Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

В сочетании с методами масс-спектрометрии для анализа тканей протеома человека Аденома гипофиза двумерного гель-электрофорез

Published: April 2, 2018 doi: 10.3791/56739
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4The State Key Laboratory of Medical Genetics, Central South University

Summary

Здесь мы представляем двумерного гель-электрофорез (2DE) в сочетании с масс-спектрометрия (МС) для разделения и идентификации ткани протеома человека Аденома гипофиза, который представляет шаблон хороший и воспроизводимые 2DE. Многие белки наблюдаются в каждом месте 2DE при анализе протеома комплекс рака с использованием MS высок чувствительности.

Abstract

Аденома гипофиза человека (ПА) является распространенной опухоли, что происходит в человеческого гипофиза в системах ось гипоталамус гипофиз ориентированных орган и могут быть классифицированы как клинически функциональных или нефункциональным ПА (FPA и NFPA). NFPA трудно для ранней стадии диагностики и терапии благодаря едва подъемные гормонов в крови, по сравнению с FPA. Нашей долгосрочной целью является использование методов протеомики для обнаружения надежных биомаркеров для уточнения ПА молекулярных механизмов и признание эффективного диагностические, прогностические маркеры и терапевтических целей. Эффективное двумерного гель-электрофорез (2DE) в сочетании с масс-спектрометрия (МС) методы были представлены здесь для анализа человеческого протеомов ПА, включая подготовку образцов, 2D электрофорез, белок визуализации, анализа изображений, в гель Пищеварение трипсина, пептид массового отпечатков пальцев (PMF) и тандем массы спектрометрия (МС/МС). 2-мерной гель электрофореза при содействии матрицы лазерной десорбции/ионизации масс-спектрометрия PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI MS/MS и 2DE-жидкостная хроматография (LC) МС/МС процедуры успешно применялись в анализе NFPA протеома. С использованием высокой чувствительности масс-спектрометр многие белки были определены с помощью метода 2DE-LC-MS/MS в каждом 2D гель пятно в анализе сложных ПА ткани для максимального охвата человеческого ПА протеома.

Introduction

ПА является распространенной опухолью, которая происходит в человеческого гипофиза в системах ось гипоталамус гипофиз ориентированных органа, которые играют важную роль в эндокринной системы человека. PA включает в себя клинические функциональные и нефункциональные PAs (FPA и NFPA)1,2. NFPA затруднено в ранней стадии диагностики и терапии из-за уровня только слегка повышенной гормонов (например, ЛГ и ФСГ) в крови, по сравнению с FPA, который значительно возрос уровень соответствующих гормонов в крови3,4 ,5. Уточнение молекулярных механизмов и открытие эффективных биомаркеров имеет важное клиническое значение в диагностике, терапии и прогноз NFPA. Наша долгосрочная цель заключается в том, чтобы развивать и использовать proteomic методы для изучения NFPA для открытия надежной биомаркеров для уточнения его молекулярные механизмы и признать эффективных терапевтических целей, а также диагностических и прогностических маркеров. 2-де, в сочетании с MS методы широко используются в нашей долгосрочной программы исследований относительно человека ПА протеома1,2,6,7, включая создание протеома ссылки карты в3,8, анализ дифференциально выраженным белком профили9,10,11,12,13, гормон варианты14 ,15, столб-поступательные изменения таких фосфорилирования тирозина и14 азотирования16,17,18, протеомических вариации инвазивных относительно Неинвазивный NFPAs19и протеомных неоднородность NFPA подтипы13, которое привело к открытию нескольких важных путь сетей (митохондриальной дисфункции, регуляции клеточного цикла, оксидативный стресс и MAPK сигнализации системы аномалии), изменяются в NFPA13,19,20.

2DE отделяет протеины согласно их Изоэлектрическая точка (Пи) (изоэлектрическая упором, МЭФ) и молекулярный вес (через натрия Додециловый сульфат электрофореза геля полиакриламида, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. это разделение общего и классической техники в области протеомики, с момента введения концепции протеома и протеомики в 1995 году24. МС является метод решающее значение для выяснения личности отделен 2DE белков, включая стратегии PMF и МС/МС. Очень быстрое развитие инструментов MS, особенно в аспектах чувствительность обнаружения и разрешения, в сочетании с улучшением системы LC, значительно улучшает личность низкий или очень низкий изобилие белков в протеома максимизировать освещение протеома. Она также побуждает наши традиционные концепции, что только один или два белки присутствуют в 2D гель пятно в анализе сложных человеческих тканей протеома и предоставляет возможность выявить несколько белков в 2D гель пятно в анализе сложных человеческих тканей протеома и увеличить охват NFPA протеома.

Здесь мы описываем подробные протоколы 2DE-MALDI MS PMF, 2DE-MALDI MS/MS и 2DE-LC-MS/MS, которые успешно использовались в анализе человека NFPA протеома. Протоколы включают в себя подготовку образцов, первый аспект (изоэлектрическая упором, ВФВ), второе измерение (SDS-PAGE), Визуализация белков (Серебряные пятная и Окрашивание Кумасси синий), изображение анализ 2D геля, Пищеварение трипсина в гель, Очистка tryptic пептидов, PMF, МС/МС и прижигание3,8,,2526базы данных. Кроме того для анализа других тканей человека протеомов легко переводит этот протокол.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Настоящий Протокол следует принципам в Xiangya больнице медицинской этики Комитет Центральный Южный университет, Китая. Головы шапка и перчатки должны носить весь экспериментальной процедуры, чтобы избежать загрязнения кератина от кожи и волос8.

