Summary
Här presenterar vi tekniker för att mäta röd cell deformability och cellulära heterogenitet av ektacytometry. Dessa tekniker är tillämpliga allmänna utredningar av röda blodkroppar deformability och särskilda undersökningar av blodsjukdomar som kännetecknas av förekomsten av både styv och deformerbara erytrocyter i cirkulationen, såsom sickle-cell anemi.
Abstract
Minskad röd cell deformability är kännetecknande för flera sjukdomar. I vissa fall kan omfattningen av defekta deformability förutsäga svårighetsgraden av sjukdomen eller förekomsten av allvarliga komplikationer. Ektacytometry använder laser diffraktion viscometry för att mäta deformability av röda blodkroppar föremål för antingen ökande skjuvspänningen eller en osmotisk gradient på ett konstant värde på tillämpad skjuvspänning. Direkt deformability mätningar är dock svåra att tolka vid mätning heterogen blod som kännetecknas av förekomsten av både styv och deformerbara erytrocyter. Detta beror på stela celler oförmåga att korrekt anpassa svar skjuvspänning och resulterar i en förvrängd diffraktionsmönster som kännetecknas av en överdriven minskning av uppenbara deformability. Mätning av graden av snedvridning ger en indikator av heterogenitet i erytrocyter i blodet. I sickle-cell anemi, är detta korrelerade med den procentandel av styv celler, som återspeglar hemoglobin koncentrationen och hemoglobin sammansättningen av erytrocyterna. Förutom att mäta deformability, ger osmotisk gradient ektacytometry information om osmotisk bräcklighet och vätskestatus av erytrocyter. Dessa parametrar också återspegla hemoglobin sammansättningen av röda blodkroppar från sickle cell patienter. Ektacytometry mäter deformability hos populationer av erytrocyter och ger inte, därför information på deformability eller mekaniska egenskaper hos enskilda erytrocyter. Oavsett, är målet av de tekniker som beskrivs häri att ge en bekväm och pålitlig metod för att mäta deformability och cellulära heterogenitet av blod. Dessa tekniker kan vara användbara för att övervaka tidsmässiga förändringar, samt sjukdomsprogression och respons till terapeutisk intervention i flera sjukdomar. Sickle cell anemi är en välkarakteriserad exempel. Andra potentiella störningar där mätningar av röda blodkroppar deformability eller heterogenitet är av intresse inkluderar blod lagring, diabetes, Plasmodium infektion, järnbrist och de hemolytisk anemier på grund av membranet brister.
Introduction
Ektacytometry ger en bekväm mått på röda blodkroppar deformability som svar på förändringar i skjuvspänning (mäts i Pascal (Pa)) eller upphäva medium osmolalitet. Relevanta parametrar för röda blodkroppar deformability inkluderar maximal töjning index (EI Max), ett mått på den maximala deformability för en röd cell som svar på ökad skjuvspänning och skjuvspänning ½ (SS ½), krävs för att uppnå halva maximala skjuvspänningen deformability. 1 osmotisk gradient ektacytometry har flera informativa parametrar. Dessa inkluderar töjning indexet minsta (EI Min), ett mått på ytan till volym baserat och osmolalitet då det sker (O Min), vilket är ett mått på osmotisk bräcklighet. EI Max och osmolalitet då det sker (O (EI Max)) ger information om membran flexibilitet och cell yta. Halva maximal töjning i hyperton armen av den osmotiska gradienten representeras av EI hyper. EI hyper och osmolalitet som det uppstår, O hyper, ger information om intracellulära viskositeten av röda cellen som bestäms av hemoglobin koncentrationen. 2 , 3 mäta deformability i heterogen blod kompliceras av det faktum att styva celler, såsom sickled röda blodkroppar, inte justeras korrekt med flödesriktningen såsom deformerbara celler som svar på ökad skjuvspänning. I stället för att producera en karakteristiska elliptiska diffraktion bild, producerar styv celler ett sfäriskt mönster vilket resulterar i en diamant-formade diffraktionsmönster när överdrog på ellipsen produceras av deformerbara celler. 4 , 5 , 6 det sfäriska mönstret har visat sig motsvara irreversibelt sickled celler genom att utföra ektacytometry på isolerade fraktioner av celler efter densitet centrifugering. 6 töjning indexberäkning omfattar åtgärder för både långa och korta axeln av ellipsen; en diamantform därför producerar en uppenbar minskning av töjning genom att öka bredden på den korta axeln. 7 det har tidigare visat att graden av diffraktion mönster distorsion är korrelerade med både andelen skäran hemoglobin (HbS) och procentandelen av sickled celler i blodet från patienter med sicklecellanemi. 5 graden av diffraktion mönster snedvridning kan erhållas av komplexa matematiska analyser. 8 det kan också erhållas genom att justera öppningen av kamerans bländare på ektacytometer eller den grå nivån av programvaran montering att ändra höjden diffraktion mönster. 5 dock information om hur du justerar den grå nivån är inte väldefinierade och kameran bländaren är inte lättillgänglig på den senaste generationen av de kommersiellt tillgängliga ektacytometer. För att kringgå dessa frågor, kan lättillgängligt kamera vinsten användas för att justera diffraktion mönster höjder. 9 med den här metoden för att uppskatta cellulära heterogenitet, kan graden av diffraktion mönster snedvridning korreleras med procentandelen av fetalt hemoglobin i blodet hos patienter med sickle-cell anemi. 10 flera osmotisk gradient ektacytometry parametrar är jämväl korrelerade med procentandelen av fostrets eller skäran hemoglobin i blod från patienter med sicklecellanemi. Diffraktion mönster distorsion korrelationer sannolikt återspeglar bidraget av hemoglobin sammansättning till procentandelen av styva, icke-deformerbara celler. Ytterligare sevärdheter genomgår hela osmotisk gradient ektacytometry profilen bifasisk förändringar som motsvarar procentandelen av täta celler i omlopp under sicklecellkris. 11
