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Biology

Cuantificación absoluta de Plasma niveles de microARN en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR

Published: February 12, 2018 doi: 10.3791/56850
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Medicinal Safety Research Laboratories, Daiichi Sankyo Co., Ltd.

Summary

Este informe describe un protocolo para la medición de los niveles absolutos de miRNA plasma, mediante la transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR con o sin la amplificación. Este protocolo permite la mejor comprensión de la cantidad de plasma miRNAs y permite la evaluación cualitativa de los correspondientes datos de diferentes estudios o laboratorios.

Abstract

RT-qPCR es uno de los métodos más comunes para evaluar objetivo individual miRNAs. Generalmente se miden los niveles de MiRNAs en relación con una muestra de referencia. Este enfoque es apropiado para examinar los cambios fisiológicos en los niveles de expresión de genes objetivo. Sin embargo, cuantificación absoluta usando mejor el análisis estadístico es preferible para una evaluación integral de los niveles de expresión génica. Cuantificación absoluta está todavía no de uso común. Este informe describe un protocolo para la medición de los niveles absolutos de plasma miRNA, usando RT-qPCR con o sin la amplificación.

Se preparó un volumen fijo (200 μL) de EDTA-plasma de la sangre de la vena femoral de monos cangrejeros consciente (n = 50). ARN total fue extraído usando sistema comercialmente disponible. MiRNAs de plasma fueron cuantificados por análisis de RT-qPCR basada en sondeos que contiene la sonda y miRNA-específico-reversa PCR primer. Curvas estándar para cuantificación absoluta se generaron usando oligonucleótidos sintéticos disponibles en el mercado del RNA. Un sintético cel-miR-238 fue utilizado como un control externo para la evaluación de normalización y calidad. Los miRNAs que mostró cuantificación ciclo (Cq) valores por encima de 35 se pre amplificados antes el paso de la qPCR.

Entre los 8 miRNAs examinados, miR-122, miR-133a y miR-192 eran detectables sin la amplificación, mientras que 499a miR, miR-1 y miR-206 requieren la amplificación debido a sus niveles de baja expresión. MiR-208a y 208b miR no eran perceptibles aún después de la amplificación. Eficacia de la muestra fue evaluada por los valores de Cq de la cel-miR-238 con picos. En este método de ensayo, variación técnica era estimada para ser menos 3-fold y el límite inferior de cuantificación (LLOQ) 102 copia/μl, para la mayoría de los miRNAs examinados.

Este protocolo proporciona una mejor estimación de la cantidad de plasma miRNAs y permite la evaluación de la calidad de los correspondientes datos de diferentes estudios. Teniendo en cuenta que el bajo número de miRNAs en los fluidos corporales, la amplificación es útil para mejorar la detección de mal expresado miRNAs.

Introduction

Un creciente número de estudios ha sido explorar microRNAs (miRNAs) como biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico de los cánceres, o supervisión y detección de otras enfermedades en estudios clínicos y no clínicos1,2,3 . Cuantitativa en tiempo real transcripción reversa PCR (RT-qPCR) es uno de los métodos más comunes utilizados para evaluar miRNAs del destino individual, porque esta técnica es más sensible de microarray4 y la secuencia de RNA a partir de plataformas5. En general, expresión de miRNA se mide en relación con una muestra de referencia utilizando el método de ΔCq6. Este enfoque es apropiado para la investigación de los cambios fisiológicos en los niveles de expresión de genes objetivo. Sin embargo, la cuantificación relativa de miRNAs en circulación ha limitado utilidad debido a sus pequeñas cantidades. Además, la variación técnica hace difícil comparar los resultados de diferentes estudios, ya que diferentes laboratorios personalizar los protocolos experimentales de RT-qPCR diferentemente, que conduce a incompatibles o incluso contradictorios resultados de diferentes estudios7.

En vista de las preocupaciones mencionadas, cuantificación absoluta podría ser más adecuada para la evaluación de las cantidades pequeñas de miRNAs en los fluidos corporales. El método de cuantificación absoluta utiliza una curva estándar generada a partir de concentraciones conocidas de oligonucleótidos sintéticos de RNA que son idénticas en secuencia para el correspondiente destino miRNA8. La salud y el Instituto de ciencias ambientales (HESI) Comité técnico de genómica recientemente llevado a cabo estudios exhaustivos para comparar los resultados de medidas absolutas de miRNAs de plasma, a través de múltiples sitios de prueba. Los resultados mostraron que utilizando un protocolo estándar para la cuantificación absoluta de miRNAs produjo resultados comparables a través de la prueba de múltiples sitios9. El método de ensayo de RT-qPCR que se describe en el presente estudio es casi idéntico al protocolo estándar de HESI, que incluye análisis multiplexado de múltiples objetivos de miRNA y la amplificación para la detección de baja expresión de miRNAs.