1. подготовка проб

  1. Соберите ПА тканей (0,2 - 0,5 мг) от нейрохирургическое отделение. Сразу же замораживание в жидком азоте и затем передать-80 ° C для хранения.
  2. Добавить 2 мл 0,9% NaCl в дистиллированной деионизированной воды (ddH2O). Это решение используйте слегка помыть кровь от поверхности ткани (3 x).
    Примечание: на протяжении всего протокола используется ddH2O с проводимостью 18.2 MΩ/см. Некоторые из tissuemight быть потеряны, когда смыть кровь от поверхности ткани.
  3. Добавление тома (10 mL; 4 ° C) раствора, содержащего 2 M уксусной кислоты и 0,1% (v/v) β-меркаптоэтанол за каждые 0,5 - 0,6 г ткани, однородный (1 мин, 13000 об/мин, 4 ° C, 10 x) с ткани гомогенизатор, sonicate Гомогенат трутневых 20 s, lyophilize и хранить в −80 ° C.
  4. Измерить содержание белка лиофилизированные, гомогенизированных образцов с помощью bicinchoninic кислоты (BCA) пробирного комплект.
    Примечание: BCA количественная оценка не является абсолютным количественной оценки, и измеренные результат будет изменена с различных техник и экспериментальной агента. Стандартный образец фиксированной концентрации должны использоваться для различных экспериментов. Таким образом будет определяться окончательной загрузки количество белков для каждого 2D гель с изображением хорошо резолюции серебро окрашенных или Кумасси окрашенных в pre-конструированные экспериментов.
    1. Добавьте около 300 мкг лиофилизированные гомогенизированные образца для одного тома (282 мкл) извлечения белков буфера (8 M мочевины и главы 4%), затем стоя за 2 ч, sonicating в ванне с водой на 5 мин, вращающихся за 1 ч, снова sonicating на водяной бане 5 мин , снова вращается за 1 ч и центрифугирование в 15000 x g 20 мин.
    2. Подготовить BSA стандартных растворов с концентрациями как упомянуто: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1500, 2000 мкг/мл с коммерческим стандартом BSA (2 мг/мл).
    3. Mix BCA реагент A и B (: b = 50: 1) как BCA рабочий раствор до использовать.
    4. Добавьте 0,1 мл образца или стандартные решения в 2 мл BCA рабочего раствора в отцентрифугировать трубку, после смешивания и затем инкубации при 37 ° C за 30 мин. Окончательно охладить при комнатной температуре в течение 10 минут и измерить A562 Нм O.D. значение.
    5. Расчет стандартной линейной линии (A562 Нм против концентрации BSA) для получения регрессионное уравнение для расчета образца белка контента со значением562nm .
  5. Используйте 150 мкг белка эквивалент лиофилизированные образца для окрашивания серебра, или 500 мкг белка для Кумасси, окрашивание, для градиента полосы рН (IPG) 18 см иммобилизованных рН 3-10 нелинейных (NL).
    Примечание: IPG сухого газа — 0,5 мм толщиной и 3 мм шириной, с разной длины, включая 7, 11, 13, 18, 24 см и диапазоны различных рН, включая pH 4-5, 4-7, 6-9 и 3-10 в градиент линейными или нелинейными рН. Используемый буфер IPG должны соответствовать газа27,28.
  6. 1.6.Add 250 мкл извлечения буфер (мочевина 7 М, 2 М тиомочевины, главы 4% (w/v), 100 мм DTT (добавить до использования), 0,5% v/v pharmalyte (добавить до использования) и след бромфеноловый синий).
  7. Держите решение ниже 30 ° C, следуют vortexing за 5 мин, sonicating на 5 мин и вращающихся на 50 мин.
  8. 110 мкл буфера регидратации (мочевина 7 М, 2 М тиомочевины, главы 4% (w/v), 60 мм DTT (добавить до использования), 0,5% v/v IPG буфера (добавить до использования) и след бромфеноловый синий). Sonicate за 5 мин. Затем поверните образца 50 мин, вихрь на 5 мин и центрифуги для 20 мин на 15000 x g.
  9. Соберите супернатант (350 мкл) как белка образец решения8.

