è orientata a destra. Lato (C) Mostra del palo dissecata anti-mesometrial del decidua (contrassegnato con una stella). La freccia indica la posizione dell'embrione. (D) vista dall'alto del prodotto del concepimento (freccia) circondato dal sacco vitellino parietale dopo rimozione parziale della decidua circostante. (E, F) Visite rappresentante dei passaggi successivi nella dissezione dell'embrione (freccia). La punta della freccia indica il sacco vitellino. (E), il cono di ectoplacental (epc) è visibile sulla destra. (G) dissezione parziale dell'embrione (freccia) dal sacco vitellino (frecce). L'allantoide è contrassegnato con una stella rossa. (H) isolato dell'embrione (freccia) con allantoide (stella rossa). La posizione dove allantois sarà tagliato dal suo sito di inserzione basale all'estremità posteriore dell'embrione è indicata con una linea tratteggiata rossa. Immagini scattate con uno stereomicroscopio con una gamma di zoom 8:1. Tutte le barre della scala sono 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: forme eterogenee e dimensioni di allantoides. Otto allantoides (un–h) sono state isolate da embrioni di una sola cucciolata. Pannello sinistro, allantoides immediatamente dopo la dissezione (0h). Pannello di destra, la stessa allantoides dopo 12 h di cultura explant. Gli espianti sono saldamente fissati, e cellule mesenchimali hanno diffuso. Gli espianti sono cerchiati per visualizzare formati di espianto. Immagini scattate con un microscopio dotato di ottica di contrasto di fase e un 5 × (Pannello sinistro) o un obiettivo di 10 × (Pannello di destra). Tutte le barre della scala sono 500 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: formazione del plesso vascolare nelle culture explant allantoide. Allantoides sono stati sezionati ed espiantati su integrina α4β1 immobilizzato come descritto nel presente protocollo. Espianti sono state coltivate per 24 h, e le cellule endoteliali nel plesso vascolare sono state macchiate usando gli anticorpi primari anti-CD31 e fluorescente etichettato anticorpi secondari. Cellule endoteliali visualizzati in verde. L'immagine superiore mostra l'intero plesso vascolare nella zona centrale un espianto di allantoide rappresentativo. L'immagine è stata scattata un microscopio dotato di fluorescenza ottica e un obiettivo 5 ×. Barra della scala, 500 µm. I due pannelli inferiori sono più alto ingrandimento immagini di un altro espianto allantoide dissecato e coltivate nelle stesse condizioni. La nave-come le strutture e le cellule endoteliali individuali possono essere visto. Immagini scattate con un microscopio confocale; scala bar, 25 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

In presenza di siero, che è una fonte ricca di molecole pro-adesiva della matrice extracellulare quali fibronectina, allantoide espianti verranno prontamente collegato a vari in plastica, vetro o filtro superfici^9,16. Così, se lo scopo del test eseguito è quello di studiare in particolare l'effetto di una modificazione genetica o qualsiasi altro trattamento allegato allantoide per immobilizzato α4β1, è fondamentale per bloccare i siti di legame non specifico (ad es., con siero bovino albumina) dopo il rivestimento delle superfici con integrina e prima incubazione con siero contenente media.

L'allegato iniziale di allantoide espianti di integrina α4β1 immobilizzato è molto sensibile al movimento, e le piastre di coltura del tessuto dovrebbero quindi essere lasciate indisturbate per un periodo di tempo predeterminato (ad es., per 12 h) prima del gol allantoide allegato. Si noti che il tempo necessario per contatto stabile formazione con il substrato può variare a seconda del ceppo del mouse analizzati o la concentrazione di integrina α4β1 immobilizzato.

Il requisito dell'intercellulare VCAM-1/α4β1-interazione per riuscita fusione chorioallantoic è fermamente radicata^11,12,13. Inoltre, molecole della matrice extracellulare quali fibronectina, collageni e altre molecole di interesse possono essere anche immobilizzati e utilizzati come substrati "chorio-mimetico".

