Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Strömlinjeformad 3D cerebellär differentiering protokoll med valfritt 2D modifiering

Published: December 9, 2017 doi: 10.3791/56888
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Pediatrics/Child Neurology, Amsterdam Neuroscience, VU University Medical Center, 2Department of Complex Trait Genetics, Center for Neurogenomics and Cognitive Research, Amsterdam Neuroscience, Vrije Universiteit Amsterdam

Summary

Vi beskriver ett förenklat 3D differentiering protokoll för hPSCs, med hjälp av definierade medium och minskade tillväxtfaktorer, kan generera cell aggregat med tidig neuroepithelial strukturer och positivt för cerebellär-associerade markörer, samt en valfri 2D modifiering för att skilja celler som en enskiktslager att generera funktionella nervceller.

Abstract

Att minska komplexiteten och kostnaden för differentiering protokoll är viktigt för forskare. Detta intresse passar med farhågor om eventuella oavsedda effekter att extrinsic mallning faktorer kan införa i mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) modeller av hjärnans utveckling eller patofysiologi, såsom maskering sjukdom fenotyp. Här presenterar vi två cerebellär differentiering protokoll för hPSCs, utformad med enklare Startmetod, färre mallning faktorer, och mindre materialbehov än föregående protokoll. Nyligen har utvecklat vi kultur förfaranden, vilket genererar friflytande 3-dimensionell (3D) produkter överensstämmer med andra hjärnan ”organoid” protokoll, inklusive morfologier relevanta för modellering hjärnans utveckling såsom sub/ventrikulär zon- och rhombic Lip-liknande strukturer. Andra använder en vidhäftande, 2D enskiktslager förfarande att komplett differentieringen, som visas kan generera funktionella cerebellär nervceller, som produkter är positiva för cerebellär-associerade markörer, och uppvisar neuron-liknande kalcium tillströmningar. Tillsammans erbjuder dessa protokoll forskare ett urval av alternativ anpassade till olika forskningsändamål samt en grundläggande modell för andra typer av strömlinjeformad neurala differentieringar.

Introduction

In vitro -protokoll för att skilja hPSCs mot cerebellär härstamningar initialt drivs på principen att härma i vivo cerebellär utveckling1,2,3,4. Som sådan, krävs de en rad faktorer som infördes vid specifika tidpunkter att köra pro-cerebellär mallning och mognad. Chief bland dessa var WNT, bone morphogenetic proteiner (bmp) och fibroblast tillväxtfaktor (FGFs) med kända roller i mitten av hindbrain utveckling och bildandet av den isthmic arrangör5,6,7. Naturligtvis, varje ytterligare steg och faktor innebär en ökning i arbetsintensiva manipulationer och större kostnader för forskaren och så utveckla enklare protokoll kan uppnå lika resultat är av intresse. Denna praktiska fråga sammanfaller fint med den hypotetiska frågan, huruvida celler behöver sådana snäva, extern kontroll över deras utveckling in vitro.

För cerebellär differentiering upp ett protokoll som publicerades 2015 nödvändigheten av att använda ett omfattande antal tillväxtfaktorer med endast FGF2, FGF19 och stromal cell-derived faktor 1 (SDF1) för mönstring ändamål8. Denna studie skilde sig också från tidigare cerebellär protokoll, genom att använda en fritt flytande 3D kultur system. Förutom att producera celler positiv för cerebellär markörer, visades i hjärnan ”organoids” som genereras av deras teknik att ställa ut relevanta morfologi, inte tillgängliga i traditionella 2D enskiktslager kulturer, såsom rhombic lip-liknande strukturer. Även om det är mindre komplicerat och kostsamt med avseende på tillväxtfaktorer, andra funktioner såsom bildning av enhetliga embryoid organ (EBs) och kultur i 96 brunnar (96WPs), gjorde det förfarandemässigt komplexa under första stegen. En annan 3D protokoll publicerade samma år, rapporterade lyckad differentiering till neurala härstamningar använder gemensamma och billig cell kultur tekniker9. Även om denna grupp undersökte kortikala snarare än cerebellär differentiering, kan tillämpningen av deras koncept för cerebellär differentiering inte diskonteras.

Vi rapporterade nyligen en 3D cerebellär differentiering-protokollet använder ett minskat antal mallning faktorer (nämligen FGF2, 4 och 8), samt en förenklad installation genom att hålla cellerna i 6-väl plattor (6WPs) hela för att minimera medelstora krav10. För att underlätta produktionen av granule celler, användes glättas agonist (SAG) under den slutliga mognad steget. SAG är ett billigare kemiska alternativ till sonic hedgehog (SHH), som hade använts i tidigare cerebellär protokoll, på grund av dess roll för att främja tillväxten av granule cellen prekursorer (GCPs) i vivo1,2, 11,12,13. Differentiering produkter överensstämde med de från andra 3D protokoll, inklusive förekomsten av cerebellär-associerade markörer i morfologiskt relevanta strukturer8,9. Sådana resultat förstärka tidigare budskapet som detaljerade härmning av i vivo miljön kanske inte är nödvändigt för komplexa 3D i vitro differentiering protokoll.

Förutom 3D protokollet, denna rapport beskriver ett 2D protokoll, utformad med samma snabb setup, materialen och minskat antal tillväxtfaktorer. Det är kapabel att producera celler från mänskliga embryonala stamceller (hESCs) eller inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), positiva markörer associerade med tidigt neurala, lillhjärnan, och granule cellen identiteter. Dessutom indikerar kalcium imaging förekomst av funktionella mänskliga nervceller. Möjligheten att välja mellan protokoll, lägger till en nivå av flexibilitet för forskare, för dem som är intresserade av antingen: (1) generera viss cell typer, (2) modellering mänskliga hjärnans utveckling och tillhörande strukturer, (3) analys optimerad i enskiktslager inställningar (t.ex., patch-clamp inspelningar), eller (4) cell-cell interaktioner i blandade neural kulturer. Deras enkla och billiga natur gör dem tillgängliga för forskare som är nya till fältet hPSC, eller behöver bas hPSC förfaranden att utforska ytterligare differentiering alternativ.

Protocol

1. förberedelser

Obs: Alla åtgärder finns Tabell för material för specifika objekt.

