Summary
Regulación traduccional desempeña un papel importante en el control de la abundancia de la proteína. Aquí, describimos un método de alto rendimiento para el análisis cuantitativo de la traducción en la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Traducción de mRNA en las proteínas es un proceso complejo que involucra varias capas de regulación. A menudo se asume que cambios en la transcripción del mRNA reflejan cambios en la síntesis de proteínas, pero se han observado muchas excepciones. Recientemente, una técnica llamada ribosoma perfiles (o Ribo-Seq) ha surgido como un método eficaz que permite la identificación, con gran precisión, que las regiones de ARNm se traducen en proteínas y cuantificación de la traducción a nivel de todo el genoma. Aquí, presentamos un protocolo generalizado para la cuantificación del genoma de la traducción con Ribo-Seq en levadura de florecimiento. Además, combinando datos de Ribo-Seq con mediciones de abundancia de ARNm permite al mismo tiempo cuantificar la eficiencia de la traducción de miles de transcripciones del mRNA en la misma muestra y comparar cambios en estos parámetros en respuesta a experimental manipulaciones o en los diferentes Estados fisiológicos. Se describe un protocolo detallado para la generación de huellas de ribosoma mediante digestión de nucleasa, aislamiento de complejos ribosoma-huella intacta vía fraccionamiento gradiente de sacarosa y la preparación de las bibliotecas de ADN para secuenciación profunda junto con el apropiado controles de calidad necesarios para asegurar un análisis preciso de la traducción en vivo .
Introduction
traducción del mRNA es uno de los procesos fundamentales en la célula, que desempeña un papel importante en la regulación de la expresión de la proteína. Por lo tanto, traducción del mRNA es firmemente controlada en respuesta a diferentes estímulos fisiológicos internos y externos 1,2. Sin embargo, los mecanismos de regulación traduccional siendo estudiados. Aquí, describimos el protocolo para la cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por ribosome profiling. El objetivo general de la técnica de generación de perfiles de ribosoma es estudiar y cuantificar la traducción de mRNAs específicos bajo condiciones celulares diferentes. Esta técnica utiliza la secuenciación de próxima generación para analizar cuantitativamente la ocupación del ribosoma a lo largo del genoma y permite el control de la tasa de proteína síntesis en vivo en el codón solo resolución 3,4. Actualmente, este método proporciona los medios más avanzados de medición de los niveles de la traducción de la proteína y ha demostrado para ser una herramienta de descubrimiento útil proporcionar información que no puede ser revelado por otras técnicas actualmente disponibles, por ejemplo a microarrays o traducción en estado matriz análisis (TSAA) 5. Como perfiles de informes sobre los cambios combinados en los niveles de transcripción y traslación salida del ribosoma, también proporciona mucha mayor sensibilidad en comparación con otros métodos.
Este enfoque se basa en profunda secuenciación de fragmentos de ARNm ribosoma protegido 3. Durante la traducción de proteínas, los ribosomas protegen ~ 28 porciones del nt de los mRNA (llamado huellas) 6. Mediante la determinación de la secuencia de los fragmentos protegidos por el ribosoma, Ribo-Seq puede mapa la posición del ribosoma sobre el ARNm traducidos e identificar qué regiones del mRNA están probables que activamente ser traducido en proteína 3,7. Además, podemos medir cuantitativamente la traducción del mRNA contando el número de huellas que se alinean a una transcripción de mRNA dado.
Para aislar los fragmentos protegidos por el ribosoma, lysates de la célula son inicialmente tratados con un inhibidor de la traducción para atascar los ribosomas seguidos por digestión de la ribonucleasa. Mientras que libres mRNA y porciones de mRNAs traducido no protegidos por los ribosomas son degradadas por la ribonucleasa, los fragmentos de ARNm ribosoma protegidos pueden ser recuperados por purificación complejos ribosoma-huella intacta. Estas huellas de mRNA son entonces convertidas en biblioteca del cDNA y analizaron por secuenciación profunda (figura 1). En paralelo a ribosome profiling, mRNA intacto es extraído de la misma muestra y ordenados. Al comparar el nivel de traducción identificado por Ribo-Seq con mediciones de abundancia del mRNA, podemos identificar los genes que son específicamente para arriba o abajo-regulados a nivel de la traducción y calcular la eficiencia de traducción de mRNA en el nivel de todo el genoma. Mientras que el protocolo descrito en este artículo es específico para la levadura, debe ser también útil para los investigadores que tratan de establecer el protocolo de Ribo-Seq en otros sistemas.
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Protocol
1. preparación del extracto
- Cepas de levadura racha de existencias congeladas solo colonias en placas de YPD (Extracto de levadura 1%, 2% peptona, 2% glucosa y agar al 2%). Incubar las placas a 30 ° C durante 2 días.
