Summary
Nous présentons ici les techniques pour mesurer la déformabilité des globules rouges et l’hétérogénéité cellulaire par ektacytomètre. Ces techniques sont applicables pour des enquêtes générales de la déformabilité des globules rouges et des enquêtes spécifiques sur les maladies du sang caractérisées par la présence d’hématies rigides et déformables en circulation, telles que l’anémie falciforme.
Abstract
Une diminution des globules rouges déformabilité est caractéristique de plusieurs troubles. Dans certains cas, la mesure de la déformabilité défectueuse peut prédire la gravité de la maladie ou la survenue de complications graves. Ektacytomètre utilisations laser viscosimétrie de diffraction pour mesurer la déformabilité des globules rouges, soumise à la contrainte de cisaillement croissante ou un gradient osmotique à une valeur constante de cisaillement appliquée. Toutefois, les mesures directes de la déformabilité sont difficiles à interpréter lors de la mesure sanguine hétérogène qui se caractérise par la présence d’hématies rigides et déformables. Cela est dû à l’incapacité des cellules rigides pour aligner correctement en réponse à la contrainte de cisaillement et de résultats dans un schéma de diffraction déformée, marquée par une baisse exagérée dans la capacité de déformation apparente. Mesure du degré de distorsion fournit un indicateur de l’hétérogénéité des érythrocytes dans le sang. Dans l’anémie falciforme, c’est en corrélation avec le pourcentage de cellules rigides, qui reflète la concentration d’hémoglobine et de la composition de l’hémoglobine des érythrocytes. En plus de mesurer la capacité de déformation, ektacytomètre gradient osmotique fournit des informations sur la fragilité osmotique et l’état d’hydratation des érythrocytes. Ces paramètres reflètent également la composition de l’hémoglobine des globules rouges de patients drépanocytaires. Ektacytomètre mesure de la déformabilité des populations de globules rouges et donc, logiciel ne fournit pas d’informations sur la déformabilité ou les propriétés mécaniques des érythrocytes individuels. Malgré tout, le but des techniques décrites dans les présentes est de fournir une méthode pratique et fiable pour mesurer la déformation et l’hétérogénéité cellulaire du sang. Ces techniques peuvent être utiles pour le suivi des changements temporels, ainsi que la progression de la maladie et réponse à l’intervention thérapeutique dans plusieurs troubles. L’anémie falciforme est un exemple bien caractérisé. Autres troubles potentiels où les mesures de déformabilité des hématies et/ou d’hétérogénéité sont d’intérêt comprennent la conservation du sang, diabète, infection à Plasmodium , carence en fer et les anémies hémolytiques en raison de défauts de la membrane.
Introduction
Ektacytomètre fournit une mesure pratique de la déformabilité des globules rouges en réponse à des altérations dans la contrainte de cisaillement (mesurée en pascals (Pa)) ou en suspendant l’osmolalité moyenne. Les paramètres pertinents de la déformabilité des globules rouges comprennent l’index de l’élongation maximale (Max AE), une mesure de la capacité de déformation maximale d’un globule rouge à la suite de plus en plus contrainte de cisaillement et contrainte de cisaillement ½ (SS ½), la contrainte de cisaillement nécessaire pour atteindre la moitié maximale déformabilité. 1 ektacytomètre gradient osmotique possède plusieurs paramètres informatifs. Il s’agit de l’indice élongation minimale (Min AE), une mesure du rapport surface-volume et l’osmolalité auquel elle produit (O Min), qui est une mesure de la fragilité osmotique. Max de l’IE et l’osmolalité auquel elle produit (O (a.-E Max)) renseignent sur la membrane flexibilité et cellule superficie. Moitié élongation maximale du bras hypertonique du gradient osmotique est représentée par l’IE hyper. AE hyper et l’osmolalité auquel il se produit, O hyper, fournissent des informations sur la viscosité intracellulaire de l’hématie qui est déterminée par la concentration d’hémoglobine. 2 , 3 la déformabilité de mesure dans le sang hétérogène est compliquée par le fait que les cellules rigides, comme les globules rouges falciformes, ne sont pas correctement alignent avec le sens de circulation telles que les cellules déformables en réponse à l’augmentation de la contrainte de cisaillement. Plutôt que de produire une image caractéristique de diffraction elliptique, rigides cellules produisent un modèle sphérique qui se traduit par un patron de diffraction en forme de losange lorsque superposées sur l’ellipse, produite par des cellules déformables. 