Een eenvoudige en goedkope Assay voor het meten van Ambulation in muismodellen van spierdystrofie

Summary

Dit protocol beschrijft een flexibele, voordelige systeem voor het meten van de muis ambulation in een open veld activiteit assay. We laten zien dat een bepaling van de 6 minuten durende ambulation op basis van dit systeem een afname van de vrijwillige beweging in mdx muizen detecteert en nauwkeurig verbetering in een spier-specifieke redding van deze dieren onderscheidt.

Abstract

Het meten van functionele resultaten bij de behandeling van spierdystrofie is een wezenlijk aspect van de preklinische testen. De beoordeling van vrijwillige ambulation in muismodellen is een niet-invasieve en reproduceerbare activiteit-test die is direct analoog aan maatregelen van patiënt ambulation zoals de 6-minuten-test en gerelateerde mobiliteit scores. Vele gemeenschappelijke methoden voor het testen van de muis ambulation snelheid en afstand zijn gebaseerd op het open veldtest, waar het dier vrij verkeer binnen een arena wordt gemeten na verloop van tijd. Een groot nadeel aan deze benadering is dat commerciële software en apparatuur voor hoge resolutie volgen van beweging is duur en mogelijk overbrengen van muizen tot gespecialiseerde faciliteiten voor het testen. Hier beschrijven we een goedkope, video-gebaseerd systeem voor het meten van de muis ambulation dat gebruik maakt van gratis en open-source software. Met behulp van dit protocol, we laten zien dat vrijwillige ambulation in het Dystrofine-lege mdx -muismodel voor Duchenne muscular dystrophy (DMD) is gedaald ten opzichte van de wild-type muis activiteit. In mdx uiting geven aan de utrophin transgenic muizen deze activiteit tekorten niet worden nageleefd en de totale afgelegde afstand is niet te onderscheiden van muizen wild-type. Deze methode is effectief voor het meten van veranderingen in vrijwillige ambulation Dystrofe pathologie is gekoppeld, en biedt een veelzijdig platform dat gemakkelijk kan worden aangepast aan uiteenlopende onderzoek instellingen.

Introduction

Betrouwbare en reproduceerbare metingen van spier functie zijn van cruciaal belang voor de beoordeling van de werkzaamheid van potentiële therapieën voor DMD. DMD is een genetische aandoening veroorzaakt door mutaties in het Dystrofine-gen, leidt tot progressieve spierzwakte, verlies van ambulation, en uiteindelijke Cardiorespiratoire mislukking. De meest gebruikte diermodel van DMD is het Dystrofine-lege mdx -muis. Een batterij van functionele tests opgedoken als routine tests voor de beoordeling van de progressie van de ziekte in de mdx -muis zo goed zoals in soortgelijke dierlijke modellen van andere dystrophie en myopathieën. Veelgebruikte in vivo tests omvatten metingen van de voorpoot grijpkracht, draad, tijd, rotarod maximum, tijd opknoping aan uitputting tijdens loopband uitgevoerd, en motorische activiteit bijhouden. Er is een aanzienlijke inspanning op het gebied op de standaardisering van deze tests, met als doel vermindering van de variabiliteit tussen de preklinische studies en verhogen het translationeel potentieel van therapeutics getest in muizen^1,2.

Een belangrijke categorie van preklinische testen is het meten van vrijwillige beweging, een parameter die vaak wordt gewijzigd in lymfkliertest modellen van spierdystrofie. Dit wordt meestal getest door te testen op basis van het open veld Activiteitencontrole, en kan horizontaal (lopen) of verticale (kweek) bewegingen in een loop van minuten of uren^2,3,4te evalueren. Een aantal studies is gebleken dat vrijwillige beweging moet worden gewijzigd in mdx muizen, vooral na het sporten, en deze metingen is gebleken te zijn gevoelig voor behandeling en ziekte progressie van de drug. Een belangrijke beperking bij het uitvoeren van deze tests is de behoefte aan gespecialiseerde, hoge kosten apparatuur. Hier, wordt een goedkope methode die tracks muis ambulation met behulp van gemakkelijk beschikbare middelen gepresenteerd.