- Inocular la levadura de una placa de YPD (uso de una sola Colonia) en 15 mL de medio YPD (Extracto de levadura 1%, 2% peptona, 2% de glucosa) en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL y crecer durante la noche con agitación (200-250 rpm) a 30 ° C.
- Cultura de diluir en 500 mL de medio YPD en un matraz estéril de 2 L, por lo que el OD600 < 0.1. Crecer las células de levadura con agitación a 30 ° C durante 3-5 h hasta OD600 = 0,5 (fase de registro medio).
- Recoger las células por filtración a través de filtros de la membrana de 0,45 μm utilizando un montaje de filtro de cristal titular. Raspar el precipitado con una espátula, flash congelación en nitrógeno líquido y almacenar a-80 ° C. El tamaño esperado de los pellets congelados es ~ 0.2 - 0.5 g.
PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido es extremadamente baja temperatura; usar protección adecuada. - Preparar un nuevo tampón de lisis (20 mM Tris-HCl de pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM de MgCl2, cicloheximida de 100 μg/mL, 0,5 mM DTT, 1% Tritón X-100) inmediatamente antes de usar, mantener en hielo.
- Poner 3 bolas de acero cromado (3.2 mm) en un tubo de acero inoxidable de 1.8 mL. Enfriado previamente en nitrógeno líquido y agregar pellets congelados, cubrir con una tapa de goma de silicona. Homogeneizar la muestra por cryogrinding de 10 s a 4200 rpm; Repita 10 veces. Enfríe los tubos en nitrógeno líquido durante al menos 10 s entre cada ronda.
Nota: Es importante mantener siempre la muestra congelada. - Añadir 1 mL de tampón de lisis, mezclar por pipeteo. Transferir a un tubo nuevo de 1,5 mL.
- Centrifugar a 20.000 x g durante 5 min a 4 ° C. Mientras trabajaba en el hielo, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL. Transfiera 100 μL de lisado a un nuevo tubo de 1,5 mL para aislamiento del mRNA de poly(A). Proceder de inmediato al aislamiento de RNA o flash congele el tubo en nitrógeno líquido. Medida OD260 del resto del lisado, que se utilizará para la extracción de la huella y flash congelar los tubos en nitrógeno líquido. Tienda los lisados a-80 ° C.
2. huella extracción
- Preparación de gradientes de sacarosa
- Prepare soluciones de 50%, 40%, 30%, 20% y 10% de sacarosa en tampón gradiente (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, cicloheximida de 100 μg/mL, 0,5 mM DTT).
- Pipetee 2,2 mL de la solución de sacarosa de 50% preparado en la parte inferior del tubo polyallomer 13,2 mL pared delgada y la congelación de la solución durante 10 minutos a-80 ° C (figura 2). Luego capa 2,2 mL de tampón de sacarosa de 40% en la parte superior del búfer de sacarosa 50% congelado y congelación durante 10 minutos a 80 ° C. Siguiendo las mismas instrucciones, capa 30%, y 20% y finalmente 10% sacarosa neutraliza encima uno del otro. Evitar burbujas de aire mientras que la estratificación. No los gradientes a-80 ° C hasta su uso. Los gradientes de sacarosa deben ser preparados al menos un día antes del experimento y guardados a-80 ° C.
- Digestión de la nucleasa
- Descongelar los gradientes de sacarosa la noche antes de los experimentos a 4 ° C.
- Descongelar el lisado (huella muestra de células) en el hielo. Transferir una alícuota de 50 OD260 unidades a un nuevo tubo de 1,5 mL de lisado de células y añadir tampón de lisis fresco hasta 1 mL. Tienda el restante lisado a-80 ° C. Añada 10 μL Rnasa I (100 U/μL) e incubar 1 h a temperatura ambiente con rotación suave en un rotador de la cabeza encima de tacones.
- (Opcional) Aclarar las muestras a 20.000 x g durante 5 min a 4 ° C y recuperar el sobrenadante en un tubo nuevo de 1,5 mL.
- Ultracentrifugación
- Suavemente la capa lisadas muestras en la parte superior de un gradiente de sacarosa 10-50%.
- Ultracentrífuga el polyallomer tubos a 210.000 x g (35.000 rpm) a 4 ° C por 3 h con rotor SW 41 Ti.
- Configuración del sistema gradiente fraccionamiento
- Encienda los componentes y el monitor UV a calentamiento durante al menos 30 minutos.
- Si utilizando un software grabador digital, inicie el software en el equipo, establecer límites de escala del gráfico -0.01 y 1.
- Llene la jeringa con la solución de Chase (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 60% de sacarosa), eliminar las posibles burbujas de aire dentro de la jeringa y cánula.