Ektacytometry är jämväl användbar i studiet av flera andra sjukdomar. Osmotisk gradient ektacytometry är diagnostiska för de ärvda röd cell membran sjukdomar, såsom ärftlig spherocytosis, ärftlig elliptocytosis och ärftliga pyropoikilocytosis. 3 , 12 , 13 , 14 sänkt deformability uppstår i järnbrist. 15 karakterisering av ”lagring lesionen” av blod har anställd ektacytometry och framtida studier som undersöker både arten av lesionen och interventioner för att förhindra dess bildning under lagringen av bankas blod sannolikt att dra nytta av den tekniker presenteras här. 16 minskad röd cell deformability har också korrelerats med mikrovaskulära sjukdomen diabetes. 17 senaste studier länka hyperglykemi, röd cell askorbat koncentrationer och osmotisk bräcklighet tyder dessa faktorer kan vara viktiga i utvecklingen av mikrovaskulära sjukdomar. 18 Ektacytometry studier pågår för närvarande att undersöka denna hypotes (Parrow och Levine, opublicerade data). Blodet steg malarial infektion är en annan intressant avenue röd cell deformability utredningar. Cellulär deformability av Plasmodiumfalciparum infekterade röda blodkroppar minskar dramatiskt under de 48 timmarna av intracellulära mognaden av parasiten från ringen scenen schizont scenen. Uppgifter tyder på att detta minskad deformability är omvänd vid mognaden av parasiten. Återföringen sammanfaller med lanseringen av infekterade erytrocyter i cirkulationen. Minskad deformability tros vara medierade av Plasmodium proteiner som främjar upptag av den röda blodkroppar. 19 dessa studier representerar ett litet urval av kliniskt viktiga villkor där mäta erytrocyt deformability och osmotisk gradient parametrar är relevanta. Finnas flera ytterligare områden av studien.
Alternativa tekniker för att mäta röd cell deformability inkluderar optisk pincett (även känd som laser fällor) som använder de fysiska egenskaperna av fotoner för att sträcka enda röda blodkroppar i en eller flera riktningar. 20 denna teknik har fördelen av att mäta deformability av enda erytrocyter, men viss osäkerhet i kraft kalibrering har producerat betydande variabilitet över studier 21 och dataanalys kan vara arbetsintensiva såvida inte automatiserad. 22 mikropipett aspiration, som använder undertryck som aspirerar en erytrocyt till en mikropipett, har också använts för att mäta deformability röda blodkroppar. 7 , 23 flera mätningar, såsom de påtryckningar som krävs för att aspirera röd cellen, är möjligt med varje åtgärd som definierar olika egenskaper hos de röda blodkroppar. 23 atomic force microscopy är en högupplöst teknik som mäter membran stelhet av kvantifiera laser beam omläggning som indikator av fribärande omläggning längs ytan av en röd cell. 24 dessa tekniker ge information om enskilda erytrocyter, är inte enkelt anpassade för att mäta förändringar i populationer av röda blodkroppar, och, i allmänhet kräver betydande tekniska sakkunskap.
Önskan att prova både individ och populationer av celler samtidigt har lett till framsteg inom automation och utvecklingen av mikrofluidik och arraybaserade metoder. Som ektacytometry, rheoscopy mäter deformability som en funktion av shear stress men bilder förvärvas direkt via Mikroskop. 25 för högre genom-satte analyser, automatiserade cell imaging har varit anställd att producera deformability-distributioner som använder rheoscope. 26 cellulära heterogenitet kan kvantifieras genom denna metod om data från en frisk kontroll ämne är tillgängliga. 27 mikrofluidik tekniker också möjliggör hög genom-satte analyser av enstaka celler; flera mönster med hjälp av anpassningar av filtrering,28 cell transit analysatorer,29 , som mäter den tid som krävs för en erytrocyt flödet genom en mikaeljacobsson och alternativ som mäter trycket krävs för erytrocyt transit snarare tid 30 har utvecklats. En annan plattform för hög genom-satte analys av enskilda celler är enda cell microchamber array chipet, som har den ytterligare fördelen att för nedströms fluorescens-baserade karaktärisering av cellerna. 31 även om var och en av dessa tekniker är potentiellt användbara och kan vara överlägsen för särskilda applikationer, inkluderar de komparativa fördelarna ektacytometry känslighet, användarvänlighet, och precision. 32 den senaste generationen av kommersiellt tillgängliga ektacytometers också äger betydande mångsidighet i antalet analyser som kan utföras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försökspersonerna i denna studie gav skriftligt informerat samtycke i enlighet med Helsingforsdeklarationen och nationella institut för hälsa institutionella Review Board godkända protokoll.