En este estudio, recoge un volumen fijo (200 μL) de EDTA-plasma de la sangre de la vena femoral de monos cangrejeros consciente (n = 50) fue utilizado10. El siguiente protocolo describe el procedimiento para la preparación de las muestras de plasma, extracción de miRNA y RT-qPCR, incluyendo la amplificación. Lo más importante, información técnica adicional sobre el protocolo se ha incluido, por lo que la cantidad de miRNAs de blanco en las muestras puede ser validada en combinación con un proceso bien calificado. En primer lugar, la curva estándar de cada miRNA se validó su rango de detección individual, antes de su cuantificación en muestras biológicas. En segundo lugar, la calidad de la metodología actual se evaluó exhaustivamente mediante valores de Cq de un control externo (cel-miR-238). Por lo tanto, esta plataforma proporciona datos más informativos y confiables para comparar resultados de diferentes estudios o laboratorios.

Los perfiles de 8 miRNAs se han incluido en este informe como resultados representativos por el método de ensayo descrito aquí. Estos miRNAs se han propuesto como biomarcadores potenciales de seguridad asociaron con lesión del tejido del hígado (miR-122 y miR-192), corazón (miR-1, miR-208a, 208b miR y miR-499a) y músculo esquelético (miR-133a y miR-206) en roedores y seres humanos3, 11,12,13.

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Protocol

Todos los experimentos fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso Comité de Daiichi Sankyo Co., Ltd.

1. preparación de la muestra

  1. Recoger la sangre (menos de 0,5 mL) de la vena femoral de monos cangrejeros en tubos con EDTA 2K que contiene.
    Nota: El citrato y heparina no son aceptables porque estos anticoagulantes inhiben la posterior PCR14,15.
  2. Coloque las muestras colectadas inmediatamente en hielo y proceso para el aislamiento del plasma dentro de 2 horas de la recolección.
  3. Centrifugar las muestras a 10.000 x g a 4 ° C durante 5 minutos.
  4. Transferir el sobrenadante a un microtubo 2 mL, seguido de centrifugación a 16.000 x g a 4 ° C por 5 min eliminar restos de células y plaquetas residuales.
    Nota: La cuantificación de miRNAs puede ser afectada significativamente por plaquetas contaminación16.
  5. Coloque 200 alícuotas μl del sobrenadante en frescos 2 mL-microtubos y almacenar a-80 ° C hasta su uso.
    Nota: Un volumen fijo de cada muestra se utiliza para la extracción de RNA; por lo tanto, el volumen de la alícuota debe ser exacto.