- Instale un tubo de ultracentrífuga con agua libre de ARNasa. Perforar el tubo con la cánula hasta que se observan dos marcas negras. Arrancar la bomba de jeringa de 1 mL/min.
- Cuando el agua pasa por la celda de flujo, pulsa el botón "Auto Zero" en el monitor UV para ajustar la línea de base 0. Ajustar la sensibilidad del monitor UV a "2.0 AU". Después de que se ha establecido una línea de base estable, parar la bomba de jeringa. Recuperar la solución de Chase y retire el tubo de ultracentrífuga.
- Aislamiento monosome
- Instalar y perforar el tubo de ultracentrífuga que contiene el gradiente de sacarosa. Arrancar la bomba de jeringa de 1 mL/min, recoger fracciones de 1 mL Control un valor de254 . Fracciones que representa el pico de monosome de los años 80 en un tubo de la piscina, mantenga en hielo (figura 3).
- Una vez que Chase solución alcanza la célula de flujo, parar la bomba de jeringa. Solución de Chase se recuperan y retire el tubo de ultracentrífuga. Repita el fraccionamiento para el resto de las muestras a partir paso 2.5.1.
Nota: Cuando termine, limpie el sistema de fraccionamiento con al menos 30 mL de agua libre de ARNasa. Lave muy bien los tubos, jeringas y todos los componentes extraíbles con agua tibia. - Filtrar las fracciones a través de Filtros centrífugos de 0.5 mL (100 kDa MWCO) a 12.000 x g durante 10 min a 4 º C y desechar el flujo a través, repita hasta que el volumen es < 100 μL. Añadir 400 μL de tampón de liberación (20 mM Tris-HCl pH 7.0, 2 mM EDTA, inhibidor de Rnasa U/mL 40). Mezclar por pipeteo, incubar en hielo 10 min y transferir la unidad a un tubo nuevo de colección. Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C y recoger el flujo a través.
- Purificación del fragmento de huella
- Transferir el flujo que contiene huella fragmentos de ARN que tubo un nuevo 1,5 mL, añadir 20 μL de SDS (a una concentración final de 1%), mezclar mediante pipeteo del 20%.
- Agregar 1 volumen de ácido-fenol: cloroformo (pH 4.5), vortex por 10 s.
PRECAUCIÓN: El ácido-fenol: cloroformo es tóxico, evitar el contacto con la piel y la inhalación. - Calentar a 65 ° C durante 5 minutos, poner en hielo durante 1 minuto centrifugar la muestra a 12.000 x g durante 5 min a 4 ° C, transferir la fase acuosa (superior) a un nuevo tubo de 1,5 mL.
- Precipitar fragmentos de ARN de la huella mediante la adición de 1/10 volumen de NaOAc (pH 5.5), volumen 1/100 de glucógeno (10 mg/mL) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%.
3. Poly(A) extracción de ARNm
- Extracción de RNA total
- Descongelar una alícuota de 100 μL de lisado de células (muestra deARN Total ) en el hielo, añadir 300 μL de 20 mM Tris-HCl pH 7.0 y 20 μL de SDS (a una concentración final de 1%), mezclar mediante pipeteo del 20%.
- Agregar 1 volumen (400 μL) de ácido-fenol: cloroformo (pH 4.5) y vortex por 10 s.
- Calentar a 65 ° C durante 5 minutos, poner en hielo durante 1 minuto centrifugar la muestra a 12.000 x g durante 5 min a 4 ° C, transferir la fase acuosa (superior) a un nuevo tubo de 1,5 mL.
- Realizar una segunda extracción del fenol. Agregar 1 volumen de ácido-fenol: cloroformo (pH 4.5), vórtice de calor s. 10 a 65 ° C durante 5 minutos, poner en hielo durante 1 minuto centrifugar la muestra a 12.000 x g durante 5 min a 4 ° C, transferir la fase acuosa a un tubo nuevo de 1,5 mL.
- Precipitar el ARN. Para esto agregue volumen 1/10 de 3 M NaOAc (pH 5.5), volumen 1/100 de glucógeno (10 mg/mL) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Incubar a-20 ° C durante al menos 1 h.
- Aislamiento del mRNA de Poly(A)
- Centrifugar las muestras de RNA a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, eliminar el etanol. Desactivación de 30 s a máxima velocidad, quitar el resto de etanol con una punta de carga de gel y secar el pellet por 5 min.
- Disolver los pellets en 300 μL de tampón de lisis/atascamiento del kit del aislamiento del mRNA del poly(A). Proceder a la extracción de ARNm de poly(A) según protocolo poly(A) mRNA aislamiento kit del fabricante.
- Precipitar las muestras de mRNA mediante la adición de 1/10 volumen de 3 M NaOAc (pH 5.5), volumen 1/100 de glucógeno (10 mg/mL) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Incubar a-20 ° C durante al menos 1 h.
