Summary
פרוטוקול זה מתאר מערכת גמישה, בעלות נמוכה למדידת העכבר ambulation ב assay פעילות שדה פתוח. אנו מראים כי וזמינותו 6 דקות ambulation מבוסס על מערכת זו מזהה ירידה בהיקף התנועה הרצונית בעכברים mdx , במדויק מבדיל שיפור חילוץ שרירים ספציפיים של חיות אלו.
Abstract
מדידת תוצאות תפקודי בטיפול של ניוון שרירים היא היבט חיוני של בדיקות פרה. להערכת ambulation מרצון במודלים של העכבר נמצא assay פעילות פולשנית לשחזור ישירות מקביל מדדים של המטופל ambulation כגון הבדיקה 6 דקות הליכה, הקשורים עשרות ניידות. שיטות נפוצות רבות לבדיקת מהירות ambulation העכבר והמרחק מבוססים על הבדיקה בשדה פתוח, שבו תנועה חופשית של חיה בתוך זירה נמדד לאורך זמן. אחת החיסרון העיקרי לגישה זו תוכנה מסחרית, ציוד ברזולוציה גבוהה ההצעה מעקב יקר, עשוי לדרוש העברת עכברים מתקנים מיוחדים לבדיקה. כאן נתאר מערכת בעלות נמוכה, מבוססי-וידאו למדידת ambulation העכבר אשר מנצל תוכנה חופשית, קוד פתוח. באמצעות פרוטוקול זה, נדגים את ambulation מרצון במודל עכבר הדיסטרופין null mdx עבור ניוון שרירים דושן (DMD) היא ירידה יחסית העכבר פראי-סוג הפעילות. ב- mdx עכברים המבטאים את transgene utrophin, גירעונות אלה פעילות שאינם קיימים, המרחק הכולל נסע להבחין מגניחותיה פראי-סוג עכברים. שיטה זו יעילה למדידת שינויים ambulation מרצון המשויך פתולוגיה dystrophic, מספקת פלטפורמה תכליתי ניתן בקלות להתאים להגדרות מחקר מגוונים.
Introduction
מדידות לשחזור ואמין של תפקוד השרירים הם קריטיים עבור הערכת יעילותם של טיפולים פוטנציאליים עבור DMD. DMD היא הפרעה גנטית נגרמת על ידי מוטציות בגן הדיסטרופין, שמוביל חולשת שרירים מתקדמת, אובדן של ambulation, וכישלון כך בסופו של דבר. הדגם בעל חיים הנפוצה ביותר של DMD הוא העכבר הדיסטרופין null mdx . סדרת בדיקות תפקודי הופיעו כמו מבחני שגרתיות להערכת התקדמות המחלה mdx העכבר באותה מידה כמו דומה מודלים חייתיים של dystrophies ו myopathies אחרים. מבחני נפוץ ויוו לכלול מדידות של כוח אחיזה forelimb, חוט תלוי זמן, מקסימום rotarod, זמן עד כדי אפיסת כוחות במהלך הליכון ריצה, מנוע פעילות מעקב. יש כבר מאמץ ניכר בשטח לתקנן את בדיקות אלה, במטרה להפחית את השתנות בין מחקרים פרה, להגדלת הפוטנציאל translational הרפוי נבדק עכברים1,2.
קטגוריה חשובה אחת של בדיקות פרה הוא המדד של התנועה הרצונית, פרמטר זה היא שונה לעתים קרובות במודלים מאתר של ניוון שרירים. זה בדרך כלל נבדק על ידי מבחני בהתבסס על ניטור פעילות בשטח פתוח, אפשר להעריך (הליכה) אופקי או אנכי (גידול) תנועות במהלך מספר דקות או שעות2,3,4. מספר מחקרים הראו התנועה הרצונית לשנות בעכברים mdx , בעיקר לאחר פעילות גופנית, מדידות אלה הוכחו להיות רגיש התקדמות המחלה וטיפול סמים. מגבלה אחת גדולה בביצוע מבחני אלה הוא הצורך עבור ציוד מיוחדים, עלות גבוהה. כאן מוצגת שיטה נמוכים העוקבת אחר ambulation העכבר באמצעות משאבים זמינים.
