Summary
该协议描述了一个灵活的, 低成本的测量鼠标移动在野外活动的测试系统。我们显示, 基于这个系统的6分钟的步行试验检测到在mdx小鼠中自愿运动的减少, 并准确地区分了这些动物的肌肉特异性抢救的改进。
Abstract
在肌营养不良症的治疗中, 测量功能性结局是临床前测试的一个重要方面。在小鼠模型中自愿移动的评估是一种非侵入性的和可重复的活性测定方法, 与患者步行6分钟的测量和相关的移动评分直接类似。许多测试鼠标移动速度和距离的常用方法都是基于野外试验, 在这个测试中, 动物在竞技场中的自由运动是随着时间的推移而测量的。这种方法的一个主要缺点是, 用于高分辨率运动跟踪的商用软件和设备成本高昂, 可能需要将鼠标转移到专门的设备进行测试。在这里, 我们描述了一个低成本, 视频的测量鼠标移动的系统, 利用自由和开源软件。使用这个协议, 我们证明, 自愿移动在肌营养不良蛋白-无效的假mdx小鼠模型的杜氏肌肉萎缩症 (DMD) 是减少相对于野生类型的鼠标活动。在表达 utrophin 转基因的mdx小鼠中, 没有观察到这些活动的缺陷, 并且总的移动距离与野生型小鼠是无法区分的。这种方法是有效的测量变化的自愿步行与不良病理学, 并提供了一个多才多艺的平台, 可以很容易地适应不同的研究设置。
Introduction
可靠和可重复的测量肌肉功能是关键的评估潜在的治疗 DMD 的疗效。DMD 是由肌营养不良蛋白基因突变引起的遗传性疾病, 导致渐进性肌肉无力, 移动丧失, 最终心肺衰竭。最广泛使用的 DMD 的动物模型是肌营养不良蛋白-空mdx鼠标。在mdx鼠标以及其他营养和病的类似动物模型中, 一组功能测试已成为评估疾病进展的常规方法。通常使用的在体内测试包括测量前肢握力, 导线悬挂时间, rotarod 最大, 在跑步机跑步的时间和运动活动跟踪的疲劳。在这一领域, 为了使这些测试标准化, 有了很大的努力, 目的是减少前临床研究的变异性, 提高在小鼠体内测试的治疗的转化潜能1,2。
临床前测试的一个重要类别是测量自愿运动, 这一参数在小鼠肌肉萎缩症模型中经常被改变。这通常是通过基于野外活动监测的分析来测试的, 并且可以在几分钟或数小时的过程中评估水平 (行走) 或垂直 (饲养) 运动,2,3,4。一些研究表明, 在mdx小鼠中, 特别是在运动之后, 自愿改变的运动, 这些测量结果对药物治疗和疾病进展很敏感。执行这些化验的一个主要限制是需要专门的、高成本的设备。在这里, 一个低成本的方法, 跟踪鼠标移动使用现成的资源。
6分钟步行距离是一种常用的标准作为临床评估工具的个人杜氏肌营养不良症5,6。这项措施的修改已被用来评估杜氏动物模型的结果, 包括mdx小鼠7和金毛猎犬肌肉萎缩症 (GRMD) 狗8。在这项研究中, 我们记录自愿开放野外运动在6分钟后, 紧接着一个温和的运动挑战。然后使用自由开源软件计算移动距离, 以测量随时间推移的水平移动。
这种方法的主要优点是可以在不同的环境中测试动物, 而无需专门的设备或昂贵的商业软件进行分析。这一分析的一个重要方面是, 它可以在一个基本的实验室设置, 而无需移动或转移到一个专门的核心设施 vivarium 小鼠。这里描述的视频跟踪协议非常适合于对相对较短的青年进行移动评估, 并且能够检测出野生类型和mdx小鼠之间的活动差异, 并揭示了救援中的功能改进模型的 DMD。
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Protocol
这里描述的方法得到了加州大学洛杉矶分校动物保育和使用委员会的批准。野生类型 (C57BL/6J) 和mdx小鼠 (C57Bl/10ScSn 背景) 是从商业来源购买的。mdx: utrophin-Tg 小鼠是来自 Ervasti 的礼物, 得到了凯戴维斯的许可, 并在mdx背景上进行了维护。6月龄雄性小鼠进行了步行试验。老鼠在 Terasaki 生命科学 Vivarium 被维护了由动物看护和用途委员会建立的指南在加利福尼亚大学洛杉矶 (批准 #2000-029-43) 和批准为这些研究被授予由加州大学洛杉矶分校动物福利保证 (批准 #A3196-01)。
1. 分庭的筹备工作
- 在一天的9的一致时间内, 在安静、温度控制的房间中执行数据收集。对被测试的小鼠进行基因型和治疗的盲测试。
- 对任何开放的野外室系统进行适应性分析。
注意: 在这项研究中, 我们使用一个廉价的, 易于运输的记录室建造从一个大的垃圾箱。野外竞技场是一个托盘设置在笼或类似的高架平台。 - 把相机放在房间上方的铁丝网上, 在整个竞技场上记录下来。
- 每次试验前用消毒剂清洗记录室。
2. 演习前的协议和数据收集
- (可选) 在活动录制之前, 使用肌肉激活协议挑战每个鼠标。
注意: 这是可选的, 但在涉及mdx小鼠的实验中推荐使用。- 允许鼠标握住数字力计的拉杆, 然后轻轻地向后拉动, 直到松开拉杆。每次试用重复此步骤五次。