- fragmentación de mRNA
- Centrifugar las muestras de mRNA a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, eliminar el etanol. Girar por 30 segundos, retire el resto de etanol con una carga de gel punta y aire seco el precipitado durante 5 minutos.
- Resuspender el mRNA en 18 μL de agua libre de ARNasa, añadir 2 μL de 10 x buffer de fragmentación de RNA. Incubar 5 min a 94° C. Transferencia de tubo de hielo.
- Precipitar al añadir volumen 1/10 de 3 M NaOAc (pH 5.5), volumen 1/100 de glucógeno (10 mg/mL) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Incubar a-20 ° C durante al menos 1 h.
4. desfosforilación
- Tratar la huella y fragmentada muestras de mRNA con la cinasa de T4 Polinucleótido. Para ello, centrifugar las muestras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, eliminar el etanol. Desactivación de 30 s a máxima velocidad, quitar el resto del etanol con un gel de carga punta. Secar el pellet por 5 min.
- Resuspender el precipitado en 7,75 μl de agua, añadir 1 μl de 10 x T4 Polinucleótido quinasa buffer, 1 μl de T4 kinase de Polinucleótido (10.000 U/mL) y 0.25 μl de inhibidor de Rnasa (20 U/μL). Incubar 1 h a 37 ° C.
- (Opcional) Funcionamiento previo un gel de TBE urea 15% en 180 V durante 15 minutos usando buffer de x TBE 1.
- Añadir 10 μl de 2 X tampón TBE urea a 10 μl de cada muestra de huella y mRNA. Preparar una muestra de control que contiene 1 μl de 10 μm tamaño superior marcador de oligonucleótidos (32 nt), 1 μl de 10 μm menor tamaño marcadores oligonucleótidos (28 nt), 8 μl de agua y 10 μl de 2 x tampón TBE urea para las muestras de la huella. Preparar una muestra de control que contiene 1 μl de 10 μm RNA marcador de oligonucleótidos (63 nt), 9 μl de agua y 10 μl de 2 x tampón TBE urea para las muestras de mRNA.
- Incubar las muestras y controles 3 minutos a 75 ° C, girar hacia abajo, poner en hielo para 1 minuto de carga cada muestra en 2 pocillos del gel de TBE urea 15%, separados los fragmentos de ARN por electroforesis en gel en 180 V durante 1 hora.
- Mancha el gel durante 5 minutos con una mancha de gel de ácido nucleico (10.000 x diluído en agua), protegen de la luz.
- Utilizando un transiluminador de luz azul, corta la banda apropiada entre los 28 y 32 marcadores de nt para las muestras de la huella (Figura 4A) y alrededor 50-70 nt para mRNA muestras (Figura 4B) con una cuchilla de limpiar. Congelar las piezas de gel de poliacrilamida a-80 ° C durante al menos 10 minutos.
- Extracto de RNA del gel de poliacrilamida como sigue. Calentar las piezas de gel a 70 ° C por 2 min, triturar el gel utilizando morteros de pellets disponibles. Eluir el RNA con tampón de elución de 300 μL (20 mM Tris-HCl pH 7.0, 2 mM EDTA) y agregar inhibidor de Rnasa de 1 μl (20 U/μL), incubar a 37 ° C durante 3 h.
- Centrifugar la muestra a 12.000 x g durante 5 min a 4 ° C, recoger el sobrenadante y precipitado por adición de 1/10 volumen de NaOAc (pH 5.5), volumen 1/100 de glucógeno (10 mg/mL) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Incubar a-20 ° C durante al menos 1 h.
5. 3' adaptador ligadura
- Centrifugar las muestras de la huella y mRNA a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, eliminar el etanol. Desactivación de 30 s a máxima velocidad, quitar el resto de etanol con una punta de carga de gel. Secar el pellet por 10 minutos.
- Resuspender el precipitado en 4,75 μl de agua libre de nucleasa, 2 μl de 50% PEG8000, 1 μl de 10 X T4 RNA ligasa buffer, 1 μl de 3'-adaptador (100 ng/μL), 0.25 μl de inhibidor de Rnasa (20 U/μL), 1 μl de ligasa de T4 RNA 2 truncado KQ (200.000 U/mL). Incubar durante una noche a 16 ° C.
- A la mañana siguiente, retirar el exceso de adaptador mediante la adición de 0,5 μl de 5'-deadenylase (10 U/μL) y 0,5 μl de exonucleasa Rec J (10 U/μL) directamente a la reacción de ligadura. Incubar durante 30 min a 30 ° C.