2. extracción de RNA

  1. Descongelar las muestras congeladas en el hielo (de paso 1.5).
    1. Mantener muestra frío en hielo durante la extracción de RNA. Enfriar el reactivo de lisis y cloroformo en antes hielo.
  2. Añadir 5 volúmenes (1000 μL) de reactivo de lisis, que contenga solución monofásica de fenol y guanidina isotiocianato, a la muestra (200 μL) y mezcla vigorosamente con un vórtex durante 1 minuto.
  3. Añadir 5 μl de 5 nM sintético miRNA de Caenorhabditis elegans (Syn-cel-miR-238-3 p).
  4. Agregar 1 volumen (200 μL) de cloroformo y mezclar vigorosamente con Vortex durante 1 minuto.
  5. Mantener en hielo durante 2 a 3 minutos y luego centrifugar las muestras a 12.000 x g a 4 ° C durante 15 minutos.
  6. Transferir la fase acuosa con cuidado a un nuevo microtubo.
    Nota: No transfieren de la fase orgánica (rojo) o interfase (blanco). El volumen de la fase acuosa recogido debe ser uniforme para evitar manejo de inconsistencia, que resulta en la mayor variación técnica. La cantidad habitual de fase acuosa transferido en este protocolo era 650 μl.
  7. Añadir 1,5 volúmenes (975 μL) de etanol y mezclar bien mediante pipeteo arriba y abajo.
  8. Transferir la muestra en una columna correspondiente y el adaptador, seguido del secado al vacío durante 3 minutos usando colectores de vacío. Si el volumen de muestra es de más de 700 μl, repita este paso para procesar la solución restante.
    Nota: Aislamiento de RNA base de columna es compatible con el método de vacío y centrifugación.
  9. Añadir 200 μL de etanol a la columna, seguida del secado al vacío durante 1 minuto.
  10. Añadir 800 μl de tampón de RCV a la columna, seguida del secado al vacío durante 2 minutos.
  11. Añadir 800 μl de tampón RPE a la columna, seguida del secado al vacío durante 2 minutos.
  12. Repita el paso 2.11.
  13. Añadir 300 μL de etanol a la columna, seguida del secado al vacío durante 1 minuto.
  14. Coloque la columna a un nuevo microtubo y centrifugar a 12.000 x g a temperatura ambiente (15 a 25 ° C) durante 1 minuto.
  15. La columna de la transferencia a un nuevo microtubo y añadir 50 μl de agua libre de nucleasa.
  16. Reposar a temperatura ambiente (15 a 25 ° C) por 3 minutos y centrifugar a 8.000 × g a temperatura ambiente (15 a 25 ° C) durante 1 minuto.
  17. Vuelva a aplicar el eluido de la columna.
  18. Repita el paso 2.16 y almacenar eluido a-80 ° C hasta su uso.

3. síntesis de cDNA

  1. Descongelar las muestras congeladas (de paso 2.18).
  2. Preparar una concentración conocida de oligonucleótidos sintéticos de RNA que corresponden al objetivo miRNAs.
    1. Uso de oligonucleótidos sintéticos de RNA para generar una curva estándar en qPCR. Solución madre de concentración de 1 x 108 copia/μl está preparado para propósitos de almacenamiento.
    2. Diluir la solución madre 10 veces para obtener 1 x 107 copia/μl (no muestras previamente amplificadas) o solución de trabajo de 1 x 105 copia/μl (muestras previamente amplificadas) como la concentración más alta para la construcción de la curva estándar. En general, un rango sugerido para las concentraciones de la curva estándar es 1 x 107 a 1 x 102 copia/μl (no muestras previamente amplificadas) o 1 x 105 a 1 x 100 copia/μl (muestras previamente amplificadas).
  3. Preparar piscina de cartilla de multiplex RT mezclando volúmenes iguales de 20 cartillas de RT x para destino miRNAs.
    Nota: Como se muestra en la figura 2, una piscina que contiene hasta 4 objetivo miRNAs se puede hacer mezclando los cebadores de RT 20 x de cada uno de los miRNAs en la piscina. Cel-miR-238 (control externo) debe ser incluido como uno de los miRNAs de destino en cada tubo. En caso de menos de 4 objetivo miRNAs, añadir volúmenes iguales de buffer TE de 1/10 en vez de 20 x RT la cartilla.
  4. Preparar la mezcla de reacción RT: 3 μl de cebador RT piscina (desde el paso 3.3), 0,15 μl de dNTPs 100 mM con dTTP, 1 μl de transcriptasa reversa (50 U/μL), 1,5 μl 10 x buffer de RT, 0.19 μl de inhibidor de Rnasa (20 U/μL) y 4.16 μl de nucleasa-libre del agua.
  5. Mezclar 10 μl de la reacción de RT mezclar con 5 μl de la muestra de RNA (de paso 3.1) u oligonucleótidos (del paso 3.2) transfiriendo e incubar en hielo durante 5 minutos.
  6. Ejecutar la reversa de la transcripción en un aparato termociclador: 16 ° C por 30 min, 42 ° C por 30 min, seguida por un paso de inactivación definitiva de la transcriptasa inversa a 85 ° C por 5 min muestras transcritas atrás de tienda a-80 ° C hasta su uso.

4. preamplificación (opcional)

Nota: Los miRNAs que muestran los valores de Cq por encima de 35 o más en qPCR posteriores son pre amplificados.