1. slå på ektacytometer
- Anslut slangen från rengöringslösningen till de låga och höga osmolaritetssystem polyvinylpyrrolidon (PVP) lösningarna. Var noga med att ansluta 0 osmolaritetssystem röret till lågosmolärt lösningen och 500 osmolaritetssystem röret till hög osmolaritetssystem lösningen.
Obs: Lågosmolärt PVP lösningen bör ha en osmolalitet mellan 35 och 55 milliosmoles per kilo (mOsm/kg), en pH 7,25-7.45 vid 25 ° C och en viskositet mellan 27,0 och 33,0 centipoise (cP) 37,0 ± 0,5 ° C. Den höga osmolaritetssystem PVP lösningen bör ha en osmolalitet mellan 764 och 804 mOsm/kg, ett pH på 7,25-7.45 vid 25 ° C och en viskositet mått på 27,0-33,0 cP på 37,0 ° 0,5 ° C. - Säkerställa att bob är sänkts ned helt i koppen. Starta programmet och prime maskinen (hårdvara kontrollera | Instrument IO). Låt instrumentet att slutföra cykeln för grundning. När cykeln är klar, lyfta bob ur koppen och helt torr bob och cup med en låg luddning rengöring vävnad.
Obs: Kvarstående vatten kommer att lysera röda celler, som producerar störningar.
2. mäta deformability som en funktion av ökad skjuvspänning
- Få blod (mindre än 1 mL är tillräcklig för att utföra dessa tekniker med replikerar) i injektionsflaska innehållande en lämplig antikoagulant.
Obs: EDTA är att föredra framför heparin eftersom det har mindre inflytande över hemorheological parametrar. 33 hålla blod vid rumstemperatur om mätningar utförs inom 6 timmar efter blod rita. - Blanda försiktigt hela blodprov före testning genom att vända injektionsflaskan flera gånger. Lägga till 25 µL helblod 5 mL iso-osmolaritetssystem PVP lösning genom pipettering, cap injektionsflaskan och blanda försiktigt genom att vända flera gånger. Iso-osmolaritetssystem PVP lösningen bör ha en osmolalitet mellan 284 och 304 mOsm/kg, ett pH på 7,3-7,4 vid 25 ° C och en viskositet på 27,0-33,0 cP på 37,0 ± 0,5 ° C.
- Välj deformability från huvudmenyn på programvaran. Skapa en ny analys och lägga till experimentella detaljer (Deformability | Lägg till önskad information | Okej).
- Lyft locket till ektacytometer, kontrollera att bob är helt nedsänkt i kopp och kopp vänder.
- Tillsätt 1 mL PVP blod lösning i utrymmet mellan koppen och bob genom pipettering.
- Lyft den bob något för att få prover ner. Vänta tills alla bubblor har flyttat ut ur lösningen, sedan Stäng locket för att ektacytometer. Om det behövs, tryck på knappen strävan att hjälpa ta bort bubblor.
- Justera känsligheten till 200 genom att flytta pilen längs rullningslisten på programvara (se anmärkning). När temperaturen är stabil vid 37 ° C och diffraktion bilden är stabil, tryck på Starta (Start).
Obs: För många studier, kan en bra diffraktion bild erhållas från frisk blod (hemoglobin koncentrationen > 12,0 g / dL, genomsnittlig korpuskulära volym av 80-96 fL och genomsnittlig korpuskulära koncentrationer av 33-36 g/dL) med kameran känsligheten inställd på 200. För studier av blod från sickle-cell anemi, har justera kameran vinsten för att generera en 4,5 cm diffraktion bild föreslagits som standardinställningen för att möjliggöra jämförelse av resultat mellan studierna och laboratorier. 9 - Iaktta diffraktionsmönster som data förvärv fortskrider att säkerställa att de förblir cirkulär, elliptiska eller diamantformade. När datainsamling är klar, Spara eller skriva ut rapporten (fil | Spara eller Arkiv | Skriv ut). EI Max och SS ½ värden rapporteras automatiskt, tillsammans med töjning index motsvarar användardefinierade eller standard shear stress. Data sparas också automatiskt av programvaran.