  1. Förbereda 500 mL definieras hPSC odlingsmedium för hPSC kultur
    Obs: Använd medium för steg 2.1-2.6.
    1. Tina hPSC medelstora tillägg över natten (o/n) vid 4 ° C. Avlägsna 12,5 mL av hPSC bas medium från medelstora flaska, tillsätt 10 mL av tillägg och 2,5 mL (att göra 100 U/L) sedan Penicillin/Streptomycin (penna/Strep) till flaskan.
    2. Förvaras vid 4 ° C och Använd inom 2 veckor.
      Obs: HPSC medium kan användas för att frysa ner celler genom att lägga till 10 µM ROCK hämmare (RI) och 10% DMSO.
  2. Förbereda 1 L neurala underhåll medium (NMM) för differentiering kultur
    Obs: Använd medium för steg 3.1-4,4.
    1. Blanda glutamin berikade DMEM/F12 och neurala bassubstratet (1:1 ratio) i en 1 L flaska, sedan tillägg med (1 x) N2 tillägg, (1 x) B27 komplettera, 5 µg/mL insulin, 1,5 mM L-glutamin, 100 µM icke-essentiella aminosyror (NEAA), 100 U/L penna/Strep och 10 µM Beta-merkaptoetanol.
    2. Lagra medium vid 4 ° C och Använd inom 3 veckor.
      Obs: Innan du lägger kosttillskott till blandade basala medium, ta bort lämplig volym justera för volymen som krävs av tillagda komponenter baserat på lager koncentrationer.
  3. Förbereda 500 mL 0,5 mM EDTA fungerande lösning för passaging hPSCs
    Obs: Använd medium för steg 2.4 och 2.5.
    1. Under flöde-huva, över 49 mL av fosfat buffrad saltlösning (PBS) från en 500 mL steril PBS flaska till en 50 mL tub. Tillsätt 0,5 mL 0,5 M EDTA och 0.9 g NaCl till 50 mL-röret. Blanda försiktigt för att lösa upp.
    2. Filter-sterilisera lösning med en 0,22 µm filter och överför till 500 mL steril PBS flaskan. Förvara i rumstemperatur (RT).
  4. Förbereda hPSC kultur plattor för hPSC kultur
    Obs: Använd plattor för steg 2.1-2.6.
    1. Gör 50 x fungerande lösning av hPSC-lämpligt vidhäftande beläggning (PAAC): Tina en injektionsflaska med PAAC o/n vid 4 ° C. Späd PAAC i förhållandet 1:1 med DMEM/F12 och överföring som 400 µL portioner i 1,5 mL rör. Lagra 50 x fungerande lösning PAAC vid-80 ° C.
      Obs: (viktigt) PAAC stelnar snabbt på RT, det är därför nödvändigt att alla komponenter (DMEM, rör, etc.) hålls på is (eller vid 4 ° C).
    2. Tina tube 50 x fungerande lösning PAAC vid 4 ° C och sedan späd 50 x i kalla DMEM/F12. Lägg till 750 µL per brunn av utspädda PAAC till en 6WP. Inkubera plattan för minst 1 h vid 37 ° C.
      Obs: PAAC plattor kan förvaras i 1 vecka vid 4 ° C, med omslag plattan efter 1 h inkubationstid. Varm tallrik till 37 ° C före användning.
  5. Förbereda anti lim (AA) plattor för differentiering kultur
    Obs: Använd plattor för steg 3.1-4.1.
    1. Göra 5 mg/mL Poly (2-hydroxietylmetakrylat) (poly-HEMA) lösning i 95% etanol. Skaka o/n vid 37 ° C tills en klar lösning erhålls. Butiken på RT.
      Obs: Filtrering genom ett 0,22 µm filter kan ta bort oupplösta poly-HEMA.
    2. Lägga till poly-HEMA kultur plattan så att det täcker botten av varje brunn. Inkubera plattan vid 37 ° C i 2 dagar, och inspektera plattan för att säkerställa fullständig förångning av vätskan/uniform beläggning av brunnar. AA plattor kan insvept och lagras på RT.
  6. Förbereda Poly-L-Ornithine/Laminin (PLO-LAM) plattor för differentiering kultur
    Obs: Använd plattor för steg 4.2-4.4.
    1. Täck ytan av brunnarna, med 20 µg/mL PLO upplöst i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Inkubera plattan o/n vid 37 ° C. Aspirera PLO och skölj 3 gånger med PBS.
      Obs: (Valfritt) Incubated tallrik med PLO kan förpackade och lagras vid 4 ° C tills den behövs.
    2. Täck ytan områdena PLO-belagd brunnarna, använda 10 µg/mL LAM upplöst i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Inkubera i minst 2 h vid 37 ° C eller o/n vid 4 ° C. Ta bort LAM och Tvätta brunnarna 2-3 x med PBS, sedan omedelbart lägga till lämpligt medium och/eller celler.
      Obs: (Valfritt) bort LAM lösning kan lagras vid 4 ° C och återanvändas upp till 2 gånger. (Viktigt) Tillåt inte LAM-belagda ytor att torka ut; för att förhindra detta omedelbart lägga PBS eller lämpligt medium.
       

2. protokoll 1: Feeder-fri hPSC kultur

Obs: hESCs erhölls från en icke-kommersiell organisation (linje H01, se Tabell för material). Tre hiPSC kontroll linjer (hvs51, 60, och 88) genererades av omprogrammering fibroblaster från tre friska mänskliga patienter (fibroblaster var härledda från anonyma, icke-identifierbar givare och därför undantagna från IRB godkännande)10, 17.