המרחק 6 דקות הליכה הוא מדד של נפוץ ככלי הערכה קלינית אצל אנשים עם דושן ניוון שרירים5,6. שינויים של אמצעי זה שימשו כדי להעריך את תוצאות במודלים חייתיים של דושן, כולל mdx עכברים7 ו- כלבי גולדן רטריבר ניוון שרירים (GRMD)8. במחקר זה, אנחנו מקליטים תנועה התנדבותית בשטח פתוח בתוך 6 דקות מיד לאחר אתגר פעילות גופנית מתונה. מרחק ambulation מכן מחושב באמצעות תוכנת קוד פתוח בחינם כדי למדוד תנועה אופקית לאורך זמן.
היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי בעלי חיים יכול להיבדק במגוון של הגדרות מבלי להזדקק ציוד מיוחד או תוכנה מסחרית עלות גבוהה לצורך ניתוח. היבט אחד חשוב של ניתוח זה הוא כי זה יכול להתבצע באווירה מעבדה בסיסית ללא צורך לעבור או להעביר עכברים החוצה ביבר למתקן הליבה מיוחדים. פרוטוקול מעקב וידאו המתוארים כאן הוא מתאים היטב ההערכה של ambulation על פני תקופות זמן קצר יחסית אפשר לזהות פעילות ההבדלים בין פראי-סוג של mdx עכברים, וכן לחשוף שיפור תפקודי חילוץ דגם של DMD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה ב אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס. פראי-סוג (C57BL/6J) ועכברים mdx (רקע C57Bl/10ScSn) נרכשו ממקור מסחרי. mdx: עכברים utrophin-Tg היו מתנה של ג'יימס Ervasti, באישור קיי דיוויס, ומתוחזק היו על רקע mdx . מבחני ambulation נערכו על עכברים זכרים במהלך בגיל 6 חודשים. עכברים היו מתוחזקים ביומן ביבר מדעי החיים Terasaki בעקבות הנחיות שנקבעו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס (לאישור #2000-029-43) ו אישור עבור מחקרים אלה הוענקה על ידי אבטחת רווחת החיה UCLA (אישור #A3196-01).
1. הכנת קאמרית
- לבצע איסוף נתונים בחדר שקט, מבוקרת טמפרטורה בזמן עקבית של יום9. לבצע את הבדיקות לראות את גנוטיפ והטיפול של העכבר הנבדקת.
- להתאים כל מערכת קאמרית בשדה פתוח לניתוח זה.
הערה: במחקר זה, אנו משתמשים חדר הקלטה בקלות יביל וזולה בנוי פח אשפה גדול. הזירה בשטח פתוח הוא מגש להגדיר כלוב או פלטפורמה מוגבהת דומה. - מניחים את המצלמה על מחוט מתכת מעל תא להקליט על פני הזירה המלאה.
- ניקוי תא הקלטה עם חומר חיטוי לפני כל משפט.
2. מראש תרגיל פרוטוקול ואיסוף נתונים
- באופן אופציונלי, מייד לפני פעילות הקלטה, לאתגר כל עכבר עם פרוטוקול הפעלת שרירים.
הערה: זה הוא אופציונלי אך מומלץ בניסויים המערבים עכברים mdx .- לאפשר את העכבר כדי אחיזה בבר משיכה של לאמוד כוח דיגיטלי ומשוך בעדינות בחזרה עד הבר למשוך לפרסומו. חזור על הליך זה חמש פעמים לכל משפט.
- שיא שיא המתח (N) בכל ניסוי.
הערה: בנוסף להיותם אתגר תרגיל עבור וזמינותו ambulation, הכוח שהופעל על ידי החיה במהלך הזה assay חוזק אחיזה יכול לשמש2,מדד תוצאה פונקציונלית נוספים10. - לבצע חמישה מחקרים הכולל עבור כל עכבר עם 1 דקות מנוחה בין בכל ניסוי.