- I slutet, tryck på alternativet ren på dialogrutan på datorskärmen (rena). Efter provet är aspirerade, skölj utrymmet mellan koppen och bob genom att spruta avjoniserat vatten in i utrymme medan instrumentet förblir i ren cykel. När ren cykeln är klar, lyfta bob ur koppen och helt torra bob och koppen med en låg luddning rengöring vävnad (kritisk: kvarstående vatten kommer att lysera röda celler, som producerar störningar).
- Klicka på knappen huvudmeny i programvaran att återgå till huvudsidan (Huvudmenyn).
3. mätning av cellulära heterogenitet
- Blanda försiktigt hela blodprov före testning genom att vända injektionsflaskan flera gånger. Pipettera 25 µL helblod till en ny 5 mL injektionsflaska av iso-osmolaritetssystem PVP lösning, cap injektionsflaskan och blanda försiktigt genom att invertera tills blandningen är homogen.
- Välj deformability från huvudmenyn. Skapa en ny analys och lägga till experimentella detaljer (Deformability | Lägg till önskad information | Okej).
- Lyft locket till ektacytometer, kontrollera att bob är helt nedsänkt i kopp och kopp vänder.
- Pipettera 1 mL av lösningen PVP blod in i utrymmet mellan kopp och bob.
- Vänta tills alla bubblor har flyttat ut ur lösningen, sedan Stäng locket för att ektacytometer.
- Se till att det finns en stabil diffraktion-bild på skärmen. Justera kameran förstärkning genom att flytta pilen längs rullningslisten på programvaran tills den producerar en 3,8 cm diffraktion höjd. Använd en linjal för att kontrollera höjden på bilden på datorskärmen.
- När temperaturen är stabil vid 37 ° C och diffraktion bilden är stabil, tryck på Starta (Start).
- Iaktta diffraktionsmönster som data förvärv fortskrider att säkerställa att de förblir runda, elliptiska eller diamant-formade. När datainsamling är klar, Spara eller skriva ut rapporten (fil | Spara eller -fil | Skriv ut).
- I slutet, tryck på alternativet ren på dialogrutan på datorskärmen (ren). Efter provet är aspirerade, skölj utrymmet mellan koppen och bob av squirting avjoniserat vatten från en sprutande flaska i det medan instrumentet förblir i ren cykel. När ren cykeln är klar, lyfta bob ur koppen och helt torra bob och koppen med en låg luddning rengöring vävnad (kritisk: kvarstående vatten kommer att lysera röda celler, som producerar störningar).
- Upprepa steg 2.1-2.5 och justerar kamerans känslighet för att erhålla en 4,5 cm diffraktion mönster höjd (steg 2.2).
- Upprepa steg 2.1-2.5 och justerar kamerans känslighet för att erhålla en 5,4 cm diffraktion mönster höjd (steg 2.2).
- I slutet, klicka på knappen huvudmenyn att återgå till huvudsidan för programvaran (huvudmenyn).
- För att avgöra graden av diffraktion mönster distorsion baserat på EI Max som en procentandel, Använd följande ekvation (samma ekvationen kan utföras med data från 4,5 cm diffraktion mönster höjden om så önskas):
- På samma sätt för att bestämma graden av diffraktion baseras mönster distorsion på SS1/2 använder samma ekvationen med rapporterade SS1/2 värdet:
4. osmotisk gradient ektacytometry
- Erhålla prov som beskrivs i punkt 1.1. Blanda försiktigt hela blodprov före testning genom att vända flera gånger. Lägga till 250 µL helblod 5 mL injektionsflaska av iso-osmolaritetssystem PVP genom pipettering, cap injektionsflaskan och blanda försiktigt genom att invertera tills blandningen är homogen.
- Välj osmoscan i huvudmenyn (Osmoscan). Placera injektionsflaskan med blodet PVP lösning under nålen på vänster sida av maskinen. Sänka nålen tills det når botten av injektionsflaskan. Kontrollera slangar är korrekt ansluten till de låga och höga osmolaritetssystem lösningarna för gradient produktion. Stäng locket till ektacytometer och öppna dörren på den nedre halvan så att du kan titta på blod ange slangen.
- Tryck på ny analys och typ i experimentella detaljer (Osmoscan | Ny analys | Ange önskad information | Okej). Justera kameran förstärkning till 200 genom att flytta pilen styra det på programvaran och låt maskinen köra tills blod ses in koppen från slangen under instrumentet.
- När blodet har angett koppen och en stabil diffraktion mönsterbild är på datorskärmen, börja datainsamling genom att trycka på start nu knappen i dialogrutan (börja nu).
- Tillåt ektacytometer uppkopplingstyp upp till cirka 500 mOsm/kg och sedan stoppa instrumentet. Spara eller Skriv ut rapport (fil | Spara eller Arkiv | Skriv ut). Data sparas också automatiskt.
- Ta bort gamla PVP-blod injektionsflaskan. Ersätta den med en ren flaska som innehåller avjoniserat vatten. Placera den under nålen, sänka nålen så att det når botten av flaskan och tryck på skölj knappen i dialogrutan att skölja lutning systemet (skölj).