  1. Upprätthålla hPSCs i feeder-fri kultur
    1. Efter upptining och plätering hPSCs på PAAC plåtar i hPSC medium (se steg 2.2), upprätthålla hPSCs vid 37 ° C med 5% CO2. Uppdatera hPSC medium dagligen (se steg 2,3), utom dagen efter upptining eller passaging och undersöka celler i Mikroskop (mål: 2.5x/0.06, 5 x / 0.12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1) att följa tillväxten Betygsätt och identifiera potentiella områden för differentiering (figur 3 , övre vänstra panelen visar exempel på differentiering).
    2. Passagen hPSCs varje 3-4 dagar, eller när kulturen når > 80% sammanflödet. Om mindre än 5% av celler uppvisar differentiering, Använd normala hPSC passaging metod (se steg 2,4), annars använder du metoden skonsam (se steg 2.5). När inte längre behövs i kultur, hPSCs kan frysas för långtidsförvaring (se steg 2,6).
  2. Tina hPSCs i hPSC medium
    1. Överföra volymen som krävs av hPSC medium till sterila tuber för upptining processen (9 mL/kryogen slang) och beredda PAAC plattan att få upptinade celler. Komplettera mediet i båda rören med 10 µM RI.
    2. Hämta cryotube från LN2 lagring och placera direkt i ett vattenbad (37 ° C). När endast en liten ice crystal återstår, ta bort från vattenbadet och överför innehållet i kryogena röret till röret för upptining processen (total volym 10 mL). Centrifugera röret vid 290 x g i 5 min på RT.
    3. Använd en serologisk pipetten att ta bort PAAC lösningen från brunnarna av PAAC plattan (se steg 1.4) avsedd att få celler och lägga hPSC medium med 10 µM RI.
      Obs: (viktigt) inte aspirera PAAC lösning med en sug nål, eller det kan stelna och täppa till linjer att vakuumpump.
    4. Ta bort supernatanten från röret och resuspendera cellerna i hPSC medium med 10 µM RI. Distribuera cellerna till destination plattan på förhållandet mellan 1 kryogen tube/brunnen av 6WP. Inkubera vid 37 ° C med 5% CO2, och uppdaterar inte medium för 1 dag.
      Obs: Starta upp celler på 5% O2 kan öka cellöverlevnad.
  3. Uppdatera hPSC medium
    1. Värma volymen som behövs av hPSC medium i ett sterilt rör på RT eller i ett vattenbad; 2 mL per brunn av 6WP föreslås.
      Obs: (Valfritt): genom att lägga ett extra belopp på hPSC medium, hPSCs kan förbli en extra dag utan uppfriskande; dock Tillåt inte detta mer än en gång i veckan.
    2. Aspirera på medellång från brunnar som innehåller hPSCs och tillsätt färsk hPSC medium.
    3. Kultur hPSCs i en inkubator på 37 ° C och 5% CO2.
  4. Passagen hPSCs i hPSC medium
    1. Överföra volymen som krävs av hPSC medium till sterila rör, för passaging processen och för beredning av PAAC plattan ta emot anpassade celler. Komplettera mediet för destination plattan med 10 µM RI. Varm medium rören på RT eller i vattenbad.
      Obs: Beredning och hantering varierar om använder en alternativ beläggningsmaterial än som anges i Tabellen för material.
    2. Använd en serologisk pipetten att ta bort PAAC lösningen från brunnarna av PAAC plattan (se steg 1.4) avsedd att få celler och lägga hPSC medium med 10 µM RI.
      Obs: (viktigt) inte aspirera PAAC lösningen med en sug nål, eftersom det kan stelna och täppa till linjer att vakuumpump.
    3. Aspirera på medellång från brunnar med hPSCs för att vara anpassade, tvätta cellerna två gånger med 0,5 mM EDTA, tillsätt sedan 0,5 mM EDTA och Inkubera under 2-5 minuter vid 37 ° C.
      Obs: 1 mL per brunn av 6WP är en tillräcklig volym EDTA för tvätt och inkubation.
    4. Kontrollera brunnarna under mikroskopet (mål: 2.5x/0.06, 5 x / 0.12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1). Om celler börjar lossa, aspirera EDTA-lösning och spola celler gratis på hPSC medium.
      Obs: (viktigt) ta hand inte ta bort hela hPSC kolonier när aspirera EDTA (vänta inte tills hela kolonier demontering). Spola inte celler mer än 5 gånger eftersom detta kan skada hPSCs och påverka pluripotency. Också, låt inte celler som står i hPSC medium med RI innan spolning celler från brunnar, som de får åter följa plattan.
    5. Baserat på empirisk bestämning (oftast relaterade till sammanflödet, storleken på kolonier, och tillväxttakten), överföra hPSCs till brunnar i destination plattan med uppdelning förhållandet 1:4-1:16 (dvs, det 1 väl från den ursprungliga plattan till 4 brunnar i destination pläterar). Inkubera vid 37 ° C med 5% CO2, och uppdaterar inte medium för 1 dag.
      Obs: Dela nyckeltal så hög som 1:16-1:20 är möjliga att förhindra trängsel och förbättra utseendet på kolonier.
  5. Passagen hPSCs med mild-metoden (G-metoden)
    1. Överföra volymen som krävs av hPSC medium till sterila rör, för den passaging processen och för beredning av PAAC plattan ta emot anpassade celler. Komplettera mediet för destination tallrik med 10 µM RI. Varmt medium rör RT eller i vattenbad vid 37 ° C.
    2. Användning serologiska pipett att ta bort PAAC lösning från brunnar i PAAC-plattan avsett (se steg 1.4) att få celler och lägga hPSC medium med 10 µM RI.
      Obs: (viktigt) gör inte PAAC aspirera med en sug nål, eller det kan stelna och täppa till linjer att vakuumpump.
    3. Aspirera medium från brunnarna med hPSCs att vara överförda och tvätta cellerna två gånger med 0,5 mM EDTA. På den andra tvätten, vänta 30 s innan aspirera EDTA, tillsätt sedan 1 mL PBS och inkubera i 4-9 min vid 37 ° C. Medan du väntar, förbereda ett sterilt rör med 4 mL PBS.
      Obs: 1 mL per brunn av 6WP är tillräcklig volym EDTA för tvätt.
    4. Kontrollera brunnarna under mikroskop (mål: 2.5x/0.06, 5 x / 0.12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1). Om celler börjar lossa, trycker du försiktigt på sidorna av plattan att hjälpa gratis kolonier. När > 50% av kolonier är fri svävande, Använd 5 mL serologiska pipett för att överföra kolonier i 1 mL PBS till röret som innehåller 4 mL PBS (inte pulverisera).
      Obs: (viktigt) eftersom syftet är att rensa upp hPSC kultur, kontrollera att avgöra om differentierade celler förbli kopplade till plattan. Dessutom är det inte nödvändigt att passagen alla kolonier i en väl med denna process, så kolonier som sitta kvar får vara kvar.
    5. Vänta 5-10 min på RT för celler att bosätta sig i röret (Centrifugera inte). Aspirera PBS från röret, utan att ta bort fast hPSCs. Noggrant Omsuspendera cellerna i hPSC medium (inte pulverisera), och överföra cellerna till destination plattan med uppdelning förhållandet 1:4-1:16. Inkubera vid 37 ° C med 5% CO2, och uppdaterar inte medium för 1 dag.
  6. Frysa ner hPSCs
    1. Beroende på sammanflödet, Använd 1 väl av hPSCs, 2-3 dagar (maximal) i kultur, att fylla 1-2 frysförvaring flaskor för lagring i LN2.
    2. I slutet av passaging (steg 2.5), Använd 500 µL eller 1 mL hPSC medium att överföra celler från 1 väl av 6WP till 1 eller 2 injektionsflaskor. frysförvaring, respektive (500 µL/injektionsflaska). Till varje rör, tillsätt 500 µL av 2 x frysa medel innehållande hPSC medel, 20 µM RI och 20% DMSO.
      Obs: (Valfritt) celler kan överföras direkt i 1 x frysning mediet vid 1 mL/flaska.
    3. Placera kryogen rören i en kryogen behållare (som innehåller isopropanol) före kylas till 4 ° C och store omedelbart vid-80 ° C.
    4. På nästa dag, överföra kryogen rören en LN2 tank för långsiktig lagring.