- מיד לאחר וזמינותו חוזק אחיזה או פרוטוקול אחר של פעילות גופנית, מקם את העכבר בבית הבליעה פעילות.
- התחל הקלטת וידאו של התנועה של העכבר בזירה קאמרית. לאפשר את העכבר כדי לחקור באופן חופשי במשך 6 דקות.
- להפסיק את 6 דקות ולחזור על העכבר לכלוב שלה הביתה.
3. ניתוח וידאו
- לחלופין, להכין וידאו עבור ניתוח על-ידי הפחתת קצב המסגרות. על מנת להפחית את קצב המסגרות עבור מעקב אחר ניתוח, להשתמש בפרוטוקול הבא וידאו עריכה תוכנה (למשל, קדמונית או בתוכנית דומה) תשמידי את קצב המסגרות הסרטונים לפי פקטור של 2.
הערה: בהתאם אורך וקצב המסגרות של הוידאו, זה עשוי להיות שימושי כדי להקטין את קצב מוידאו לפני ניתוח. במחקר זה, צולם ב 30 מסגרות לשנייה (6 דקות הקלטה, סה כ מונעת 10,800 מסגרות).- טעינת הוידאו לתוך התוכנה.
- תחת תפריט 'מהירות', בחר ' מהירות: מהר ' והגדר מהירות 2 x.
- ייצוא וידאו המושמדות בתבנית קובץ .mp4 למעקב אחר ניתוח.
- לפתוח את הסרטון לניתוח בו התוכנה. הגדר הכיול עבור הקלטת על-ידי שימוש בכלי שורת הוידאו. צייר קו לאורך צד אחד של התא. לחץ לחיצה ימנית על הקו ובחר "מדד כיול..." הזן את הגודל הממשי של הצד קאמרית בסנטימטרים.
- כדי להתחיל מעקב אוטומטי למחצה של העמדה העכבר, לחץ על הסמן 'העברה'.
החל המסגרת הראשונית בסרט הווידאו, לחץ לחיצה ימנית על הנקודה לבצע אחריהם מעקב; נקודת מעקב מסומן בעיגול כחול.
הערה: במחקר הנוכחי, המיקום של כל בעל חיים היה מעקב ע י איתור בבסיס הזנב. - לקדם את המסגרת על-ידי לחיצה על החץ ימינה על המקלדת. נקודת מעקב תנוע באופן אוטומטי בהתבסס על מיקומה של בסיס הזנב.
- אם המיקום מעקב אינו מתואם עם נקודת עניין בתוך מסגרת נתונה, באופן ידני ליישר את העיגול הכחול אל בסיס הזנב.
הערה: בהתאם לאיכות הווידאו ואת המהירות של העכבר, המעקב עשוי לדרוש רמות מגוונות של קלט משתמש כדי לשמור על היישור באמצעות נקודת עניין. הנתיב של העכבר צריך לקדם את דרך הקורס של הוידאו.
- אם המיקום מעקב אינו מתואם עם נקודת עניין בתוך מסגרת נתונה, באופן ידני ליישר את העיגול הכחול אל בסיס הזנב.
- בתום מעקב של וידאו מלא, לשמור את הסרטונים והמעקב הכיסוי. יצא את הנתונים לפי מיקום של העקיבה על-ידי בחירה "לייצא את הגיליון האלקטרוני".
4. ניתוח נתונים
- לפתוח בנתונים מיקומיים תוכנית גיליון אלקטרוני. תוכנת ניתוח תנועה דוחות ש-x, Y לתאם בין המיקום של העכבר בכל מסגרת.