- När sköljningen är klar, tryck på alternativet ren på dialogrutan på datorskärmen (rena). När ren cykeln är klar, lyfta bob ur koppen och helt torra bob och koppen med en låg luddning rengöring vävnad (kritisk: kvarstående vatten kommer att lysera röda celler, som producerar störningar).
Obs: Rapporten osmoscan ger töjning index över den osmotiska gradienten. O (EI Min), O (EI Max), EI Max, EI Min, EI hyper och O hyper genereras automatiskt och tas med i rapporten. Utbudet av osmotisk gradient ektacytometry parametrar erhålls från blod från 9 friska frivilliga är: EI Min 0,12-0.196 godtyckliga enheter (a.u.); O Min 117-144 mOsm/kg; EI Max 0.551-0.573 a.u.; O (EI Max) 272-312 mOsm/kg. EI hyper 0,278-0,286; O Hyper 454-505 mOsm/kg.
5. att stänga av ektacytometer
- Ren instrumentet ordentligt innan den stängs.
- För att göra detta, Anslut slangen från de låga och höga osmolaritetssystem lösningarna till y-adaptern leder till rengöringslösningen. Placera en injektionsflaska innehållande rengöringslösningen under nålen på vänster sida av maskinen och sänka nålen tills det når botten av injektionsflaskan. Säkerställa att bob är sänkts ned helt i koppen.
- Nära programvaran och tryck på starta på slutet av dagen rena dialogrutan på bildskärmen (nära | Starta). Låt instrumentet att cykla genom rengöring helt.
- Koppla bort slangen till avfallsflaskan och ta bort den från instrumentet att kassera avfall. Torka bob. Stäng av maskinen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ektacytometry resultaten beskrivs i detta manuskript kan användas för att mäta röd cell deformability i alla. En schematisk bild av den allmänna uppbyggnaden av ett ektacytometer visas i figur 1. Homogen populationer av erytrocyter kommer att producera en elliptisk diffraktionsmönster som svar på ökad skjuvspänning som kan användas för att beräkna indexet töjning som visas i figur 2. Diffraktion mönster distorsion uppstår i heterogen blodprov eftersom styv erytrocyter inte justera ordentligt med deformerbar celler och producera en sfärisk mönster att överlägg ellipsen vilket resulterar i en diamant formad diffraktionsmönster. Detta förvrängda mönster är alltmer upptäckas som kameran vinst justeras för att generera större diffraktion mönster storlekar som visas i figur 3. Homogen blod populationer, som återfinns hos friska frivilliga, inte producerar olika deformability kurvor när olika diffraktion storlekar mäts (figur 4A). Däremot visar heterogen blod befolkningar, såsom blod från patienter med sicklecellanemi, signifikanta minskningar i deformability åtgärder som en funktion av diffraktion mönsterstorlek (figur 4). I skäran blod, när graden av diffraktion mönster distorsion mäts som en funktion av EI Max, är det korrelerad med HbS (figur 5A) och adult hemoglobin variant, HbA2 (bild 5 c). Transfusion korrigerar snedvridning, som indikeras av dess omvänt förhållande med andelen normala vuxna hemoglobin (HbA) i blodet (figur 5 d). Om graden av diffraktion mönster distorsion mäts som en funktion av Skjuvspänningen ½ (figur 5B) eller som en funktion av EI Max (figur 5E), är det korrelerad med fetalt hemoglobin. Förhållandet är dock starkare i tidigare än den senare. Viktiga osmotisk gradient ektacytometry parametrar, såsom O (EI Max), EI Min och O Min ger ytterligare information om den cellulära hydrering, ytan till volym nyckeltal och osmotisk bräcklighet, respektive. Osmotisk gradient kurvor som erhållits från skäran blod är karakteristiskt vänster-skiftat med markanta minskningar av deformability som blir allt mer uttalade i regionen hyperton som visas i figur 6.