4 , 5 , 6 le modèle sphérique s’est avéré correspondent aux cellules falciformes irréversiblement en exécutant ektacytomètre sur les fractions isolées de cellules après centrifugation de densité. 6 le calcul de l’indice élongation comprend des mesures sur l’axe de l’ellipse ; les deux long et court un losange a donc produit une diminution apparente de l’élongation en augmentant la largeur de l’axe court. 7 il a été précédemment montré que le degré de distorsion de patron de diffraction est corrélé avec le pourcentage de l’hémoglobine (HbS) de la faucille et le pourcentage de cellules falciformes dans le sang de patients atteints de drépanocytose. 5 le degré de distorsion de patron de diffraction peut être obtenu par des analyses mathématiques complexes. 8 il peut aussi être obtenu en réglant l’ouverture de l’ouverture de la caméra sur l’ektacytometer ou le niveau de gris du logiciel montage pour modifier la hauteur de patron de diffraction. 5 Toutefois, détails concernant la façon d’ajuster le niveau de gris ne sont pas bien définies et l’ouverture de l’appareil photo n’est pas facilement accessible sur la dernière génération de l’ektacytometer disponible dans le commerce. Pour contourner ces problèmes, le gain de la caméra facilement accessible peut être utilisé pour ajuster des hauteurs de patron de diffraction. 9 à l’aide de cette méthode pour estimer l’hétérogénéité cellulaire, le degré de distorsion de patron de diffraction peut être corrélé avec le pourcentage d’hémoglobine foetale dans le sang des patients atteints de drépanocytose. 10 plusieurs paramètres ektacytomètre gradient osmotique sont également corrélées avec le pourcentage de foetus ou faucille d’hémoglobine dans le sang de patients atteints de drépanocytose. Diffraction distorsion corrélations susceptibles de reflétant la contribution de la composition de l’hémoglobine pour le pourcentage de cellules rigides, indéformable. D’intérêts supplémentaires, le profil de toute ektacytomètre gradient osmotique subit des changements de biphasique qui correspondent au pourcentage de cellules denses en circulation au cours de la crise de la drépanocytose. 11
Ektacytomètre est également utile dans l’étude de plusieurs autres troubles. Ektacytomètre gradient osmotique permet de diagnostiquer les troubles de membrane héréditaire des globules rouges, comme la Sphérocytose héréditaire, elliptocytose héréditaire et pyropoikilocytosis héréditaire. 3 , 12 , 13 , 14 la déformabilité réduite se produit dans une carence en fer. 15 la caractérisation de la lésion « stockage » du sang a employé ektacytomètre et futures études portant sur la nature de la lésion et interventions visant à prévenir sa formation lors du stockage du sang mis en banque est susceptibles de bénéficier de la techniques présentées ici. 16 la déformabilité érythrocytaire diminuée a aussi été corrélée avec maladie microvasculaire chez les diabétiques. 17 études récentes qui relie l’hyperglycémie, érythrocytaire ascorbate et fragilité osmotique suggèrent que ces facteurs peuvent être importants dans le développement de la maladie microvasculaire. 18 ektacytomètre études sont actuellement en cours pour étudier cette hypothèse (Parrow et Levine, données inédites). Paludisme de la scène sang est une autre avenue intéressante des enquêtes de déformabilité des globules rouges. Déformabilité cellulaire de Plasmodium falciparum infectés de globules rouges diminue considérablement au cours des 48 heures de maturation intracellulaire du parasite du stade de l’anneau au stade schizonte. Éléments de preuve indiquent que cette diminution de la déformabilité est renversée par la maturation du parasite. L’inversion coïncide avec la libération des hématies infectées dans la circulation. Une diminution de la déformabilité est pensée pour être médiée par des protéines de Plasmodium qui favorisent la sequestration du globule rouge. 19 ces études portent sur un petit échantillon des conditions cliniquement importantes où la mesure déformabilité des érythrocytes et des paramètres de gradients osmotiques sont pertinentes. Il existe plusieurs domaines d’étude complémentaires.