- כדי לחשב מרחק שהושג על ידי מסגרת, השתמש במשוואה הבאה (איפה עמדה במסגרת אחד x1, y1 ומסגרת שני הוא x2, y2):
הערה: ניתן לחשב מרחק מצטבר לאורך זמן על-ידי הוספת את המרחק בין כל מסגרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
וריאציות של שדה פתוח וזמינותו הוכחו להיות שיטה יעילה כדי לבחון את התקדמות המחלה במודלים של ניוון שרירים. . הנה, נדגים וידאו רב-תכליתי מעקב אחר שיטה לניתוח של תנועת העכבר מימדי באמצעות ציוד הקלטה זמינים ותוכנות קוד פתוח (איור 1 א'–B). דיווח על מסתדר עם תוצאות של מבחני דומים, אנו מראים כי עכברים mdx תגר עם פרוטוקול תרגיל מיד לפני בדיקה מראה באופן משמעותי פחות התנועה הרצונית של פעילות בשטח פתוח 6 דקות יותר פראי-סוג עכברים (איור 1C , איור 2). בעקבות מהפעלת אתגר חוזק אחיזה, mdx עכברים מתון בדרך כלל נשארים עדיין הדקות הראשונות של פרוטוקול ambulation, עם עלייה צנועה בתנועה דקה 4 עד 5 (איור 3 א). בעת בדיקת חיות פראי-סוג של mdx ללא אתגר תרגיל, הבחנו אין הבדל סה כ מרחק שהושג (איור 2).
. זה עקבי עם דוחות מקבוצות אחרות מסתכל מבחני תנועה דומה, עם unexercised mdx מציג אין הבדל או ירידות קטנות יחסית פראי-סוג עכברים. בנוסף הערכנו העכברים הטרנסגניים לבטא רמות גבוהות של utrophin כדי לבחון את רמת הרגישות של שלנו assay (mdx: utr-tg, פיונה קו)11,12. Mdx: utr-tg הוא מודל הצלה חזקים של פנוטיפ mdx עם כמה תכונות dystrophic. לאחר פעילות גופנית, עכברים mdx לבטא utrophin היו להבחין מגניחותיה פראי-סוג, עם הבדל משמעותי בהמרחק הכולל נסע (איור 3B) או בכל הזמן המצטבר מצביע נמדד (איור 3 א).
מעקב מבוססי וידאו מסתמך על מסגרת-על השתנות, נמדד גם הצופה ידנית הניקוד או על ידי זיהוי תוכנה אוטומטיות. ניתוח תנועה חופשית וקוד מקור פתוח תוכנה מאפשר זיהוי אוטומטי למחצה של תנועת בעלי חיים, שבו תנועות מבלי שיבחינו או מוערכים יתר על המידה ניתן ידנית לתקן כפי המעקב הפעילות נוצרת. כדי למזער את עיבוד נתונים ב- assay הזה, אנחנו לביצוען קטעי וידאו מקוריים מ 30 fps מוקלטות כדי 15 fps. כדי לקבוע את ההשפעה של הקטנת קצב הדגימה, מדדנו סה כ מרחק נסע מ 1 דקות של וידאו קצב מסגרת מלאה, ואז לעומת מדידות מרחק נגזר מגירסאות לביצוען של קבוצת הנתונים (איור 4A). . מצאנו את הפחתת קצב המסגרות בחצי (דקימאטיו ב- 2) ירד המרחק נמדד ב- 5.0% ומחושב להפחית את קצב המסגרות נמוך ככל 7.5 fps נשמר כמעט 90% של המרחק המקורי (89.2% מרחק מ וידאו 30 fps). הדיוק של המרחק נמדד הוריד בחדות לאחר הנקודה הזו למרות datasets אפילו מאוד להחרבת לקרב עדיין מקרוב את ערכיהן הנתיב של החיה (איור 4B). תצפיות אלה להדגיש את חשיבות בהתחשב במסגרת שיעור ו עיבוד בהערכת פעילות בעלי חיים, ומדגימים כי ניתן להיעזר רזולוציה מרחבית גבוהה בנתוני וידאו לביצוען.