Corio-allantoidea allegato dipende dall'interazione intercellulare tra VCAM-1 e la sua associazione partner integrina α4β1. Nell'utero, corio-allantoidea attaccamento e la fusione successiva può avvenire solo quando l'allantoide è sufficientemente esteso per fare contatto con il corion. Data la variabilità fisiologica in misure allantoide in una fase inerente allo sviluppo particolare, corio-allantoidea allegato e fusione avvenire qualche tempo tra E 8.0 e 9.0 E (gamma, E 7,5-E 9,25)^14,16. Metodi in particolare studiare il processo transitorio di allantoide attaccamento al piatto corionico nell'utero nel topo vivente non sono facilmente disponibili a presentano. Piuttosto, analisi sono focalizzate principalmente sulla determinazione laboriosa di corio-allantoidea fusione dalla valutazione istologica di es., allantoico diffusione sulla superficie del corion e lo sviluppo dello strato labirinto in un singolo, pre-determinata tempo punto^11,12,13,16. Questa analisi di endpoint non possono discriminare tra i difetti che sono specificamente a causa di alterata attaccamento della allantois al corion ed effetti di corion-dipendente ed è limitata dalla variabilità intrinseca in fasi di sviluppo dell'embrione e allantoico dimensioni. Come discusso nella sezione Risultati rappresentante, la fisiologica variabilità nei formati allantoide può provocare un ritardo relativo in fusione chorioallantoic ~ 26% degli embrioni wildtype C57BL/6J. Statisticamente parlando, quasi due in sette topi incinta sarebbero quindi stati sacrificati troppo presto (61 embrioni da sette cucciolate, cucciolata media dimensione 8,7), che si traduce nella necessità di un sostanziale allevamento in eccesso per gli studi su larga scala. È interessante notare che, microsurgical esperimenti hanno rivelato che il corion è già competente di fondersi con l'allantoide nella fase 1 somite coppia, e che l'allantoide esibisce capacità massima fusione negli embrioni con 3-5 somite coppie¹⁴. Quindi, chorioadhesive cellule del allantois sono formate e funzionalmente competenti prima l' allegato chorioallantoic effettivo in vivo. L'analisi ex utero di attaccamento allantoide ai ligands immobilizzati, come presentato qui, è quindi relativamente indipendente di dimensioni dato allantoide. Quindi, uno dei vantaggi di questo metodo è che consente di ignorare i difetti in allungamento allantoide e si concentra sul passaggio successivo nella formazione della placenta, cioè, chorioallantois allegato. Questo approccio può quindi essere utilizzato per distinguere tra difetti di allungamento allantoide e allegato chorioallantois in mutanti genetica del topo.

In contrasto con il tradizionale metodo di aspirazione allantoide dal suo punto di attacco per l'embrione, usando una pipetta di bocca¹⁶, l'attuale protocollo utilizza un approccio di taglio manuale e allantois successivamente viene gestito utilizzando puntali di grande orifizio . Un importante vantaggio di aspirazione allantoide è che questo metodo evita la gestione diretta del tessuto. Taglio e la manipolazione allantois può danneggiare le cellule chorioadhesive nella guaina esterna del mesotelio allantoico. Tuttavia, taglio allantois con forcipe è usato con successo prima in ex vivo colture di tessuti pre-placental¹⁷, e la cinetica di espianto allantoico attaccamento e la morfologia delle culture explant descritto nella presente studio sono simili ai dati pubblicati, basati sull'isolamento allantoide di aspirazione¹⁶. Questi risultati suggeriscono che le cellule chorioadhesive sono sufficientemente ben conservate al taglio manuale della allantois, e tale differenziazione di espianto non è gravemente perturbata, come indicato dalla formazione di endoteli CD31-positivi. Diretto taglio della allantois inoltre offre la possibilità di sezionare solo due terzi superiori della allantois che esprimono VCAM-1¹³, e garantisce minore contaminazione con cellule sacco vitellino, che potrebbe essere necessario essere tagliati dalla base della allantoide Dopo Allantoide aspirazione¹⁸.

L'analisi ex utero di espianto allantoico adesione alla immobilizzato, integrina α4β1 ricombinante fornisce una lettura qualitativa di un passo importante, prima che è necessario per fusione corio-allantoidea, cioè, l'interazione intercellulare tra VCAM-1 espresso il allantois e integrina α4β1 localizzato il mesotelio corionico, che è derivato da mesoderm extraembryonic. Tuttavia, anche se queste molecole di due adesione sono riconosciute come i giocatori di principio in fusione corio-allantoidea, ~ 50% degli embrioni con mutazioni omozigoti KO in VCAM-1 o α4 delle integrine subiscono chorioallantoic fusione nel vivo^{11 ,12,13}. A causa di questo penetranza incompleta, il metodo ex vivo descritto nel presente protocollo non può essere sufficiente per escludere un requisito per queste molecole di due adesione in modelli genetici con un guasto di fusione corio-allantoidea.