De 6 minuten lopen afstand is een statistiek die vaak gebruikt als een instrument van de klinische beoordeling bij personen met Duchenne spierdystrofie^5,6. Wijzigingen van deze maatregel hebben zijn gebruikt ter beoordeling van de resultaten in diermodellen voor Duchenne, met inbegrip van mdx muizen⁷ en golden retriever spierdystrofie (GRMD) honden⁸. In deze studie registreren wij vrijwillige open veld beweging in de 6 minuten direct na een milde oefening uitdaging. Ambulation afstand werd vervolgens berekend op basis van vrije open-source software voor het meten van horizontale beweging na verloop van tijd.

Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat de dieren kunnen worden getest in een scala aan instellingen zonder speciale apparatuur of hoge kosten commerciële software voor analyse. Een belangrijk aspect van deze analyse is dat het kan worden uitgevoerd in een omgeving van basic Labor zonder te verplaatsen of muizen uit de vivarium overbrengen in een gespecialiseerde core-faciliteit. Het protocol van de video-tracking hier beschreven kan is geschikt voor de beoordeling van de ambulation gedurende een relatief korte tijd-periode en detecteren activiteit verschillen tussen wild-type en mdx muizen, evenals onthullen functionele verbetering in een redding model van DMD.

Protocol

De hier beschreven methoden werden goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de University of California, Los Angeles. Wild-type (C57BL/6J) en mdx muizen (C57Bl/10ScSn achtergrond) werden gekocht van een commerciële bron. MDX: utrophin-Tg muizen waren een geschenk van James Ervasti, met toestemming van Kay Davies, en werden onderhouden op de mdx -achtergrond. Ambulation tests werden uitgevoerd op mannelijke muizen op 6 maanden oud. Muizen werden onderhouden in het Terasaki Life Sciences Vivarium na door de institutionele Animal Care vastgestelde richtsnoeren en gebruik Comité bij de Universiteit van Californië, Los Angeles (goedkeuring #2000-029-43) en goedkeuring voor deze studies werd verleend door de UCLA Animal Welfare Assurance (goedkeuring #A3196-01).

1. voorbereiding van de kamer

1. Verzamelen van gegevens in een rustige, temperatuur gecontroleerde kamer in een consistente tijd van dag⁹uitvoeren Voer de tests verblind tot het genotype en de behandeling van de muis wordt getest.
2. Aanpassen elk open veld kamer systeem voor deze analyse.
   Opmerking: In deze studie gebruiken we een goedkoop en gemakkelijk te vervoeren opname kamer opgebouwd uit een grote prullenbak. De arena van het open veld is een lade instellen op een kooi of soortgelijke verhoogde platform.
3. Plaats de camera op een gaas boven de kamer opnemen over de volledige arena.
4. Reinig de zaal van de opname met een ontsmettingsmiddel voor elk afzonderlijk experiment.

2. vooraf oefening Protocol en gegevensverzameling

1. U kunt desgewenst onmiddellijk voorafgaand aan de opname van de activiteit, daag elke muis met een spier activering protocol.
   Opmerking: Dit is optioneel maar aanbevolen in experimenten met mdx muizen.
   1. Laat de muis greep de pull-bar van een digitale kracht meten en trek voorzichtig terug tot de pull-bar wordt vrijgegeven. Herhaal deze procedure vijfmaal per proef.
   2. Record piek spanning (N) voor elk afzonderlijk experiment.
      Opmerking: Naast de uitdaging van een oefening voor de ambulation assay bijeenkomen, de kracht uitgeoefend door het behandelde dier tijdens deze greep kracht test kan worden gebruikt als een extra functionele uitkomst maatregel^2,10.
   3. Vijf totale proeven voor elke muis met 1 min van rust tussen elke proef uitvoeren.
2. Onmiddellijk na de bepaling van de sterkte greep of andere oefening protocol, plaatst u de muisaanwijzer in de zaal van de activiteit.
3. Start de video-opname van alle bewegingen van de muis in de arena van de kamer. Laat de muis om te vrij verkennen voor 6 min.
4. Stop de opname op 6 min en de muis terug naar haar kooi.