- Precipitar las muestras. Para ello, Añadir 30 μl de agua libre de nucleasa, 1 glucógeno μl (10 mg/mL), 1/10 volumen de NaOAc (pH 5.5) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Incubar a-20 ° C durante al menos 1 h.
6. transcripción reversa
- Centrifugar las muestras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, eliminar el etanol. Desactivación de 30 s a máxima velocidad, quitar el resto de etanol con una punta de carga de gel. Secar el pellet por 10 minutos.
- Resuspender el precipitado en 11.5 μl de agua libre de nucleasa, Añadir 0,5 μl de la cartilla de reversa de la transcripción de 8 μm (cartilla de RT) y 1 μl de mezcla de dNTP (10 mM). Incubar por 5 min a 65 ° C, colocar en hielo.
- Añadir 4 μL de 5 X buffer primera línea, 2 μl de 0,1 M TDT, 0.5 μl de inhibidor de Rnasa (20 U/μL), 0.5 μl de transcriptasa reversa (200 U/μL). Incubar durante 30 min a 48 ° C, 1 min a 65 ° C, 5 minutos a 80 ° C.
- No precipitan y proceder de inmediato a la hidrólisis de ARN mediante la adición de 0,8 μl de 2 M NaOH, incubar 30 minutos a 98 º C. Agregar 0,8 μl 2M HCl para neutralizar la reacción.
- Precipitar las muestras.
7. circularización
- Centrifugar las muestras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, eliminar el etanol. Desactivación de 30 s a máxima velocidad, quitar el resto de etanol con una punta de carga de gel y secar el pellet por 10 minutos.
- Resuspender el precipitado en 16.75 μl de agua libre de nucleasa. Añadir 2 μl de 10 x buffer ligasa de monocatenario DNA (ssDNA), 1 μl de 50 mM MnCl2, 0.25 μl de ssDNA ligasa (100 U/μL). Incubar durante 1 h a 60 ° C, 10 minutos a 80 ° C. No precipitan y almacenar el producto de reacción de la ligadura de ssDNA a-20 ° C.
8. PCR amplificación de biblioteca
- Mientras trabajo en el hielo, mezcla lo siguiente en un tubo PCR: 146 μl de agua libre de nucleasa, 2 μl de cebador Forward de 20 μm, 2 μl de 20 μm indexadas revertir la cartilla, 40 μl de 5 x buffer de plymerase de ADN de alta fidelidad, 4 μL de dNTPs (10 mM), 4 μL del producto de reacción de la ligadura de ssDNA y 2 μl de ADN polimerasa de alta fidelidad. Elegir un primer indexadas revertir diferentes para cada muestra que va ser multiplexado para secuenciación. Transferir una alícuota de 50 μl de la mezcla PCR en 4 nuevos tubos PCR.
- Realizar la amplificación por PCR con número variable de ciclos (8, 10, 12, 14) con la siguiente configuración:
1 min a desnaturalización inicial de 98 ° C
ciclos de 8 a 14:
15 s a 94 ° C
5 s a 55 ° C
10 s a 65 ° C
2 min a 65 ° C extensión final - Precipitar el producto PCR mediante la adición de 1/10 volumen de 3 M NaOAc (pH 5.5), volumen 1/100 de glucógeno (10 mg/mL) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Incubar a-20 ° C durante al menos 1 h.
- Centrifugar las muestras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, eliminar el etanol. Desactivación de 30 s a máxima velocidad, quitar el resto de etanol con una punta de carga de gel y secar el pellet.
- Resuspender el precipitado en 8 μl de agua libre de nucleasa, añadir 2 μl de no desnaturalizar 5 x buffer de muestras de ácidos nucleicos. Cargar la muestra en 1 bien de gel 8% TBE no desnaturalizantes. Separar los productos de ADN por electroforesis en gel de 150 V durante 35 minutos. Como control, preparar una muestra que contiene 0,5 μl de escalera de ADN de 10 bp (1 μg/μl), 7.5 de μl de agua y 2 μl de no desnaturalizar 5 x buffer de muestras de ácido nucleico y ejecutar en un carril separado del gel.
- Mancha el gel durante 5 minutos con una mancha de gel de ácido nucleico (10.000 x diluído en agua), protegen de la luz. Utilizando un transiluminador de luz azul, corta la banda alrededor de 150 bp para las muestras de la huella y alrededor 180 bp para muestras de mRNA (figura 6) con una cuchilla de limpieza. Guarde las piezas de gel a-80 ° C durante al menos 10 minutos.
- Calentar las piezas de gel a 70 ° C por 2 min, triturar el gel utilizando morteros de pellets disponibles. Eluir el ADN con 300 μL de 20 mM Tris-HCl pH 7.0 e incubar a 37 ° C durante 3 h.