  1. Descongelar las muestras congeladas (del paso 3.6).
  2. Hacer diluciones seriadas 10 veces del producto de RT de oligonucleótidos sintéticos de RNA; 1 x 10-5 a 1 x 100 copia/μL para generar la curva estándar.
  3. Preparar piscina de primer ensayo multiplex mezclando volúmenes iguales (5 μl) de 20 x cartillas análisis miRNAs de destino con la concentración final de cada cartilla de ensayo está diluyendo 200-fold de búfer en un volumen final de 1000 μl de TE.
    Nota: Los iniciadores de análisis cuyo objetivo miRNAs puede ser detectable en qPCR posterior sin la amplificación y los cel-miR-238 (control externo) no se incluyen en la piscina de la cartilla.
  4. Preparar la mezcla de reacción de amplificación previa: 12,5 μl de 2 x listo para su uso reactivo preamplification, 3,75 μl de piscina de primer ensayo (de paso 4.3) y 6,25 μl de agua libre de nucleasa.
  5. Mezcla 22,5 μl de la reacción de amplificación previa mezclar con 2,5 μl de muestra transcripción inversa (del paso 4.1) o de oligonucleótidos (del paso 4.2) transfiriendo e incubar en hielo durante 5 minutos.
  6. Ejecutar la reacción en un aparato termociclador: 95 ° C por 10 min; seguido de 12 ciclos de 95 ° C por 15 s y 60 ° C durante 4 min. almacenan muestras previamente amplificadas a-80 ° C hasta su uso.

5. cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR)

  1. Descongelar las muestras congeladas (de paso 3.6 o paso 4.6).
  2. Diluir las muestras 5 veces con agua estéril.
  3. Preparar diluciones seriadas 10 veces del producto RT derivado de oligonucleótidos sintéticos de RNA; 1 x 107 a 1 x 102 copia/μl (no muestras previamente amplificadas) o 1 x 105 a 1 x 100 copia/μl (muestras previamente amplificadas) para la generación de curvas estándar.
  4. Preparar la mezcla de reacción de qPCR: 10 μl de 2 x reactivo de amplificación listo para su uso, 1 μl de 20 x reactivo de ensayo, que contiene la cartilla de la polimerización en cadena y sonda correspondiente a miRNA blanco, avance/retroceso y 7 μl de agua libre de nucleasa.
  5. Transferencia 18 μL de la mezcla de reacción de qPCR para las placas de reacción de 96 pocillos rápido óptico y añadir 2 μl de muestras diluidas (de paso 5.2 o 5.3 de paso) en los pocillos.
    Nota: Las muestras y estándares para qPCR se configuran por duplicado.
  6. Selle la placa con la película adhesiva y centrifugar brevemente.
  7. Ejecutar la reacción en un termociclador en tiempo real: 95 ° C por 20 s, seguido por 45 ciclos de 95 ° C para 1 s y 60 ° C por 20 s.

6. Análisis de datos

  1. Calcular el número de copia cruda de cada muestra utilizando el software de análisis de datos que trabaja con correspondiente termociclador en tiempo real.
    Nota: Línea de umbral se establece manualmente en "1.0" en todas las placas en el estudio, para confirmar la reproducibilidad en comparación con sus vales de Cq. Nivel de corte se fija en Cq > 40 ciclos.
  2. Calcule el promedio del número de copia cruda de cada muestra de duplicados.
  3. Calcular el factor de corrección dividiendo un número de copia del cel-miR-238 en cada muestra el promedio de número de copia del cel-miR-238 de todas las muestras en un tubo correspondiente.
    Nota: Como se muestra en la figura 2, cada tubo contiene hasta 4 miRNAs de destino incluyendo cel-miR-238 (control externo). Por lo tanto, el factor de corrección se calcula para cada tubo utilizando el correspondiente valor de la cel-miR-238.
  4. Calcular el número de copia ajustada al dividir el número de copia cruda promedio de cada muestra (de paso 6.2) por el factor de corrección (de paso 6.3) para cada muestra.
  5. Calcular el número de copia absoluto multiplicando el número de copia cruda ajustada de cada muestra (de paso 6.4) por el el factor de dilución para cada muestra.
    Nota: El factor de dilución es "5" en el presente Protocolo, que se deriva de paso 5.2.
  6. Calcular la eficiencia de amplificación por PCR de la pendiente de la parcela de los valores de Cq para cada dilución serial contra concentración de cDNA de registro.
    Nota: Fórmula para el cálculo de la eficiencia; E = (10(-1/pendiente) -1) x 100%.
  7. Calcular la variación técnica utilizando los valores de Cq de cel-miR-238 de todas las muestras mediante la fórmula E = (eficacia de la amplificación de 2 x)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)).
    Nota: Los pasos 6.5 y 6.7 se utilizan para la evaluación de la calidad del procedimiento.