3. video-analyse

1. U kunt desgewenst voorbereiden video analyse door het verminderen van de framerate. Ter beperking van de framesnelheid voor het bijhouden van de analyse, het volgende protocol gebruiken in een video-editing software (b.v., iMovie of een soortgelijk programma) te decimeren de videoframesnelheid met een factor 2.
   Opmerking: Afhankelijk van de lengte en de frame rate van de video, het wellicht nuttig om de video framerate vóór de analyse. In deze studie, werd video opgenomen op 30 frames/s (6 min opnemen, ongeveer 10,800 frames totaal).
   1. Het laden van de video in de software.
   2. Selecteer onder het menu 'Speed', ' snelheid: snel ' en zet snelheid naar 2 x.
   3. Exporteer de gedecimeerd video in MP4-indeling voor het bijhouden van de analyse.
2. Open de video voor analyse in het softwareprogramma. Stel de kalibratie voor de video-opname met behulp van het hulpmiddel lijn. Teken een lijn langs een kant van de kamer. Klik met de rechtermuisknop op de regel en selecteer "Kalibreren maatregel..." Geef de werkelijke grootte van de kant van de kamer in centimeters.
3. Om te beginnen met semi-automatische bijhouden van de muispositie, klik op de 'move'-cursor.
   Vanaf het eerste frame in de video, klik met de rechtermuisknop op het punt worden bijgehouden; het punt van de tracking is gemarkeerd met een blauwe cirkel.
   Opmerking: In de huidige studie, de positie van elk dier werd gevolgd door het traceren van de basis van de staart.
4. Verder het frame door te klikken op de pijl-rechts op het toetsenbord; het bijhouden van punt moet automatisch worden verplaatst op basis betreffende de positie van de staart base.
   1. Als de positie van de tracking is niet afgestemd op het punt van belang in een bepaald frame, handmatig uitlijnen de blauwe cirkel aan de basis van de staart.
      Opmerking: Afhankelijk van de kwaliteit van de video en de snelheid van de muis, de tracking kan vereisen verschillende niveaus van de input van de gebruiker om de aanpassing aan het punt van belang. Het pad van de muis moet gaan doorheen de cursus van de video.
5. Wanneer volgen van de volledige video voltooid is, slaat u de video- en tracing-overlay. Exporteer de positionele gegevens van de tracering door het selectievakje 'Exporteren naar werkblad'.

4. de gegevensanalyse

1. De positionele gegevens openen in een spreadsheetprogramma van de software. De software van de analyse van het verkeer meldt dat de X, Y-coördinaat van de positie van de muis in elk frame.
2. Wilt berekenen afstand reisde door frame, gebruikt u de volgende vergelijking (waar positie in frame een is x₁, y₁ en frame twee is x₂, y₂):
   
   Opmerking: Cumulatieve afstand na verloop van tijd kan worden berekend door de afgelegde tussen elk frame toe te voegen.

Representative Results

Variaties van het open veld test is gebleken dat een effectieve methode voor het testen van de progressie van de ziekte in modellen van spierdystrofie. Hier tonen we een veelzijdige video tracking methode voor de analyse van tweedimensionale muisbeweging met behulp van gemakkelijk beschikbare opname-apparatuur en open bronsoftware (figuur 1A-B). Consistent met resultaten gemeld uit soortgelijke testen, we laten zien dat mdx muizen uitgedaagd met een oefening protocol onmiddellijk voordat aanzienlijk minder vrijwillige beweging in een open veld 6 minuten durende taak dan wild-type muizen (Figuur 1 c testen weergeven , Figuur 2). Na de lichte inspanning van een grip sterkte uitdaging, mdx muizen meestal blijven nog voor de eerste paar minuten van het ambulation-protocol, met een bescheiden toename van de beweging door minuut 4 tot en met 5 (figuur 3A). Bij het testen van wild-type en mdx dieren zonder een oefening uitdaging, ontdekt wij geen verschil in de totale afgelegde afstand (Figuur 2).