Les autres techniques pour mesurer la déformabilité des globules rouges incluent des pinces optiques (également connus comme pièges laser) qui utilisent les propriétés physiques des photons d’étirer unique des globules rouges dans une ou plusieurs directions. 20 cette technique a l’avantage de la mesure de la déformabilité des érythrocytes unique, mais une incertitude dans l’étalonnage de la force a produit une variabilité considérable dans l’ensemble des études 21 et analyse des données peut être fastidieux à moins que automatisé. 22 aspiration micropipette, qui utilise une pression négative pour aspirer un érythrocyte dans une micropipette, a également été utilisée pour mesurer la déformabilité des globules rouges. 7 , 23 mesures multiples, tels que la pression nécessaire pour aspirer les globules rouges, sont possibles avec chaque mesure définissant les différentes caractéristiques du globule rouge. 23 la microscopie à force atomique est une technique de haute résolution qui mesure la rigidité de la membrane en quantifiant la déflexion du faisceau laser comme indicateur de flexion en porte-à-faux le long de la surface d’un globule rouge. 24 ces techniques fournissent des informations sur les érythrocytes individuels, ne sont pas facilement adapté pour mesurer l’évolution des populations de globules rouges et, en général, nécessitent une expertise technique considérable.
Le désir de goûter individuel et des populations de cellules simultanément a conduit à des progrès dans l’automatisation et le développement de la microfluidique et des méthodes axées sur le tableau. Comme ektacytomètre, rheoscopy mesures de déformation en fonction de la contrainte de cisaillement, mais les images sont acquises directement par l’intermédiaire de microscope. 25 pour plus élevée à travers-put analyses, imagerie cellulaire automatisée a été employé pour produire des distributions de déformabilité utilisant le rheoscope. 26 hétérogénéité cellulaire peut être mesurée par cette méthode si les données d’un sujet sain de contrôle sont disponibles. 27 techniques microfluidiques permettent aussi élevée à travers-put analyses des cellules simples ; conceptions multiples à l’aide des adaptations de filtration, analyseurs de transit cellule28 ,29 , qui mesure le temps requis pour un érythrocyte traversent une micropore et qui mesurent la pression nécessaire pour le transit des érythrocytes plutôt des solutions de rechange que temps, 30 ont été développées. Une autre plate-forme pour élevée à travers-put analyse de cellules individuelles est la puce de tableau de microchamber cellule unique, qui a l’avantage supplémentaire de permettre en aval caractérisation basés sur la fluorescence des cellules. 31 bien que chacune de ces techniques peut être utile et peut être supérieur pour des applications particulières, les avantages comparatifs des ektacytomètre comprend la sensibilité, simplicité d’utilisation et précision. 32 la dernière génération d’ektacytometers disponible dans le commerce possède également une polyvalence considérable du nombre de tests pouvant être effectués.
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Protocol
Tous les sujets de cette étude a donné consentement éclairé conformément à la déclaration d’Helsinki et les protocoles nationaux instituts de santé Institutional Review Board a approuvé.
1. allumer l’ektacytometer
- Raccordez le tuyau de la solution de nettoyage sur les solutions de polyvinylpyrrolidone (PVP) de haute et basse osmolarité. Veillez à connecter le tube osmolaire 0 à la solution de faible osmolarité et le tube d’osmolaire 500 à la solution osmolaire élevé.
Remarque : La solution PVP de faible osmolarité devrait avoir une osmolalité entre 35 et 55 milliosmoles par kilogramme (mOsm/kg), un pH de 7,25-7,45 à 25 ° C et une viscosité entre 27,0 et 33,0 centipoise (cP) à 37,0 ± 0,5 ° C. La solution PVP osmolarité élevée devrait avoir une osmolalité entre 764 et 804 mOsm/kg, un pH de 7,25-7,45 à 25 ° C et une mesure de la viscosité du cP de 27,0-33,0 à 37,0 ° 0,5 ° C. - Veiller à ce que le bob est complètement abaissée dans la tasse. Lancez le logiciel et amorcer la machine (matériel vérifier | Instrument de IO). Laissez l’instrument achever le cycle d’amorçage. Une fois le cycle terminé, sortir la coupe de la bob et séchez complètement le bob et la coupe avec un bas charpie, tissu de nettoyage.
Remarque : L’eau résiduelle sera lyser les globules rouges, produisant des interférences.
2. mesure de la déformation en fonction de l’accroissement de la contrainte de cisaillement
- Obtenir (inférieur à 1 mL est suffisante pour effectuer ces techniques avec réplique) de sang dans le flacon contenant un anticoagulant approprié.