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Representative Results

Flujo de trabajo de análisis de miRNA por RT-qPCR y calidad assessment
La figura 1 muestra el flujo de trabajo de miRNA análisis de muestras de sangre usando qPCR10. La calidad de los experimentos puede ser verificada mediante la inclusión de cel-miR-238 como un control externo. Esto revelará las variaciones técnicas en la extracción de RNA y RT-qPCR posteriores procesos. En este estudio, la media ± SD de los valores de Cq calculado a partir de 50 muestras fue 21.0 ± 0.4 (tabla 1). Si la cel-miR-238 se diluyó debido a la etapa de pre-amplificacion, el valor de Cq fue 24.2 ± 0.4 (tabla 1). En el método de ensayo descrito aquí, el grado de variación técnica se estima que menos de 3-fold basada en la diferencia en los valores de Cq. El grado de variación permanecieron constante incluso cuando paso de pre amplificación adicional tuvo que ser incluido. Estos valores son compatibles con los de otras muestras de diferentes especies de animales, como ratones, ratas y seres humanos realizan en este laboratorio (datos no mostrados).

Detectable entre curva estándar para miRNA blanco

Sin la amplificación de las muestras

Producto transcrito inverso (RT) de oligonucleótidos sintéticos de RNA en concentraciones de 1 x 107 copia/μl se diluyó en serie antes de qPCR posterior. Estas series fueron utilizadas para generar la curva estándar que garantiza cobertura consistente de todas las muestras biológicas que eran perceptibles sin etapa de pre-AMPLIFICACION. Los valores de Cq de la muestra patrón en concentración de 1 x 102 copia/μL fueron generalmente cerca de la cortada de niveles para cada objetivo de miRNA. Por lo tanto, el límite de detección se estimaba que 1 x 102 copia/μl (figura 3).

Muestras previamente amplificadas

Para determinar el rango detectable de muestras que requieren la amplificación, se compararon dos series diferentes de las muestras diluidas, tal como se ilustra en la figura 4. Para generar la curva estándar A, se prepararon diluciones seriadas del producto antes de la etapa de pre-amplificacion RT. Entonces la serie de normas previamente amplificadas fueron utilizada para qPCR posterior. Para generar la curva estándar B, se hizo la primera dilución de muestras previamente amplificadas a una concentración de 1 x 105 copia/μl. Estas curvas estándar demostraron los límites de detección aparentemente distintos (figura 5). Aunque curva estándar B demostró la gama lineal de aumento hasta 1 copia/μl, curva estándar A no podría ser utilizada para amplicones específicos en concentraciones menores de 102 o copia 10 3/μl (figura 5). Este resultado sugiere que cantidades extremadamente pequeñas de miRNAs no pueden evaluarse aún con el paso de pre-amplificación. Además, las muestras previamente amplificadas deben ser interpretadas con cuidado cuando los valores de Cq son > 30, porque eran los límites de detección de las muestras previamente amplificadas cerca de este valor. Por lo tanto, como regla general, curva estándar B fue utilizada en el método descrito aquí, después de determinar el rango detectable, con el fin de evitar el uso de un número insuficiente de parcelas estándar.

En consecuencia, el límite inferior de cuantificación (LLOQ) fue 102 copia/μL para la mayoría de los miRNAs (figura 3 y figura 5). Sólo miR-1 demostró una mayor LLOQ (copia 10 3/μL) (figura 5). La eficiencia de amplificación promedio fue aproximadamente el 90%, con el coeficiente de correlación (R2) de las curvas estándar que van desde 0.998 1.000. Se consideran las características de un ensayo de RT-qPCR precisa un lineal R2 igual o superior a 0.98 y una eficiencia de amplificación de PCR de 90 a 110%17. Por lo tanto, se verificó la calidad de las curvas estándar en el ensayo.