Dit is in overeenstemming met de verslagen van andere groepen op zoek naar soortgelijke beweging testen, met unexercised mdx tonen geen verschil of de kleine dalingen ten opzichte van de wild-type muizen. We geëvalueerd bovendien transgene muizen uiting van hoge niveaus van utrophin om te testen van de gevoeligheid van onze assay (mdx: utr-tg, Fiona lijn)^11,12. De mdx: utr-tg is een robuuste redding model van het fenotype van de mdx met paar Dystrofe functies. Na de oefening, mdx muizen uiting van utrophin waren niet te onderscheiden van wild-type, met geen significant verschil in de totale afgelegde afstand (figuur 3B) of op een van de cumulatieve tijd punten gemeten (figuur 3A).

Video-based tracking is afhankelijk van frame-voor-frame variabiliteit, gemeten door beide handmatige waarnemer scoren of door geautomatiseerde software opsporing. Software van de analyse van de beweging van vrije en open source zorgt voor semi-automatische detectie van dierlijke beweging, waarin onopgemerkt of overschatte bewegingen kunnen worden handmatig gecorrigeerd als de activiteit trace is gegenereerd. Om te minimaliseren van de verwerking van de gegevens in deze test, wij gedownsampled de oorspronkelijke video's uit de opgenomen 30 bps tot 15 fps. Om te bepalen van het effect van het verlagen van de samplefrequentie, we de totaal gemeten afstand reisde vanaf 1 min van de volledige frame rate video en vervolgens vergeleken afstandsmeting afgeleid van gedownsampled versies van de gegevensset (figuur 4A). We vonden dat het terugdringen van de framerate gehalveerd (decimering door 2) daalde de gemeten afstand met 5,0%, en vermindering van de framerate zo laag als 7.5 fps bijna 90% van de oorspronkelijke afstand behouden berekend (89.2% van afstand van 30 fps video). De nauwkeurigheid van de gemeten afstand afgezet scherp na dit punt, hoewel zelfs zeer gedecimeerd datasets nog steeds nauw benaderd het pad van het dier (figuur 4B). Deze opmerkingen benadrukken het belang van de framesnelheid en signaalverwerking bij de beoordeling van dierlijke activiteit gezien, en aantonen dat hoge ruimtelijke resolutie in gedownsampled videogegevens kan worden gehandhaafd.