Remarque : EDTA est préféré par héparine non fractionnée, parce qu’il a moins d’influence sur les paramètres HÉMORHÉOLOGIQUES. 33 sang Gardez à température ambiante si les mesures sont effectuées dans les 6 heures de sang dessiner. - Mélanger doucement l’échantillon de sang avant de tester en retournant la fiole plusieurs fois. Ajouter 25 µL de sang à 5 mL de solution PVP iso-osmolaires en pipettant également, boucher le flacon et mélanger doucement en retournant plusieurs fois. La solution PVP iso-osmolaires devrait avoir une osmolalité entre 284 et 304 mOsm/kg, un pH de 7,3 à 7,4 à 25 ° C et une viscosité de 27,0-33,0 cP à 37,0 ± 0,5 ° C.
- Sur le logiciel choisir déformabilité depuis le menu principal. Créez une nouvelle analyse et ajoutez les détails expérimentaux (déformabilité | Ajouter détails désirés | OK).
- Soulevez le couvercle à ektacytometer, vérifiez que le bob est complètement abaissée dans la coupe et la coupe tourne.
- Ajouter 1 mL de solution de sang PVP dans l’espace entre la coupe et le bob de pipetage.
- Soulevez le bob légèrement pour ramener des échantillons. Attendre que toutes les bulles ont déplacé hors de la solution, puis fermez le couvercle de l’ektacytometer. Si nécessaire, appuyez sur le bouton d’aspiration pour enlever les bulles.
- Réglez le gain à 200 en déplaçant la flèche le long de la barre de défilement sur le logiciel (voir note). Lorsque la température est stable à 37 ° C et l’image de diffraction est stable, appuyez sur start (Démarrer).
Remarque : Pour beaucoup d’études, une image de diffraction bon peut être obtenue de sang sain (hémoglobine concentration > 12,0 g / dL, volume corpusculaire moyen de 80-96 fL et les concentrations d’hémoglobine corpusculaire moyenne de 33 à 36 g/dL) avec le gain de caméra égale à 200. Pour les études du sang de l’anémie falciforme, ajuster le gain de la caméra pour générer une image de diffraction 4,5 cm a été suggéré comme paramètre par défaut pour permettre une comparaison des résultats à travers des études et des laboratoires. 9 - Observer la diffraction des progresse d’acquisition de données pour s’assurer qu’ils restent circulaire, elliptique ou en forme de losange. Lors de l’acquisition des données est terminée, enregistrer ou imprimer le rapport (fichier | Enregistrer ou fichier | Impression). Max de l’AE et SS ½ valeurs figureront automatiquement, ainsi que les indices d’allongement correspondant à spécifié par l’utilisateur ou par défaut contraintes de cisaillement. Données seront également enregistrées automatiquement par le logiciel.
- À la fin, appuyez sur l’option clean sur la boîte de dialogue à l’écran de l’ordinateur (Clean). Après que l’échantillon est aspiré, rincer l’espace entre la coupe et bob en injectant l’eau déionisée dans l’espace tandis que l’instrument reste dans le cycle de nettoyage. Une fois le cycle de nettoyage est terminé, sortir le bob la coupe et séchez complètement le bob et la coupe avec un bas charpie, tissu de nettoyage (critique : l’eau résiduelle sera lyser les globules rouges, produisant des interférences).
- Cliquez sur le bouton Menu principal sur le logiciel pour retourner à la page d’accueil (Menu principal).
3. mesurer l’hétérogénéité cellulaire
- Mélanger doucement l’échantillon de sang avant de tester en retournant la fiole plusieurs fois. Pipetter 25 µL de sang pour un nouveau flacon de 5 mL de solution PVP iso-osmolaires, boucher le flacon et mélanger doucement en retournant jusqu'à ce que le mélange soit homogène.
- Déformabilité, choisissez le menu principal. Créez une nouvelle analyse et ajoutez les détails expérimentaux (déformabilité | Ajouter détails désirés | OK).
- Soulevez le couvercle à ektacytometer, vérifiez que le bob est complètement abaissée dans la coupe et la coupe tourne.
- Pipette 1 mL de la solution de sang PVP dans l’espace entre la coupe et le bob.
- Attendre que toutes les bulles ont déplacé hors de la solution, puis fermez le couvercle de l’ektacytometer.
- Veiller à ce qu’une image stable de diffraction est présente sur l’écran. Ajuster le gain de la caméra en déplaçant la flèche le long de la barre de défilement sur le logiciel jusqu'à ce qu’il produise une hauteur de diffraction de 3,8 cm. Utilisez une règle pour vérifier la hauteur de l’image sur l’écran de l’ordinateur.
- Lorsque la température est stable à 37 ° C et l’image de diffraction est stable, appuyez sur start (Démarrer).