- 记录每项试验的峰值张力 (N)。
注意: 除了作为运动试验的挑战, 在这一握力测定过程中, 动物施加的力可以作为一个额外的功能结果测量2,10。 - 对每只老鼠进行五次总试验, 每次试验1分钟休息。
- 紧跟握力测定或其他运动协议后, 将鼠标置于活动室。
- 启动在会议厅竞技场的鼠标移动的视频记录。允许鼠标自由探索6分钟。
- 停止录制在6分钟, 并将鼠标返回到其主笼。
3. 视频分析
- (可选) 通过降低帧速率为分析准备视频。为了减少跟踪分析的帧速率, 请在视频编辑软件 (例如、iMovie 或类似程序) 中使用以下协议, 将视频帧速率降低2倍。
注意: 根据视频的长度和帧速率, 在分析前降低视频帧速率可能是很有用的。在本研究中, 录像记录在30帧/秒 (6 分钟录音, 约10800帧总数)。- 将视频加载到软件中。
- 在 "速度" 菜单下, 选择 "速度: 快速", 并设置速度为2x。
- 以. mp4 文件格式导出被破坏的视频以进行跟踪分析。
- 在软件程序中打开视频进行分析。使用 "线条" 工具设置视频录制的校准。沿着房间的一侧画一条线。右键单击该行, 然后选择 "校准测量..."以厘米为单位输入实际大小的腔室侧。
- 要开始半自动跟踪鼠标位置, 请单击 "移动" 光标。
从视频的初始帧开始, 右键单击要跟踪的点;跟踪点用蓝色圆圈标记。
注意: 在本研究中, 每只动物的位置都通过跟踪尾巴的底部来跟踪。 - 通过单击键盘上的右箭头来前进框架;跟踪点应根据尾部底座的位置自动移动。
- 如果跟踪位置与给定帧中的兴趣点不一致, 请手动将蓝色圆圈与尾部的底座对齐。
注意: 根据视频的质量和鼠标的速度, 跟踪可能需要不同级别的用户输入, 以保持与感兴趣点的对准。鼠标的路径应该在视频过程中前进。
- 如果跟踪位置与给定帧中的兴趣点不一致, 请手动将蓝色圆圈与尾部的底座对齐。
- 完整视频的跟踪完成后, 保存视频和跟踪覆盖。通过选择 "导出到电子表格" 导出跟踪的位置数据。
4. 数据分析
- 在电子表格软件程序中打开位置数据。移动分析软件在每个框架中报告鼠标的 X、Y 坐标位置。
- 要计算帧移动的距离, 请使用以下公式 (其中第一帧的位置为 x1, y1 , 第二帧为 x2, y2):
注: 随着时间的推移, 累积的距离可以通过增加每个帧之间的距离来计算。
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Representative Results
开放野外试验的变化已被证明是一种有效的方法来测试疾病进展的模型肌肉萎缩症。在这里, 我们演示了一种通用的视频跟踪方法, 用于分析 two-dimensional 鼠标移动使用现成的记录设备和开源软件 (图 1A-B)。与类似分析报告的结果一致, 我们显示mdx小鼠在测试之前, 在一个6分钟的野外任务中, 比野生型小鼠更少的自愿运动挑战 (图1C,图 2)。随着握力挑战的轻度消耗, mdx鼠标在移动协议的最初几分钟内通常仍然保持不动, 并且在移动时的动作量会适度增加4到 5 (图 3A)。在测试野生类型和mdx动物时, 如果没有运动挑战, 我们检测到的总距离没有差异 (图 2)。
这是与其他组的报告相一致的, 研究类似的运动分析, 未mdx显示与野生型小鼠没有区别或小的减少。我们还对表达高水平 utrophin 的转基因小鼠进行了评估, 以测试我们的检测灵敏度 (mdx: utr-tg, 菲奥娜线)11,12。mdx: utr-tg 是一种具有少量不良特征的mdx表型的健壮的救援模型。在练习之后, 表达 utrophin 的mdx小鼠与野生类型是无法区分的, 在总的距离 (图 3B) 或所测量的任何累计时间点 (图 3A) 上没有显著差异。
视频跟踪依赖于帧的可变性, 通过手动观察评分或自动软件检测来衡量。自由和开放源码运动分析软件允许对动物运动进行半自动检测, 在这种情况下, 在生成活动轨迹时, 可以手动纠正未被察觉或高估的运动。为了最大限度地减少数据处理在这个分析, 我们缩减原始的录影从被记录的 30 fps 到 15 fps。为了确定降低采样率的效果, 我们测量了1分钟全帧速率视频的总距离, 然后比较了从缩减版本的数据集 (图 4A) 导出的距离测量。我们发现, 将帧速率降低一半 (抽取 2) 将测量的距离降低了 5.0%, 并将帧速率降低为 7.5 fps 保留了近90% 的原始距离计算 (89.2% fps 视频的距离)。在这一点之后, 测量距离的精确度急剧下降, 虽然即使是高度毁灭的数据集仍然接近动物的路径 (图 4B)。这些观察强调了在评估动物活动时考虑帧速率和信号处理的重要性, 并证明了高空间分辨率可以保留在缩减的视频数据中。