Figuur 1: vertegenwoordiger open veld sporen van 6 minuten durende ambulation afstand. (A) Set-up van activiteit opname kamer gebruikt in deze studie. Grip meter gewend was voor oefening uitdaging voorafgaande assay en gratis ambulation werd opgenomen op het open veld-platform. (B) Composietbeeld van 6 min video-opname met tracering analyse in beweging bijhouden van software. (C) Overlay van twee representatieve sporen (WT, grijs, n = 1; mdx, rood, n = 1). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: Effect van oefening op de mdx -ambulation. 6 minuten durende ambulation afstanden werden opgenomen in de 6 maanden oud met of zonder voorafgaande oefening (niet-uitgeoefend MDX-n = 5, WT n = 4; uitgeoefend MDX-n = 5, WT n = 5). Geen significant verschil tussen WT en mdx wanneer unexercised werd waargenomen, maar een significant verschil was te zien in muizen uitgeoefend vóór assay (geen oefening: WT 1077.0± 106.4 cm, mdx 971.0 ± 36.16 cm; post-exercise: WT 770.2 ± 30.75 cm, mdx 127,8 ± 36.16 cm). Gegevens vertegenwoordigen betekent ± SEM. statistieken berekend met two-way ANOVA gevolgd door Tukey is meerdere vergelijkingstest (*p < 0,05, **p < 0,01, *** p < 0.001 en ***p < 0.0001). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: Transgene uitdrukking van utrophin verbetert ambulation in mdx muizen. 6 minuten durende ambulation afstanden werden opgenomen in de 6 maanden oud met behulp van een open veld activiteit kamer (WT n = 5, MDX-n = 5, mdx: utr-Tg n = 4). (A) cumulatieve afstand reisde door de minuut. Geen significant verschil tussen WT en mdxwerd ontdekt: utr-tg op elk gewenst moment. Statistieken berekend met two-way ANOVA gevolgd door Tukey is meerdere vergelijkingstest (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0.001 en ***p < 0.0001). (B) totale open veld afstand reisde meer dan 6 min (WT 770.2 ± 30.75 cm, mdx 127,8 ± 36.16 cm, mdx: utr-Tg 701.3 ± 33.54 cm). Gegevens vertegenwoordigen betekent ± SEM. statistieken berekend met one-way ANOVA gevolgd door Tukey is meerdere vergelijkingstest (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0.001 en ***p < 0.0001).Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: Effect van samplefrequentie op ambulation bijhouden. In een wild-type muis, 1 min van ambulation afstand werd opgenomen en bijgehouden met behulp van de beweging voor het bijhouden van software met volledige framesnelheid (30.0 fps, 1,819 totale frames). De twee-dimensionale positie van de muis in elk frame was bepaald, en deze gegevens vervolgens werden gedecimeerd te simuleren bijhouden in lagere frame rate video (30, 22,5, 20, 15, 10, 7.5, 6, 3, 1.5 en 0,75 fps). (A) totale afstand berekend op basis van de coördinaten in elke gegevensset gedownsampled. Stippellijnen weergegeven waarden binnen 5% van de afstand berekend op basis van de full frame stem op video. Gegevens in deze studie werden verkregen uit video gedecimeerd tot 15 fps (rode pijl). (B) Overlays van sporen vergelijken volledige frame rate traceren met 1,5 bps (boven) en 15 fps (zie hieronder). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Het open veld assay biedt een effectieve en niet-invasieve manier om te testen motor functie in muismodellen van spier ziekte, en variaties van deze bepaling kunnen dienen als een waardevolle eindpunt maatregel voor pre-klinische studies. Een belangrijke beperking met dit type van test is de hoge kosten en beperkte toegankelijkheid van activiteit bewakingssystemen. In deze studie tonen we een systeem van de goedkope p.a. open veld activiteit die vergelijkbare resultaten aan bestaande commerciële software en apparatuur kunnen genereren. Dit systeem kan worden gebruikt binnen vivaria waar muizen zijn gehuisvest, eliminerend de behoefte om dieren naar core faciliteiten. De veelzijdigheid van deze test maakt ook het gebruik van video bijhouden in een breed scala aan onderzoeks- en educatieve instellingen, met inbegrip van undergraduate laboratorium cursussen gericht op dierlijke fysiologie en gedrag.

In deze studie vonden we dat verschillen in vrijwillige beweging tussen wild-type en mdx muizen gemakkelijk gevonden volgende verergering door oefening kunnen. Deze robuuste verschil is gemeld door andere groepen kijken naar soortgelijke activiteit resultaten, met inbegrip van urenlange open veld testen en testen 's nachts te fokken. Terwijl wij geen verschil in vrijwillige ambulation unexercised wild-type en mdx muizen waargenomen, komt dit overeen met resultaten van andere groepen¹³. Sommige onderzoekers hebben gemeld een bescheiden verschil in vrijwillige ambulation afstand tussen de unexercised wild-type en mdx muizen⁷, terwijl anderen geen verschil^{13 melden}. Onze bevindingen ondersteunen het gebruik van spier activering vóór de test om betrouwbaar detecteren een statistisch significant verschil in mdx -activiteit.

In deze studie gepresenteerd we muizen met een roman open veld omgeving. Dit nieuwe milieu-protocol gebruikt, zien we weinig variabiliteit binnen groepen. Echter wanneer muizen worden geplaatst in een onbekende omgeving, ze de neiging om activiteit¹⁴hebben verhoogd. Als dezelfde dieren worden getest in meerdere sessies, dieren moeten worden gewend aan de kamer van de opname en het volledige testprotocol meerdere keren ondergaan voordat het opnemen van gegevens.