- Observer des patrons de diffraction fur et acquisition données pour s’assurer qu’ils restent circulaire, elliptique ou en forme de losange. Lors de l’acquisition des données est terminée, enregistrer ou imprimer le rapport (fichier | Enregistrer ou fichier | Impression).
- À la fin, appuyez sur l’option clean sur la boîte de dialogue sur l’écran d’ordinateur (Clean). Après que l’échantillon est aspiré, rincer l’espace entre la coupe et bob par squirting eau déionisée provenant d’une bouteille de gicler dedans, alors que l’instrument reste dans le cycle de nettoyage. Une fois le cycle de nettoyage est terminé, sortir le bob la coupe et séchez complètement le bob et la coupe avec un bas charpie, tissu de nettoyage (critique : l’eau résiduelle sera lyser les globules rouges, produisant des interférences).
- Répétez les étapes 2.1-2.5 et ajuste le gain de la caméra pour obtenir une hauteur de patron de diffraction de 4,5 cm (étape 2.2).
- Répétez les étapes 2.1-2.5 et ajuste le gain de la caméra pour obtenir une hauteur de patron de diffraction de 5,4 cm (étape 2.2).
- À la fin, cliquez sur le bouton menu principal pour retourner à la page principale du logiciel (Menu principal).
- Pour déterminer le degré de distorsion de patron de diffraction basé sur IE Max en pourcentage, utilisez l’équation suivante (la même équation peut être effectuée avec les données de la hauteur de patron de diffraction 4,5 cm si vous le souhaitez) :
- De même, pour déterminer le degré de diffraction distorsion modèle issu des SS1/2 Utilisez la même équation avec la valeur déclarée de la SS1/2 :
4. osmotique gradient ektacytomètre
- Obtenir l’échantillon tel que décrit au point 1.1. Mélanger doucement l’échantillon de sang avant de tester en retournant plusieurs fois. Ajouter 250 µL de sang au flacon de 5 mL iso-osmolaires PVP en pipettant également, boucher le flacon et mélanger doucement en retournant jusqu'à ce que le mélange soit homogène.
- Choisissez osmoscan dans le menu principal (Osmoscan). Placez le flacon contenant le sang solution PVP sous l’aiguille sur le côté gauche de la machine. Piquez l’aiguille jusqu'à ce qu’il touche le fond du flacon. Assurez-vous de tube est bien connecté aux solutions pour la production de gradient osmolaire haute et basse. Fermer le couvercle de l’ektacytometer et ouvrez la porte sur la moitié inférieure afin que vous puissiez regarder le sang entrer dans le tube.
- Appuyez sur nouvelle analyse et type de détails expérimentaux (Osmoscan | Nouvelle analyse | Entrez les détails souhaités | OK). Régler le gain de la caméra à 200 en déplaçant la flèche tout contrôler sur le logiciel et permettent à la machine jusqu'à ce que le sang est vu entrer dans la coupe de la tubulure sous l’instrument.
- Une fois que le sang est entré dans la coupe et une image de patron de diffraction stable est sur l’écran d’ordinateur, commencer d’acquisition de données en appuyant maintenant sur le début bouton dans la boîte de dialogue (Démarrer maintenant).
- Laissez l’ektacytometer d’acquérir des données allant jusqu'à environ 500 mOsm/kg, puis arrêter l’instrument. Enregistrer ou imprimer le rapport (fichier | Enregistrer ou fichier | Impression). Données permettra aussi de sauvegarder automatiquement.
- Retirer le vieux flacon PVP-sang. Remplacez-la par une cuvette propre contenant de l’eau désionisée. Placez-le sous l’aiguille, mettre l’aiguille vers le bas afin qu’il touche le fond de la cuvette et appuyez sur le bouton de rinçage dans la boîte de dialogue de rincer le système de gradient (rinçage).
- Une fois que le rinçage est terminé, appuyez sur l’option clean sur la boîte de dialogue à l’écran de l’ordinateur (Clean). Une fois le cycle de nettoyage est terminé, sortir le bob la coupe et séchez complètement le bob et la coupe avec un bas charpie, tissu de nettoyage (critique : l’eau résiduelle sera lyser les globules rouges, produisant des interférences).