2. двумерного гель-электрофорез

  1. МЭФ (первый аспект): выполнить МЭФ на изоэлектрической система фокусировки, как описано ниже.
    1. 350 мкл пример решения белка, в слот стрипов IPG 18 см.
    2. Положить 18 см IPG газа гель сторона вниз на решение примера белка (избежать пузырей).
    3. Добавьте 3-4 мл минерального масла для покрытия полосы IPG.
    4. Соберите IPG стрипов изоэлектрической фокусировки системы заостренным концом на пластины обратно (+) и квадратный конец на табличке спереди (−).
    5. Увлажняет всю ночь (~ 18 ч при комнатной температуре).
    6. Установите параметры МЭФ: максимальный ток 30 МКА на полосы, 20 ° C; 250 В, ч. 1, 125 Vh, шаг и удерживайте; 1000 V, 1 ч, 500 Vh, градиент; 8000 V, 1 ч, 4000 Vh, градиент; 8000 V, 4 h, 32000 Vh, шаг и удерживайте; и 500 V, 0,5 ч, 250 Vh, шаг и удерживайте. Дайте ему поработать общее время 7,5 h и 36,875 Vh.
    7. После МЭФ вывезти каждый IPG газа и удаление дополнительных минеральное масло с неразрешимой бумажным полотенцем. Теперь оберните полосу в лист полиэтиленовой пленкой и хранить в −80 ° C.
      Примечание: IPGstrip держатель должен чиститься с держателем IPGstrip моющего раствора и дистиллированной воды.
  2. SDS-PAGE (второй аспект): выполняют SDS-PAGE в вертикальной системы электрофореза ячейки
    Примечание: Каждый размер геля SDS-страницы должны быть 255 x 190 x 1 мм.
    1. Использование нескольких гель заклинателя бросить 12% страницы разрешения гели. Для литья 12% гели страницы, выполните следующие действия.
      1. Добавьте 270 мл ddH2O, 150 мл 1,5 М трис-HCl (рН 8,8), 180 мл 40% (w/v) раствор акриламида/bisacrylamide (29: 1, 40% w/v акриламида и 1,38% w/v N, N'-methylenebisacrylamide), 3 мл Персульфат аммония 10%, а 150 мкл TEMED сделать гель решение в стакан. Осторожно перемешать и избежать пузырей.
      2. Залейте раствор геля мягко в многоадресной камеры до ожидаемого гель высоты (19 см).
      3. Сразу же добавьте около 3 мл ddH2O на каждом разрешая гель для покрытия гели. Пусть гель полимеризоваться около 1 часа.
    2. Подготовка 20 Л буфер электрофореза (25 мм трис, 192 мм глицерин и 0.1% SDS). Заполните бак буфера блока разделения электрофорез с этот буфер.
    3. Вынуть целенаправленного IPG полоски из морозильника и сбалансировать полоски для 10 мин, тряся мягко в 4 мл сокращения равновесия буфера (375 мм трис-HCl (рН 8,8), 6 M мочевины, 2% (w/v) SDS, глицерина 20% (v/v), 2% w/v DTT (добавить до использования) и след бромфеноловый синий).
    4. Сбалансировать за 10 мин, осторожно тряся уменьшение полосы IPG в 4 мл алкилирования равновесия буфера (375 мм трис-HCl (рН 8,8), 6 M мочевины, 2% (w/v) SDS, глицерина 20% (v/v), 2,5% w/v iodoacetamide (добавить до использования) и след бромфеноловый синий).
    5. Во время гель равновесия разбирать многоадресной камеры и вывезти подготовленный разрешая гель кассеты. Промойте 3 x с ddH2O. удалить избыток ddH2O нерастворимых бумажным полотенцем и положить в Стандер гель.
    6. Промойте уравновешенной IPG полоски с буфер электрофореза и удалите избыток жидкости на поверхности полосы IPG нерастворимых бумажным полотенцем.
    7. Положите IPG газа на разрешая гель SDS-PAGE и пусть IPG газа пластиковые боковой контакт больше стеклянную пластину и заостренным концом налево.
    8. Залить 3-4 мл горячего агарозы 1% в буфер электрофореза SDS (~ 80 ° C) быстро, чтобы запечатать IPG газа на вершине каждого геля SDS-PAGE и положил на топ сторону IPG полосы вниз верхней части короче стеклянную пластину без пузырей и затем полимеризоваться за 10 мин.
    9. Вставьте кассету собрал гель вертикально между пластиковые прокладки в системе вертикального электрофореза. Поместите в верхней части гель с IPG полосы рядом с катода (−).
    10. Отрегулируйте уровень буфера электрофореза погрузиться гель кассеты.
    11. Подключите и установите блок питания/управления в режиме постоянного напряжения и запустить в 200 V около 370 мин при мониторинге красителя.
    12. После запуска, вынуть кассету гель от системы электрофореза и осторожно удалить гель из геля кассеты, избегая разрывая гель, после окрашивания разделенных 2DE белков.
  3. Окрашивание 2DE-отделенный белков
    1. Серебряный пятнать
      1. Аккуратно перенести гель с двумя руками в трее, содержащий 250 мл раствора фиксации (50% метанола (v/v) и уксусная кислота 5% (v/v)) и осторожно встряхивайте гель для 20 мин.
      2. Отменить решение и добавить 250 мл 50% (v/v) метанола в трее и осторожно встряхните 10 мин.
      3. Отменить метанола и добавить 250 мл ddH2O в трее. Встряхните мягко в течение 10 мин.
      4. Осторожно встряхнуть лари за 1 мин в 250 мл сенсибилизации буфер, содержащий тиосульфата натрия 0,02% (w/v) и отказаться от жидкости.
      5. Осторожно встряхните геля в 250 мл ddH2O 1 мин (повторить еще раз). Утилизируйте жидкость после каждого шага.
      6. Осторожно встряхните гель для 20 мин в 250 мл Серебряный реакции раствора (0,1% (w/v) нитрат серебра с 200 мкл формальдегида 37% (v/v) добавлены перед использованием).
      7. Осторожно встряхните геля в 250 мл ddH2O 1 мин (повторить еще раз). Утилизируйте жидкость после каждого шага.
      8. Трясти геля мягко в 250 мл раствора развития (3% (w/v) карбонат натрия с 100 мкл 37% (v/v) формальдегида добавлены до использования) до получения желаемой интенсивности окрашивания (обычно 1-3 мин), затем отменить жидкости.
      9. Осторожно встряхнуть гель для 10 мин в 250 мл, останавливая решения (5% (v/v) уксусная кислота) и отказаться от жидкости.
      10. Осторожно встряхнуть за 5 мин в 250 мл ddH2O и отбросить жидкости.
      11. Держите гель 250 мл, хранение решение 8,8% глицерина при 4 ° C.
    2. Блестящий синий Окрашивание Кумасси
      1. Подготовить Кумасси, окрашивание раствора путем растворения Кумасси блестящий синий G250 0,3 г, аммония сульфат 25 g и фосфорной кислоты 25 мл в ddH2O и до общего объема 200 мл. Перед использованием, добавить метанола 50 мл.
      2. Добавить 250 мл Кумасси, окрашивание решения гелем и осторожно встряхивайте при комнатной температуре до ясно появляются пятна протеина (~ 2-4 ч). Слейте жидкость.
      3. Добавьте 250 мл ddH2O и поколебать медленно в течение 5 мин, затем два раза больше. Слейте жидкость.
      4. Добавьте 250 мл Открашивающий раствора (20% (v/v) этанола) и поколебать медленно до тех пор, пока фоновый цвет становится почти бесцветная и отбросить жидкости.
      5. Заменить свежим destaining раствором, когда старый один становится темно и отбросить жидкости.
      6. Добавьте 250 мл ddH2O и поколебать медленно в течение 5 минут удалить жидкость.
      7. Добавить 250 мл хранения раствора (8,8% глицерина) и хранить при 4 ° C.
  4. Анализ изображений электрофорез двумерного гель
    1. Оцифровывать витражные гели с планшетный сканер.
    2. Входного изображения в 2D гель системы анализа изображений.
    3. Выявлению и количественной оценке каждое пятно с помощью программного обеспечения анализа изображений 2D гель согласно протоколу производителя.
    4. Матч пятна между различными гели.