3. protokoll 2: 3D ”Organoid” differentiering

  1. Inställning av differentiering med modifierad G-metod för passaging av hPSCs
    1. Överföra nödvändig mängd NMM för antalet destination brunnar till ett sterilt rör. Komplettera med 4 ng/mL FGF2 och 10 µM RI. Värma medium röret på RT eller i vattenbad vid 37 ° C.
      Obs: Beroende på confluencen av originering brunnarna, hPSCs koncentreras under distributionen till destination plattan i en 2:1 eller 3:1 baserat (dvs, 2 brunnar från den ursprungliga plattan till 1 väl Skyltens destination), med en slutet volym 2,5 mL/brunn av 6WP.
    2. Aspirera på medellång från brunnar innehållande hPSCs göras åtskillnad mellan, och tvätta cellerna två gånger med 0,5 mM EDTA. På den andra tvätten, vänta 30 s innan aspirera EDTA, tillsätt sedan 1 mL PBS och inkubera i 4-9 min vid 37 ° C. Medan du väntar, förbereda ett sterilt rör med 4 mL PBS.
      Obs: 1 mL per brunn av 6WP är tillräcklig volym EDTA för tvätt. (Viktigt) Det är bättre att använda hPSCs som var längre än 3 dagar i kultur efter sista passagen, och minst 1-2 passager efter upptining.
    3. Kontrollera brunnar under mikroskopet (mål: 2.5x/0.06, 5 x / 0.12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1). Om celler börjar lossa, gratis cellerna genom skonsam att trycka på sidorna av plattan. Överföra cellerna till en tub innehållande 4 mL PBS med 5 mL pipett.
      Obs: (viktigt) ljus rodnad och sönderdelning är tillåtet att bryta upp kolonier och samla lösa celler, men ignorerar celler som förblir vidhäftat till plattan.
    4. Låt röret sitta i 10 min vid RT, för gravitation separation. Alternativt kan du Centrifugera cellerna lätt (som inte är större än 200 x g på RT, för 5 min) om det behövs.
    5. Aspirera PBS från röret, utan att ta bort fast hPSCs, resuspendera cellerna i NMM med 4 ng/mL FGF2 och 10 µM RI, och sedan distribuera till AA-belagd plattan i förhållandet 2:1 eller 3:1. Inkubera vid 37 ° C med 5% CO2, och uppdaterar inte mediet för 3 dagar, om det inte krävs (se steg 3.2.1).
      Obs: (Valfritt) för att underlätta överföring av celler, lägga till en del av odlingsmedium brunnar i destination plattan före distributionen och resuspendera cellerna i en mindre volym. Dessutom kan hPSCs vara målat och räknas för att definiera exakta start cell densiteten. Den slutliga volymen i destination plattan bör dock 2,5 mL/brunnen av 6WP.
  2. Bibehålla friflytande differentiering kultur vid 37 ° C (5% CO2)
    1. Kontrollera plattorna varje dag för ändringar i medellång färg, ansamling av döda celler, klumpar och följsamhet till väl bottnar.
      1. Tillval: Oavsett medium ändra schemat, uppdatera (inklusive de första 3 dagarna av nr uppfriskande) medium om det har vänt gul och följ instruktionerna för medelstora ändra/uppdatera (steg 3.3). Om flertalet celler visas döda, följ instruktionerna för medelstora ändra/uppdatera med gravitation separation (steg 3,4).
        Obs: Bildandet av EBs och tillväxt i stora cell aggregat förväntas, men celler och cell aggregat kan klumpa ihop i stora massor inte beror på individuella tillväxt/spridning. Om detta beaktas, är ljus trituration att bryta upp massorna tillåtet. Om celler börjar följa AA-platta ytan, kan de återstående flytande innehållet av brunnar överföras direkt till nya brunnar, eller överförs under processen för medelstora ändra/uppdatera. Försök inte att överföra celler som har anslutit sig till plattan.
    2. Dag 3, ändra mediet till NMM med 4 ng/mL FGF2. Uppdatera medium varannan dag.
    3. Dag 7, ändra mediet till NMM med 1 µM Retinoic Acid (RA), 100 ng/mL FGF8B och 4 ng/mL FGF2. Uppdatera medium varannan dag.
      Obs: (viktigt) RA är ljuskänsliga. Ljuskänsligt RA kultur prover.
    4. Dag 14, ändra mediet till NMM med 100 ng/mL FGF8B, 100 ng/mL FGF4 och 20 ng/mL FGF2. Uppdatera medium varannan dag.
    5. Dag 17, ändra mediet till NMM med 100 ng/mL FGF8B. Uppdatera medium varannan dag.
    6. På dag 21, ändra mediet till NMM med 100 ng/mL hjärnan som härrör neurotrofa faktorn (BDNF) och 10 ng/mL gliaceller som härrör neurotrofa faktor (GDNF). Uppdatera medium varannan dag.
    7. Dag 28, ändra mediet till NMM med 100 ng/mL BDNF och 10 ng/mL GDNF, 3 ng/mL SAG, 100 ng/mL neurotrofa faktor 3 (NT3) och 25 mM KCl. uppdatera medium varannan dag.
    8. På dag 35, samla den 3D organoids för analys.
  3. Ändra/uppdatera differentiering medium för 3D kultur
    1. Överföra nödvändig mängd NMM med lämpliga komponenter (se steg 3.2.2-3.2.7 för komponenten schema) till ett sterilt rör. Varm i vattenbad vid 37 ° C.
    2. Tips på plattan och skaka försiktigt tills cellerna bosätta sig nedre kant av brunnarna. Försiktigt bort 2 mL av gamla medium med serologiska pipett, undvika borttagning av cellerna, sedan Tillsätt 2 mL av färskt medium. Inkubera vid 37 ° C med 5% CO2.
      Obs: (viktigt), slutet volym bör vara 2,5 mL/brunnen av 6WP. Om avdunstning sker, ta inte bort 2 mL av gamla medium som detta skulle ytterligare torka ut cellkulturer; istället, lägga till extra medium.
  4. Ändra/uppdatera differentiering medium med gravitation separation
    1. Överföra nödvändig mängd NMM med lämpliga komponenter till ett sterilt rör. Varm i vattenbad vid 37 ° C.
    2. Överför innehållet i brunnarna till ett sterilt rör och låt röret sitta i 10 min vid RT, för gravitation separation.
    3. Använd en pipett för att avlägsna gamla medium från röret, att ta hand inte ta bort bosatte sig celler, Återsuspendera i NMM med lämpliga komponenter, och sedan distribuera till nya AA-belagd brunnar. Inkubera vid 37 ° C med 5% CO2.
      Obs: (Valfritt) för bekvämlighet, en del av odlingsmedium kan läggas till destinationen brunnar tidigare distribution, med differentiering cellerna resuspended i en lägre volym. Slutet volymen bör vara 2,5 mL/brunnen av 6WP.