Remarque : Le rapport d’osmoscan propose des indices de l’élongation dans le gradient osmotique. O (EI Min), EI Max, O (IE Max), EI Min, EI hyper et O hyper sont générés automatiquement et inclus dans le rapport. La gamme de paramètres d’ektacytomètre gradient osmotique obtenus à partir de sang de 9 volontaires sains est : EI Min 0,12-0.196 unités arbitraires (u.a.) ; O Min 117-144 mOsm/kg ; L’IE Max 0.551-0.573 a.u. ; O (IE Max) 272-312 mOsm/kg ; IE 0,278 hyper-0,286 ; O Hyper 454-505 mOsm/kg.
5. mettre hors tension l’ektacytometer
- Nettoyer l’appareil bien avant il est arrêté.
- Pour cela, raccordez le tuyau dans les solutions de haute et basse osmolarité à l’adaptateur en y menant à la solution de nettoyage. Placez un flacon contenant la solution de nettoyage sous l’aiguille sur le côté gauche de la machine et piquez l’aiguille jusqu'à ce qu’il touche le fond du flacon. Veiller à ce que le bob est complètement abaissée dans la tasse.
- Fermer le logiciel, puis appuyez sur Démarrer sur l’extrémité de la boîte de dialogue propre de jour sur l’écran d’ordinateur (proches | Commencer à). Laissez l’instrument faire défiler les nettoyer complètement.
- Débrancher le tuyau à la bouteille pour eaux usées et retirez-le de l’instrument pour jeter les déchets. Sécher le bob. Mettre la machine hors tension.
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Representative Results
Les résultats d’ektacytomètre décrits dans ce manuscrit peuvent servir à mesurer la déformabilité des globules rouges dans toutes les conditions. Une représentation schématique de la générale mise en place d’un ektacytometer est illustrée à la Figure 1. Des populations homogènes des érythrocytes vont produire un schéma de diffraction elliptiques en réponse à l’accroissement de la contrainte de cisaillement qui peut être utilisée pour calculer l’indice d’allongement tel qu’illustré à la Figure 2. Distorsion de patron de diffraction se produit dans des échantillons sanguins hétérogène car rigide des globules rouges ne pas aligner correctement avec cellules déformables et produire un modèle sphérique que superpositions l’ellipse ayant pour résultat un diamant en forme de schéma de diffraction. Ce modèle déformé est détectable de plus en plus comme le gain de la caméra est ajusté pour générer de grandes tailles de patron de diffraction tel qu’illustré à la Figure 3. Des populations homogènes de sang, que l'on trouve chez des volontaires sains, ne produisent pas de courbes de déformabilité différentes tailles différentes de diffraction sont mesurés (Figure 4 a). En revanche, les populations de sang hétérogènes, tels que le sang de patients atteints de drépanocytose, montrent une diminution significative des mesures de déformation en fonction de la taille de motif de diffraction (Figure 4). Dans le sang de la faucille, le degré de distorsion de patron de diffraction est mesurée en fonction de l’IE Max, il est en corrélation avec HbS (Figure 5 a) et la variante de l’hémoglobine adulte, HbA2 (Figure 5). Transfusion corrige la distorsion, comme en témoigne sa relation inverse avec le pourcentage d’hémoglobine adulte normale (HbA) dans le sang (Figure 5). Si le degré de distorsion de patron de diffraction est mesuré en fonction de la contrainte de cisaillement ½ (Figure 5 b) ou en fonction de l’IE Max (Figure 5E), il est en corrélation avec hémoglobine foetale. Cependant, la relation est plus forte dans le premier que le second. Ektacytomètre gradient osmotique principaux paramètres, tels que O (Max AE), AE Min et O Min fournissent des informations supplémentaires sur l’hydratation cellulaire, ratios de surface-volume et de la fragilité osmotique, respectivement. Courbes de gradients osmotiques provenant du sang de faucille sont caractéristiquement décalés vers la gauche avec des diminutions marquées de déformabilité qui deviennent plus en plus prononcées dans la région hypertonique comme illustré à la Figure 6.