3. Определение разделенных 2DE белков с MS

  1. Подготовка смеси tryptic пептид
    Примечание: Силиконизированный или низкий удержание труб и наконечники должны использоваться во избежание любой потери белков и пептидов.
    1. Серебро гель минигелей
      1. Акцизный гель пятна в 1,5 мл силиконизированный трубки и мыть в 500 мкл ddH2O 6 раз.
      2. Промывают гель в новой 1,5 мл силиконизированный трубки и фарш на многие мелкие кусочки (0.5-1 мм3).
      3. Отмойте гель куски в 20 мкл destaining решение, которое смешивает частью 30 мм калия Гексацианоферрат и частью 100 мм тиосульфата натрия (1:1) перед использованием позволить коричневатого цвета исчезают (обычно 1-2 мин). Слейте жидкость.
      4. Промойте гель части с 20 мкл ddH2O 5 - 6 раз позволить желтого цвета исчезают. Утилизируйте жидкость после каждого шага.
      5. 20 мкл бикарбонат аммония 200 мм на куски гель и остаться на 20 мин мыть части геля ddH2O (20 мкл, 1 раз). Слейте жидкость.
      6. По крайней мере дважды обезвоживает гель штук с 30 мкл Ацетонитрил позволить гель куски превратить непрозрачный белый и вакуум центрифуга сухой за 30 мин.
    2. Кумасси блестящий синий гель минигелей
      1. Вырезать пятна геля в 1,5 мл силиконизированный трубку и мыть с 500 мкл ddH2O по крайней мере 3 раза.
      2. Вставьте новый 1,5-мл силицированного промывают гель и рубить его на несколько частей (0.5-1 мм3) с кончиком пипетки.
      3. Отмойте гель в 50-100 мкл минигелей раствор (1:1 v/v микс 200 мм NH4HCO3 с ацетонитриле) в зависимости от объема геля, инкубации при 37 ° C на водяной бане. Повторить и добавить свежий раствор минигелей, до тех пор, пока цвет исчезает (~ 1 ч). Утилизируйте жидкость после каждого шага.
      4. Промойте гель части раз с 20 мкл ddH2O.
      5. Обезвоживает гель штук в 100 мкл Ацетонитрил (по крайней мере дважды), чтобы куски гель белеет непрозрачного.
      6. Пылесос сухой для 30 мин.
    3. Пищеварение трипсина в гель белков в кусочки сушеных гель
      1. Растворяют 20 мкг (833 пмоль) порошка лиофилизированных трипсина в 100 мкл 50 мм уксусной кислоты.
      2. 20 мкл раствора трипсина (200 нг/мкл) разбавляют до 16 нг/мкл с 230 мкл бикарбонат аммония 50 мм.
      3. 20-30 мкл (0,32 0,48 мкг) решения разреженных трипсина в каждую пробирку, содержащих кусочки сушеных гель. Проинкубируйте 18-20 ч при 37 ° C в водяной бане. Пусть решение стоять на 4 ° С 30 мин.
      4. Центрифуга решение аккуратно для 10 s. Sonicate в ванне с водой для 5-6 минут при 30 ° C и затем центрифуги на 12000 x g на 2 мин.
      5. Соберите супернатанта, содержащие смесь tryptic пептида в 0,5 мл силицированного трубку.
    4. Очистка tryptic пептид смеси с C18 microcolumn.
      1. Мыть каждый столбец C18, Ацетонитрил (10 мкл, 5 раз), а затем с 50% Ацетонитрил (10 мкл, 5 раз).
      2. Сбалансировать с 0,1% трифтор уксусной кислоты (ТФК) (10 мкл, 5 раз).
      3. Пипетка образец вверх и вниз через подготовленный C18 колонку для 15 раз.
      4. Вымойте образца 2 x с 0.1% 10 мкл TFA.
        Примечание: Очищенный tryptic пептидов, сохраняются в столбце C18.
      5. Добавление тома (6 мкл) раствора (85% v/v acetonitrile/0.1% v/v муравьиной кислоты) в трубу силицированного чистой 0,5 мл, Пипетка это решение осторожно и медленно вверх и вниз через пептид C18 Бусины для 10 x мыть Бонд пептидов в раствор, воздушно-сухой и хранилище (−20 ° C) для анализа MS.
  2. Анализ MS
    1. Анализ MALDI MS PMF
      1. 4 мкл 85% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA растворить смесь очищенный tryptic пептид. Нагрузки 2 мкл растворяют tryptic пептид смесь на тарелку MALDI и сразу 2 мкл раствора а-циано-4-Гидроксикоричная кислота (CHCA), который содержит 10 г/Л в ацетонитриле 500 мл/Л 1 мл/Л TFA, затем просушите.
      2. Загрузите MALDI пластины с tryptic пептид смесь в масс-спектрометр MALDI MS.
        Примечание: Задаются параметры инструмента в режиме отражателя с 20 кв, ускорения напряжения, положительной полярности и 160 ns задержку добычи. Каждый МС спектра приобретается с 200 выстрелов лазер с спектр m/z 1000 до 4000 после внешней калибровки с стандартным пептид массы.
      3. Используйте программное обеспечение MS спектра обработки для обработки каждой МС спектра, включая коррекция базовой линии, удаление шума (5%) и пик deisotoping.
      4. Исправьте массовые список из каждого МС спектра с удаления загрязняющих масс от трипсина, матрица, кератины и другие неизвестные загрязнители параллельно бланк гель экспериментов.
      5. Вход, исправлена масса список Некодирующие PMF-основе Поиск программного обеспечения для идентификации белков в базе данных Swiss-Prot белка с параметрами поиска, включая PMF тип поиска, человека, трипсина с 1 максимальная пропустил расщепления, фиксированный carbamidomethyl цистеина, переменная метионина окисление, monoisotopic, пептид массового терпимости 50 ppm, пептид заряд государство (1 +) и сигнал к шуму (S/N) 5.0.
      6. Идентифицировать белки с белка статистически значимые результаты, и где белка оценка =-10 × log(p), где p — вероятность того, что наблюдаемое матч случайное событие.
    2. Анализ MALDI-MS/MS
      1. 4 мкл 50% v/v acetonitrile/0.1% v/v TFA растворить смесь очищенный tryptic пептид. Каждый очищенный tryptic пептид смесь (0.5 мкл) заметили на 384-ну MALDI-плита, сразу заметили 0.5 мкл насыщенных CHCA матрицы в 50% acetonitrile/0.1% TFA на вершине пептида образца и затем высушить на воздухе.