图 1: 具有代表性的野外移动距离6分钟的痕迹.(A) 在本研究中使用的活动记录室的设置。握力仪是用于运动的挑战之前的化验, 然后自由移动记录在开放的野外平台。(B) 在运动跟踪软件中使用跟踪分析的6分钟视频录制的复合图像。(C) 覆盖两个代表性的痕迹 (重量, 灰色, n = 1;mdx, 红色, n = 1)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 运动对mdx移动的影响。6 分钟的移动距离被记录在6月的年龄有或没有事先锻炼 (non-exercised mdx n = 5, 重量n = 4; 行使了mdx n = 5, 重量n = 5)。在未时, 小波变换和mdx之间没有显著差异, 但在检测前的小鼠中有显著差异 (无运动: 体重 1077.0±106.4 厘米, mdx 971.0 ±36.16 厘米; 运动: 重量770.2 ±30.75 厘米,mdx 127.8 ±36.16 厘米)。数据代表的意思是± SEM. 统计数据使用 two-way 方差分析, 其次是 Tukey 的多个比较的测试 (*p和 #60; 0.05, ** p 和 #60; 0.01, *** p 和 #60; 0.001 和 ***p和 #60; 0.0001)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: utrophin 的转基因表达改善了mdx鼠标的移动.6分钟的移动距离被记录在6月的年龄使用开放的野外活动室 (重量n = 5, mdx n = 5, mdx: utr-Tg n = 4)。(A) 累计距离 (分钟)。在小波和mdx之间没有发现明显的差异: utr-tg 在任何一点。统计数据使用 two-way 方差分析, 其次是 Tukey 的多个比较的测试 (*p和 #60; 0.05, **p和 #60; 0.01, ***p和 #60; 0.001 和 ***p和 #60; 0.0001)。(B) 总的开放字段距离超过6分钟 (重量770.2 ± 30.75 cm, mdx 127.8 ± 36.16 cm, mdx: utr-Tg 701.3 ±33.54 厘米)。数据代表的意思是± SEM. 统计数据使用 one-way 方差分析, 其次是 Tukey 的多个比较的测试 (*p和 #60; 0.05, ** p 和 #60; 0.01, *** p 和 #60; 0.001 和 ***p和 #60; 0.0001)。请点击这里查看更大版本的这个数字。
图 4: 采样率对移动跟踪的影响.在一个野生类型的鼠标, 1 分钟的移动距离记录和跟踪使用运动跟踪软件在全帧速率 (30.0 fps, 1819 总帧)。确定了鼠标在每个帧中的 two-dimensional 位置, 然后这些数据被摧毁以在较低帧速率的视频中模拟跟踪 (30、22.5、20、15、10、7.5、6、3、1.5 和 0.75 fps)。(A) 从每个缩减数据集中的坐标计算出的总距离。虚线显示了从全帧速率视频计算出的距离的5% 以内的值。这项研究的数据是从视频中被摧毁的 15 fps (红色箭头) 获得的。(B) 覆盖的跟踪比较全帧速率跟踪与 1.5 fps (上面) 和 15 fps (下)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
野外试验提供了一种有效而非侵入性的方法来检测肌肉疾病的小鼠模型中的运动功能, 而这种检测的变异可以作为临床前研究的一项重要的终点措施。这类化验的一个主要限制是活动监测系统的高成本和有限的可及性。在这项研究中, 我们展示了一个低成本的开放现场活动分析系统, 可以产生类似的结果, 现有的商业软件和设备。该系统可以在 vivaria 的地方使用, 从而避免了将动物转移到核心设施的需要。这一分析的多功能性也使得在各种研究和教育设置中使用视频跟踪, 包括以动物生理学和行为为重点的本科生实验课程。
在这项研究中, 我们发现, 野生类型和mdx小鼠之间的自愿运动的差异, 可以很容易地发现后, 通过运动的恶化。这一强大的差异已经报告了其他团体的研究类似的活动结果, 包括 hour-long 开放现场化验和隔夜饲养化验。虽然我们观察到未野生类型和mdx小鼠之间的自愿移动没有区别, 但这与其他组13的结果是一致的。一些研究人员报告了未野生类型和mdx鼠标之间在自愿移动距离上的差异,7, 而其他报告没有差异13。我们的发现支持在测试之前使用肌肉激活, 以便可靠地检测mdx活动中的统计学意义差异。
在这项研究中, 我们提出了一个新的开放领域环境的小鼠。使用这一新的环境协议, 我们观察到小组内部很少有变化。但是, 当鼠标放置在不熟悉的环境中时, 它们的活动往往会提高14。如果同样的动物在多个疗程中被测试, 动物应该习惯于记录室并且在记录数据之前多次接受完整的测试协议。