Figure 1 . Schéma de montage ektacytometer. Une tasse externe tourne autour d’un bob stationnaire à génère des contraintes de cisaillement sur le sang remis en suspension dans une solution PVP de viscosité définie qui est placée entre eux. Un schéma de diffraction est généré par un laser qui passe à travers la solution et le schéma de diffraction est affiché sur un écran de projection. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Aperçu général de la relation entre l’indice de motif et de l’allongement diffraction. Schéma de diffraction obtenu de sang sain en réponse à la tension de cisaillement présente le modèle elliptique attendu. Indice d’allongement (AE) est calculé à l’aide de l’équation a indiqué 7. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Hétérogénéité cellulaire produit des distorsions de patron de diffraction. Patrons de diffraction obtient de sang provenant d’un patient de l’anémie falciforme lorsque le gain de l’appareil photo est réglé pour produire A) un schéma de diffraction de 3,8 cm, B) un schéma de diffraction de 4,5 cm et C) un patron de diffraction de 5,4 cm. Courbes de déformabilité montrant une diminution progressive de la capacité de déformation apparente et une augmentation correspondante dans la contrainte de cisaillement apparente ½, indiqué par les lignes, du sang même lorsque le gain de l’appareil photo est réglé pour produire D) la diffraction de 3,8 cm modèle, E) le patron de diffraction de 4,5 cm et F) le patron de diffraction de 5,4 cm. [Réimprimé avec la permission de Philippe et al. 10]. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Distorsions de patron de diffraction produisent une diminution apparente de déformabilité dans un éventail de contraintes de cisaillement dans le sang de patients atteints de drépanocytose. Comparaison des courbes de déformabilité généré à partir de A) sang des volontaires en bonne santé et B) sang de patients atteints de drépanocytose en réglant le gain de la caméra pour générer une taille de motif de diffraction 3,8 cm, 4,5 cm et 5,4 cm. Courbes de déformabilité générées avec le sang des patients atteints de drépanocytose, mais pas des volontaires sains, montrent diminution progressive et importante de déformabilité apparente en réponse à aussi peu que 5 Pa la contrainte de cisaillement en fonction de la diffraction taille du motif. [Réimprimé avec la permission de Renoux et al. 9]. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Le degré de distorsion de patron de diffraction est corrélé avec la composition de l’hémoglobine dans le sang de patients atteints de drépanocytose. Les analyses de régression linéaire montrent la relation entre A) la distorsion axée sur les EI Max de déformabilité et le pourcentage d’HbS, B) la distorsion de base 1/2 SS de déformabilité et le pourcentage d’hémoglobine fœtale (HbF), C) la Axée sur les EI Max distorsion de déformabilité et le pourcentage de HbA2, D) la distorsion axée sur les EI Max de déformabilité et le pourcentage de HbA et E) aux fins de comparaison directe, la distorsion axée sur les EI Max dans déformabilité et le pourcentage de HbF dans le sang de patients atteints de drépanocytose. Coefficient de corrélation de Pearson produit instant, ret correspondant p-valeur sont indiqués. [Reproduit avec la permission de Parrow al.10]. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 . Sang d’un patient souffrant de drépanocytose montre un déplacement gauche caractéristique concomitante avec la déformabilité réduite par rapport au sang d’un volontaire sain lors de l’analyse par ektacytomètre gradient osmotique. Sang provenant d’un volontaire sain (-) indique une courbe représentant ektacytomètre gradient osmotique avec l’emplacement des paramètres importants indiqués. Valeurs gradients osmotiques de la saine sont bénévole a.u. 0,143 pour AE Min, 146,3 mOsm/kg pour l’O Min, a.u. 0,576 pour IE Max et 473 mOsm/kg pour l’O hyper. Une courbe représentant ektacytomètre gradient osmotique générée avec le sang d’un patient souffrant d’anémie falciforme se superposent (-). Les valeurs de gradients osmotiques du sang de la drépanocytose sont 0,237 a.u. EI min, 110,3 mOsm/kg pour l’O Min, a.u. 0,429 pour IE Max et 406 mOsm/kg pour l’O hyper. [Adapté avec la permission de Philippe et al. 10]. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les ektacytomètre techniques décrites sont simples et bien automatisé, assurant des résultats valables et reproductibles. Néanmoins, il existe quelques étapes cruciales. Contrôle de la température correcte du sang est important. Stockage à température ambiante pendant plus de huit heures peut affecter SS ½ valeurs. 34 s’assurer que la température de la machine est stable à 37 ° C est également important, comme la viscosité du milieu à suspension est dépendante de la température. Sang doit être complètement oxygéné pour éviter une diminution de déformabilité partir d’échantillons non oxygénés ou partiellement oxygénés, à moins que ce sont des paramètres expérimentaux d’intérêt. 35 du point de vue de l’instrumentation, un nettoyage correct de l’instrument est essentiel de s’assurer qu’il n’y a aucun PVP restant dans le tuyau ou le point d’entrée du bob comme il durcira à l’écoulement du fluide séchage et bloc par le biais de l’instrument. Attention à ces détails favorisera des résultats précis et garder l’appareil en bon Etat de fonctionnement.