Efectos de la amplificación de pequeñas cantidades de miRNAs

Los miRNAs que mostraron valores de Cq por encima de 35 o mayor en qPCR posteriores fueron previamente amplificadas. Este procedimiento mejora la detección de pequeñas cantidades de miRNAs. Por ejemplo, los valores de Cq (media ± SD) de miR-206 no pre amplificados fue 37,9 ± 1.9, mientras que los del pre amplificado miR-206 disminuyó a 27.0 ± 2.2. Se observaron diferencias significativas entre pares de mediciones duplicadas en muestras no pre amplificados en altos valores de Cq (figura 6). En contraste, las muestras previamente amplificadas demostraron valores casi iguales en duplicados (figura 6). Estos resultados indicaron que la amplificación sería eficaz para proporcionar datos más precisos y fiables en los casos de pequeñas cantidades de muestras.

Perfil de plasma miRNAs en monos cangrejeros

Utilizando la plataforma de ensayo establecidas, los niveles plasmáticos de 8 miRNAs (miR-1, miR-122, miR-133a, miR-192, miR-206, miR-208a, 208b miR y miR-499a) de 50 cangrejeros monos fueron analizan (figura 7)10. En este ensayo, miR-122, miR-133a y miR-192 eran detectables sin la amplificación, mientras que 499a miR, miR-1 y miR-206 requieren la amplificación debido a sus niveles de baja expresión. Sin embargo, miR-208a ni miR-208b era perceptible incluso con amplificación previa. Los datos no se distribuyeron normalmente; por lo tanto, se realizó una transformación logarítmica para calcular su media y desviación estándar. Entre los miRNAs examinado, miR-122 registró el mayor promedio plasma (5,71 x 104 copia/μL), con un rango dinámico pequeño (20-fold). En cambio, se observaron grandes rangos dinámicos para miR-1 (581-fold), miR-133a (971-fold) y miR-206 (426-fold).

Figure 1
Figura 1 : Flujo de trabajo esquemático ensayo miRNA por RT-qPCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Flujo de trabajo manual de reparacion de reversa de la transcripción de ensayo miRNA. Una piscina que contiene hasta 4 objetivo miRNAs se puede hacer mezclando los cebadores de RT 20 x de cada uno de los miRNAs en la piscina. Cel-miR-238 (control externo) debe ser incluido como uno de los miRNAs de destino en cada tubo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Análisis de datos miR-238
Sin
La amplificación		 Con
La amplificación
N 50 50
Significa 21.0 24.2
SD 0.4 0.4
Max Cq 21.8 25.3
Cq min 20.3 23.5
Mediana 21.0 24.2
Max-Min 1.3 1.8
Eficacia de la amplificación 89 89
Variación 2.4 2.8

Tabla 1: evaluación de la calidad utilizando valores de ciclo (Cq) cuantificación de cel-miR-238. Se evaluaron las variaciones técnicas de los valores de Cq de miR-238 en cada ensayo. Cincuenta muestras se dividieron en dos grupos correspondientes a (derecho) o sin (izquierda) paso la amplificación previa. Variación se calculó mediante la fórmula E = (eficacia de la amplificación de 2 x)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)). Se calculó la eficacia de la amplificación de la pendiente de la curva estándar. Las muestras que requieren paso de pre-amplificación se diluyeron durante la etapa de pre-amplificacion (miR-238 sí mismo no era previamente amplificado). Esta figura ha sido modificada desde nuestro informe10.