איור 1: נציג פתח שדה עקבות של מרחק 6 דקות ambulation. (א) הגדרת לשכת פעילות הקלטה השתמשו במחקר זה. גריפ מד שימש לפני אתגר תרגיל assay, ולאחר מכן ambulation חינם הוקלט על פלטפורמת בשטח פתוח. תמונה ללא הפרדות צבע (B) של הקלטת עם ניתוח מעקב בתנועה תוכנת מעקב וידאו 6 דקות. (ג) כיסוי של שני סימנים. נציג (WT, אפור, n = 1; mdx, אדום, n = 1). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ההשפעה של פעילות גופנית על mdx ambulation. ambulation 6 דקות מרחקים הוקלטו ב 6 חודשים של גיל עם או ללא פעילות גופנית מוקדמת (ממניעים שאינם mdx n = 5, WT n = 4; ממניעים mdx n = 5, WT n = 5). הבדל משמעותי נצפתה בין WT mdx כאשר unexercised, אבל הבדל משמעותי נראתה בעכברים ממניעים לפני assay (בלי התעמלות: WT 1077.0± 106.4 ס"מ, mdx 971.0 ± ס מ 36.16; שלאחר פעילות גופנית: WT 770.2 ± 30.75 ס מ, ± mdx 127.8 36.16 ס מ). נתונים מייצגים אומר ± סטטיסטיקה ב- SEM מחושב באמצעות ANOVA דו-כיווני ואחריו Tukey מבחן השוואה מרובים (*p < 0.05, * *p < 0.01, * * * p < 0.001 ו * * *p < 0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ביטוי הטרנסגניים utrophin משפר את ambulation בעכברים mdx . 6 דקות ambulation מרחקים הוקלטו ב 6 חודשים של גיל באמצעות חדר פעילות בשטח פתוח (WT n = 5, mdx n = 5, mdx: utr-Tg n = 4). (א) המרחק המצטבר נסע דקה. זוהה הבדל משמעותי בין WT mdx: utr-tg בשלב כלשהו. סטטיסטיקה מחושב באמצעות דו כיוונית ANOVA ואחריו Tukey הוא המבחן של השוואה מרובים (*p < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001 ו * * *p < 0.0001). (B) פתוח הכולל שדה מרחק נסע מעל 6 דקות (WT 770.2 ± 30.75 ס מ, mdx 127.8 ± ס מ 36.16, mdx: utr-Tg 701.3 ± 33.54 ס מ). נתונים מייצגים אומר ± סטטיסטיקה ב- SEM מחושב באמצעות חד-כיווני אנובה ואחריו Tukey מבחן השוואה מרובים (*p < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001 ו * * *p < 0.0001).אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: ההשפעה של קצב הדגימה על מעקב ambulation. ב עכבר פראי-סוג, 1דקות קחרמב ambulation הוקלט ולעקוב אחר באמצעות תנועה מעקב תוכנה בקצב מסגרת מלאה (30.0 fps, 1,819 סה כ מסגרות). המיקום דו-ממדית של העכבר בכל מסגרת נקבע, נתונים אלה הושמדו ואז כדי לדמות מעקב בווידאו קצב המסגרת התחתונה (30, 22.5, 20, 15, 10, 7.5, 6, 3, 1.5 ו- 0.75 fps). (א) המרחק הכולל שמחושבים קואורדינטות ב כל ערכת נתונים לביצוען. קווים מנוקדים מציגים ערכים בתוך 5% של המרחק לחשב מתוך המסגרת מלא שיעור וידאו. הנתונים במחקר זה התקבלו וידאו הצטמצמה ל 15 fps (חץ אדום). כיסויי (B) עקבות השוואת מסגרת מלאה קצב עקיבה עם 1.5 fps (לעיל) ו- 15 fps (להלן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
וזמינותו בשדה פתוח מספק דרך יעילה, לא פולשנית מבחן המוטורית במודלים של העכבר של מחלת שריר, וריאציות של assay הזה יכול לשמש כאמצעי הקצה ערך מחקרים קליניים. מגבלה אחת גדולה עם סוג זה של וזמינותו היא עלות גבוהה ומוגבל הנגישות של פעילות מערכות ניטור. במחקר זה, נדגים מערכת בעלות נמוכה עבור ניתוח פעילות שדה פתוח שיכולות לייצר תוצאות דומות קיימת תוכנה מסחרית וציוד. מערכת זו יכולה לשמש בתוך vivaria שבו שוכנות עכברים, ומבטל את הצורך להעברת חיות למתקני הליבה. צדדיות של assay זו מאפשרת גם השימוש של וידאו מעקב במגוון רחב של מחקר, חינוכיות, כולל קורסים לתואר ראשון מעבדה התמקדו פיזיולוגיה של בעלי חיים ואת ההתנהגות.