Quantification de l’hétérogénéité cellulaire peut-être nécessiter des modifications. Dans le schéma de diffraction de 3,8 cm, certains échantillons peuvent montrer une chute précipitée dans l’index d’élongation pour les contraintes de cisaillement plus élevés. Parfois, cela peut être surmonté en répétant la mesure avec un échantillon frais. Dans le cas contraire, le degré de distorsion de patron de diffraction peut être mesuré à l’aide d’une valeur d’index de l’élongation d’une contrainte de cisaillement inférieure ou le patron de diffraction 4,5 cm peut être utilisé. 9 il peut également être difficile d’obtenir un schéma de diffraction de 3,8 cm de sang sain parce que le grand axe de l’ellipse est trop long même au gain le plus bas de la caméra. Encore une fois, les données de modèle de diffraction 4,5 cm permet de contourner ce problème. La valeur choisie, bien sûr, convient constante à travers l’expérience que les comparaisons ne sont possibles que de données calculées en utilisant le même point et diffraction Patron taille des données. Comme les mesures de l’hétérogénéité cellulaire dépendent de l’instrument mis en place, validation interne peut être obtenue en mesurant les distorsions de patron de diffraction sur des fractions de cellules isolées, ou mélanges de fractions, densité suivante précisément définis centrifugation comme décrite précédemment. 6
Il est important de noter que beaucoup de paramètres ektacytomètre est sensibles aux caractéristiques du patient. Citons dans l’anémie falciforme statut alpha globine,36 MCV 37 et transfusion. 10 c’est pourquoi, les études cliniques doivent être soigneusement conçues et ces relations doivent être pris en compte lors de l’interprétation des données ektacytomètre.
Une autre mise en garde importante est qu’il n’y a pas une relation directe générale entre les mesures de réduction ektacytomètre et réduction de la survie des globules rouges. Conditions asymptomatiques à sévèrement diminuée capacité de déformation, telles que l’Asie du sud-est ovalocytose, existent. 38 Toutefois, mesure de la déformabilité par n’importe quelle technique est complexes et dépendent de la surface cellulaire rapport volumétrique (sphéricité), viscosité cytoplasmique (concentration d’hémoglobine cellulaire) et rigidité de la membrane. Rhéologie des globules rouges est également complexe, et il n’y a pas une technique qui permet de reproduire la complexité de la circulation sanguine et physiologiques dans les lits vasculaires diverses. Néanmoins, ektacytomètre fournit des renseignements importants sur la déformabilité des hématies altérées et la rhéologie.
La principale limite d’ektacytomètre est l’incapacité de mesurer la capacité de déformation dans des cellules individuelles. Ainsi, dans l’anémie falciforme, il n’y a aucun moyen de déterminer la contribution de l’hémoglobine fœtale, qui a une distribution hétérocellulaires, sur la déformabilité d’un érythrocyte particulière. 10 même, dans une mare de sang de Plasmodium infectés provenant d’un patient il est impossible de déterminer l’influence de la maturité de parasite au sein d’une cellule spécifique de sang rouge. 19 future studies comparant ektacytometery résultats avec ceux obtenus à l’aide de méthodes appropriées pour les cellules individuelles pourrait se révéler utiles. Indépendamment de cette limitation, ektacytomètre fournit une mesure pratique et sensible de la rhéologie des érythrocytes et de l’hétérogénéité des populations de sang. Ces données sont importantes dans l’étude de plusieurs troubles et sont souvent de pertinence clinique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros de la National Institutes of Diabetes, digestif et maladies rénales et National Heart, Lung and Blood Institute des National Institutes of Health. Les opinions exprimées ici sont la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LoRRca MaxSis standard version | Mechatronics | LORC109000 | |
| LoRRca MaxSis Osmoscan | Mechatronics | LORC109001 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 0mOsm | Mechatronics | QRR030910 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 500mOsm | Mechatronics | QRR030930 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 5mL vials | Mechatronics | QRR030901 | |
| X clean | Mechatronics | QRR010946 | |
| P1000 | MilliporeSigma | Z646555 | |
| P200 | MilliporeSigma | Z646547 | |
| P200 filter tips | MidSci | AV200-H | |
| P1250 filter tips | MidSci | AV1250-H | |
| Kimwipes | MidSci | 8091 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| 15 mL conical vial | MidSci | C15R |
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