- Centrifugar la muestra a 12.000 x g, 5 min a 4 ° C, recoger el sobrenadante y precipitado por adición de 1/10 volumen de NaOAc (pH 5.5), volumen 1/100 de glucógeno (10 mg/mL) y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. Incubar a-20 ° C durante al menos 1 h.
- Centrifugar las muestras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, eliminar el etanol. Desactivación de 30 s a máxima velocidad, quitar el resto de etanol con una punta de carga de gel y secar el pellet. Finalmente, suspender las bibliotecas en 20 μl de agua libre de nucleasas y proceder a la cuantificación, control de calidad y secuencia.
9. Biblioteca cuantificación y secuenciación de alto rendimiento
- Antes de enviar las muestras para la secuencia, determinar el rendimiento y la calidad de la polimerización en cadena-amplificados de la bibliotecas. Perfiles representativos de huella y las bibliotecas de la secuencia de ARNm se muestran en la figura 7. El tamaño esperado de la biblioteca de la polimerización en cadena-amplificada es bp 148-152 para las muestras de la huella y 170-190 bp para muestras de mRNA.
- Si varias muestras con códigos de barras diferentes se agruparon para la secuencia, realizar cuantificación precisa de las bibliotecas usando un análisis de cuantificación de biblioteca de secuencia de la qPCR.
- Las bibliotecas en proporciones equimolares de la piscina. Calcular el volumen total de la piscina como 3 μl x número total de muestras a ser agrupados. Determinar el volumen de cada biblioteca que debe añadirse para que las bibliotecas se mezclan en las proporciones equimolares a alcanzar la concentración final de 10 nM de la piscina. Agregar el volumen calculado de cada biblioteca en un nuevo tubo de 1.5 mL, mezclar mediante pipeteo. Añadir agua para conseguir el volumen total calculado. Almacenar bibliotecas combinadas a-20 ° C.
- Enviar una alícuota de la biblioteca agrupada para ser secuenciados utilizando 50 secuenciación del solo-fin bp ejecuta en una plataforma de secuenciación Illumina. Nos rutinariamente múltiplex 12 muestras en una sola secuencia ejecutar, qué rendimientos ~ 200 millones Lee por carril de secuenciación.
Nota: El número de lecturas de la huella recogida por cada muestra depende de la cantidad de material de entrada y el nivel de contaminación de rRNA.
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Representative Results
Tuberías detalladas para el análisis Bioinformático de ribosome profiling datos han sido descritos 8,9. Además, varios grupos de investigación han desarrollado herramientas bioinformáticas para el análisis de expresión génica diferencial y tratamiento de los datos de la secuencia, que son específicos para ribosome profiling método 10,11,12 ,13,14,15,16,17,18. El primer paso en el análisis de datos de Ribo-Seq es demultiplexado y recortar la secuencia de adaptador de 3' AGATCGGAAGAGCACACGTCT con Cutadapt software 19. Entonces la Lee de la secuencia se alinean contra no-codificación RNAs, como el rRNA y tRNA, con corbatín 20 para eliminar contaminantes de secuencias, y luego se asignan lecturas que no se alinean al genoma de la levadura. Leer cuenta por gene entonces podrá evaluarse HTseq cuenta software 21y genes expresados diferencialmente se identifican con DESeq2 22.
La figura 8 muestra resultados representativos del análisis cuantitativo de la traducción en hbs1Δ 23,24 levadura eliminación mutante que se obtuvieron usando nuestro protocolo. En primer lugar, se evaluaron el número y proporción de lecturas que corresponden al ARN no codificante (por ejemplo rRNAs) obtenida después de ordenar bibliotecas huella y mRNA generadas por células de tipo salvaje y el mutante de hbs1Δ. Encontramos que, incluso sin rRNA agotamiento pasos (discutidos abajo), de 50 a 60% de todas las lecturas secuenciadas en nuestra huella bibliotecas corresponden a fragmentos de espacio protegido por el ribosoma (figura 8A). En cambio, sólo el 3% de los fragmentos derivados de rRNA fueron observado en las bibliotecas de mRNA demostrando que aislamiento del mRNA de poly(A) permite la eliminación efectiva de rRNA Lee. Juntos, hemos sido capaces de obtener lecturas más de 10 millones de huella para cada una de las muestras de la huella por secuenciación 2 repeticiones. Para evaluar la variabilidad de la generación de la biblioteca y reproducibilidad de los datos, se analizan generalmente por lo menos dos repeticiones biológicos independiente por cada condición experimental. Bibliotecas de muestra huella y mRNA mostrar buena reproductibilidad con coeficiente de correlación de Pearson R ~ 0.99 entre muestras combinadas (figura 8B).