Figur 1 . Schematisk av ektacytometer set-up. En yttre cup roterar runt en stationär bob att genererar skjuvspänningen på blod resuspended i en PVP-lösning av definierade viskositet som är placerad mellan dem. En diffraktionsmönster genereras av en laser som passerar genom lösningen och diffraktionsmönster visas på en filmduk. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Allmän översikt över förhållandet mellan diffraktion mönster och töjning index. Diffraktionsmönster som erhållits från frisk blod svar på shear stress visar förväntade elliptiskt mönster. Töjning index (EI) beräknas med hjälp av ekvation anges 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Cellulära heterogenitet producerar diffraktion mönster snedvridningar. Diffraktionsmönster erhållits från blod från en sickle cell anemi patienten när kameran vinst justeras för att producera A) en 3,8 cm diffraktionsmönster, (B) en 4,5 cm diffraktionsmönster och (C) en 5,4 cm diffraktionsmönster. Deformability kurvor visar en progressiv minskning av uppenbara deformability och en motsvarande ökning i uppenbara skjuvspänningen ½, anges av linjer, från samma blod när kameran vinst justeras för att producera D) 3,8 cm diffraktion mönster, E) 4,5 cm diffraktionsmönster och F) 5,4 cm diffraktionsmönster. [Reprinted med tillstånd från Parrow et al. 10]. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 . Diffraktion mönster snedvridningar producera en uppenbar minskning av deformability inom en rad olika skjuvspänningar i blod från patienter med sicklecellanemi. Jämförelse av deformability kurvor genererade från (A) blod från friska frivilliga och (B) blod från patienter med sickle-cell anemi genom att justera kameran vinsten att generera en 3,8 cm, 4,5 cm och 5,4 cm diffraktion mönsterstorlek. Deformability kurvorna genereras med blod från patienter med sickle-cell anemi, men inte från friska frivilliga, visar progressiv och betydande minskningar av uppenbara deformability svar på så lite som 5 Pa shear stress som en funktion av diffraktion mönsterstorlek. [Reprinted med tillstånd från Renoux et al. 9]. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 . Graden av diffraktion mönster distorsion är korrelerad med hemoglobin sammansättning i blod från patienter med sicklecellanemi. Linjär regressionsanalyser visar förhållandet mellan (A) EI Max-baserade förvrängningen i deformability och andelen av HbS, (B) SS 1/2-baserat förvrängningen i deformability och andelen av fetalt hemoglobin (HbF), (C) den EI Max-baserade distorsion i deformability och andelen av HbA2, D) EI Max-baserade förvrängningen i deformability och andelen av HbA och E) för att direkt jämförelse, EI Max-baserade förvrängningen i deformability och andelen av HbF i blod från patienter med sicklecellanemi. Korrelationskoefficienten till Pearsons momentprodukt, roch motsvarande p-värde anges. [Reprinted med tillstånd från Parrow et al.10]. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 . Blod från en patient med sicklecellanemi visar en karakteristisk vänster SKIFT samtidig med minskad deformability jämfört med blod från friska volontär när analyseras av osmotisk gradient ektacytometry. Blod från friska volontär (-) visar en representativ osmotisk gradient ektacytometry kurva med platsen för viktiga parametrar anges. Osmotisk gradient värden från den friska frivilliga är 0.143 a.u. för EI Min, 146,3 mOsm/kg för O Min, 0,576 a.u. för EI Max och 473 mOsm/kg för O hyper. En representativ osmotisk gradient ektacytometry kurva genereras med blod från en patient med sickle-cell anemi är överlagrat (-). Osmotisk gradient värden från sickle cell blodet är 0.237 a.u. för EI Min, 110,3 mOsm/kg för O Min, 0,429 a.u. för EI Max och 406 mOsm/kg för O hyper. [Anpassad med tillstånd från Parrow et al. 10]. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ektacytometry metoder som beskrivs är enkel och väl automatiserade, att säkerställa giltig och reproducerbara resultat. Dock finns vissa kritiska moment. Rätt temperaturkontroll av blod är viktigt. Lagring i rumstemperatur mer än åtta timmar kan påverka SS ½ värden. 34 att säkerställa att temperaturen i maskinen är stabil vid 37 ° C är också viktigt, som av det uppskjutande mediet viskositet är temperaturberoende. Blodet bör vara fullt syresatt för att undvika minskad deformability som härrör från icke-syresatt eller delvis syresatt prover, såvida inte dessa är experimentella parametrar av intresse. 35 från synvinkel av instrumentering, korrekt rengöring av instrumentet är avgörande för att säkerställa att det finns ingen PVP kvar i slangen eller startpunkten av bob som det förhärdar vid torkning och block vätskeflöde genom instrumentet. Uppmärksamhet åt dessa detaljer kommer att främja korrekta resultat och hålla instrumentet i bra körförhållanden.
Kvantifiering av cellulära heterogenitet kan kräva ändring. I 3,8 cm diffraktionsmönster, kan några prover visar en brant nedgång i indexet töjning vid de högsta skjuvspänningar. Detta kan ibland lösas genom att upprepa mätningen med ett färskt exempel. Annars, graden av diffraktion mönster snedvridning kan mätas med indexvärdet töjning från en lägre skjuvspänningen eller 4,5 cm diffraktionsmönster kan användas. 9 det kan också vara svårt att erhålla ett 3,8 cm diffraktionsmönster från frisk blod eftersom den långa axeln av ellipsen är alltför länge även på den lägsta kamera-vinsten. Igen, 4,5 cm diffraktion mönsterdata kan användas för att kringgå detta problem. Det värde som väljs bör naturligtvis hållas konstant över experimentet eftersom jämförelser endast är möjligt från data beräknas med hjälp av samma data point och diffraktion mönsterstorlek. Som de cellulära heterogenitet åtgärderna är beroende av instrument inrättats, intern validering kan erhållas genom att mäta diffraktion mönster snedvridningar på isolerad cell fraktioner, eller exakt definierade blandningar av fraktioner, följande densitet centrifugering som tidigare beskrivits. 6
Det är viktigt att notera att många ektacytometry parametrar är känsliga för patientens egenskaper. Exempel i sickle cell anemi är alfa-globin status,36 MCV 37 och transfusion. 10 därför kliniska studier behöver utformas omsorgsfullt och dessa relationer behöver redovisas när tolkning ektacytometry data.