4. protokoll 3: Alternativa 2D differentiering kultur

  1. Starta och underhålla kultur med stegen enligt avsnitt 3 för 3D protokoll genom dag 12
    1. Följ steg 3.1-3.2.3 och ändra/uppdatera medium enligt steg 3.3 och 3.4.
  2. Växla till och upprätthålla som 2D enskiktslager kultur
    1. Dag 13 differentiering, följ instruktionerna för att ändra/uppdatera medium med gravitation separation (steg 3,4), endast distribuera celler/aggregaten till PLO-LAM belagd plåt (se steg 1,6) med ett slutet volym 2,5 ml/väl av 6WP.
      Obs: Medium kan kompletteras med 10 µM RI under den inledande pläteringen hjälpa följsamhet och överlevnad av celler. (Viktigt) Det är önskvärt att sprida jämnt cellerna i brunnar, att undvika låg densitet eller trängs på plattorna, och passage (se steg 4,4) vid behov. Önskad storlek av PLO-LAM belagda plattor (dvs, 6WP, 12WP, etc.) måste empiriskt bestämmas utifrån spridningen räntan för cellinje, och syftet med produkten. Instruktioner kommer att ge volymer för 6WP och kan konverteras genom att halvera för varje fördubbling av väl nummer (dvs.2 mL per brunn för 6WP, 1 mL/bra för 12WP, etc.)
    2. Dag 14, ändra mediet till NMM med 100 ng/mL FGF8B, 100 ng/mL FGF4 och 20 ng/mL FGF2. Uppdatera medium varannan dag som beskrivs i steg 4,3.
    3. Dag 17, ändra mediet till NMM med 100 ng/mL FGF8B. Uppdatera medium varannan dag som beskrivs i steg 4,3.
    4. På dag 21, ändra på medellång till NMM med 100 ng/mL BDNF och GDNF för 10 ng/mL. Uppdatera medium varannan dag som beskrivs i steg 4,3.
    5. Dag 28, ändra mediet till NMM med 100 ng/mL BDNF och 10 ng/mL GDNF, 3 ng/mL SAG, 100 ng/mL NT3 och 25 mM KCl. uppdatera medium varannan dag som beskrivs i steg 4,3.
    6. På dag 35, samla celler för analys eller upprätthålla i samma medium som steg 4.2.5 för utökade kultur (potentiella gräns inte testat).
  3. Ändra/uppdatera differentiering medium för 2D kultur
    1. Överföra nödvändig mängd NMM med lämpliga komponenter (se steg 4.2.2-4.2.5 för komponenten schema) till ett sterilt rör. Varm i vattenbad vid 37 ° C.
    2. Aspirera på medellång från brunnar, tillsätt 2 mL ny medelstor sedan. Inkubera vid 37 ° C med 5% CO2.
      Obs: (Valfritt) slutet volym kan hållas vid 2,5 mL/väl av 6WP, med pipett ta bort 2 mL av gamla medium och lägga 2 mL färsk medium. Reservera en del av gamla kan medium i brunnar och förhindra celler från luften kontakt, minska chock för cellerna under förändring steg.
  4. Passagen 2D differentiering kultur
    1. Överföra nödvändig mängd NMM med lämpliga komponenter (se steg 4.2.2-4.2.5 för komponenten schema) till sterila tuber, för passaging process och, separat, för att förbereda PLO-LAM belagd plåt för att ta emot anpassade celler. Komplettera med destination plattan med 10 µM RI medium. Värma medium rören på RT eller i ett vattenbad vid 37 ° C. För att spara på komponenter, är det möjligt att använda NMM ensam för att tvätta cellerna under processen passaging.
      Obs: (viktigt) om produkter ska användas i kalcium imaging experimenterar, säkerställa att passagen celler mellan 2-6 dagar före utgången av differentiering.
    2. Aspirera mediet från wells att vara anpassade. Lägg till 300 µL per brunn av trypsin-baserade dissociation agent (se Tabell för material), virvel tallrik att täcka brunnar, sedan omedelbart bort dissociation agenten.
    3. Låt plattan att sitta i 2 min på RT och sedan lossa cellerna genom att trycka på sidorna av plattan. Lägga till 600 µL per brunn definierade trypsin hämmare (DTI) och överföra cellerna i DTI till ett sterilt rör med 5 mL NMM.
    4. Centrifugera röret vid 290 x g i 15 min på RT. aspirera på medellång och lägga till ytterligare 5 mL NMM till röret.
    5. Centrifugera röret vid 290 x g i 15 min på RT. aspirera på medellång och resuspendera cellerna i lämpligt medium som innehåller RI.
    6. Distribuera cellerna på PLO-LAM plattan med uppdelning förhållandet 1:1-1:12, beroende på den ursprungliga sammanflödet, spridning ränta och storlek differentiell ursprung till destination plattan, och underhålla vid 37 ° C med 5% CO2.

Representative Results

Visuell översikt av minskad tillväxt faktor 2D och 3D cerebellär differentiering protokoll
Figur 1 visar övergripande tidslinjen för 2D och 3D cerebellär differentiering protokoll, att identifiera exogena faktorer och tid för plätering. De typiska framsteg för hPSCs som genomgår 3D cerebellär differentiering avbildas i figur 2: med hESC line H01 start som kolonier feeder-fri kultur i dag 0 (övre vänstra delen av figuren); som genomgår EB bildandet av dag 2 (övre mitt); växer till större cell aggregat med uppenbara lumen efter neurala induktion med RA och FGF8 dag 14 (övre högra); bildar aggregat av varierande storlek och form på dag 28 (lägre vänster); utvecklas i komplexitet med olika strukturer av en enda samlade anges vid dag 28 (lägre mitten); och med fortsatt morfologiska förändringar av samma strukturer på dag 35 (nedre högra). De typiska framsteg för hPSCs som genomgår 2D cerebellär differentiering avbildas i figur 3: med hESC linje H01 som kolonier feeder-fri kultur i dag 0 (övre vänstra delen av figuren, med cirkel som anger området av differentierade celler bland hESC kolonier) ; som genomgår EB bildandet av dag 2 (övre mitt); växer till större cell aggregat med uppenbara lumen efter neurala induktion med RA och FGF8 på dag 13 (övre högra); frodas som vidhäftande celler efter plätering dag 14 (lägre vänster); och då som en enskiktslager av celler med mer komplex/mogen morfologi på dag 35 under låg (lägre mitten) och hög förstoring (nedre högra).

3D produkter uppvisar markörer och strukturer av tidig Neuroepithelium
Figur 2 (nedre vänstra bilden) och figur 4 visar heterogena 3D sammanlagda morfologi sett under odling, på grund av varierande tillväxt och/eller mognad priser, samt en stokastisk sammanslagning eller bryta isär av aggregat. Trots heterogenitet producerar varje differentiering aggregat uppvisar tidiga neurala och neuronala markörer, inklusive cerebellär granule markör ZIC1, indikerat av immuncytokemi (ICC) färgning i figur 5. Viktigare, föreslår figur 5 och figur 6 att en enkel 3D kultur, med minskad tillväxtfaktorer, är kapabel att generera aggregat med komplexa strukturer relaterade till hjärnans utveckling som tidig neuroepithelium och rhombic läpp.