Además de evaluar el nivel de traducción de proteínas a nivel de genoma, ribosome profiling permite medir cambios en la eficiencia de la traducción entre las condiciones experimentales 3. Para esto, una parte alícuota de la célula lisada (no tratada con ribonucleasa) se utiliza para aislamiento del mRNA de poly(A) y preparación de una biblioteca de RNA-Seq. Porque tanto huella bibliotecas y RNA-Seq preparados bajo las mismas condiciones controladas y pueden atribuirse a cada repetición individual, conjuntos de datos Ribo-Seq y RNA-Seq pueden compararse directamente para identificar los genes que son regulados por los cambios en el mRNA transcripción, traducción eficacia, o por un efecto combinado. Para identificar genes que están arriba o abajo-regulado específicamente en el nivel de la traducción de la proteína en el mutante hbs1Δ, calculamos cambios en la eficiencia de traducción dividiendo la huella rpkm valores por rpkm de mRNA para cada uno de los genes (figura 8).
Figura 1: Resumen del protocolo Ribo-Seq. El conjunto del Protocolo puede realizarse en aproximadamente 11 días. Se muestra el tiempo estimado para cada paso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: preparación de gradientes de sacarosa Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: perfiles de gradiente de sacarosa representante. (A) Perfil de gradiente de sacarosa obtenidos para control (no tratadas con Rnasa I) muestra. (B) para extraer fragmentos de ARN protegidos del ribosoma, lysates de la célula son tratadas con Rnasa I por 1 h a temperatura ambiente (RT). Luego se recogen fracciones correspondientes al pico monosomal para la extracción de la huella. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: imágenes representativas de los geles de poliacrilamida 15% obtienen después del tratamiento de T4 Polinucleótido kinasa. (A) el tamaño de la rebanada de gel suprimido alrededor de 28 y 32 nt se muestra para las muestras de la huella. (B) cortar la rebanada de gel de 50-70 nt para las muestras de mRNA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: imágenes representativas de los geles de poliacrilamida de 10% obtienen tras la transcripción reversa. (A) corte la banda superior ~ 128 nt para obtener muestras de la huella correspondiente al producto de la transcripción inversa. (B) cortar la banda alrededor de 150-170 nt para las muestras de mRNA (banda superior). Las bandas inferiores que corresponden a la cartilla de RT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: purificación del gel de poliacrilamida de polimerización en cadena-amplificado bibliotecas. Productos PCR obtenidos después de 8, 10, 12 y 14 ciclos de amplificación de la biblioteca fueron resueltos en gel de TBE no desnaturalizantes 8%.El tamaño de las bibliotecas de la huella larga duración ~ 150 bp, mientras que el tamaño de las bibliotecas de mRNA es ~ 170-190 BP evitar la banda inferior que contiene el inserto.
Figura 7: Análisis de equipo Bioanalyzer. (A) representante Bioanalyzer perfiles de la biblioteca de la polimerización en cadena-amplificada huella. El tamaño medio de la biblioteca de la huella debe ser de 148 a 152 nt. (B) perfiles Bioanalyzer representante de la biblioteca de la secuencia obtienen para las muestras de mRNA. El tamaño esperado de la biblioteca de mRNA es 170-190 nt. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: resultados representativos. (A) número de rRNA, mRNA y huella de lecturas obtenidas para la muestra de tipo salvaje y el mutante de hbs1Δ. Número combinado de lecturas generadas por biológico dos repeticiones de la secuencia se muestra células de tipo salvaje y el mutante de hbs1Δ. (B) reproducibilidad de las mediciones de huella y la abundancia de ARNm entre dos repeticiones. Se indican los coeficientes de correlación de Pearson (R). (C) transcripcional y traduccional cambios en el mutante de hbs1Δ. Significativamente los genes para arriba- y abajo-regulados en hbs1Δ se agrupan de acuerdo a si se ven afectados por un cambio en la transcripción del mRNA, eficiencia de la traducción, o por un efecto combinado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Cartillas de | Secuencia de | Índice | ||||
| adaptador de 3' (100 ng/μL) | / 5rApp/AGATCGGAAGAGCACACGTCT/3ddC | |||||
| Cartilla de RT | pGATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAACGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT/iSp18/GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Primer avance de PCR | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGACG | |||||
| Primer Índice 1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | ATCACG | ||||
| Primer índice 2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | CGATGT | ||||
| Primer índice 3 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | TTAGGC | ||||
| Primer índice 4 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | TGACCA | ||||
| Primer índice 5 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | ACAGTG | ||||
| Primer índice 6 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | GCCAAT | ||||
Tabla 1: 3' secuencias de adaptador y cartilla.