从野外试验中评估数据的一个重要的考虑因素是它对动物的行为和情绪状况非常敏感, 尤其是焦虑样的行为。mdx可能对新环境具有不同的行为响应, 而不是野生类型的控制动物。然而, 我们另外测试了肌肉特异的抢救, mdx: utr-Tg 老鼠, 表达 utrophin 在肌肉特定促进者之下。这些小鼠的表现和野生类型的动物一样, 表明在mdx小鼠的任何行为差异都不会推动自愿移动的改变。
野外试验广泛应用于行为范式以及运动功能的研究中, 有多种参数可以从活动监测系统中记录。在商业活动分析软件中常用的一些测量方法包括自动检测特定行为、转向频率、垂直移动以及特定感兴趣区域的偏好。本研究采用的6分钟步行距离法, 其输出量主要限于水平移动距离和速度。
此外, 由于在本协议中半自动跟踪所需的用户输入级别, 这种检测可能不太适合在较长时间内进行活动监视或同时测量多个动物。在这项研究中, 我们发现, 训练有素的用户可以处理和提取数据的视频约15-30 分钟每记录。虽然这只代表了 small-scale 实验的适度时间负担, 但对于在较长时间内观察大型样本集的研究而言, 这一水平的分析将很快变得望而却步。虽然更多的全自动商业跟踪系统通常成本超过2万美元, 这些解决方案可能是更成本-和时间为实验室的移动经常测试。然而, 对于只测试少量动物的实验室和教育环境, 这种方法的简单设置和重现性为评估运动行为提供了一个有价值的工具。
可利用的数据分析类型是在确定临床前研究的适当终点化验中的重要考虑因素。当我们能够通过6分钟移动距离 (野生类型、 mdx和mdx: utr-tg) 来一致地检测出三种基因型之间的差异时, 对 longer-term 活动的更复杂的分析可能是可取的, 当看微妙自愿行动的变化。但是, 这种低成本设置的易用性和简单性使它成为mdx鼠标模型中前临床研究的有用和高度相关的功能测试。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院的资助 [R01 AR048179 和 R01 HL126204 到钢筋混凝土 W, T32 AR059033 和 F32 AR069469to 福斯特 G] 和肌肉萎缩症协会美国 [274143 和416364至 R.C.W.]。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Video camera | Apple Inc. | ME553LL/A | For recording ambulation video, iPhone 5S Plus (or equivalent) |
Kinovea software (version 0.8.15) | Kinovea Association | Open source video analysis software. Free download, PC compatible (Version 0.8.15, www.kinovea.org) | |
iMovie (version 10.0.6) | Apple Inc. | Any similar software can be used to reduce video frame rate (optional) | |
Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bin (Open field chamber) | Rubbermaid | # 1778013 | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. |
Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (Open field chamber) | US Acrylic, LLC | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. | |
C57BL/6J | Jackson Laboratory | #000664 | Male 6 month mice |
C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) | Jackson Laboratory | #001801 | Male 6 month mice |
mdx: utrophin-Tg (fiona) | Gift from from James Ervasti, with permission from Kay Davies | Male 6 month mice |
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