Figure 3
Figura 3 : Parcela de curvas estándar para muestras no pre amplificados. Curvas estándar (N = 3, duplicado) fueron generados por el registro de concentración versus Cq. lineal análisis de regresión se calculó para determinar la pendiente, que corresponde a la eficiencia de amplificación. Estándar de curvas para miR-122 (superior), miR-192 (medio) y miR-133a (inferior) mostraron una relación lineal entre concentración y Cq en la gama de prueba. En las curvas estándar, barras de error representan una desviación estándar de tres ensayos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Procedimiento para generar curvas estándar para las muestras previamente amplificadas. (Curva estándar A) Una concentración representativa de oligo sintética (1 x 105 copia/μL) fue inversa transcrito, siguió preparando 10 veces series de dilución seriada de la muestra estándar. Estas normas pre amplificadas fueron utilizadas para qPCR posterior. (Curva estándar B) Una concentración representativa de oligo sintética (1 x 105 copia/μL) fue inversa transcribe y pre amplificado. Entonces, una serie de dilución seriada 10 veces de muestras estándar se prepararon antes de qPCR posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Diagrama de curvas estándar A y B para las muestras previamente amplificadas. Curva estándar A (n = 1, duplicado) y curva estándar B (n = 3, duplicado) fueron generados por el registro de concentración versus Cq. lineal análisis de regresión se calculó para determinar la pendiente, que corresponde a la eficiencia de amplificación. ()Alto) Curva estándar A (línea punteada) demostró aparentemente no específicos amplicon en 1 x 102 copia/μl, mientras que curva estándar B (línea sólida) demostraron la relación lineal entre concentración y Cq en la gama probada de miR-1. (Medio y inferior) Curva estándar A (línea punteada) no demostró productos en concentraciones de 1 x 102 copia/μl o más bajo, mientras que el estándar de la curva B (línea sólida) demostró relación lineal entre concentración y Cq en la gama probada de miR-499a y miR-206. En la curva estándar B, barras de error representan una desviación estándar de tres ensayos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Parcela de amplificación de muestras pre amplificadas y no amplificado de pre. (Superior) parcela de amplificación de miR-206 en muestras representativas (A, B, C) sin (arriba), o con pre-amplificación (inferior). Se establecieron las medidas por duplicado. Hubo diferencias entre las dos muestras como duplicados en muestras no pre amplificados, especialmente en mayores Cq las muestras (A y B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7 : Valor absoluto de plasma microRNAs (miRNAs) en monos cangrejeros. Los niveles de expresión de los miRNAs son representados por diagramas de punto. Se determinaron la media y el valor de dos desviaciones estándar por debajo y por encima de la media (se muestra en el cuadro gris), después de una transformación logarítmica. Esta figura ha sido modificada desde nuestro informe10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Nuestra evaluación completa proporciona un análisis estadístico más riguroso de la amplitud de la gama dinámica, que indica claramente que la magnitud de la variación entre muestras individuales fue muy diferente entre los miRNAs probado. Aunque estas variaciones pueden atribuirse a sus pequeñas cantidades en los fluidos corporales, debe señalarse que estos datos reflejan no sólo las variaciones biológicas, sino también variaciones técnicas. La mayoría de la variación de la técnica puede ser evaluada mediante valores de Cq del control externo (cel-miR-238), que se utiliza en otras plataformas de ensayo18. Ya que ha habido no hay controles internos estandarizados en el análisis de miRNA, la información de variación técnica debería incluirse en el análisis, para determinar la calidad del ensayo19. Variación técnica era estimada para ser menos de 3-fold en el método descrito en este informe. Aunque no es posible determinar el nivel de calidad para este procedimiento debido a la falta de información técnica comparable en otras investigaciones, incluyendo dicha información contribuye a mejorar la fiabilidad y garantiza la compatibilidad entre diferentes estudios.

Un número de trabajos recientes ha reportado que diversas variables pre-analíticas tales como manipulación de muestra, las condiciones de almacenamiento y duración de almacenamiento antes de la transformación pueden afectar la confiabilidad y reproducibilidad de circulación miRNA mediciones20 , 21. aunque este estudio no tuvo en cuenta los efectos de las variables pre-analíticas, se seguir los siguientes pasos cuidadosamente durante la preparación de la muestra para reducir al mínimo las variaciones. En primer lugar, plasma fue procesado tan pronto como sea posible (dentro de la colección después de 2 horas) para minimizar el efecto de la estabilidad de miRNAs en plasma8,22. Aunque miRNAs se consideran ser estable a temperatura ambiente (15 a 25 ° C), no está todavía claro si el intervalo entre la colección y procesamiento de suero o plasma afecta los niveles de miRNA. En segundo lugar, cada muestra de plasma fue inspeccionado visualmente para eliminar el sesgo analítico de la contaminación con glóbulos rojos hemolizadas, que representa uno de los factores de confusión que pueden afectar los niveles de circulación miRNAs23.