Een belangrijke overweging bij de evaluatie van de gegevens van open veld testen is dat het zeer gevoelig voor dierlijke gedrag en emotionele omstandigheden, met name angst-achtig gedrag. Het is mogelijk dat de mdx een verschillende gedragsmatige reactie op het nieuwe milieu dan de dieren van de wild-type controle wellicht. Echter we daarnaast getest een spier-specifieke redding, de mdx: utr-Tg muis, die spreekt van utrophin onder een spier-specifieke promotor. Deze muizen uitgevoerd alsmede wild-type dieren, wat suggereert dat eventuele gedrags verschillen in mdx muizen niet de wijzigingen in de vrijwillige ambulation rijdt.

Open veld testen worden veel gebruikt in behavioral paradigma's zo goed zoals in studies van motor functie, en er zijn een verscheidenheid van parameters die van activiteit monitoring systemen kunnen worden opgenomen. Sommige van deze metingen gebruikte in de software van de analyse van de commerciële activiteit omvatten de automatische detectie van specifieke gedragingen, frequenties, verticale beweging en voorkeuren voor specifieke regio's van belang. Voor de 6 minuten durende ambulation afstand assay gebruikt in deze studie, is de output grotendeels beperkt tot de afstand en snelheid van horizontale ambulation.

Bovendien, als gevolg van het niveau van de invoer van de gebruiker vereist voor semi-automatische tracking in dit protocol, zou deze test waarschijnlijk niet geschikt voor activiteit monitoring voor langere tijd of meerdere dieren tegelijk meten. In deze studie vonden we dat een opgeleide gebruiker kan verwerken en extraheren van gegevens uit video's in ongeveer 15-30 min per opname. Terwijl dit slechts een matige tijd last voor kleinschalige experimenten vertegenwoordigt, zou dit niveau van analyse snel worden onbetaalbaar voor studies op zoek grote sample sets over een langere periode. Terwijl meer volledig geautomatiseerde commerciële opspoor Systemen meestal meer dan 20.000 dollar kosten, kunnen deze oplossingen meer kosten - en tijd-effectief voor laboratoria waar ambulation wordt vaak getest worden. Voor laboratorium en educatieve instellingen die alleen kleine aantallen dieren te testen, biedt de eenvoudige set-up en de reproduceerbaarheid van deze bepaling echter een waardevol instrument voor het beoordelen van gedrag van de motor.

De vormen van data-analyses die beschikbaar zijn een belangrijke overweging bij de vaststelling van passende eindpunt testen voor een pre-klinische studie. Terwijl wij waren kundig voor speurder consequent verschillen tussen drie genotypen met behulp van 6 minuten ambulation afstand (wild-type, mdxen mdx: utr-tg), een meer complexe analyse van de langerlopende activiteit kan het wenselijk zijn als we kijken subtiele wijzigingen in vrijwillige beweging. Echter, de toegankelijkheid en de eenvoud van deze goedkope set-up maken het een nuttig en relevant functionele test voor pre-klinische studies in de mdx -muismodel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Video camera	Apple Inc.	ME553LL/A	For recording ambulation video, iPhone 5S Plus (or equivalent)
Kinovea software (version 0.8.15)	Kinovea Association		Open source video analysis software. Free download, PC compatible (Version 0.8.15, www.kinovea.org)
iMovie (version 10.0.6)	Apple Inc.		Any similar software can be used to reduce video frame rate (optional)
Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bin (Open field chamber)	Rubbermaid	# 1778013	Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin.
Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (Open field chamber)	US Acrylic, LLC		Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin.
C57BL/6J	Jackson Laboratory	#000664	Male 6 month mice
C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx)	Jackson Laboratory	#001801	Male 6 month mice
mdx: utrophin-Tg (fiona)	Gift from from James Ervasti, with permission from Kay Davies		Male 6 month mice