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Discussion
El enfoque de Ribo-Seq ha emergido como una tecnología de gran alcance para el análisis de mRNA traducción en vivo en el nivel 3de todo el genoma. Estudios con este enfoque, que permite el control de traducción con codón solo resolución, ha contribuido a nuestra comprensión de la regulación traduccional. A pesar de sus ventajas, Ribo-Seq tiene varias limitaciones. Fragmentos de ARN ribosómico (ARNr) son siempre Co purificados durante el aislamiento de huellas protegido ribosoma disminuyendo el rendimiento de lecturas de secuencia útil que puede obtenerse en Ribo-Seq experimentos 9,25. Nuestros datos demuestran que la contaminación de rRNA puede contribuir a 40-50% de todas las lecturas (figura 8). Una de las maneras de superar esta limitación es aumentar la profundidad de la secuencia. Rondas adicionales de secuenciación deben realizarse hasta que se alcance el número requerido de lecturas de secuencia para cada una de las muestras analizadas. Análisis de las bibliotecas de la secuencia preparada usando nuestro protocolo indica que se pueden obtener lecturas de huella más de 5 millones para cada biblioteca de huella, cuando 12 muestras son multiplexadas juntos en un estándar 50 bp solo fin de ejecutar la plataforma Illumina HiSeq 2000. Sin embargo, si se observa contaminación significativa con rRNA, se puede realizar un paso de extracción opcional de rRNA.
Una de las estrategias para eliminar rRNA contaminar fragmentos de bibliotecas de la huella es utilizar Hibridación Sustractiva con los oligonucleótidos biotinilados como se describió anteriormente 8,26,27. Alternativamente, rRNA contaminando Lee puede eliminarse utilizando kits de agotamiento de rRNA comercialmente disponibles. Para ello, los investigadores pueden realizar agotamiento del rRNA en fragmentos purificados huella 3'-adaptador-ligada del paso 5.4. Agotamiento de rRNA siguientes, huella de muestras pueden ser precipitadas y utilizadas directamente por transcripción inversa (paso 6) como se describe en el protocolo.
Además de purificación de monosomes mediante fraccionamiento de gradiente de sacarosa descrito en nuestro protocolo, se han desarrollado varios métodos que utilizan una base de columna de purificación 28 y ultracentrifugación a través de un colchón de sacarosa 8 ,29. Aunque estos métodos pueden acelerar el proceso de preparación de biblioteca de huella y son técnicamente menos difíciles en comparación con el fraccionamiento de gradiente de sacarosa, no permiten el análisis cualitativo de las monosomes purificadas y la eficiencia de la nucleasa paso de la digestión. Recientemente, la elección de nucleasa ha demostrado afectar a la eficacia de la purificación de fragmentos de ARN protegidos del ribosoma en diferentes especies 30. Mientras que tiene una actividad robusta en lysates de la célula de levadura, su actividad Rnasa se ha demostrado para afectar la integridad de los ribosomas en tejidos de ratón, así como en moscas de la fruta. Por lo tanto, la elección y concentración de nucleasa deben optimizarse al adoptar este protocolo a otras especies.
Otra consideración importante es el uso de los inhibidores de la traducción. Mayoría de los protocolos para el ribosoma perfilado generalmente involucran tratar las células con inhibidores de la elongación, como la cicloheximida o harringtonine, con el fin de evitar la segunda vuelta de los ribosomas durante la célula cosecha 3. Una de las limitaciones del uso de los inhibidores de la traducción es que los fármacos difunden progresivamente en la célula, induciendo una inhibición progresiva de los ribosomas 31. Por otra parte, las drogas no inhibir traducción iniciación o terminación. Como consecuencia, los ribosomas desproporcionadamente se acumulan en el codón de inicio y se agotan en el codón de parada 8,27,31. Para limitar este artefacto, elegimos flash congelar las células en nitrógeno líquido y tratar con cicloheximida en el momento de la extracción en tampón de lisis solamente.
A pesar de un número relativamente grande de los reportes que han utilizado Ribo-Seq en varias especies, se carecen de protocolos estandarizados para realizar análisis de Ribo-Seq. En consecuencia, no se puede comparar directamente Ribo-Seq datos generados por diferentes laboratorios. Por ejemplo, comparación de ribosoma publicado conjuntos de datos de perfiles reveló discrepancias significativas en los resultados entre estudios 32. Esto es en parte debido a mejoras continuas que se han hecho como el protocolo evolucionado en los últimos años. Además, muchos investigadores modifican el ribosome profiling protocolo para adoptar a las necesidades específicas de su estudio o modelo de sistema 9,25. Además estandarizar el ribosoma perfiles de protocolo, así como análisis de datos y la normalización, permitiera prevenir algunos de los sesgos experimentales y garantizar la cuantificación exacta y reproducible de la traducción en vivo .
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de becas en salud AG040191 y AG054566 a VML. Esta investigación se llevó a cabo mientras VML recibió una beca de investigación lejos de la American Federation for Aging Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
References
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