2D produkter uppvisar cerebellär markörer och funktionella neuronala aktiviteten
Medan 2D kulturer inte kan återge komplexa 3D-strukturer, är de kan generera celler uppvisar tidiga neurala och neuronala markörer, inklusive cerebellär granule cellen markör ZIC1, indikerat av ICC färgning i figur 7. Gen uttryck analys via RT-PCR, stöder som kan ses i figur 8, ICC färgning resultat, även om förekomsten av tidiga granule cellen markör ATOH1 är variabel mellan experiment och linjer. Kalcium imaging hanteras lättare i 2D kultur. Som ses i figur 9, kompletterande Video 1och kompletterande Video 2, visar elektriskt stimuleras cellerna kalcium tillströmningar som är typiska för neuronal bränning mönster, vilket tyder på generation av funktionella nervceller.

Figure 1
Figur 1: tidslinje av differentiering-protokollet (börjar på dag 0 differentiering). Heldragen linje rutorna ange när specifika faktorer läggs till odlingsmediet och prickad linje rutorna ange plattan-beläggning för valfritt 2D modifiering. För FGF2, nedpilen refererar till lägre koncentrationer (4 ng/mL) och uppåtpilen refererar till högre koncentrationer (20 ng/mL). Denna siffra har ändrats från Holmes och Heine10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: representant brightfield bilder av 3D protokollet. hESC kolonier på d0, EBs på d2, aggregat efter induktion på d14, mängder av olika storlek och morfologi (numrerade 1-5) på d28, en enda aggregat med unika, identifierbara funktioner (anges med bokstäver en–c) på d28, och synliga förändringar i samma funktioner på d35. Skalstapeln = 100 µm. Denna siffra har ändrats från Holmes och Heine10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: representant brightfield bilder i 2D protokoll. hESC kolonier en d0, EBs på d2, aggregerar efter induktion på d13, efter plätering aggregat på d14, efter mognad på d35 sedda på 5 x förstoring, och 20 x förstoring. Den vita cirkeln i den övre vänstra panelen visar området av differentierade celler bland hESC kolonier. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Brightfield bilder visar varierande storlek och komplexitet i 3D kultur. Mängder vid (A) dag 8 (hESCs) och (B) d35 (hiPSCs). Den sistnämnda bilden består av tre separata bilder att visa hela samlade. Båda aggregaten kan ha påverkats genom en sammanslagning av mindre aggregat eller förlust (avbryter) strukturer. Skalstapeln = 200 µm. Denna siffra publiceras från Holmes och Heine10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: ICC bilder av 3D produkter visar relevanta markörer och strukturer. På kultur d35, 3D produkter utställning: PAX6 (grön) och TBR2 (röd) av lumen av neurala rosett-liknande formation (första raden); DCX (grön) och NeuN (röd) sprider sig från yttre kanten ventrikulära zon (VZ)-gilla strukturerar (andra raden); KIRREL2, en markör som är associerad med cerebellär neuroepithelium (tredje raden, vänster); och ZIC1 en markör är associerad med cerebellär granule celler (tredje raden, höger). Experimentet genomfördes flera gånger med fyra olika hPSC rader: hESC linje H01 (n = 5), och iPSC linjerna hvs88 (n = 4), hvs60 (n = 3), och hvs51 (n = 1). Pilarna pekar på Rhombic lip (RL)-liknande struktur. Skalstapeln = 100 µm. Denna siffra publiceras från Holmes och Heine10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: storskaliga ventrikulära zon-liknande struktur i 3D produkt. På kultur d35 är ett hESC-derived aggregat positivt för PAX6 (grön) och TBR2 (röd) vanligen förknippas med tidig nervceller finns inom ventrikulära zoner (VZs) och subventrikulära (SVZs), in vivo. (Överst) En asterisk (*) markerar den apikala sidan av en VZ-liknande regionen kör längs kanten av aggregatet, med parenteser som anger djup/avdelningen för VZ / SVZs. (mitten) sammanfogad signaler Visa spridda delar av PAX6 +/ TBR2-cellerna ökar i storlek mot den övre högra änden av VZ. (Botten) Högre förstoring bild av avsnittet anges av en rektangel i panelen mellersta. Skalstapeln = 100 µm. Denna siffra har ändrats från Holmes och Heine10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: ICC bilder av 2D produkter visar relevanta markörer. På kultur d35, 2D produkter utställning, från hESCs (översta raden) och hiPSCs (nedersta raden), celler positivt för: granule cellen markör ZIC1 och flyttande cerebellär neuron markör TAG1 (vänster kolumn); och neuronala markör neurofilament (NF) och TAG1 (högra kolumnen). Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: RT-PCR av 2D produkter. mRNA uttryck analys av hESC linje H01 (översta raden) och hiPSC fodrar hvs60 (nedersta raden) i slutet av 2D protokollet visar produkter med gelelektrofores för: granule cellen markör ZIC1, granule cellen markör ATOH1, flyttande cerebellär neuron markör TAG1, Purkinje cell markör Calbindin (CALB), spänningsberoende kalcium kanal CACNA1A (C-1A), CACNA1E (C-1E), gamma - aminosmörsyra (GABA) B receptor 1 (G-Br1), och städning gen EIF4G2).

Figure 9
Figur 9: kalcium imaging/analys av 2D produkter. På kultur d35 registrerades hPSC differentiering produkter i 2 min under mikroskopet, efter inkubation med fluor5 färg. 30 s, celler stimuleras elektriskt för 10 s vid 10 Hz. (A) stillbilder Visa hESCs vid 0 s (vänster) och efter starten av elektrisk stimulering 30 s (höger). Pilarna anger regionen av intresse (ROI) för analys av kalcium tillströmning. (B) grafiska analysen visar förändring i relativ fluorescens kontra tid för ROI (förändring av fluorescens = (F-F0) f0, där F0 = (∑F1-n) / n), med neuron-liknande spikar som inträffar före, under och efter stimulering. Svart stapel anger längden på elektrisk stimulering. Skala bar (vit) = 50 µm. fullständig registrering för hESC (som kan ses här) och en hiPSC linje (visas inte) är tillgängliga i kompletterande Video 1 och kompletterande Video 2, respektive. Inspelningarna är i AVI-format, 4 x hastighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande Video 1: kalcium imaging video av 2D produkt från hESC linje H01. På kultur d35 färga differentiering produkter från hESC linje H01 spelades i 2 min under mikroskopet, efter inkubation med fluor5. 30 s, celler stimuleras elektriskt för 10 s vid 10 Hz. inspelningar har gjorts på 2 bildrutor/s, och bearbetas till AVI video på ~ 7 bildrutor/s, producera en video som varar ~ 30 s, ~ 4 x hastighet. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande Video 2: kalcium imaging video av 2D produkt från hiPSC line hvs51. På kultur d35 registrerades differentiering produkter från hiPSC line hvs51 för 2 min under mikroskopet, efter inkubation med fluor5 färg. 30 s, celler stimuleras elektriskt för 10 s vid 10 Hz. inspelningar har gjorts på 2 bildrutor/s, och bearbetas till AVI video på ~ 7 bildrutor/s, producera en video som varar ~ 30 s, ~ 4 x hastighet. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Discussion