In condizioni fisiologiche, le integrine α4β1 sono incorporate nella membrana plasmatica di trofoblasto corionica e sono incorporate in un'intricata rete di proteine strutturali e segnalazione che cooperano per regolare adesione cellula-cellula (e cellula-matrice) ¹⁹. come con la maggior parte riduzionista in vitro approcci, la complessità dell'interfaccia associazione VCAM-1 corionica è modellata solo in misura molto limitata di integrina α4β1 immobilizzato. Oltre alla mancanza di potenziale di altri importanti contributi strutturali o segnalazione derivato dal chorion intatta in questo sistema, è probabile che solo una frazione delle integrine che sono immobilizzate su una superficie rigida, bidimensionale sono presenti nell'attivo, conformazione associazione competente, "open".

Il metodo proposto si approssima l'attaccamento precoce e diffondendo il passaggio della allantois al corion e può anche relazione sullo sviluppo del plesso vascolare allantoico quando combinato con l'analisi di nave formazione⁹. Tuttavia, l'attuale approccio non modella l'invasione di chorion di germogliatura angiogenesi mediata dalle cellule endoteliali allantoico, né riflette morfogenesi di ramificazione di corion, che è un processo essenziale per fusione corio-allantoidea e lo sviluppo successivo del labirinto placentare¹⁰.

Con contrasto di fase o microscopia di interferenza differenziale abbinato (semi-) automatica analisi dell'immagine, il metodo proposto potrebbe essere applicato nelle schermate su larga scala per l'analisi iniziale di ritardata o mancata allantoico allegato in vitro. Oltre all'analisi di mutanti del topo, il metodo potrebbe essere di interesse per gli effetti di farmaci, agenti patogeni, metaboliti o agenti ambientali su allantoico allegato a schermo.

In numerosi mutanti del topo, corio-allantoidea allegato non riesce a verificarsi, sebbene l'allantoide e il corion sembrano sono sviluppati normalmente. Inoltre, mutanti che mostrano difetti chorioallantoic allegato in genere visualizzare penetranza incompleta^1,2,10. Sarà importante indagare se questi geni funzionalmente apparentemente molto diversi impatto delle vie molecolari comuni e/o processi cellulari. Formazione immagine dal vivo degli espianti allantoide derivati da mutanti del topo ha il potenziale di tali meccanismi. Ad esempio, le cellule nella guaina esterna del allantois dissecata potrebbero essere etichettate con coloranti fluorescenti vitali (ad esempio di DiI o DiO lipofilico carbocyanine traccianti^16,18) all'immagine adesione e diffusione di eventi, o per tenere traccia delle cellule migrazione in tempo reale. Inoltre, reporter fluorescenti che visualizzare le proteine del citoscheletro o adesione può risultare per essere informativo.

Recentemente, è stato descritto un sistema di co-coltura ex vivo per pre-attaccamento murino allantoides e chorions, e questo approccio è stato usato con successo per studiare gli eventi che si verificano dopo chorioallantoic allegato, come strato labirinto formazione¹⁷. L'analisi dell'efficienza allegato allantoide su immobilizzato chorions isolato da vari (ad es., organismi geneticamente modificati) modelli di mouse possono produrre nuove comprensioni i giocatori molecolari e le vie che governano i primi passi nello sviluppo della murino placenta.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J wildtype mice	The Jackson Laboratory	Stock No: 000664
70 % (v/v) Ethanol	VWR International	930031006
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	Forceps used to open the abdominal cavity.
Micro dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11	Straight blades.
Spring scissors	Fine Science Tools	15012-12	Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.
Microspoon	Carl Roth	AT18.1	5 mm Spoon diameter.
Microtiter plates	ibidi	81501	We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-α4β1-mediated binding to plastic.
10 cm dish	Nunc	150350	Sterile tissue culture dishes.
3.5 cm dish	Nunc	150288	Sterile tissue culture dishes.
Large orifice pipette tips	Biozym	VT0140X	Low binding pipette tips, 200 µL.
α4β1 integrin	R&D Systems	6054-A4	Murine α4β1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537	Without Ca2+ and Mg2+.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-03600	The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately.
Penicillin/Streptomycin	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
L-Glutamine	PAN Biotech	P04-80100	100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
Fetal bovine serum	Biochrom	S 0115	We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement).
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7030	We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C.
para-Formaldehyde	Carl Roth	0335.2	To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks.
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023	To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.
α-CD31 Antibodies	BD Biosciences	550274	Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.
Secondary goat anti-rat antibodies	Thermo Fisher	A-11006	Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381	Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000
Labovert	Leitz	Labovert	Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.
M80	Leica Microsystems	M80	Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.
DM4000B	Leica Microsystems	DM4000B	Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.
Digital camera	JVC	KY-F75U	3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	SP5	Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.