La amplificación es útil para mejorar la detección de cantidades muy pequeñas de miRNAs en biofluidos sin introducir un sesgo de detección24. En el presente estudio, los valores de Cq de las curvas estándar construidos usando oligonucleótidos sintéticos previamente amplificadas demostraron alta reproducibilidad en el análisis. Esto permitió la cuantificación absoluta utilizando muestras previamente amplificadas, que permitió la detección de pequeñas cantidades de miRNAs. Por otra parte, estándares de número de copia baja (1 x 102 o 103 copia/μL) no muestran amplicones específicos, en combinación con la amplificación. Mestdagh et al. 24 informó que medida de miRNAs número copia baja mostraron una variación mayor tras procedimiento de pre-amplificación, comparado con moderada o alta copia número miRNAs, debido a la baja eficiencia de la transcripción inversa, que podría ser el resultado de miRNA características de la secuencia. Por lo tanto, el rango de detección de curvas estándar para cada miRNA debe ser validado antes de la cuantificación de muestras biológicas, especialmente para los miRNAs previamente amplificado, para eliminar resultados falsos positivos. Más importante aún, debe ser observado que los niveles absolutos de miRNAs diferentemente procesados como muestras pre amplificadas y no amplificado de pre no pueden compararse directamente porque no se especifica la cantidad de muestra previamente amplificada en cada miRNA.

Este informe describe un procedimiento para la determinación de los niveles de miRNA absoluta en muestras de plasma utilizando RT-qPCR. No se detectaron algunos miRNAs incluso después de la amplificación. Para detectar estos miRNAs de expresión baja, puede tener un enfoque diferente ser utilizado. Aunque con una mayor cantidad de muestra puede eludir este problema como una solución sencilla, grandes cantidades de muestra no siempre están disponibles. Hasta la fecha, los avances tecnológicos han permitido el desarrollo de diversas plataformas para miRNA perfiles25,26. Gotita PCR digital (ddPCR) ha sido desarrollado recientemente y ofrece un método alternativo al convencional RT-qPCR para cuantificación absoluta. Esta tecnología innovadora se ha divulgado para ser un método preciso, reproducible y sensible que puede detectar un blanco miRNA en niveles de 1 copia/μl27,28. Si ddPCR puede detectar una baja concentración de miRNAs sin una etapa de pre-amplificacion, sería una gran ventaja porque los niveles de miRNAs múltiples pueden compararse entre sí. Cambios en los procedimientos de extracción y posterior RT-qPCR, plataforma molecular y reactivos utilizados producirá inevitablemente resultados variables. Sin embargo, estas variaciones pueden resolverse siempre transparentes resultados de controles externos y los niveles absolutos de los miRNAs. Evaluación de la calidad apropiada del método es la clave para mejorar el discernimiento de los cambios biológicos en estudios de perfiles de miRNA.

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Disclosures

El autor no tiene ningún conflicto de interés que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación no recibió ninguna subvención específica de organismos de financiación en los sectores público, comercial o sin fines de lucro.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Microtainer tube (K2EDTA) Becton, Dickinson and Company 365974 For blood collection
Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL Eppendorf 0030124359
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  1.5 mL Eppendorf 0030120086
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  2.0 mL Eppendorf 0030120094
Synthetic oligonucleotide Hokkaido System Science - Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade)
Tris-EDTA Buffer  (pH 8.0) Nippon Gene 314-90021 TE buffer
Buffer RPE QIAGEN - Contents in miRNeasy mini kit 
Buffer RWT QIAGEN - Contents in miRNeasy mini kit 
miRNeasy Mini Kit QIAGEN 217004
Nuclease-Free Water  QIAGEN 129114
QIAzol Lysis Reagent QIAGEN - Contents in miRNeasy mini kit 
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic  QIAGEN 219600 ID:MSY0000293, 5 nmol
SC Adapters TAIGEN Bioscience Corporation S0120 For RNA extraction
VacEZor 36 Complete System TAIGEN Bioscience Corporation M3610 For RNA extraction
7900HT Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific Inc. 4351405 Fast 96-Well Block
GeneAmp PCR System 9700 Thermo Fisher Scientific Inc. 9700
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific Inc. 4346907
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific Inc. 4311971
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific Inc. 4444557
TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000248
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002245
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002246
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002222
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000491
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000510
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 000511
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 002290
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) Thermo Fisher Scientific Inc. 4427975 Assay ID: 001352
TaqMan MicroRNA Reverse
Transcription Kit		 Thermo Fisher Scientific Inc. 4366597
TaqMan PreAmp Master Mix (2×) Thermo Fisher Scientific Inc. 4391128
Chloroform  Wako Pure Chemicals 035-02616
Ethanol (99.5) Wako Pure Chemicals 057-00456

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References

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Cuantificación absoluta de Plasma niveles de microARN en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR
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Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR. J. Vis. Exp. (132), e56850, doi:10.3791/56850 (2018).

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