Komplexiteten och kostnaderna är relevanta faktorer för stamcellsforskare när du väljer eller utveckla differentiering protokoll. Detta gäller särskilt eftersom det är en öppen fråga om hur mycket extern kontroll krävs för att generera önskat celltyper, eller — att posera det annorlunda — hur behöriga hPSCs är på att producera sin egen utvecklande miljö, om de lämnas åt sig själva med tillräcklig näringsämnen. Införandet av exogena faktorer in vitro- kan mycket väl ge önskad cell produkter, men de kan också störa med inneboende utvecklingsmässiga kapacitet celler skulle ställt in-vivo. Sådana överväganden är viktiga, särskilt om målet är användningen av patientderiverade iPSCs för sjukdom modellering. Omfattande användning av mönstring eller tillväxtfaktorer kunde dölja sjukdomen fenotyper. De protokoll som beskrivs i denna rapport följer trenden i tidigare studier att minska komplexiteten, kostnaden och/eller användning av extrinsic mallning faktorer8,9.

Baserat på resultat som rapporterats av Muguruma et al., och vår egen studie, verkar det som det är möjligt att uppnå differentiering mot cerebellär öden utan gemensamma ansträngningar för att reproducera i vivo villkor, som tidigare studier har gjort 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. den spännande delen är att de två studierna använt olika uppsättningar av tillväxtfaktorer, vilket tyder på att varken set var nödvändiga, även om båda använde FGF2. Vi körde ytterligare tester, där FGFs selektivt uteslöts från protokollet och visade att celler kan generera samma produkter utan extrinsic FGFs10. Skillnaderna mellan våra studier var kvalificerade av det faktum att vi används olika hPSC linjer och kultur metoder, inducerad neurala differentiering med RA och ingår komponenter för att stödja granule cellöverlevnad och mognad (BDNF, GDNF, SAG och KCL)11 –14. Dessutom var en mindre komplex start-metoden, jämfört med Muguruma et al., anställd. Sina protokoll började genom att skapa enhetliga EBs i 96WPs, som isolerade dem fysiskt och kemiskt från varandra. Protokollet här hade alla PSC relativt trångt tillsammans i 6WPs under EB-formationen, vilken tillät dem att interagera fritt. Hur detta kan ha differentially påverkat den fysiska och kemiska miljön av EBs och senare organoids (inklusive inneboende produktion av signalering föreningar) är okänd, och kunde utforskas. Också, medan vi visar uttrycket av gener associerade med — och så suggestiv av — cerebellär ursprung, ligger inom strukturer morfologiskt liknar dem som rapporterats av Muguruma et al., kan vi inte utesluta generation av neuronala-liknande strukturer som är av icke-cerebellär identitet. Framtida studier, med en stor panel av antikroppar som de rapporteras av Muguruma et al. (dvs, ATOH1, CALB, etc.) skulle göra sådana uppdrag, och jämförelse mellan produkter av båda protokollen, mer övertygande.

Inom 3D protokollet, det är viktigt att börja med och upprätthålla ett tillräckligt antal celler i kulturen att säkerställa tillräckligt antal slutprodukter för analys. Gett betydande die-off tidigt i protokollet, rekommenderar vi att du börjar med mer än 500 EBs per brunn under de första 3 dagarna i kultur (figur 1). Detta bör inte vara svårt att uppnå viss koloni storlekar för hPSCs i feeder-fri kultur, men kanske inte lika lätt för de som fortfarande använder feeder-beroende metoder. Med tanke på det stora antalet celler, är det viktigt att titta på för färgförändring medium (indikerar pH-förändringar) och ansamling av döda celler. Båda måste korrigeras för att förhindra kollaps av kulturen. Det kan också finnas klumpar av celler och aggregat i massiva strukturer. Även om det kan fortfarande resultera i aggregat som kan analyseras, reduceras produktkvantitet kraftigt, så att bryta dem upp i mindre aggregat med skonsam sönderdelning kan vara användbar. Dock undvika störande normala aggregat, som själva kan växa till stora storlekar (figur 4). Om aggregat blir alltför gles, rekommenderas det att kombinera brunnar så att aggregaten inte helt isolerade. Produkten variabilitet (i antal, storlek och morfologi) är ett välkänt problem i 3D cellodling, inklusive för de protokoll som börjar med isolerade, enhetlig EB bildandet steg, tyder på att en mindre komplex startproceduren (såsom protokollet beskrivs här ) kan vara mer praktiskt8,15. Medan denna heterogenitet är något som forskare måste ha i åtanke, särskilt under analys, genereras rapporterade protokollet produkter överensstämmer med de som finns i andra 3D protokoll8,9,15. Baserat på storlek och morfologi, faller de inom spänna av neurala rosett till cerebral organoid, som beskrivs i en senaste översyn av Kelava och Lancaster15, med de mest passande klassificering av sfäroid. Särskilt anmärkningsvärt, är förekomsten av 3D-strukturer tyder på neural rosetter med lumen, (sub) ventrikulär zoner och rhombic-lip liknande funktioner (figur 5 och figur 6) som identifierats av andra grupper8 , 15 , 16 , 17. eftersom varje experiment producerade minst en aggregerad med förmodad VZ/SVZs och cerebellär-associerade markörer (ZIC1, KIRREL2), de är användbara kriterier för att avgöra framgången för en 3D differentiering med våra protokoll, med RL-liknande funktioner som ger extra stöd. Utöka längden på kultur tidigare 35 dagar har inte testats, men kunde göras för att fastställa maximala omfattningen av tillväxt, komplexitet och mognad som tillåts av denna teknik.