במחקר זה, מצאנו כי הבדלים התנועה הרצונית בין עכברים פראי-סוג של mdx ניתן בקלות שזוהו החרפה הבאים על ידי פעילות גופנית. ההבדל חסון דווחה על-ידי קבוצות אחרות, מסתכל על תוצאות פעילות דומה, כולל מבחני שדה פתוח להעברתו והגידול בן לילה מבחני. בזמן שצפינו בהם אין הבדל ambulation מרצון בין unexercised פראי-סוג mdx עכברים, זה עקבי עם תוצאות אחרות קבוצות13. יש חוקרים דיווחו את ההבדל צנוע מרצון ambulation המרחק בין unexercised פראי-סוג mdx עכברים7, ואילו אחרים הדו ח אין הבדל13. הממצאים שלנו תומך בשימוש של הפעלת השריר לפני בדיקות כדי לזהות באופן אמין הבדל משמעותי סטטיסטית בפעילות mdx .
במחקר זה, הצגנו עכברים עם סביבה הרומן בשטח פתוח. באמצעות פרוטוקול זה הרומן סביבה, הבחנו השתנות מעט מאוד בתוך קבוצות. עם זאת, כאשר עכברים ממוקמים בסביבה לא מוכרת, הם נוטים מוגברים פעילות14. אם החיות באותה להיבדק על-פני הפעלות מרובות, בעלי חיים צריך להיות בלתי לחדר ההקלטה, עוברים את פרוטוקול מבחן מלא פעמים רבות לפני הקלטת נתונים.
אחד שיקול חשוב בהערכת נתוני מבחני שדה פתוח היא שזה רגישה מאוד התנהגות בעלי חיים ומצבים רגשיים, התנהגויות כמו חרדה במיוחד. זה אפשרי כי mdx עשויה להיות תגובה התנהגותית שונה הסביבה הרומן מאשר החיות פראי-סוג הבקרה. עם זאת, בדקנו בנוסף הצלה שרירים ספציפיים, mdx: העכבר utr-Tg, המבטאת utrophin תחת מקדם שרירים ספציפיים. אלו עכברים שבוצעו וכן בעלי חיים פראי-סוג, רומז כי כל הבדלים התנהגותיים בעכברים mdx אינם מרחיקים את השינויים ב- ambulation מרצון.
מבחני שדה פתוח נמצאים בשימוש נרחב התנהגותית פרדיגמות באותה מידה כמו מחקרים של המוטורית, ויש מגוון רחב של פרמטרים שניתן לתיעוד של מערכות ניטור פעילות. חלק מדידות אלה נפוץ פעילות מסחרית ניתוח תוכנה כוללים את הגילוי האוטומטי של התנהגויות ספציפיות, פנו תדרים, תנועה אנכית, והעדפות לאזורים מסוימים של עניין. עבור וזמינותו מרחק 6 דקות ambulation השתמשו במחקר זה, הפלט הוא מוגבל במידה רבה מרחק ומהירות של ambulation אופקי.
בנוסף, בשל רמת קלט המשתמש הנדרש לצורך מעקב אוטומטי למחצה של פרוטוקול זה, assay זה סביר לא תהיה מתאימה עבור פעילות פיקוח עבור תקופות זמן ארוכות יותר או מדידת חיות מרובים במקביל. במחקר זה, מצאנו כי משתמש מיומן יכול לעבד, לחלץ נתונים מתוך סרטי וידאו בכ-15-30 דקות לכל הקלטה. בזמן זה מייצג רק נטל זמן בינוני לניסויים בקנה מידה קטן, רמה זו של ניתוח במהירות יהפוך אוסרני עבור מחקרים מחפש ערכות מדגם גדול במשך פרק זמן ארוך יותר. בעוד מערכות אוטומטיות יותר מלא מסחרית המעקב עולה בדרך כלל יותר מ- 20,000 דולר ארה ב, פתרונות אלה עשוי להיות יותר עלות, זמן-אפקטיביות עבור מעבדות שבו נבדק בתדירות גבוהה ambulation. עם זאת, מעבדה והגדרות החינוכי לבחון רק מספר קטן של בעלי חיים, פשוט הגדרת הפארמצבטית של assay הזה מספק כלי חשוב להערכת התנהגות מוטורית.