En annan viktig varning är att det inte är en allmän direktrelation mellan minskad ektacytometry åtgärder och minskning av röda blodkroppar överlevnad. Asymtomatiska tillstånd med kraftigt minskad deformability, såsom sydostasiatiska ovalocytosis, existerar. 38 deformability mätningar av någon teknik är dock komplexa och beroende på det cell yta att volymförhållandet (sfärisk), cytoplasmiska viskositet (cellular hemoglobin koncentrationen) och membran styvhet. Röda blodkroppar reologi är jämväl komplex, och det finns inte en teknik som är tillgänglig och som kan reproducera komplexiteten i fysiologiska blodflödet i olika kärlbäddar. Ektacytometry ger ändå viktiga insikter i förändrad röd cell deformability och reologi.
Den främsta begränsningen av ektacytometry är oförmågan att mäta deformability i enskilda celler. Således, i sicklecellanemi finns det inget sätt att avgöra bidraget av fetalt hemoglobin, som har en heterocellular utbredning, på deformability av en viss erytrocyt. 10 jämväl, i en pool av Plasmodium infekterat blod från en patient finns det inget sätt att avgöra påverkan av parasiten förfaller inom en specifik röda blodkroppar. 19 framtidsstudier jämföra ektacytometery resultat med dem som erhålls med hjälp av metoder är lämpligt för enskilda celler skulle vara värdefullt. Oavsett denna begränsning ger ektacytometry en bekväm och känsliga mått på de reologiska egenskaperna hos erytrocyter och heterogenitet blod populationer. Dessa uppgifter är viktiga i studien av flera sjukdomar och är ofta klinisk relevans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av intramurala forskningsprogrammet av de nationella institut till Diabetes, mag och njursjukdomar och nationella hjärta, lunga och Blood Institute of National Institutes of Health. De åsikter som uttrycks här är ensam ansvarig för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LoRRca MaxSis standard version | Mechatronics | LORC109000 | |
| LoRRca MaxSis Osmoscan | Mechatronics | LORC109001 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 0mOsm | Mechatronics | QRR030910 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 500mOsm | Mechatronics | QRR030930 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 5mL vials | Mechatronics | QRR030901 | |
| X clean | Mechatronics | QRR010946 | |
| P1000 | MilliporeSigma | Z646555 | |
| P200 | MilliporeSigma | Z646547 | |
| P200 filter tips | MidSci | AV200-H | |
| P1250 filter tips | MidSci | AV1250-H | |
| Kimwipes | MidSci | 8091 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| 15 mL conical vial | MidSci | C15R |
References
- Bessis, M., Mohandas, N., Feo, C. Automated ektacytometry: a new method of measuring red cell deformability and red cell indices. Blood Cells. 6 (3), 315-327 (1980).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Osmotic gradient ektacytometry: comprehensive characterization of red cell volume and surface maintenance. Blood. 61 (5), 899-910 (1983).
- Da Costa, L., et al. Diagnostic tool for red blood cell membrane disorders: Assessment of a new generation ektacytometer. Blood Cells Mol Dis. 56 (1), 9-22 (2016).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Deformability of oxygenated irreversibly sickled cells. J Clin Invest. 65 (1), 189-196 (1980).
- Rabai, M., et al. Deformability analysis of sickle blood using ektacytometry. Biorheology. 51 (2-3), 159-170 (2014).
- Bessis, M., Mohandas, N. Laser Diffraction Patterns of Sickle Cells in Fluid Shear Fields. Blood Cells. 3, 229-239 (1977).
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y. Blood Cell - An Overview of Studies in Hematology. Moschandreou, T. E. , InTech. (2012).
- Streekstra, G. J., Dobbe, J. G., Hoekstra, A. G. Quantification of the fraction poorly deformable red blood cells using ektacytometry. Opt Express. 18 (13), 14173-14182 (2010).
- Renoux, C., et al. Importance of methodological standardization for the ektacytometric measures of red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (2), 173-179 (2016).
- Parrow, N. L., et al. Measurements of red cell deformability and hydration reflect HbF and HbA2 in blood from patients with sickle cell anemia. Blood Cells Mol Dis. 65, 41-50 (2017).
- Ballas, S. K., Smith, E. D. Red blood cell changes during the evolution of the sickle cell painful crisis. Blood. 79 (8), 2154-2163 (1992).
- Johnson, R. M., Ravindranath, Y. Osmotic scan ektacytometry in clinical diagnosis. J Pediatr Hematol Oncol. 18 (2), 122-129 (1996).