      2. Пусть MALDI-TOF-TOF MS/MS управляться автоматически, с использованием 100 выстрелов лазер для приобретения одной MS1 спектра, и накапливая 6 повторил MS1 спектры в один синтетический MS1 спектра.
      3. Установите 4 наиболее интенсивным прекурсоров ионов от каждого синтетических MS1 спектра для анализа МС/МС. Использование 100 лазерный кадры для каждого прекурсора Ион приобрести один МС/МС спектра, и накапливать 4 повторяются МС/МС спектры в один синтетический МС/МС спектра.
      4. Использование синтетических данных MS/MS для поиска белков через MS/MS-основе белка Поиск программного обеспечения с параметрами, включая MS/MS Ион Поиск, человека базы данных Swiss-Prot, трипсина с максимум 1 пропущенных расщепления, фиксированной carbamidomethyl (C), переменная Окисление (М), monoisotopic значения массы, пептид массового допуск ± 100 ppm и фрагмент массового допуск ± 0,7 да.
      5. Определение белка с вероятностью статистически на основе показателя Mowse и ионы оценка = -10 x Log(P), где p — вероятность того, что наблюдаемое матч случайное событие.
    3. Анализ LC-ЭСИ-MS/MS
      1. 6 мкл 5% v/v acetonitrile/0.1% v/v муравьиной кислоты растворить смесь очищенный tryptic пептид.
      2. Использование высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) системы в сочетании с электроспрей ионизации (ESI) онлайн-MS/MS Масса спектрометра с МС/МС приобретенных данных управления программным обеспечением для управления всей операции.
      3. Используйте C18 ловушку столбец (300 мкм и.д. × 5 мм длиной) и реверс фаза C18 столбец (75 мкм и.д. x 15 см длины) с градиентом разделения на 98% растворителя (0,1% муравьиной кислоты) и 2% растворителем B (0,1% муравьиной кислоты в 100% ацетонитриле) 2 мин , 2% до 40% растворителем B за 45 мин, 40% до 95% растворителем B на 5 мин и 95% растворителем B 10 мин (в общей сложности 65 мин 300 нл/мин).
      4. Установите положительный ион режим и режим данных зависимых автоматический опрос для приобретения МС и МС/МС спектры и столкновения индуцированной диссоциации (ДУР) для фрагментации ионов.
      5. Значение каждого сканирования MS массовых спектр m/z 350-1800 с разрешением 100 000 на m/z 400. Выполните проверку для 7 наиболее интенсивным ионов в MS сканирования.
      6. На основе использования MS/MS белка Поиск программного обеспечения я для поиска в базе данных для идентификации белков.
        1. Выберите базу данных, человеческий белок.
        2. Выберите трипсина с одним пропустили расщепления сайта допускается.
        3. Задать допуск пептида (±10 ppm), фрагмент Ион терпимости (±0.8 Da), carbamidomethylation пептид заряда (2 +, 3 + и 4 +), фиксированный на цистеина и переменная окисления в метионин.
        4. Набор ложных обнаружения ставок (ФДР) < 1% и только пептиды с ранга 1 принимаются.
        5. Определение белка с PSM≥1 (PSMs: общее количество выявленных пептид последовательностей (PSMs) для белков, в том числе резервно определены) и по крайней мере два уникальных пептидов на белок.
      7. Кроме того используйте MS/MS-белка поиска программного обеспечения на основе II для поиска в базе данных для идентификации белков.
        1. Конвертировать raw файл MS в файл .mgf.
        2. Выбран человеческий белок базы данных (uniprothuman_20161031.fasta, который содержит последовательности 70940 и 23897047 остатков).
        3. Выберите Пищеварение трипсина с максимум 2 пропущенных разобщенности.
        4. Набор carbamidomethyl (C), переменной deamidated (NQ) и окисления (M), прекурсор Ион массового терпимости 10 ppm, дочь ионной массы терпимости 0,8 Да и пик monoisotopic.
        5. Идентифицировать белки с пороговое значение 0,05 и по крайней мере 2 уникальных пептидов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1. 2DE-MALDI MS PMF: с экспериментальной процедурой, описанной выше, в общей сложности 150 мкг белка были извлечены из ФСГ выразил NFPA тканей (женщина, 50 лет, АКТГ (-), GH (-), ПРЛ (-), LH (-), ФСГ (+) и ТТГ (-)) и выстроились с 18 см IPG полосы (рН 3-10 NL) и геля SDS-PAGE большого формата, затем визуализируется с Серебряный пятнать. Мы получили воспроизводимость и хорошо 2DE гель шаблон NFPA протеома ткани (рис. 1), с среднего позиционные отклонения, 1,98 ± 0,75 мм в направлении МЭФ и 1.62 ± 0,68 мм в направлении SDS-PAGE и с пятнами примерно 1200 белка обнаружен в карте гель 2DE, которые распространялись в основном в пределах области рН 4-8 и массы 15-150 кДа3. В общей сложности 337 гель пятна были подакцизным и подвергается гель минигелей, Пищеварение трипсина, очистка tryptic пептидов, MALDI-TOF-MS PMF анализ и. PMF данных был использован для идентификации белков с талисман поиска в базе данных человеческий белок. В общей сложности 192 избыточных белков (представляющие 107 неизбыточной белков) были определены из 141 пятна геля из 337 анализируемого гель пятна (141/337 = 42%), и не белка была выявлена в 196 пятна (196/337 = 58%) (Таблица 1). Для этих 141 пятна, только одна белка на месте была выявлена в 121 пятна, 2 белков на месте были определены в 12 точках (пятна, 31, 32, 33, 41, 42, 43, 44, 68, 75, 137, 148 и 224), 5 белков на месте были определены в 3 точках (пятна 19 22 и 23), 6 белков на месте были определены в 3 точках (пятна 24, 91 и 93), и 7 белков на месте были определены в 2 места (мест 72 и 92).