סוגי ניתוח הנתונים הזמינים הם שיקול חשוב בקביעת מבחני נקודת הקצה המתאימה למחקר טרום קליניים. בזמן שהיינו מסוגלים בעקביות לזהות הבדלים בין שלושה אחרים באמצעות מרחק ambulation 6 דקות (פראי-סוג mdx, mdx: utr-tg), ניתוח מורכב יותר של פעילות וקהילותיהם עשוי להיות רצוי כאשר מסתכלים על עדינות שינויים בתנועה בהתנדבות. אולם, הנגישות ואת הפשטות של הגדרת נמוכים זה להגיע בדיקה פונקציונלית מאוד רלוונטי ושימושי עבור מחקרים קליניים במודל עכבר mdx .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מכוני הבריאות הלאומיים [R01 AR048179 ו R01 HL126204 R.C.W, T32 AR059033, F32 AR069469to כרומטוגרפיה] וארה ב ניוון שרירים האגודה [274143 ו- 416364 כדי R.C.W.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Video camera | Apple Inc. | ME553LL/A | For recording ambulation video, iPhone 5S Plus (or equivalent) |
| Kinovea software (version 0.8.15) | Kinovea Association | Open source video analysis software. Free download, PC compatible (Version 0.8.15, www.kinovea.org) | |
| iMovie (version 10.0.6) | Apple Inc. | Any similar software can be used to reduce video frame rate (optional) | |
| Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bin (Open field chamber) | Rubbermaid | # 1778013 | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. |
| Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (Open field chamber) | US Acrylic, LLC | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. | |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | #000664 | Male 6 month mice |
| C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) | Jackson Laboratory | #001801 | Male 6 month mice |
| mdx: utrophin-Tg (fiona) | Gift from from James Ervasti, with permission from Kay Davies | Male 6 month mice |
References
- Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2. 2, (2010).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785 (2014).
- Kobayashi, Y. M., et al. Sarcolemma-localized nNOS is required to maintain activity after mild exercise. Nature. 456 (7221), 511-515 (2008).
- Belanto, J. J., et al. Microtubule binding distinguishes dystrophin from utrophin. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5723-5728 (2014).
- McDonald, C. M., et al. The 6-minute walk test in Duchenne/Becker muscular dystrophy: longitudinal observations. Muscle Nerve. 42 (6), 966-974 (2010).
- Mazzone, E., et al. Star Ambulatory Assessment, 6-minute walk test and timed items in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 20 (11), 712-716 (2010).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
- Acosta, A. R., et al. Use of the six-minute walk test to characterize golden retriever muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 26 (12), 865-872 (2016).
- Sousa, N., Almeida, O. F., Wotjak, C. T. A hitchhiker's guide to behavioral analysis in laboratory rodents. Genes Brain Behav. 5, Suppl 2. 5-24 (2006).
- Gibbs, E. M., et al. High levels of sarcospan are well tolerated and act as a sarcolemmal stabilizer to address skeletal muscle and pulmonary dysfunction in DMD. Hum Mol Genet. 25 (24), 5395-5406 (2016).
- Gillis, J. M. Multivariate evaluation of the functional recovery obtained by the overexpression of utrophin in skeletal muscles of the mdx mouse. Neuromuscul Disord. 12, Suppl 1. S90-S94 (2002).
- Tinsley, J., et al. Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med. 4 (12), 1441-1444 (1998).
- Song, Y., et al. Suite of clinically relevant functional assays to address therapeutic efficacy and disease mechanism in the dystrophic mdx mouse. J Appl Physiol. 122 (3), 593-602 (2017).
- Bolivar, V. J. Intrasession and intersession habituation in mice: from inbred strain variability to linkage analysis. Neurobiol Learn Mem. 92 (2), 206-214 (2009).