- Mohandas, N., Clark, M. R., Jacobs, M. S., Shohet, S. B. Analysis of factors regulating erythrocyte deformability. J Clin Invest. 66 (3), 563-573 (1980).
- Lazarova, E., Gulbis, B., Oirschot, B. V., van Wijk, R. Next-generation osmotic gradient ektacytometry for the diagnosis of hereditary spherocytosis: interlaboratory method validation and experience. Clin Chem Lab Med. 55 (3), 394-402 (2017).
- Anderson, C., Aronson, I., Jacobs, P. Erythrocyte Deformability is Reduced and Fragility increased by Iron Deficiency. Hematology. 4 (5), 457-460 (1999).
- Reinhart, W. H., et al. Washing stored red blood cells in an albumin solution improves their morphologic and hemorheologic properties. Transfusion. 55 (8), 1872-1881 (2015).
- Shin, S., et al. Progressive impairment of erythrocyte deformability as indicator of microangiopathy in type 2 diabetes mellitus. Clin Hemorheol Microcirc. 36 (3), 253-261 (2007).
- Tu, H., et al. Low Red Blood Cell Vitamin C Concentrations Induce Red Blood Cell Fragility: A Link to Diabetes Via Glucose, Glucose Transporters, and Dehydroascorbic Acid. EBioMedicine. 2 (11), 1735-1750 (2015).
- Tiburcio, M., et al. A switch in infected erythrocyte deformability at the maturation and blood circulation of Plasmodium falciparum transmission stages. Blood. 119 (24), e172-e180 (2012).
- Henon, S., Lenormand, G., Richert, A., Gallet, F. A new determination of the shear modulus of the human erythrocyte membrane using optical tweezers. Biophys J. 76 (2), 1145-1151 (1999).
- Mills, J. P., Qie, L., Dao, M., Lim, C. T., Suresh, S. Nonlinear elastic and viscoelastic deformation of the human red blood cell with optical tweezers. Mech Chem Biosyst. 1 (3), 169-180 (2004).
- Moura, D. S., et al. Automatic real time evaluation of red blood cell elasticity by optical tweezers. Rev Sci Instrum. 86 (5), 053702 (2015).
- Evans, E. A. New membrane concept applied to the analysis of fluid shear- and micropipette-deformed red blood cells. Biophys J. 13 (9), 941-954 (1973).
- Chen, X., Feng, L., Jin, H., Feng, S., Yu, Y. Quantification of the erythrocyte deformability using atomic force microscopy: correlation study of the erythrocyte deformability with atomic force microscopy and hemorheology. Clin Hemorheol Microcirc. 43 (3), 243-251 (2009).
- Musielak, M. Red blood cell-deformability measurement: review of techniques. Clin Hemorheol Microcirc. 42 (1), 47-64 (2009).
- Dobbe, J. G., Streekstra, G. J., Hardeman, M. R., Ince, C., Grimbergen, C. A. Measurement of the distribution of red blood cell deformability using an automated rheoscope. Cytometry. 50 (6), 313-325 (2002).
- Dobbe, J. G., et al. Analyzing red blood cell-deformability distributions. Blood Cells Mol Dis. 28 (3), 373-384 (2002).
- Kikuchi, Y., Arai, T., Koyama, T. Improved filtration method for red cell deformability measurement. Med Biol Eng Comput. 21 (3), 270-276 (1983).
- Moessmer, G., Meiselman, H. J. A new micropore filtration approach to the analysis of white cell rheology. Biorheology. 27 (6), 829-848 (1990).
- Guo, Q., et al. Microfluidic analysis of red blood cell deformability. J Biomech. 47 (8), 1767-1776 (2014).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Appl Phys Lett. 100 (17), 173702-173703 (2012).
- Baskurt, O. K., et al. Comparison of three commercially available ektacytometers with different shearing geometries. Biorheology. 46 (3), 251-264 (2009).
- Baskurt, O. K., et al. New guidelines for hemorheological laboratory techniques. Clin Hemorheol Microcirc. 42 (2), 75-97 (2009).
- Uyuklu, M., et al. Effects of storage duration and temperature of human blood on red cell deformability and aggregation. Clin Hemorheol Microcirc. 41 (4), 269-278 (2009).
- Uyuklu, M., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effect of hemoglobin oxygenation level on red blood cell deformability and aggregation parameters. Clin Hemorheol Microcirc. 41 (3), 179-188 (2009).
- Embury, S. H., Clark, M. R., Monroy, G., Mohandas, N. Concurrent sickle cell anemia and alpha-thalassemia. Effect on pathological properties of sickle erythrocytes. J Clin Invest. 73 (1), 116-123 (1984).
- von Tempelhoff, G. F., et al. Correlation between blood rheological properties and red blood cell indices(MCH, MCV, MCHC) in healthy women. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (1), 45-54 (2016).
- Da Costa, L., Galimand, J., Fenneteau, O., Mohandas, N. Hereditary spherocytosis, elliptocytosis, and other red cell membrane disorders. Blood Rev. 27 (4), 167-178 (2013).