2. 2DE-MALDI MS/MS и 2DE-LC-MS/MS: с использованием экспериментальной процедуры, описанной выше, в общей сложности 500 мкг белка, извлеченные из инвазивные NFPA ткани (мужчина, 22 года, АКТГ (-), гормон роста (-), ПРЛ (++), LH (-) и ФСГ (-)) одевался с IPG (18 см) газа рН 3-10 NL) и гель SDS-страницы большого формата, затем визуализируется с Окрашивание Кумасси синий G250. Это окрашивание принесли воспроизводимость и высокое качество 2DE гель шаблон инвазивных протеома NFPA ткани (рис. 2), с средняя позиционное отклонение ± 1,95 0,85 мм в направлении МЭФ и 1,85 ± 0,79 мм в направлении SDS-PAGE и с приблизительно spotsdetected 1100 белка на карте гель 2DE, которые распространялись в основном в пределах рН 4-8 и масса 15-150 кДа29. 10 точек случайно выбранных и обозначены на рисунке 2 были подакцизным и подвергается гель минигелей, Пищеварение трипсина, очистки tryptic пептидов, следуют MALDI-МС/МС и LC-ЭСИ-MS/MS анализов. Каждый набор данных МС/МС был использован для идентификации белков с талисман поиска в базе данных человеческий белок. Для всех мест, в среднем 1 белка на месте была определена с анализом MALDI-TOF-TOF MS/MS, тогда как многие белки (в среднем 63 белков в одно пятно гель, в среднем 71 белков в пул 2 подходящих мест и в среднем 118 белков в пул 3 матча Hed пятна геля) в каждой соответствующей месте были определены с анализом LC-ЭСИ-MS/MS (Таблица 2). Здесь необходимо упомянуть, что системы LC-ЭСИ-MS/MS имеет намного выше чувствительность и резолюции относительно системы анализа MALDI-MS/MS. Эти данные ясно показывает, что каждый 2D пятно гель содержит много белков, белки не только один или два в сложных человеческих раковых тканей протеома.

Figure 1
Рисунок 1 : Серебро витражи шаблон 2-де протеома ФСГ выразил NFPA, проанализированы с IPGstrip рН 3 - 10 NL и 12% концентрацию геля SDS-PAGE. Красно коричневые пятна являются белки серебро витражи, оранжевый фон серебро окрашенных геля. Приклеенные этикетку пятна были проанализированы с PMF MALDI-TOF-MS. Воспроизводится от Wang X, и др. (2015) 3, с разрешения от Wiley-VCH. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Кумасси синим витражи шаблон 2-де протеома NFPA, проанализированы с IPGstrip рН 3 - 10 NL и 12% концентрацию геля SDS-PAGE. Приклеенные этикетку пятна были проанализированы с MALDI-TOF-TOF MS/MS и LC-ЭСИ-MS/MS. Пятна 1 *, 2 *, 3 *, 5 * и 16 * были сопоставлены в соответствующих точках 1, 2, 3, 5 и 16 и объединить от 2 соответствует гели. Изменение от Zhan X, и др. (2018) 29, с разрешения от Wiley-VCH. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Table 1
Таблица 1: Количество белков, которые были определены в каждом 2DE гель пятно с анализом MALDI-TOF-MS PMF.

Table 2
Таблица 2: Количество белков, которые были выявлены в каждом месте гель 2DE с анализом МС/МС.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

2DE, в сочетании с MS методы, включая 2DE-MS PMF и 2DE-MS/MS, успешно используется в нашей долгосрочной программе - использование протеомики для изучения человеческого NFPA proteomic вариации и молекулярных сети вариации для разяснения молекулярных механизмов и Открытие эффективных биомаркеров для NFPAs. На основе 2DE сравнительные протеомики с хорошей воспроизводимостью играет важную роль в определении NFPA proteomic вариации9,10,11,12,13, 19и 2DE, в сочетании с методом антитела демонстрирует свои преимущества в обнаружении данного столб-поступательные изменения и варианты данного белка, такие как обнаружение тирозин азотирования16,17 , 18 и GH варианты14,15.

Однако 2DE, в сочетании с методом MS считается трудоемкая техника с трудностями в анализ низкого залегания белков, гидрофобные белки, чрезвычайно основные или кислой белков и крайне низкой или высокой массы белки2. Например чрезвычайно низкой массы (< 10 кДа) или Месса (> 150 кДа) белки и чрезвычайно основные (Пи > 7.5 или 8) или кислой (Пи < 3.5 или 4) белки не обнаруживаются легко 2DE с 18-cm IPG полосы рН 3-10 NL3. С быстрым развитием гель бесплатно разделение методов, включая двумерные жидкостной хроматографии (2D-LC) в сочетании с стабильного изотопа маркировки как iTRAQ и ТМТ в последние десять лет23, кажется, что де-2 постепенно отступило от своих Центральный статус в протеомике исследований в анализе протеома сложные ткани, потому что 2D-LC в сочетании с стабильного изотопа маркировки и МС/МС методы эффективно преодолеть недостатки методов, основанных на 2DE.

Недавние исследования показали, что с помощью масс-спектрометрии высок чувствительности, такие как LC-ЭСИ-МС/МС (его чувствительность находится в диапазоне 1-10 amol) в определении разделенных 2DE белков, новые характеристики метода де-2 были обнаружены, которые показывают 2D гель пятно содержит много белков (Таблица 2). Это противоречит традиционной концепции только одного или двух белков на месте, как это подтверждается в базе данных 2DPAGE мира (мир 2DPAGE портал: http://world-2dpage.expasy.org/portal). Это четко демонстрирует, что пропускная способность 2-де в идентификации белков в сложных протеома человека намного выше, чем предполагалось ранее, а именно что там были только одного-двух белков в месте 2D гель. Этот techinique предлагает обещание использовать для 2DE в области протеомики. Один из 2DE можно отделить над до десяти тысяч мест3,8,22 в анализе сложных протеома человека, таким образом 2DE является более подробный метод разделения максимально упростить сложности протеом Примеры до LC-MS/MS анализ по отношению к системе 2D-LC первый мерного LC обычно генерирует дроби 18-30 до анализа LC-MS/MS. Таким образом 2DE в сочетании с высок чувствительности масс-спектрометрия может использоваться для создания огромной информации Справочная карта для сложного человека протеом, особенно для тех низких или крайне низкие изобилии белки. Кроме того де-2 в сочетании со стабильным изотопом маркировки (например, iTRAQ, ТМТ и SILAC) и высокая чувствительность масс-спектрометрии может использоваться для количественной оценки крупномасштабных proteomic различия между разными условиями. Кроме того 2DE в сочетании с стабильного изотопа маркировки и высокая чувствительность масс-спектрометрии имеет абсолютные преимущества в крупномасштабных обнаружения и количественного определения белка PTMs, варианты белка, белка видообразования и видов белков. Эти преимущества будут иметь 2DE, активизировать деятельность в области протеомики.

Кроме того для изучения других болезней человека протеомов легко переводятся существующих протоколов для анализа человеческого протеома ткани ПА, описанные здесь.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана национального фонда естественных наук Китая (Грант № 81572278 и 81272798 XZ), субсидий из Китая «863» план проекта (Грант № 2014AA020610-1-XZ), Xiangya больница фондов для введения талант (к XZ) и Хунань Фонд провинциального естественных наук Китая (Грант № 14JJ7008 к XZ). Авторы также признают научный вклад д-р Доминик м. Desiderio в центра науки здоровья университета штата Теннесси. X.Z. постоянно разработаны и используются методы 2DE-MS для анализа протеома Аденома гипофиза, начиная с 2001 года, задуманная концепция для настоящей рукописи, написал и пересмотренный рукописи, координировал работу соответствующих и отвечал за финансовая поддержка и соответствующую работу. Ю.л. приняла участие в пересмотре рукописи. Y.H участие в коллекцию ссылок и Редакция рукописи. Все авторы одобрил окончательный вариант рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ettan IPGphor 3  GE Healthcare isoelectric focusing system.
Ettan DALTsix multigel caster Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALT II System Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA The vertical electrophoresis system
Ettan IPGphor strip holder Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel caster Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA Multigel caster
Voyager DE STR MALDI-TOF MS  ABI, Foster City,CA MALDI-MS PMF
MALDI-TOF-TOF Autoflex III, Bruker MALDI-MS/MS mass spectrometer
LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD Thermo Scientific, Waltham, MA, USA ESI-MS/MS mass spectrometer
EASY-nano LC system  Proxeon Biosystems, Odense, Denmark High performance liquid chromatography system
PepMap C18 trap column  300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
RP C18 column 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA
KimWipe Kimvipe  Insoluble paper towel
Watter Made by PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenizer Brinkmann Instruments, Westbury, NY
PDQuest Bio-Rad,  Hercules, CA 2D gel image analysis software
SEQUEST  Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339)
DataExplore (ver. 4.0.0.0) software MS spectrum-processing software
Mascot software PMF-based protein searching software  
Mascot software MS/MS-based protein searching software
Proteome Discoverer software v.1.3 beta Thermo Scientific
Xcalibur software v.2.1 MS/MS data-acquired management software 
Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta Human protein database
SEQUEST (version No. 1.3.0.339)  MS/MS-based protein searching software I
MASCOT (version 2.3.02)  MS/MS-based protein searching software II
C18 ZipTip microcolumn Millipore
PeptideMass Standard kit  Perspective Biosystems
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Fisher Scientific 23227
2-D Quant Kit GE Healthcare 80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDE AMRESCO 0172
ACRYLAMIDE AMRESCO 0341
DTT Sigma-Aldrich D0632
Thiourea Sigma-Aldrich T8656
Urea VETEC V900119
SDS AMRESCO 0227
CHAPS AMRESCO 0465
TEMED AMRESCO M146
Ammonium Persulfate AMRESCO M133
Trypsin Promega, Madison, WI, USA V5111
IPG buffer pH 3-10, NL GE Healthcare 17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm GE Healthcare 17-1235-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
  2. Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
  3. Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
  4. Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
  5. Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
  6. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710 (2013).
  7. Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
  8. Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
  9. Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
  10. Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
  11. Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
  12. Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
  13. Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
  14. Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
  15. Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
  16. Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
  17. Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
  18. Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
  19. Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
  20. Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13 (2010).
  21. O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
  22. Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
  23. Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009 (2015).
  24. Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
  25. Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
  26. Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
  27. Zhan, X. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. Zheng, W. , Peking Union Medical College Press. Beijing. 93-108 (2005).
  28. Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. Westermeier, R. , VCH Wiley. Weinheim. (1997).
  29. Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. , (2018).

Tags

Исследования рака выпуск 134 двумерного гель-электрофорез изоэлектрического упором электрофорез геля акриламида Серебряный пятнать Окрашивание Кумасси анализ изображений пептид массового отпечатков пальцев (PMF) тандемные масс-спектрометрия (МС/МС) гипофиза Аденома протеом
В сочетании с методами масс-спектрометрии для анализа тканей протеома человека Аденома гипофиза двумерного гель-электрофорез
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhan, X., Huang, Y., Long, Y.… More

Zhan, X., Huang, Y., Long, Y. Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome. J. Vis. Exp. (134), e56739, doi:10.3791/56739 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter