Summary
このプロトコルでは、オープン フィールド活性測定法でマウス歩行を測定するためフレキシブル、低コストのシステムについて説明します。このシステムに基づいて 6 分間歩行試験mdxマウスにおける随意運動の減少を検出し、正確にこれらの動物の筋特異救助の改善を区別することを示す.
Abstract
前臨床試験の重要な側面は、筋ジストロフィーの治療に機能的な成果を測定します。マウスモデルの自主的な歩行の評価は、直接患者の歩行 6 分間歩行試験などの対策に似ています、モビリティのスコアを関連非侵襲的で再現可能な作業の試金。マウス歩行スピードと距離をテストするための多くの一般的な方法は、アリーナ内の動物の自由運動が時間をかけて測定されるオープン フィールド試験に基づいています。このアプローチの 1 つの主要な欠点はその商業ソフトウェアと高解像度モーショントラッ キング用機器は高価なマウスをテストするための専門施設に転送する必要があります。ここでは、無料とオープン ソース ソフトウェアを利用してマウス歩行を測定するための低コスト、ビデオベースのシステムについて述べる。デュシェンヌ型筋ジストロフィー (DMD) は野生型マウスの活動の相対的な減少はジストロフィン null mdxマウス モデルにおいて、自主的な歩行を示すこのプロトコルを使用して、.Mdxの研究遺伝子を発現するマウス、これらの活動の財政赤字は観察されないし、旅の総距離は野生型マウスと区別。このメソッドは、筋ジストロフィーの病理学に関連する自主的な歩行の変化の測定に有効ですし、多様な研究設定に容易に合わせることができる汎用性の高いプラットフォームを提供します。
Introduction
筋機能の信頼性と再現性のある測定は DMD の潜在的な治療の効果を評価するために重要です。DMD は、進歩的な筋肉弱さ、歩行、および最終的な心肺不全の損失につながるジストロフィン遺伝子の変異による遺伝性疾患です。DMD の最も広く利用された動物モデルはジストロフィン null mdxマウスです。機能テストのバッテリは、ジストロフィーなどの筋疾患のような動物モデルの同様、 mdxマウスの病気の進行を評価するためのルーチンのアッセイとして浮上しています。一般的に使用される生体内での試金、前肢握力、トレッドミル、ランニング、モーター アクティビティの追跡中に枯渇する時間、rotarod 最大、時間を掛かっている線があります。前臨床研究間のばらつきを軽減しマウス1,2でテスト治療のトランスレーショナルリサーチの可能性を高める目的と、これらのテストを標準化するフィールドには相当な努力をされています。
前臨床試験の 1 つの重要なカテゴリは、随意運動、筋ジストロフィー症マウスモデル内が頻繁に変更されるパラメーターの測定値です。これはオープン フィールドの活動の監視に基づくアッセイによってテストは通常、数分または数時間の2,3,4のコース上 (歩行) 水平または垂直 (飼育) の動きを評価する可能性があります。研究の数は、運動後特にmdxマウスに変更される随意運動を示しているし、薬物治療と病気の進行を重視するこれらの測定値が示されています。これらの試金の実行の 1 つの主要な制限は、専門的な高額の機器を必要です。ここでは、マウス歩行の容易に利用可能なリソースの使用を追跡する低コストの方法が表示されます。
6 分間歩行距離は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー5,6を持つ個人で臨床の評価ツールとして一般的に使用される指標です。このメジャーの変更は、 mdxマウス7ゴールデン ・ リトリーバー (GRMD) 筋ジストロフィー犬8などデュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデル動物での結果を評価するために使用されています。本研究では軽度の運動課題の直後 6 分で自主的なオープン フィールドの動きを記録します。歩行距離、時間をかけて水平方向の動きを測定する無料のオープン ソース ソフトウェアを使用してを求めた。
この方法の主な利点は、分析のための専用の機器や高コストの商業ソフトウェアを必要とせずさまざまな設定で動物をテストできることです。この分析の 1 つの重要な側面は、移動または専門中核施設にビバリウムからマウスを転送しなくても基本的な実験室の設定で実行できることです。ここで説明ビデオ追跡プロトコルは比較的短時間の期間にわたって歩行の評価に適してことができます野生型およびmdxマウスの活性の違いを検出し、救助の機能向上を明らかにします。DMD のモデル。
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Protocol
ここで説明する方法は、動物介護制度およびカリフォルニア大学ロサンゼルス校で使用委員会によって承認されました。野生型 (c57bl/6 j) およびmdxマウス (C57Bl/10ScSn バック グラウンド) は、商業ソースから購入しました。mdx: 研究 Tg マウス ケイ ・ デイヴィスからの許可とジェームズ Ervasti から贈られ、 mdxの背景に維持されました。歩行アッセイは、生後 6 ヶ月で雄マウスで行われました。マウス機関動物ケアによって確立されたガイドラインに従う寺崎生命科学ビバリウムで維持および使用委員会カリフォルニア大学、ロサンゼルス (承認 #2000-029-43)、これらの研究のための承認を受けた、カリフォルニア大学ロサンゼルス校動物福祉保証 (承認 #A3196-01)。
1. 商工会議所の準備
- 日9の一貫した時に静かで、温度調整された部屋でデータ収集を実行します。遺伝子型とテストされているマウスの治療に目がくらんでテストを実行します。
- この分析の任意のオープン フィールド チャンバー方式を適応します。
注: この研究では、大きなゴミ箱から構築した安価で簡単にトランスの記録室を使用します。オープン フィールド アリーナは、ケージまたは同じような高架のプラットフォームに設定トレイです。 - 完全アリーナ全体を記録するチャンバーの上の金網にカメラを配置します。
- 各試験の前に消毒記録室をきれいに。
2. 事前運動プロトコルとデータ収集
- 必要に応じて、直前の活動記録、筋肉の活性化のプロトコルで各マウスに挑戦します。
注: これはオプションですが推奨されるmdxマウス実験で。- デジタルフォース ゲージの引き棒をつかんで軽く引いて引き棒がリリースされるまでには、マウスを許可します。トライアル 5 回この手順を繰り返します。
- トライアルごとにレコードのピーク張力 (N)。
注: 歩行の試金のための練習課題として機能に加えて、このグリップ強度アッセイ中に動物によって加えられた力は追加機能結果メジャー2,10として使用できます。 - 各試行間の残りの 1 分で各マウスの 5 つの総試験を実行します。
- 活動室でマウスを置くグリップ強度試験や他の運動のプロトコルの直後します。
- 室内楽の分野でマウスの動きのビデオ録画を開始します。6 分を自由に探索するマウスを許可します。
- 6 分で録画を停止し、その家のケージにマウスを返します。
3. ビデオ分析
- 必要に応じて、フレーム レートを減らすことによって分析のためビデオを準備します。追跡分析のフレーム レートを減らすために 2 の要因によってビデオのフレーム レートを削減するのにはビデオ編集ソフト (例えば、iMovie または同様のプログラム) に次のプロトコルを使用します。
注: ビデオの長さやフレーム レートに応じてことができます分析の前にビデオのフレーム レートを削減します。本研究では 30 フレーム/秒 (6 分記録、合計約 10,800 フレーム) で撮影しました。- ソフトウェアにビデオをロードします。
- '速度'] メニューの [を選択 '速度: 高速' し速度を 2 倍に設定します。
- .Mp4 ファイル形式分析を追跡するための間引きビデオをエクスポートします。
- ソフトウェア プログラムで解析のためのビデオを開きます。[線] ツールを使用して、記録ビデオの調整を設定します。商工会議所の 1 つの側面に沿って線を引きます。行を右クリックし、「キャリブレーション測定...」を選択商工会議所側の実際のサイズをセンチメートル単位で入力します。
- マウスの位置の半自動追跡を開始、'移動' のカーソルをクリックします。
ビデオの最初のフレームから開始して、追跡する; ポイントを右クリックしてください。追跡ポイントは、青い円で示されます。
注: 本研究では各動物の位置は尾のベースをトレースによって追跡されました。 - キーボードの右向きの矢印をクリックして、フレームを進める追跡ポイントは、尾の基点の位置に基づいて自動的に移動する必要があります。
- 追跡位置は特定のフレームへの関心のポイントと揃っていない場合手動で、尾の根元にある青い丸を合わせます。
注: ビデオの品質とマウスの速度、に応じて追跡は興味のポイントとの整合性を維持するためにユーザー入力の変数のレベルを必要があります。マウスの軌跡は、ビデオのコースを進める必要があります。
- 追跡位置は特定のフレームへの関心のポイントと揃っていない場合手動で、尾の根元にある青い丸を合わせます。
- 完全なビデオのトラッキングが完了すると、ビデオ、およびトレースのオーバーレイを保存します。「スプレッドシートにエクスポート」を選択することによって、トレースの位置データをエクスポートします。
4. データ解析
- 表計算ソフトで位置データを開きます。運動解析ソフトウェアは、X, Y 座標の各フレームで、マウスの位置を報告します。
- フレームによって走行距離を計算する次の式を使用 (1 つのフレーム内の位置が、x1, y1フレーム 2、x2y2)。
注: 時間の経過と共に累積距離は、各フレームの間の距離を追加することによって計算できます。
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Representative Results
オープン フィールド測定のバリエーションは、筋ジストロフィー症で病気の進行をテストする効果的な方法であると示されています。ここでは、汎用性の高いビデオ追跡二次元のマウスの動きを容易に利用できる録音機器とオープン ソース ソフトウェア (図 1 a-B) の解析手法を示す.Mdxマウスは、野生型マウス (図 1 より 6 分オープン フィールド作業で大幅に少ない随意運動を示すテスト前にすぐに運動プロトコルで挑戦したを示す同様の試金から報告された結果に一致して、図 2)。グリップ力の挑戦、 mdxマウスの軽度の労作を通常以下歩行プロトコルであり、分 5 に 4 (図 3 a) 動きの緩やかな増加の最初の数分間のためにまだ残る。運動チャレンジなしの野生型およびmdx動物をテストするとき我々 は旅の総距離 (図 2) の違いを検出されません。
これ、未行使mdx違いまたは野生型マウスに対するわずかな減少を示さないと同様の運動アッセイを見て他のグループからのレポートと一致。我々 はさらに我々 の分析の感度をテストするために研究のハイレベルを発現するトランスジェニック マウスを評価 (mdx: utr tg、フィオナ行)11,12。Mdx: utr tg はいくつか栄養障害による機能を持つmdx表現型の堅牢な救助モデル。次の演習では、 mdxマウス研究を表現する (図 3 b) 旅の総距離に有意差なしの野生型から区別されたまたは累積的な時間のいずれかでポイントを測定 (図 3 a)。
ビデオ ベースの追跡は、フレームごとに変化、得点どちらか手動観測することによってソフトウェアの自動検出に依存しています。フリーでオープン ソース運動解析ソフトウェアは、半自動検出で検出されない、または過大評価の動き手動で修正できるアクティビティ トレースが生成される、動物の動きのためことができます。この分析では、データ処理を最小限に抑えるために我々 ダウン サンプリング 15 fps を 30 fps の記録から元動画。サンプリング レートを減少させる効果を決定する合計を測定した距離フルフレーム レート ビデオの 1 分から旅し、ダウン サンプリング データ セット (図 4 a) のバージョンから派生した距離測定を比較します。半分フレーム率を軽減することがわかった (引き 2) は測定距離を 5.0% 減し、7.5 fps 保持元の距離のほぼ 90% ほど低いフレーム レートを下げる (30 fps ビデオからの距離 89.2%) を計算します。距離の測定の精度急落このポイントの後も高い間引きデータセットはまだ密接に動物 (図 4 b) のパスを近似が。これらの観察はフレーム レートや動物の活動の評価における信号処理の検討の重要性を強調し、ダウン サンプリングされた映像データの高空間分解能を保持できることを示します。
図 1: 代表的な 6 分間歩行距離のフィールド トレースを開く。(A) 本研究で使用される活動記録室を設置しました。グリップ メーター アッセイ、運動チャレンジ前の使用されたし、オープン フィールド プラットフォームに自由歩行を記録しました。(B) 6 分トラッキング ソフトウェアの動きのトレース分析でビデオ録画の複合イメージ。2 つの代表的なトレース (C) オーバーレイ (WT、灰色、 n = 1;mdx、赤、 n = 1)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: mdxの歩行運動の影響.6 分歩行距離は 6 ヶ月前の練習の有無の記録された (非行使mdx n = 5、WT n = 4; mdx nを行使 5、WT nの = = 5)。WT とmdxとき未行使、間に有意差は認められなかったが、アッセイの前に行使マウスで有意差が見られた (ない運動: WT 1077.0± 106.4 cm、 mdx 971.0 ± 36.16 cm; 運動後: WT 770.2 ± 30.75 cmmdx 127.8 ± 36.16 cm)。データを表す意味 ± SEM. 統計計算テューキー続いて双方向分散分析を使用しての多重比較のテスト (*p < 0.05 * *p < 0.01 * * * p < 0.001 と * * *p < 0.0001)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 研究の遺伝子組換え発現向上mdxマウス歩行します。6 分間歩行距離はオープン フィールド活動室を用いた生後 6 ヶ月で録音された (WT n = 5、 mdx n = 5、 mdx: utr Tg n = 4)。(A)「分累積距離。WT とmdxの重要な違いは見つかりませんでした: 任意の時点で utr tg。統計計算テューキー続いて双方向の分散分析を使用しての多重比較のテスト (*p < 0.05 * *p < 0.01、* * *p < 0.001 と * * *p < 0.0001)。(B) 合計オープン フィールド距離 6 分以上 (WT 770.2 ± 30.75 cm、 mdx 127.8 ± 36.16 cm、 mdx: utr Tg 701.3 ± 33.54 cm)。データを表す意味 ± SEM. 統計計算テューキーが続く一方通行 ANOVA を使用しての多重比較のテスト (*p < 0.05 * *p < 0.01 * * *p < 0.001 と * * *p < 0.0001)。この図の拡大版を表示するのには、ここをクリックしてください。
図 4: 追跡歩行に及ぼすサンプリング レート。野生型マウスの歩行距離の 1 分は記録し、フルフレーム レート (30.0 fps、1,819 合計フレーム数) のソフトウェアをトラッキングの動きを使用して追跡。各フレーム内のマウスの二次元位置が決定され、これらのデータは、低いフレーム レートのビデオの追跡をシミュレートするために間引きされた (30、22.5、20、15、10、7.5、6、3、1.5、および 0.75 fps)。(A) 合計距離ダウン サンプリング データ セットの座標から計算です。点線で動画フル フレームから計算した距離の 5% 以内の値を評価します。この研究のデータは、15 fps (赤矢印) に激減したビデオから得られました。(B) 完全なフレーム レート トレース 1.5 fps (上) と (下) 15 fps を比較するトレースのオーバーレイ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
オープン フィールド試験は筋疾患のマウスモデルの運動機能をテストするのには効果的かつ非侵襲的な方法を提供し、このアッセイのバリエーションは、前臨床試験のための貴重なエンドポイント測定として使用できます。このタイプの試金と 1 つの主要な制限は、活動監視システムの高コストと限られたアクセシビリティです。本研究では、既存の商業ソフトウェアおよび装置と同様の結果を生成するオープン フィールド活動解析のための低コスト システムを示しています。このシステムは、vivaria マウスが収容されている場所で使用できるコア施設に動物を譲渡する必要があります。このアッセイの汎用性の追跡研究と動物生理・行動に重点を置いた学部研究所コースを含む教育の設定のさまざまなビデオの使用ができます。
本研究では野生型とmdxマウス間の随意運動の違いが運動によって容易に検出された次の増悪をすることができますがわかった。この堅牢な違いは、他のグループと同様の活動の成果を見て、1 時間オープン フィールド アッセイを含む、一晩の試金を飼育で報告されています。未行使の野生型とmdxマウスの自主的な歩行の違いは認められなかった、これは他のグループ13からの結果と一致。他は違い13報告ないしながら、一部の研究者は未行使の野生型およびmdxマウス7の自主的な歩行距離のささやかな違いを報告しています。我々 の調査結果は、 mdx活動の統計的に有意な違いを確実に検出するために検査前に筋の使用をサポートします。
本研究では新規オープン フィールド環境とマウスを発表しました。この新奇環境プロトコルを使用して、グループ内の非常に小さな変動を観察した.ただし、マウスはなじみのない環境に配置する場合、アクティビティ14を高まっているがちです。同じ動物を複数のセッションにわたってテストする場合は、動物は記録室に慣れる必要がありますや、データを記録する前に完全なテスト プロトコルを複数回受けます。
オープン フィールドの試金からデータの評価の 1 つの重要な考察は動物の行動および感情的な条件に非常に敏感です特に不安様行動します。Mdxは、野生型制御動物よりも新規の環境に異なる行動応答できますです。ただし、さらに筋特異救助、 mdxテスト: utr Tg マウス、筋固有プロモーターの下で研究を表現します。これらのマウスは野生型動物、 mdxマウスにおける動作の違いが自主的な歩行の変更を運転していないことを示唆しているだけでなく、実行されます。
オープン フィールドの試金は運動機能の研究にも行動パラダイムの中で広く、さまざまなアクティビティの監視システムから記録することができますパラメーターです。商業活動分析ソフトウェアでよく使用されるこれらの測定のいくつかは特定の動作の自動検出のほか、周波数、垂直方向の動き、および関心の特定の領域の設定をオンに。本研究で使用される 6 分歩行距離測定、アウトプットは大部分の距離と水平歩行の速度に制限されます。
さらに、このプロトコルで半自動追跡のために必要なユーザー入力のレベルのためこの試金ないだろうよく活動時間の長い期間のための監視や並列で複数の動物の測定に適しています。本研究では、訓練を受けたユーザーが処理でき、1 回あたり約 15-30 分のビデオからデータを抽出を発見します。これ、小規模な実験だけそれなりの時間負担が、この分析レベルに法外な研究の長い期間にわたって大規模でサンプル セットをお探しのため急速になります。完全に自動化された商業追跡システム通常 20,000 米ドル以上の費用、これらのソリューションよりコスト- と時間-効果的な歩行は頻繁にテスト研究所の可能性があります。ただし、研究室およびテストのみを少数の動物の教育現場は、簡単なセットアップ、このアッセイの再現性を提供します貴重なツール モーター動作を評価するため。
利用可能なデータ分析の種類は、前臨床研究の適切なエンドポイント アッセイを決定する際に重要な考慮事項です。一貫して 6 分歩行距離を使用して 3 つの遺伝子型の違いを検出することができた (野生型、 mdxでは、 mdx: utr tg)、微妙なを見たときに長期的な活動のより複雑な分析がある可能性があります随意運動の変化。しかし、アクセシビリティとこの低コスト設定のシンプルさ、前臨床試験に有用で関連性の高い機能テストmdxマウス モデルです。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所 [R01 AR048179 と R.C.W、T32 AR059033、F32 AR069469to E.M.G R01 HL126204] と [274143 と R.C.W. に 416364] 筋ジストロフィー協会米国からの補助金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Video camera | Apple Inc. | ME553LL/A | For recording ambulation video, iPhone 5S Plus (or equivalent) |
| Kinovea software (version 0.8.15) | Kinovea Association | Open source video analysis software. Free download, PC compatible (Version 0.8.15, www.kinovea.org) | |
| iMovie (version 10.0.6) | Apple Inc. | Any similar software can be used to reduce video frame rate (optional) | |
| Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bin (Open field chamber) | Rubbermaid | # 1778013 | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. |
| Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (Open field chamber) | US Acrylic, LLC | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. | |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | #000664 | Male 6 month mice |
| C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) | Jackson Laboratory | #001801 | Male 6 month mice |
| mdx: utrophin-Tg (fiona) | Gift from from James Ervasti, with permission from Kay Davies | Male 6 month mice |
References
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