2D protokollet använder samma icke-anhängare EB formation och neurala induktion process som protokollet 3D och så kommentarerna ovan gäller också. När förgylld, bör en annan uppsättning överväganden övervägas. EBs ska följa snabbt för cellerna att föröka sig utåt på plattan. Om det finns problem med följsamhet, tillägg av RI (om inte redan används), minskad volym av medium eller experimentella förändringar i PLO-LAM koncentration kan tillämpas. Det är viktigt att hålla cellerna från att växa alltför tät eller gles (helst odlas mellan 20-80% konfluens) i brunnarna; daglig övervakning och lägligt passaging är viktigt, att undvika över-konfluens eller flytande celler. Till skillnad från 3D protokollet, bör det inte finnas betydande die-off under kultur, om det kan finnas områden med dålig tillväxt, eller en uppbromsning av spridning priser. Passaging påverkar tillståndet mognad av celler (exempelvis ta bort cellprocesser och utvecklade nätverk mellan celler) och bör hållas i åtanke när du närmar dig punkter där celler kommer att samlas in eller analyserade på något sätt. Till exempel kalcium är imaging det mycket viktigt att passagen celler mellan 2-6 dagar före analys. Passaging för nära kan analys innebära celler inte har haft tid att ansluta eller mogen och för långt kan resultera i celler trångboddhet, försvårar imaging. Även om variationen mellan experiment kan finnas, är resultat förenliga med dem som rapporterats i ursprungliga 2D cerebellär protokoll1,2. ICC färgning och gen uttryck analys bekräfta närvaron av celler som är positiva för granule cellen markör ZIC1, även också identifiera markörer associerade med andra neurala och cerebellär identiteter (figur 7 och figur 8). Kalcium imaging, som innebär att elektrisk stimulering av cellerna inkuberas med fluor5 färgämne, anges funktionella neuronala aktiviteten (figur 9, kompletterande Figur1och kompletterande figur 2), men det inte är bekräftat om dessa var granule celler. Det kan hävdas att genom att ge cellerna mer tid för att mogna genom att förlänga längden på kultur tidigare 35 dagar, funktionella neuronala aktiviteten bör öka. Denna potential kan undersökas i framtiden.

Förutom i linje med forskning som föreslås ovan, skulle det vara av intresse att avgöra skillnader i produkten identiteter (kvantitet och kvalitet) mellan protokollen 2D och 3D. Vikten av extrinsic FGFs testades inte i 2D protokollet, och det skulle vara bra att veta om bristen på 3D-strukturen efter plätering, och så de associera signalvägar, skulle göra 2D kulturer mer eller mindre beroende av de tidigt mönstring föreningar. Mer avskalad protokoll (t.ex., ingen RA, BDNF, SAG) är lika trolig linjer för vidare utredning. Slutligen, framtida studier kan dra nytta av nya forskningsverktyg för att bättre karaktärisera (och bedöma generation effektivitet) mänskliga-specifika cerebellär neuronala undertyper.

Med de givna varningar i åtanke rapporterade båda protokollen kan användas för cerebellär differentieringar, med produkter anpassade till olika ändamål. De kan fungera som praktiska utgångspunkter för forskare pilotstudier, testning livskraft cellinjer för sådana indelningar, eller som en grundläggande modell för andra typer av riktade neurala differentiering.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi är tacksamma mot Gerbren Jacobs och Jurjen Broeke för deras teknisk experthjälp, till Prisca Leferink för att bidra till utveckling och karakterisering av två kontroll iPSC linjer och Lisa Gasparotto för att demonstrera våra förfaranden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12+Glutamax Gibco 31331-028 glutamine fortified DMEM/F12
Neurobasal medium Gibco 21103-049 neural basic medium
N2 supplement Gibco 17502-048
B27 supplement Gibco 17504001
Insulin Imgen PT468-B
L-glutamine Gibco 25030-024
Non-essential Amino Acids (NEAA) Gibco 11140-035
beta-mercaptoethanol Gibco 21985-023
Poly-L-Ornithine Sigma P3655
Poly (2-hydroxyethyl methacrylate) Sigma P3932 aka Poly-Hema
Laminin Sigma L2020
E8 medium and supplement Gibco A1517001 hPSC medium and supplement
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Sodium Chloride Sigma S-5886
y-27632 (ROCK inhibitor) SelleckChem S1049-10mg
DMSO Sigma D-2650
Geltrex Gibco A1413302 hPSC-appropriate adherent coating (PAAC)
0,5M EDTA Gibco 15575-020
0.2 um filter VWR 28145-77
1.5 mL Eppendorf tube VWR 525-0130
DMEM/F12 Gibco 21331-020
Ethanol VWR 83804360
Parafilm Sigma PM996 wrap for culture plates
cryotubes ThermoFisher 368632
TrypLE Gibco 12563-029 trypsin-based dissociation agent
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) Gibco R-007-100
FGF-2 Peprotech 100-18B
FGF-4 R&D Systems 100-31
FGF-8B Peprotech 100-25
Retinoic Acid Sigma R2625
Brain Derived Neurotrophic Factor Peprotech 450-02
Glial Derived Neurotrophic Factor Peprotech 450-10
Potassium Chloride Sigma P5405
Neurotrophic Factor 3 Peprotech 450-03
Smoothened Agonist (SAG) Cayman 11914 CAS 912545-86-9
Axiovert 40C microscope Zeiss Brightfield imaging microscope
Axiocam Zeiss Brightfield imaging - image aquisition
Eppendorf Centrifuge 5810 Eppendorf 521-0996 centrifuge for cell culture
PBS (gebufferde natrium oplossing) Braun Medical 3623140
5 ml Serological pipets VWR 612-4950
10 ml Serological pipets VWR 612-4951
6-wells culture plates VWR 734-2323
12-wells culture plates VWR 734-2324
hESCs WiCELL line H01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).
  2. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. , Chapter 1, Unit 1H 5 (2012).
  3. Su, H. L., Muguruma, K., Matsuo-Takasaki, M., Kengaku, M., Watanabe, K., Sasai, Y. Generation of cerebellar neuron precursors from embryonic stem cells. Dev Biol. 290, 287-296 (2006).
  4. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2997-3002 (2007).
  5. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain--hindbrain development. Trends Genet. 12, 15-20 (1996).
  6. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Curr Opin Cell Biol. 12, 736-741 (2000).
  7. Tam, E. W. Y., Benders, M. J. N. L., Heine, V. M. Cerebellar Development-The Impact of Preterm Birth and Comorbidities. Fetal and Neonatal Physiology. , 5th ed, (2017).
  8. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Rep. 10, 537-550 (2015).
  9. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12, 671-678 (2015).
  10. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6, 402-406 (2017).
  11. Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened. Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).
  12. Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).
  13. Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
  14. Borghesani, P. R., et al. BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells. Development. 129, 1435-1442 (2002).
  15. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).
  16. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).
  17. Englund, C., et al. Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J Neurosci. 25, 247-251 (2005).
  18. Warlich, E., et al. Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 19, 782-789 (2011).

Tags

Utvecklingsbiologi fråga 130 3D organoid pluripotenta stamceller lillhjärnan granule cellen cortex
Strömlinjeformad 3D cerebellär differentiering protokoll med valfritt 2D modifiering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holmes, D. B., Heine, V. M.… More

Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification. J. Vis. Exp. (130), e56888, doi:10.3791/56888 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter