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Developmental Biology

Immunocytochemical विश्लेषण के लिए प्रसंस्कृत मानव भ्रूण मस्तिष्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के Zika वायरस संक्रमण

Published: February 5, 2018 doi: 10.3791/56917
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3
1Department of Neuroscience and Cell Biology, University of Texas Medical Branch, 2Department of Neurology, Johns Hopkins University, 3Beijing Institute for Brain Disorders, Capital Medical University

Summary

यह आलेख विवरण विधियों कि संस्कृति में मानव भ्रूण मस्तिष्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए उपयोग किया जाता है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में उन्हें विभिन्न न्यूरॉन उपप्रकार और astrocytes में अंतर करने के लिए कैसे, Zika वायरस संक्रमण का अध्ययन करने के लिए तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के उपयोग पर एक जोर के साथ.

Abstract

मानव भ्रूण मस्तिष्क तंत्रिका स्टेम सेल एक अद्वितीय गैर आनुवंशिक रूप से संशोधित मॉडल मानव विकास तंत्रिका पर विभिंन उत्तेजनाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए प्रणाली है । बल्कि एक पशु मॉडल या आनुवंशिक रूप से संशोधित प्रेरित pluripotent कोशिकाओं का उपयोग करें, मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को एक प्रभावी इन विट्रो प्रणाली उपचार के प्रभाव, स्क्रीन दवाओं, या व्यक्तिगत मतभेदों की जांच करने के लिए प्रदान करते हैं । यहां, हम सीरम मुक्त मीडिया के साथ संस्कृति में मानव भ्रूण मस्तिष्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, विभिंन भड़काने प्रक्रियाओं के माध्यम से विभिंन ंयूरॉन उपप्रकार और astrocytes में अंतर करने के लिए, और फ्रीज और ठीक इन कोशिकाओं । इसके अलावा, हम Zika वायरस संक्रमण का अध्ययन करने के लिए मानव भ्रूण मस्तिष्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करने की एक प्रक्रिया का वर्णन ।

Introduction

Zika वायरस (ZIKV) एक flavivirus या तो यौन संचारित है, या मच्छर वैक्टर एडीज aegypti और एडीज albopictus मच्छरों द्वारा । ZIKV हाल ही में एक गंभीर सार्वजनिक स्वास्थ्य के संचरण और संबद्ध स्नायविक लक्षण1की आसानी के कारण खतरे के रूप में पहचाना गया था । सबसे अधिक स्नायविक प्रभाव के विषय में से एक गर्भवती संक्रमित माताओं2,3करने के लिए पैदा भ्रूण में microcephaly के विकास है । Microcephaly एक neurodevelopmental विकार है जहां सिर भ्रूण विकास के दौरान और जंम के समय ठेठ आकार से छोटा है, परिधि से कम 2 मानक विचलन मतलब है4नीचे के साथ । छोटे सिर परिधि सामांयतः विकासात्मक देरी, बरामदगी, दृष्टि और सुनवाई हानि, और खिला कठिनाई के रूप में comorbidities की एक किस्म के साथ है ।

हाल के अध्ययनों से पशु मॉडल या प्रेरित pluripotent स्टेम सेल का इस्तेमाल किया है neurodevelopment पर ZIKV संक्रमण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए,6,7,8। हालांकि इन अध्ययनों ZIKV के हमारे ज्ञान के लिए योगदान दिया है, विभिंन प्रजातियों के उपयोग या आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं को समय लेने और/या अतिरिक्त चर है कि तंत्रिका कोशिकाओं को विकसित करने पर ZIKV के प्रभाव को पाया मई जोड़ सकते है5, ६ , 7 , 8. हालांकि, hNSC संस्कृति, विशेष रूप से इस प्रोटोकॉल में वर्णित गैर अनुयाई neurosphere संस्कृति के साथ कठिनाई, यह है कि संस्कृति9संस्कृति का संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों के प्रति बहुत संवेदनशील है । मध्यम घटकों, या यहां तक कि संस्कृति पोत के भौतिक हैंडलिंग में कोई परिवर्तन,9कोशिकाओं से एक प्रतिक्रिया बटोरने के लिए पर्याप्त है । इन मुद्दों को संबोधित करने के लिए, हम एक इन विट्रो मानव भ्रूण मस्तिष्क व्युत्पंन तंत्रिका स्टेम सेल (hNSCs) संस्कृति mechanistically भ्रूण तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं पर ZIKV के प्रभाव से पूछताछ के लिए विकसित की है । हमारे विधि का प्रयोग, hNSCs स्पष्ट phenotypic परिवर्तन10के बिना ८० से अधिक मार्ग के लिए बनाए रखा गया था । इसके अलावा, ऐसे trisomy के रूप में गुणसूत्र परिवर्तन या तो कोई नहीं या ंयूनतम11थे । यह hNSC कल्चर एक नॉन-अनुयाई neurosphere कल्चर के रूप में बढ़ता है । neurospheres का एक लाभ यह है कि क्षेत्रों संस्कृति में एक अद्वितीय पर्यावरण आला है कि अधिक vivo में niches में दो आयामी संस्कृतियों9की तुलना में प्रतिबिंबित करता है बनाएं । इस प्रोटोकॉल का एक और लाभ यह है कि कई प्रकार के सेल hNSC संस्कृति से प्राप्त किया जा सकता है, एक अंवेषक को सक्षम करने के लिए hNSC अस्तित्व और भेदभाव पर दिया चर के प्रभाव का निरीक्षण । इस प्रोटोकॉल के लिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विकास या रोग के बारे में यंत्रवत सवालों के जवाब देख व्यक्तियों के लिए लागू है । निंनलिखित प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक hNSC संस्कृति का विस्तार करने के लिए ZIKV के साथ संक्रमित है, और बाद में भेदभाव की प्रक्रिया पर संक्रमण के प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए hNSCs अंतर । यह भी लंबी अवधि के उपयोग के लिए hNSCs स्टोर करने के लिए तरीके शामिल हैं, और ंयूरॉंस के विभिंन प्रकार में hNSCs अंतर है कि ZIKV प्रेरित घाटे मस्तिष्क कुरूपता के लिए योगदान के आगे की जांच की अनुमति11। हमारा मानना है कि इस प्रोटोकॉल के लिए ब्याज की भी है जैसे किसी भी पर्यावरणीय उत्तेजना के प्रभाव को समझने की मांग जांचकर्ताओं तंत्रिका स्टेम सेल अस्तित्व और भेदभाव पर संक्रमण या विषाक्त पदार्थों के रूप में ।

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Protocol

मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं मूलतः पहली तिमाही में मानव भ्रूण cortexes त्याग से व्युत्पंन थे12। सभी प्रोटोकॉल प्रक्रियाओं टेक्सास चिकित्सा शाखा नैतिकता दिशानिर्देश मानव ऊतक नमूनों के उपयोग के विषय में विश्वविद्यालय का पालन करें, और सेल लाइनों संस्थागत जैव सुरक्षा समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. स्टॉक मीडियम तैयारी और स्टेम सेल रिकवरी

  1. संस्कृति मध्यम स्टॉक (DFHGPS) को तैयार करने के चरणों में reएजेंट के संयोजन द्वारा 1.1.1.-1.1.5.
    1. उच्च ग्लूकोज और एल glutamine (डी) के साथ Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम के २१० मिलीलीटर जोड़ें. यह 4 ˚ सी पर स्टोर ।
    2. एल-glutamine अनुपूरक (च) के साथ हैम के F12 पोषक मिश्रण के ७० मिलीलीटर जोड़ें । यह 4 ˚ सी पर स्टोर ।
    3. 15 मिमी HEPES बफर (एच) के ४.२ मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर यह दुकान ।
    4. 10% D-ग्लूकोज समाधान (G) की ४.२ मिलीलीटर जोड़ें और इसे कमरे के तापमान पर संग्रहीत करें ।
    5. पेनिसिलिन/streptomycin (PS) समाधान के २.८८ मिलीलीटर जोड़ें । Aliquot 3 मिलीलीटर aliquots में स्टॉक समाधान की आवश्यकता होती है और जब तक जरूरत हो aliquots को-20 ° c में संग्रहीत करें ।
      नोट: मध्यम में पेनिसिलिन की अंतिम एकाग्रता १०० यूनिट/एमएल होगा, और streptomycin की एकाग्रता १०० µ g/एमएल होगा । इस माध्यम को प्रोटोकॉल के शेष के लिए DFHGPS के रूप में संदर्भित किया जाएगा और 1-2 सप्ताह के भीतर उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए । यदि आवश्यक हो, तो DFHGPS को आनुपातिक रूप से स्केल किया जा सकता है ।
  2. दिन पहले कोशिकाओं को बरामद कर रहे हैं, वातानुकूलित माध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ कोट एक T75 कुप्पी, hNSC सेल लाइन के पिछले संस्कृतियों से प्राप्त की है, और ८.५% कार्बन डाइऑक्साइड (2) रात भर के साथ एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में छोड़ दें ।
    नोट: यदि वर्तमान में संवर्धन hNSCs, मध्यम सहेजें कि कक्षों में एक मध्यम परिवर्तन के दौरान बढ़ रहा है । यह वातानुकूलित माध्यम है क्योंकि यह "वातानुकूलित" कोशिकाओं द्वारा किया गया है । वातानुकूलित मध्यम एक पेंच टोपी ट्यूब में बचाया और लगभग 7 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है । hNSCs प्राप्त करने के लिए संबंधित लेखक से संपर्क करें । वातानुकूलित मध्यम पसंद है, लेकिन बिल्कुल आवश्यक नहीं है, खासकर जब पहली hNSCs की संस्कृति शुरू ।
  3. वसूली के दिन, एक ५० मिलीलीटर पेंच कैप ट्यूब में DFHGPS के गर्म 20 मिलीलीटर में एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान के लिए ंयूनतम 10 मिनट के लिए और पानी के स्नान में रखने के लिए तैयार जब तक का उपयोग करें ।
  4. एक अलग से 15 मिलीलीटर पेंच कैप ट्यूब में, DFHGPS के 10 मिलीलीटर गर्म एक ३७ ° c पानी में स्नान के लिए ंयूनतम 10 मिनट और यह पानी स्नान में रखने के लिए तैयार जब तक १.१३ कदम में उपयोग करने के लिए ।
  5. बर्फ के एक कंटेनर और सभी मध्यम घटकों (तालिका 1) पुनर्प्राप्त करें । बर्फ पर सभी मध्यम अवयव गल जाएं और मध्यम परिवर्तन की तैयारी करते हुए उन्हें बर्फ पर छोड़ दें ।
  6. वातानुकूलित मध्यम स्टॉक के 5 मिलीलीटर प्राप्त करें (4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) और १.१४ कदम में उपयोग करने के लिए तैयार जब तक एक ३७ ° c पानी स्नान में रखना । यदि कोई वातानुकूलित मध्यम या वर्तमान मानव भ्रूण तंत्रिका स्टेम सेल संस्कृति है कदम १.२ के बाद ध्यान दें देखें ।
  7. १.३ कदम से ५० मिलीलीटर पेंच कैप ट्यूब पुनः प्राप्त करें और यह सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में जगह है । एक नया 15 मिलीलीटर पेंच कैप ट्यूब में DFHGPS के 10 मिलीलीटर स्थानांतरण, और फिर ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में वापस DFHGPS मध्यम के शेष 10 मिलीलीटर युक्त ५० मिलीलीटर ट्यूब जगह है ।
  8. तरल नाइट्रोजन में संग्रहित hNSCs की एक क्रायो-शीशी प्राप्त करें । देखो नोट १.२ कदम के बाद अगर कोई वर्तमान मानव भ्रूण तंत्रिका स्टेम सेल संस्कृति है ।
    नोट: मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को मूल रूप से त्याग मानव भ्रूण12 दिमाग से व्युत्पंन और आनुवंशिक संशोधनों के बिना10संस्कृति में बनाए रखा गया । 5 × 106 कोशिकाओं गल और एक T75 कुप्पी पर चढ़ाया जाना चाहिए । प्रत्येक क्रायो-शीशी 5 × 106 कोशिकाओं को शामिल करना चाहिए; इसलिए कुप्पी प्रति एक शीशी की जरूरत होती है ।
  9. ३७ ° c पानी स्नान में कोशिकाओं की एक शीशी गल हर 10 लगभग 1 मिनट के लिए या जब तक बर्फ पिघला है और शीशी की सामग्री को पूरी तरह से तरल है । संभावित संदूषण से बचने के लिए पूरी शीशी पानी के नीचे न जलमग्न करें ।
  10. बीएससी में, एक P1000 माइक्रो पिपेट का उपयोग करने के लिए गल कोशिका समाधान महाप्राण और यह ड्रॉप वार जोड़ने के लिए 15 मिलीलीटर ट्यूब से कदम १.७, DFHGPS के 10 मिलीलीटर युक्त. पिघला हुआ सेल समाधान ड्रॉप वार जोड़ने के लिए, सवार पर धीरे से नीचे दबाएँ ताकि केवल एक बूंद या दो एक ही बार में जारी किया गया है. इस बीच, 15 मिलीलीटर ट्यूब एक त्वरित मिश्रण की अनुमति के लिए घूमता है ।
  11. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए २०० x g पर सेल सस्पेंशन केंद्रापसारक । supernatant त्यागें, सेल गोली बनाए रखने के लिए सुनिश्चित कर रही है ।
  12. चरण १.११ के दौरान, ५० मिलीलीटर ट्यूब से युक्त शेष 10 एमएल चरण १.७ से प्राप्त । इस केंद्रापसारक के बाद, 10 मिलीलीटर DFHGPS में सेल गोली reसस्पेंड और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए २०० x g पर फिर से केंद्रापसारक ।
  13. अंतिम स्पिन के दौरान, बीएससी में चरण १.४ (तालिका 1) से DFHGPS मध्यम के 10 मिलीलीटर में वृद्धि कारकों को जोड़ने के लिए तालिका 1 का पालन करके नए विकास माध्यम तैयार करें । उपयोग करने के लिए तैयार होने तक बीएससी में विकास कारकों से युक्त नए माध्यम को छोड़ दें ।
  14. १.२ कदम से T75 कुप्पी निकालते हैं और आकांक्षा द्वारा वातानुकूलित मध्यम कोटिंग त्यागें । फिर १.६ कदम से वातानुकूलित मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ें । एक सीरम पिपेट का उपयोग कर कुप्पी के लिए । कुप्पी के नीचे खरोंच करने के लिए नहीं सावधान रहें ।
  15. केंद्रापसारक से कोशिकाओं की ट्यूब पुनः प्राप्त करने और इसे aspirating द्वारा supernatant त्याग, सेल गोली बरकरार छोड़ ।
  16. एक 5 मिलीलीटर सीरम पिपेट और pipetting ऊपर और नीचे कई बार का उपयोग करके १.१३ कदम से नए मीडिया के 10 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड । १.१४ कदम से लेपित T75 कुप्पी के निलंबन जोड़ें । शेष 5 मिलीलीटर का उपयोग करने के लिए ट्यूब है कि सेल गोली शामिल कुल्ला, और फिर कुप्पी के लिए उन 5 मिलीलीटर जोड़ने के रूप में अच्छी तरह से ।
  17. रॉक T75 कुप्पी आगे और पीछे 3 बार सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को समान रूप से कुप्पी भर में वितरित कर रहे हैं । सुनिश्चित करें कि कुप्पी की टोपी हवा के प्रवाह की अनुमति के लिए ढीला है । एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण, नोट्स बनाने, और यदि संभव हो तो छवियों को ले.
    नोट: कोशिकाओं को पारदर्शी और गोलाकार दिखना चाहिए । एक नोट बनाओ अगर वहां कोशिकाओं है कि देखो अंधेरे, अपारदर्शी, या विषम बोर्डर है के रूप में इस सेल मौत का संकेत कर सकते हैं । इसके अलावा किसी भी कवक या जीवाणु संक्रमण के लिए देखो, जैसे मीडिया के रंग में पीला होता जा रहा है ।
  18. ८.५% CO2के साथ एक ३७ ° c मशीन में कक्षों की कुप्पी रखें ।
    नोट: 7.1-7.4 की श्रेणी में इस सीरम मुक्त संस्कृति मीडिया का पीएच बनाए रखने के लिए ५.०% CO2 के बजाय ८.५% का उपयोग करें ।

२. hNSC मध्यम बदल

नोट: हर 3-4 दिन मध्यम बदलें ।

  1. बीएससी चालू करें और ७०% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से साफ । एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण ।
    नोट: कक्षों और क्षेत्र आकारों की दिखावट पर नोट्स बनाएं । वसूली या यात्रा के बाद तीन दिन, कोशिकाओं को एक साथ क्लस्टर और गैर अनुयाई neurospheres फार्म शुरू होगा ।
    चेतावनी: यदि कोशिकाएं कुप्पी के नीचे का पालन करती हैं, तो संस्कृति को त्यागने की आवश्यकता होगी क्योंकि कोशिका पालन में समय से पहले विभेद बढ़ेगा और कोशिकाएं स्टेम अवस्था बनाए रखने में असमर्थ होंगी । अगर कुप्पी में बहुत अधिक कोशिकाएं हैं, तो कोशिकाएं बड़े क्षेत्रों (व्यास में 2 मिमी से अधिक) का रूप धारण कर सकती हैं, जिस स्थिति में, क्षेत्र के केंद्र में कोशिकाएं मध्यम में विकास कारकों तक पहुंच की कमी के कारण अंतर करना शुरू कर देगी । यदि व्यास में 1 मिमी से बड़े क्षेत्रों में मनाया जाता है, कोशिकाओं को पारित किया जा सकता है (कदम 3.1-3.22) ।
  2. १.४ और १.५ चरणों का पालन करें, और ताजा मध्यम के 10 मिलीलीटर तैयार (चरण १.१३ देखें) ।
  3. पक्ष को कुप्पी झुकाव, क्षेत्रों कुप्पी के नीचे करने के लिए सिंक करने के लिए अनुमति देता है ।
  4. एक 5 मिलीलीटर सीरम पिपेट का उपयोग कर परित मध्यम के ऊपर से वातानुकूलित मीडिया के 5 मिलीलीटर निकालें, किसी भी neurospheres महाप्राण करने के लिए नहीं ध्यान ले । एक साफ 15 मिलीलीटर ट्यूब में वातानुकूलित मीडिया के 5 मिलीलीटर प्लेस ।
  5. कुप्पी से वातानुकूलित मीडिया के एक अतिरिक्त 5 मिलीलीटर निकालें, फिर ध्यान से क्षेत्रों से परहेज, और एक ही 15mL ट्यूब में 5 मिलीलीटर जगह है ।
  6. कुप्पी में वातानुकूलित मीडिया और कोशिकाओं के शेष 5 मिलीलीटर के लिए २.२ कदम से नए मीडिया के 10 मिलीलीटर जोड़ें । फ्लैट नीचे कुप्पी सेट और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण ।
  7. यदि यह प्रतीत होता है कोशिकाओं वातानुकूलित माध्यम के संग्रह के दौरान aspirated किया गया है, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए १०० x g पर वातानुकूलित माध्यम स्पिन । वातानुकूलित माध्यम के 1 मिलीलीटर में नीचे जमा होने वाले किसी भी कक्ष को पुनः निलंबित करें, और फिर उंहें संस्कृति कुप्पी में जोड़ें ।
  8. एक 15 मिलीलीटर पेंच कैप ट्यूब में कदम 2.5/2.6 पर 4 ˚ C से अप्रयुक्त वातानुकूलित मीडिया के 10 मिलीलीटर स्टोर ।
  9. दोहराएं चरण 1.17/

3. hNSC गद्यांश

नोट: hNSCs हर 9-11 दिन बीतने होना चाहिए अगर कोशिकाओं को सामांय रूप से बढ़ती है, के रूप में जनसंख्या दोहरीकरण समय लगभग 3 दिन13है ।

  1. यदि एक नई कुप्पी में एनएससी का विस्तार, सुनिश्चित करें कि सभी नए कुप्पी कदम १.२ में के रूप में लेपित हैं ।
  2. २.१ चरण में के रूप में बीएससी साफ़ करें, और चरण १.४ और १.५ आचरण ।
  3. माध्यम के रूप में चरण १.१३ में तैयार करें । प्रत्येक T75 कुप्पी मध्यम के 10 मिलीलीटर की आवश्यकता होती है । कई T75 कुप्पी के लिए, बोतल की संख्या से मीडिया के 10 मिलीलीटर गुणा ।
  4. या तो 1 या 3 मिलीलीटर Dulbecco के फॉस्फेट-बफर खारा (dPBS) और ग्लूकोज और जगह एक ३७ ° c पानी स्नान में 10 मिनट के लिए गर्म करने के लिए तैयार (trypsin समाधान के लिए) के अनुसार तालिका 2में वॉल्यूम. इस समय trypsin या DNase न जोड़ें । DNase यांत्रिक या रासायनिक कोशिका पृथक्करण के कारण मृत कोशिकाओं से जारी किसी भी डीएनए को तोड़ने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
    नोट: के लिए एक T75 कुप्पी विकास के 9-10 दिनों के बाद पारित वहां लगभग 30 × 106 कोशिकाओं होगा, अगर 5 × 106 मूल कुप्पी पर वरीयता प्राप्त थे । आमतौर पर, dPBS समाधान के 1 मिलीलीटर 10 × 106 कोशिकाओं के लिए प्रयोग किया जाता है । इसलिए, dPBS समाधान के 3 मिलीलीटर एक T75 कुप्पी 9-10 दिनों के बाद पारित करने के लिए की जरूरत है ।
  5. जगह साफ छोटे वजन नाव और हूड में hemocytometer । ७०% इथेनॉल के साथ साफ है और लगभग 5 मिनट के लिए हुड में शुष्क हवा की अनुमति ।
    नोट: बकरों की नाव का इस्तेमाल स्टेप्स 3.17.1 में किया जाएगा ।
  6. कोशिकाओं है कि मशीन से पारित किया जाएगा और बीएससी में लाने की कुप्पी निकालते हैं । झुकाव कुप्पी धीरे कोशिकाओं को परित मीडिया के नीचे करने के लिए सिंक करने की अनुमति । कुप्पी में मीडिया की करीब 15 मिलीलीटर है ।
  7. 5 मिलीलीटर भागों (यानी 5 मिलीलीटर + 5 एमएल) में मीडिया के बारे में 10 मिलीलीटर निकालें । एक साफ 15 मिलीलीटर में मीडिया के इस 10 मिलीलीटर प्लेस "" वातानुकूलित माध्यम के लिए मुख्यमंत्री "लेबल ट्यूब । ध्यान रखें कि कुप्पी में मीडिया के शेष 5 मिलीलीटर में बसे कक्षों में से किसी को भी महाप्राण न करें; इन कोशिकाओं और मीडिया के 5 मिलीलीटर कदम ३.८ के अधीन किया जाएगा ।
    1. "CM" ट्यूब से वातानुकूलित मीडिया के 3 मिलीलीटर ले लो (३.७ कदम से) और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में जगह "trypsin अवरोधक समाधान" लेबल । यह चरण ३.१२ में उपयोग किया जाएगा । 3 मिलीलीटर को हटाने के बाद, वहां वातानुकूलित मीडिया के 7 मिलीलीटर "सेमी" ट्यूब में छोड़ दिया है । ३.९ कदम जब तक एक तरफ "मुख्यमंत्री" ट्यूब सेट करें ।
  8. मीडिया और T75 कुप्पी में शेष कोशिकाओं के 5 मिलीलीटर निकालें, और एक साफ 15 मिलीलीटर ट्यूब में जगह "कोशिकाओं" लेबल ।
  9. (कदम 3.7.1 से) वातानुकूलित मीडिया के 7 मिलीलीटर युक्त "मुख्यमंत्री" ट्यूब ले लो और T75 कुप्पी के नीचे दो बार वातानुकूलित मीडिया के ३.५ मिलीलीटर भागों के साथ, एक 5 मिलीलीटर सीरम पिपेट का उपयोग कर कुल्ला । प्रत्येक कुल्ला के बाद, "कोशिकाओं" ट्यूब में ३.५ मिलीलीटर भागों जगह है । इस चरण का उद्देश्य सभी neurospheres (कोशिकाओं) को T75 कुप्पी से निकालना है.
  10. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए १०० x g पर "कोशिकाओं" ट्यूब केंद्रापसारक । जबकि कोशिकाओं कताई कर रहे हैं, ३७ ° c पानी स्नान से dPBS/ग्लूकोज समाधान प्राप्त करने और तालिका 2के अनुसार trypsin और DNase की उचित मात्रा में जोड़ें ।
  11. "कोशिकाओं" ट्यूब कताई बंद कर दिया है के बाद, सभी वातानुकूलित मध्यम supernatant निकालें और "CM" ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
  12. कदम 3.7.1 से "trypsin अवरोधक समाधान" लेबल ट्यूब ले लो । और तालिका 3में इंगित trypsin अवरोधक की मात्रा जोड़ें । trypsin समाधान के लिए उपयोग किया गया के रूप में trypsin अवरोधक समाधान का एक ही वॉल्यूम का उपयोग करें ।
  13. प्लेस trypsin अवरोधक समाधान ३७ ° c पानी स्नान में जब तक जरूरत है ।
  14. 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेल गोली करने के लिए trypsin समाधान जोड़ें और ऊपर और नीचे लगभग 5-10 बार एक 5 मिलीलीटर पिपेट के साथ पिपेट । ट्यूब की टोपी बंद करो और 5 मिनट के लिए एक ३७ ° c पानी के स्नान में मशीन । 5 मिनट के बाद, कोशिकाओं को पुनः प्राप्त और ऊपर और नीचे 5-10 बार पिपेट । फिर एक अतिरिक्त 10-15 मिनट के लिए ३७ ° c जल स्नान में मशीन ।
  15. पिछले 5 मिनट में, बीएससी के लिए trypsin अवरोधक समाधान ले जाएँ.
  16. चरण २.१४ पूर्ण होने के बाद कक्षों को पुनर्प्राप्त करें और क्षेत्रों को पूरी तरह असंबद्ध (20-30 बार) होने तक कक्षों को ऊपर और नीचे पिपेट. तो तुरंत trypsin अवरोधक समाधान जोड़ने और ऊपर और नीचे 10 बार पिपेट । असंबद्ध कोशिकाओं और trypsin अवरोधक के इस समाधान के लिए "सेल निलंबन" के रूप में भेजा जाएगा ।
  17. निंन चरणों के द्वारा कक्ष निलंबन में कक्षों की संख्या की गणना करें ।
    1. पिपेट 15 µ एल के Trypan नीले पूर्व मिश्रण (5 µ एल के ०.४% Trypan नीले और µ के 10 dPBS एल के) एक छोटे से वजन नाव पर, और फिर सेल निलंबन के 5 µ एल जोड़ें । पिपेट ऊपर और नीचे 3-5 बार मिश्रण करने के लिए । उसके बाद, पिपेट के 10 µ l को Trypan नीला/सेल निलंबन के दोनों ओर एक hemocytometer एक गिलास coverslip के साथ कवर किया ।
    2. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें और चार कोने ग्रिड में से प्रत्येक में कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना । इन संख्याओं को एक साथ जोड़ें ।
  18. दूसरे पक्ष के लिए गिनती दोहराने और दोनों पक्षों को एक साथ औसत ।
  19. प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं की कुल संख्या देने के लिए १०,००० द्वारा इस संख्या गुणा । सेल निलंबन में कक्षों की कुल संख्या की गणना करने के लिए मिलीलीटर की कुल संख्या के आधार पर इस संख्या को गुणा करें । गणना T75 कुप्पी प्रति ५,०००,००० कोशिकाओं के बीज के लिए सेल निलंबन की कितनी मात्रा की जरूरत होगी ।
    नोट: आमतौर पर, 9-10 दिनों के बाद, एक T75 25-30 × 106 कोशिकाओं होगा । इसलिए, यदि सभी कोशिकाओं को नई कुप्पी में passaging, तो कुल 5-6 कुप्पी की जरूरत होती है ।
  20. प्रत्येक T75 कुप्पी के लिए चरण ३.१९ में परिकलित सेल के निलंबन की मात्रा की कुप्पी प्रति 5 × 106कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए जोड़ें । यदि वॉल्यूम 5 ml से कम है, तो कुल 5 मिलीलीटर तक बनाने के लिए अतिरिक्त शर्त मध्यम जोड़ें । फिर नई DFHGFPS मीडिया के 10 मिलीलीटर वृद्धि कारकों से युक्त (तालिका 1) कुप्पी के लिए जोड़ें ।
  21. दोहराएँ चरण १.१७ और १.१८ और यह सुनिश्चित कुप्पी कोशिकाओं के प्रकार के साथ लेबल किया गया है, तारीखों, कुप्पी में कोशिकाओं की संख्या, और पारित होने की संख्या (यह सेल के पारित कर दिया गया है बार की संख्या है). उसके बाद चरण 4-9 के लिए ले जाएँ ।
  22. यदि आवश्यक हो, एक T75 कुप्पी में बीज अतिरिक्त कोशिकाओं को घनत्व पर 30 × रात भर कुप्पी प्रति 106कोशिकाओं, और अगले दिन फ्रीज चरण 4 के अनुसार ।

4. hNSC जमने और भंडारण

  1. passaging के बाद दिन, ठंड के लिए कोशिकाओं से युक्त मशीन से कुप्पी पुनः प्राप्त (३.१९ कदम और ३.२२ से) । कुप्पी झुकाव और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में कुप्पी और जगह से सभी मध्यम और कोशिकाओं को हटा दें । तो 5 मिनट के लिए २१६ x g पर ट्यूब केंद्रापसारक ।
  2. केंद्रापसारक प्रक्रिया के दौरान, ठंड मध्यम (तालिका 4) तैयार करें । हर 5 × 106 कोशिकाओं के लिए ठंड मध्यम के 1 मिलीलीटर तैयार करते हैं । कक्षों की संख्या चरण ३.१९ में निर्धारित किया गया था जब प्रत्येक कुप्पी में रखने के लिए कितने कक्षों का निर्धारण । यह संख्या रातोंरात नहीं बदली होगी ।
  3. सेल नाम, गद्यांश नंबर, सेल नंबर, प्रथमाक्षर और दिनांक के लेबल के साथ क्रायो-संरक्षित शीशियों को तैयार करें । केंद्रापसारक के बाद, आकांक्षा द्वारा supernatant निकालें और फिर से ठंड के माध्यम में सेल गोली निलंबित इतना है कि 5 × 106 कोशिकाओं/ एक 5 मिलीलीटर पिपेट का प्रयोग, aliquot 1 मिलीलीटर प्रति शीशी और सील कसकर (5 × 106 प्रति शीशी कोशिकाओं) ।
  4. शीशियों में एक क्रायो-isopropanol के २५० मिलीलीटर के साथ कंटेनर की रक्षा (isopropanol के प्रतिस्थापन के प्रति 5 बार की अधिकतम उपयोग) । में-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर रातोंरात स्टोर, और फिर एक तरल नाइट्रोजन टैंक भंडारण प्रणाली को हस्तांतरण ।

5. मान्यता के लिए चढ़ाना अनुयाई hNSC

  1. passaging से पहले दिन (3.1 कदम-3.22), २.२ चरण में के रूप में बीएससी साफ है, और एक 24 अच्छी तरह से थाली और बाँझ गिलास 12 मिमी coverslips प्राप्त करते हैं ।
  2. संदंश का प्रयोग, प्लेट के प्रत्येक कुआं के नीचे एक एकल coverslip रखें ।
  3. कोट कवर युक्त कुओं ०.०१% पाली के साथ फिसल जाता है-डी-lysine (PDL) बाँझ पानी में और 1 ज के लिए ३७ ˚ सी में मशीन । एक 24 अच्छी तरह से प्लेट के लिए, PDL के २५० μL का उपयोग करें ।
  4. कुओं से PDL निकालें, और फिर कोट के साथ 1 µ g/cm2 laminin/dPBS (२५० μL प्रति अच्छी तरह से) । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर थाली मशीन । यदि अगले दिन की जरूरत नहीं है, प्लेट के किनारों के आसपास parafilm लपेटकर parafilm के साथ प्लेट सील और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
    नोट: laminin के साथ लेपित प्लेटों को 2 सप्ताह के लिए संग्रहीत किया जा सकता है अगर parafilm के साथ बंद के रूप में लंबे समय के रूप में कवर फिसल सूखी नहीं है ।
  5. चरण 3.1-3.22 में वर्णित के रूप में बीतने वाले कक्ष, और फिर लेपित coverslips के साथ 24-well प्लेट में बीज के लिए कक्षों की संख्या निर्धारित करें ।
  6. आकांक्षा के माध्यम से कुओं से किसी भी अतिरिक्त laminin समाधान निकालें, और dPBS के ०.५ मिलीलीटर के साथ एक बार कुल्ला । इसके बाद बीज कोशिकाओं को कुएं में 0.6-1 x 105 कोशिकाओं के घनत्व पर अच्छी तरह से प्रति सेमी2 । चरणों के अनुसार किसी भी शेष कोशिकाओं का प्रयोग करें-3.21 ।
  7. 24 के दौरान Atvarious बार अच्छी तरह से प्लेट संस्कृति, ठीक है और विभिंन स्टेम सेल मार्करों के लिए 9 कदम निंनलिखित के लिए कोशिकाओं दाग ।

6. गाबा और ग्लूटामेट न्यूरॉन्स प्राप्त करने के लिए भड़काना

  1. 3.1-3.22 में वर्णित के रूप में कक्ष बीतने, और फिर ५.६ चरण में के रूप में एक 24-well प्लेट में बीज के लिए कक्षों की संख्या निर्धारित करें ।
  2. भड़काने के पहले दिन, कवर फिसल जाता है और कोट प्लेट तैयार के रूप में कदम 5.1-5.4 में वर्णित है ।
  3. दिन भड़काने पर, 2-3 दिन की कोशिकाओं युक्त कुप्पी निकालते हैं । एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में प्लेस और 5 मिनट के लिए १०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं गोली ।
  4. तालिका 5के अनुसार एपिडर्मल विकास कारक/ल्यूकेमिया निरोधात्मक फैक्टर/laminin (मनट) भड़काना मध्यम तैयार करें ।
  5. एक मनट के साथ कोशिकाओं को पुनर्निलंबित ।
  6. बीज एक 24-well प्लेट (५.६ कदम का पालन करें) में कोशिकाओं को निलंबित कर दिया ।

7. मोटर न्यूरॉन्स प्राप्त करने के लिए भड़काना

  1. चरण 6.1-6.4 का पालन करें ।
  2. तालिका 6के अनुसार मूल fibroblast growth फ़ैक्टर/हेपरिन/Laminin (FHL) भड़काने वाले मध्यम को तैयार करें ।
  3. चरण ५.६ का पालन करें ।

8. Zika वायरस का संक्रमण

नोट: ZIKV तापमान के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है, इसलिए यह आवश्यक है कि ZIKV स्टॉक-८० डिग्री सेल्सियस पर जमा हो और फ्रीज/ बर्फ पर aliquots काम करते रहो ।

  1. कदम 3.1-3.22 में वर्णित के रूप में पारित कोशिकाओं । कुल 3-4 लाख कोशिकाओं को एक 24 अच्छी तरह से थाली बीज की जरूरत है, इसलिए जब passaging, एक कुप्पी में संक्रमण और बोने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या डाल जब passaging ।
  2. अगर धुंधला करने के लिए 24-वेल प्लेट में कोशिकाएं सीडिंग करें तो coverslips और प्लेट को स्टेप 5.1-5.4 के हिसाब से तैयार कर लें.
  3. passaging के बाद, एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में कदम ८.२ से सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर प्लेस, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर २०० x g पर केंद्रापसारक । फिर आकांक्षा द्वारा supernatant को हटा दें ।
  4. ZIKV शेयर में ८.३ कदम से गोली फिर से स्थगित 1 से 10 के संक्रमण (मुि) की बहुलता प्राप्त करने के लिए । ZIKV सॉल्यूशन का वॉल्यूम ०.५ mL से ज्यादा नहीं होना चाहिए । नकली उपचार (नियंत्रण कोशिकाओं) के लिए, एक ही मात्रा और ZIKV स्टॉक में इस्तेमाल किया माध्यम के प्रकार में कोशिकाओं reसस्पेंड ।
    नोट: ZIKV स्टॉक तैयारी और संक्रमण के एक पिछले प्रकाशन11में विस्तृत रहे हैं । मध्यम के साथ मॉक संक्रमण भी किए जाते हैं ।
  5. ३७ ° c पर सेल/ZIKV मिश्रण के ऊपर मशीन 1 एच के लिए ट्यूब उलटा 2-3 बार, और फिर कमरे के तापमान पर २१६ x जी में 5 मिनट के लिए मिश्रण केंद्रापसारक एक सेल गोली प्राप्त करते हैं । dPBS में गोली reसस्पेंड और कमरे के तापमान पर २१६ x g पर 5 मिनट के लिए फिर से केंद्रापसारक ।
  6. आकांक्षा द्वारा supernatant निकालें, उचित माध्यम के साथ कोशिकाओं को पुनः निलंबित, और प्रयोग के लिए आवश्यक कुप्पी या थाली में संक्रमित कोशिकाओं को लोड । यदि एक 24 में कोशिकाओं बोने अच्छी तरह से थाली उचित माध्यम से 12 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड, और फिर एक अच्छी तरह से निलंबन के ५०० μL जोड़ें ।
    नोट: इस बिंदु पर या तो वृद्धि मीडिया में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए स्टेम सेल पर ZIKV के प्रभाव का पालन, या कदम 6 या 7 के लिए जाने के लिए भेदभाव की प्रक्रिया पर ZIKV के प्रभाव का अध्ययन ।

9. धुंधला प्रक्रिया

  1. कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, मध्यम निकालें, एक बार कुल्ला के साथ ०.५ मिलीलीटर (24-अच्छी तरह से प्लेट) आइस कोल्ड फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) की ।
  2. पंजाबियों को हटाएं, और 4% paraformaldehyde के ०.५ मिलीलीटर के साथ कवर कोशिकाओं और 20-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें ।
  3. paraformaldehyde और कुल्ला कोशिकाओं तीन बार पंजाब के ०.५ मिलीलीटर के साथ निकालें, तीसरे पंजाबियों कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए कुल्ला छोड़ ।
  4. इस बिंदु पर या तो रात भर में पंजाबियों को छोड़ दो और 4 ˚ सी, या 10 मिनट कुल्ला के बाद धुंधला शुरू में थाली की दुकान ।
  5. 10 मिनट के बाद, पंजाबियों कुल्ला, 5% सामांय बकरी सीरम (NGS), ०.३% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA), ०.२५% ट्राइटन एक्स-१०० के साथ एक स्थिर स्थिति में 45-60 मिनट के लिए कोशिकाओं को ब्लॉक Tris-बफर खारा (टीबीएस) । उदाहरण के लिए, अवरुद्ध समाधान का उपयोग करने के 1 मिलीलीटर बनाने के लिए: 10 µ एल के 25% ट्राइटन एक्स-१००, ५० µ एल के १००% NGS, और १०० µ एल के 3% BSA मिश्रित µ के ८४० टीबीएस एल में ।
  6. ब्लॉकिंग चरण के दौरान, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें, जिससे यह सुनिश्चित हो कि सभी रिएजेंट बर्फ पर रखे जाएं । hNSCs मांय करने के लिए, प्रोटीन जैसे Nestin उनके खिलाफ उपयुक्त एंटीबॉडी का उपयोग कर लक्षित किया जा सकता है । ZIKV संक्रमण को मांय करने के लिए, ZIKV कोट प्रोटीन के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग करें11। भेदभाव के लिए, ऐसे वर्ग III β-tubulin के रूप में उपयोग मार्करों के लिए ंयूरॉन आबादी की पहचान करते हुए glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) astrocytes की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्राथमिक एंटीबॉडी की सांद्रता विक्रेता और बहुत पर निर्भर करता है empirically निर्धारित कर रहे हैं । हम सबसे एंटीबॉडी 1:100 से 1:2000 कमजोर पड़ने के लिए इस्तेमाल किया है ।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए १२,००० x g पर प्राथमिक एंटीबॉडी केंद्रापसारक, और फिर एक कमजोर पड़ने बनाने; एंटीबॉडी के 1:1000 कमजोर पड़ने के उदाहरण के लिए, टीबीएस में ०.२५% ट्राइटन एक्स-१०० की ७.२ मिलीलीटर में वांछित एंटीबॉडी के ७.२ µ एल जोड़ें ।
  7. एक 24 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से एंटीबॉडी समाधान के लगभग ३०० µ एल जोड़ें, और कमरे के तापमान पर या 4 ˚ सी में एक स्थिर स्थिति में रातोंरात 2 घंटे के लिए एक स्थिर स्थिति में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं गर्मी ।
  8. मशीन के बाद, एक स्थिर स्थिति में 10 मिनट प्रत्येक के लिए कमरे के तापमान पर तीन बार टीबीएस के ०.५ मिलीलीटर के साथ धो कोशिकाओं ।
  9. १२,००० x g पर माध्यमिक एंटीबॉडी 4 डिग्री सेल्सियस में 2 मिनट के लिए केंद्रापसारक, तो ०.२५% ट्राइटन x-100/टीबीएस समाधान में पतला । एक अच्छी तरह से ३०० µ एल जोड़ने के लिए पर्याप्त एंटीबॉडी समाधान बनाओ । यहां, फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी 1:500 (चित्रा 3) पतला ।
  10. अंतिम टीबीएस धोने के बाद, एक अच्छी तरह से माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के ३०० µ एल जोड़ें और एक स्थिर स्थिति में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अंधेरे में गर्मी । पर इस बिंदु से, सभी कदम एक अंधेरे कमरे में जगह ले जाना चाहिए ।
  11. एक स्थिर स्थिति में 10 मिनट प्रत्येक के लिए टीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धो लें ।
  12. पिछले 10 मिनट धोने के दौरान, टीबीएस में अनुशंसित एकाग्रता के लिए परमाणु मार्कर DAPI परमाणु दाग पतला (आमतौर पर 1:1000-1:5000) । एक अच्छी तरह से ३०० µ एल जोड़ने के लिए पर्याप्त समाधान बनाओ ।
  13. अंतिम धोने के बाद, एक अच्छी तरह से DAPI समाधान के ३०० µ एल जोड़ें और एक स्थिर स्थिति में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए गर्मी । फिर टीबीएस के ०.५ मिलीलीटर के साथ एक बार धो लें ।
  14. प्रतिदीप्ति के लिए एक विरोधी क्षीण बढ़ते माध्यम का उपयोग करें और 1 ड्रॉप (10-15 µ l) प्रति coverslip कि स्लाइड पर रखा जाएगा. सावधानी से coverslips को हटाने के लिए चिमटी का उपयोग 24-well प्लेट कुओं से और स्लाइड पर बढ़ते माध्यम ड्रॉप पर सेल सतह नीचे जगह है ।
  15. स्लाइड पर coverslips रखे जाने के बाद, स्लाइड को समतल स्लाइड-धारक में रखें । स्लाइड लेबल करने के लिए सुनिश्चित करें कि स्लाइड पर कक्षों की पहचान करने के लिए सभी प्रासंगिक जानकारी की आवश्यकता होगी, फिर प्रकाश से सुरक्षित स्लाइड रखने के लिए एल्यूमीनियम पंनी के साथ धारक को कवर करें ।
  16. 4 ˚ सी पर स्लाइड्स को स्टोर करें और बढ़ते मध् यम को रातोंरात जमना की अनुमति दें । अगले दिन, एक epifluorescent माइक्रोस्कोप के साथ यूवी-2E/सी फ़िल्टर (340-380 एनएम), GFP HYQ बीपी फ़िल्टर (450-490 एनएम), या Y-2E/सी टेक्सास लाल फ़िल्टर (540-580 एनएम), 20X आवर्धन का उपयोग कर स्लाइड का निरीक्षण करें ।

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Representative Results

उनके प्रफलन अवस्था में कल्चरल hNSCs नॉन-अनुयाई neurospheres (figure 1) के रूप में विकसित होंगे । तुरंत hNSC बीतने के बाद, वहां कई व्यक्तिगत कोशिकाओं है, जो कुल होगा और अगले कुछ दिनों में क्षेत्रों के रूप में शुरू होगा (आंकड़ा 1a और 1b) । स्वस्थ क्षेत्रों में लगभग 1-2 मिमी व्यास 9-10 दिन एक मार्ग (चित्रा 1C) के बाद होना चाहिए । 2 मिमी से बड़ा हो जाना क्षेत्रों एक अंधेरे केंद्र का विकास होगा और मध्यम में वृद्धि कारकों क्षेत्र के केंद्र में कोशिकाओं तक पहुँचने में सक्षम नहीं होगा, अवांछित भेदभाव में जिसके परिणामस्वरूप. स्वस्थ क्षेत्रों पारदर्शी दिखाई देगा और क्षेत्र (चित्रा 1C) के किनारों के आसपास छद्म cilia प्रदर्शित करेगा ।

दाग लगाने के प्रयोजनों के लिए एक अनुयाई सतह पर neurospheres चढ़ाना अनुयाई क्षेत्रों (चित्र 2a) की वृद्धि में परिणाम होगा । इन क्षेत्रों संस्कृति पोत की सतह को छूने और कुछ अनुमानों पोत की सतह पर बाहर खींच, जबकि एक केंद्रीय क्षेत्र (चित्रा 2aबनाए रखने होगा) । भड़काना और कोशिकाओं को अलग कोशिकाओं एक सेल संस्कृति थाली के नीचे एक कवर पर्ची का पालन करने के लिए की आवश्यकता होती है, जैसे कि एक 24 अच्छी तरह से थाली । उचित कण्ठ कदम और विभेद माध्यम के अलावा के बाद, कोशिकाओं को संस्कृति पोत की सतह भर में फैल जाएगा और कोशिकाओं के परस्पर monolayer के रूप में विकसित (चित्रा बी#).

या तो hNSC संस्कृति या विभेदित कोशिकाओं के phenotype की वैधता की पुष्टि करने के लिए, फ्लोरोसेंट immunohistochemistry इस्तेमाल किया जा सकता है । Nestin एक मध्यवर्ती आमतौर पर एनएससी में व्यक्त रेशा है और hNSC संस्कृति (चित्रा 3) सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अंतर के बाद न्यूरॉन्स की उपस्थिति सत्यापित करने के लिए, वर्ग III β-tubulin आम तौर पर (चित्र3) ंयूरॉंस लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि भड़काना कदम के लिए एक अंतर निंनलिखित न्यूरॉन्स के एक उच्च प्रतिशत प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है, वहां अभी भी संस्कृति में astrocytes किया जाएगा । Glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) astrocytes लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है क्रम में विभेदित कोशिकाओं के जो प्रतिशत astrocytes या ंयूरॉंस बन गया ।

हमने पाया है कि एनएससी के K048 लाइन दोनों अफ्रीकी और ZIKV के एक विशिष्ट ZIKV एंटीबॉडी के साथ धुंधला immunofluorescent द्वारा पता लगाया की एशियाई उपभेदों से संक्रमित था । प्रतिनिधि छवियां आरेख 4में दिखाई जाती हैं । नकली संक्रमण hNSC आकृति विज्ञान या अस्तित्व (चित्र 4a, 4c) में परिवर्तन नहीं लाना था । ZIKV एक संक्रमित कोशिका के परिधीय क्षेत्र में एक दिन में एक 1 घंटे के संक्रमण के बाद रहने के लिए जाता है, लेकिन 3 से 7 दिनों में पूरे सेल भरता है (चित्रा 4B, 4d, 4E). ध्यान से, एक ही मुि (०.१), K048 कोशिकाओं में अनुमानित 5% संक्रमण दर के साथ काफी कम है उन से हाल ही में रिपोर्ट ZIKV संक्रमण की दर (अप करने के लिए ८०%) मानव त्वचा में-प्रेरित एनएससी7। इस अध्ययन, ८०% infectivity रिपोर्टिंग, ZIKV के प्रोटोटाइप अफ्रीकी तनाव का इस्तेमाल किया (MR766) कि माउस मस्तिष्क कोशिकाओं में १४० से अधिक मार्ग के दौरान एक neurotropic phenotype अनुकूलित हो सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: hNSC संस्कृति के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों. (A-C) प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों hNSC संस्कृति 1, 4 और 9 दिनों के passaging के बाद 10x आवर्धन पर लिया, क्रमशः । स्केल बार्स: ६० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: अनुयाई संस्कृतियों के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों. (एक) प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र अनुयाई hNSC संस्कृति, चढ़ाना के बाद 7 दिनों के 10x इज़ाफ़ा पर ले लिया छवियां । (ख) प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों अनुयाई विभेदित कोशिकाओं के 10x इज़ाफ़ा निंनलिखित पक्ष भड़काने और 9 भेदभाव के दिनों में लिया । स्केल बार्स: ६० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: hNSCs और विभेदित संस्कृतियों के फ्लोरोसेंट छवियां । (क) अनुयाई hNSCs के 20X इज़ाफ़ा पर लिया प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियों परमाणु मार्कर के साथ सना हुआ, DAPI (नीला), और स्टेम सेल मार्कर Nestin (लाल) । स्केल बार: ६० µm (ख) प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियों को विभेदित कोशिकाओं के 60X इज़ाफ़ा पर लिया तंत्रिका मार्कर βIII-tubulin (हरा), astrocyte निर्माता GFAP (लाल), और परमाणु मार्कर DAPI (नीला) के साथ दाग । स्केल बार्स: 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: मानव भ्रूण मस्तिष्क में ZIKV संक्रमण-व्युत्पंन एनएससी । मानव एनएससी या तो नकली इलाज किया गया (एक और सी), ०.१ के मुि में ZIKV के एक अफ्रीकी वंश तनाव के साथ 1 घंटे के लिए inoculated (बी और डी), या ZIKV के एक एशियाई तनाव के साथ हाल ही में मेक्सिको में २०१६ में मच्छरों से अलग (ई) । Immunofluorescent धुंधला एक से सात दिनों के बाद टीका में एनएससी में ZIKV एंटीबॉडी के लेबल का पता लगाता है (बी में 1 डीपीआई, डी में 7dpi, और ई में 3 डीपीआई) । स्केल बार्स 10 ए-डी में µm, और ई. में 5 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

एक T75 के लिए DFHGPS मीडिया 10 मिलीलीटर
TPPS * १७३ µ l
२०० मिमी एल-Glutamin ५० µ l
10 मिलीग्राम/एमएल इंसुलिन * * 25 µ l
20 µ g/एमएल एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर 10 µ l
20 µ g/एमएल बेसिक fibroblast ग्रोथ फैक्टर 10 µ l
10 µ g/एमएल ल्यूकेमिया अवरोध करनेवाला फैक्टर 10 µ l
5 मिलीग्राम/एमएल हेपरिन 10 µ l
* १०० µ जी/एमएल कैल्सीटोनिन, १०० µ एम putresine, 20 एनएम प्रोजेस्टेरोन, और 30 एनएम सोडियम selenite युक्त मिश्रण ।  मिश्रण केंद्रित शेयरों से बना है, और aliquots-८० डिग्री सेल्सियस और 6 सप्ताह की तैयारी के भीतर इस्तेमाल preferablly पर जमा हो जाती है ।   केंद्रित शेयर 10 मिलीग्राम/एमएल कैल्सीटोनिन, 30 मिमी putrescine, 10 µ एम प्रोजेस्टेरोन और 15 µ एम सोडियम selenite-८० ˚ सी में संग्रहित है ।
* * इंसुलिन ०.०१ N hydroen क्लोराइड, ०.२ µ एम कम प्रोटीन बाध्यकारी फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर में भंग कर दिया है, और 6 सप्ताह के लिए 4 ˚ सी पर संग्रहीत ।

तालिका 1: नए प्रसार माध्यम के लिए वृद्धि कारक ।

dPBS * 1 मिलीलीटरएक 3 एमएलबी
10% ग्लूकोज ६० µ l १८० µ l
२.५% Trypsin 10 µ l 30 µ l
Dnase * * 5 µ l 15 µ l
* Dulbecco के फॉस्फेट-खारा बफर
* * Deoxyribonuclease
१०,०००,००० कक्षों के लिए a
३०,०००,००० कक्षों के लिए b

तालिका 2: trypsin की तैयारी ।

वातानुकूलित मीडिया 1 मिलीलीटरएक 3 एमएलबी
Trypsin अवरोधक 10 µ l 30 µ l
१०,०००,००० कक्षों के लिए a
३०,०००,००० कक्षों के लिए b

तालिका 3: trypsin अवरोधक की तैयारी ।

DFHGPS * ०.७ एमएलए २.१ एमएलबी
FBS * * 20% ०.२ एमएल ०.६ एमएल
DMSO * * * 10% ०.१ एमएल ०.३ एमएल
* DMEM, F12, HEPES, ग्लूकोज, पेनिसिलिन-streptomycin
* * भ्रूण गोजातीय सीरम
Dimethyl sulfoxide
एक शीशी में ५,०००,००० कोशिकाओं के लिए a
तीन शीशियों के लिए ख , ५,०००,००० कोशिकाओं/

तालिका 4: ठंड मध्यम की तैयारी।

DFGHPS * एक अच्छी तरह से एक 24 में अच्छी तरह से थाली के लिए 1 मिलीलीटर
TPPS * * १७.३ µ l
२०० मिमी एल-glutamine 5 µ l
10 मिलीग्राम/ २.५ µ l
20 µ g/एमएल एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर 1 µ l
10 µ जी/एमएल ल्यूकेमिया निरोधात्मक फैक्टर 1 µ l
1 मिलीग्राम/एमएल Laminin 1 µ l
* युक्त DMEM, F12, HEPES, ग्लूकोज, पेनिसिलिन-streptomycin
* * युक्ता १०० µ g/मिलि कैल्सीटोनिन, १०० µ m putresine,
20 एनएम प्रोजेस्टेरोन, और 30 एनएम सोडियम selenite

तालिका 5: मनट भड़काने की तैयारी मध्यम ।

DFGHPS * एक अच्छी तरह से एक 24 में अच्छी तरह से थाली के लिए 1 मिलीलीटर
TPPS * * १७.३ µ l
२०० मिमी एल-glutamine 5 µ l
10 मिलीग्राम/ २.५ µ l
20 µ g/एमएल बेसिक fibroblast ग्रोथ फैक्टर ०.५ µ l
5 मिलीग्राम/एमएल हेपरिन ०.५ µ l
1 मिलीग्राम/एमएल Laminin 1 µ l
* युक्त DMEM, F12, HEPES, ग्लूकोज, पेनिसिलिन-streptomycin
* * युक्ता १०० µ g/मिलि कैल्सीटोनिन, १०० µ m putresine,
20 एनएम प्रोजेस्टेरोन, और 30 एनएम सोडियम selenite

तालिका 6: FHL भड़काना मध्यम की तैयारी ।

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Discussion

संस्कृति और हेरफेर करने की क्षमता hNSCs एक महत्वपूर्ण उपकरण है कि उच्च प्रवाह दवा स्क्रीनिंग10,11,12,14के लिए मानव रोग मॉडलिंग से प्रयोजनों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रदान करता है, 15,16,17. कई सवाल है कि कैसे मानव भ्रूण मस्तिष्क एनएससी या उनकी संतान के रूप में संबोधित किया जा रहे ZIKV संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, चाहे ZIKV के विभिंन उपभेदों समान दक्षता के साथ एनएससी संक्रमित है, और कैसे microcephaly में तंत्रिका विकास के परिणामों के दौरान संक्रमण । हमने इस hNSC कल्चर का इस्तेमाल11,14neuropathology जुड़े Zika वायरस की जांच के लिए किया है । तीन व्यक्तिगत दाताओं से अलग कोशिकाओं के तीन उपभेदों का उपयोग करके, हम भी ZIKV संक्रमण के बाद मनाया स्नायविक घाटे को संवेदनशीलता के लिए व्यक्तिगत मतभेदों की तुलना करने में सक्षम हैं11. इस तकनीक की सीमाओं में से एक hNSC नमूनों को सुलभता और वातानुकूलित माध्यम उचित संस्कृति के लिए आवश्यक है. इस बाधा को दरकिनार, इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त कोशिकाओं के रूप में एक सामग्री हस्तांतरण की व्यवस्था करने के लिए इसी लेखक से संपर्क करें व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं ।

इन विट्रो में अध्ययन hNSCs का उपयोग न केवल बुनियादी स्टेम सेल व्यवहार में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, वे भी एक उत्कृष्ट मंच प्रदान करने के लिए पूर्व नैदानिक अनुसंधान आचरण । हालांकि, संवर्धन hNSCs की तकनीकी चुनौतियों के रूप में उंहें प्रभावी और प्रतिलिपि मॉडल के रूप में प्रयोग में एक बाधा के रूप में सेवा कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल में, हम प्रमुख कदम और तरीके कि संवर्धन तरीकों में परिवर्तनशीलता को कम करने और एक स्वस्थ और स्थिर hNSC स्टेम सेल संस्कृति उपज इस्तेमाल किया जा सकता है रेखांकित किया है । hNSC neurosphere संस्कृति का उपयोग करने की एक खामी यह है कि कोशिकाएं किसी भी और सभी उत्तेजनाओं के प्रति अत्यंत संवेदनशील होती हैं । यहां तक कि ऊपर विस्तृत प्रोटोकॉल के साथ, यह करीब ध्यान देने के लिए महत्वपूर्ण है कितना बोतल या hNSCs के बर्तन संभाल रहे हैं, के रूप में प्रोटोकॉल पर सूक्ष्म रूपांतरों neurosphere व्यवहार में परिवर्तन में परिणाम कर सकते हैं ।

इस तरीके कागज का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा विकास कारकों और विभिंन मीडिया की तैयारी का कॉकटेल है । यदि hNSC संस्कृति का दोहरीकरण समय बहुत कम है, या कई कोशिकाओं संस्कृति पोत को adherie (जब वे गैर अनुयाई होना चाहिए), पहला कदम यह सुनिश्चित करना है कि विकास कारकों का इस्तेमाल किया जा रहा है उचित एकाग्रता और समाप्त नहीं हो रहा है । इस प्रोटोकॉल में सभी विकास कारकों एक बहुत ही कम शैल्फ जीवन एक बार गल (5-6 दिन) है । इसके अतिरिक्त, हम कई कंपनियों से विकास कारकों का इस्तेमाल किया है और गुणवत्ता और संस्कृति को बनाए रखने की जरूरत एकाग्रता में अंतर देखा । इसलिए, हम अत्यधिक सटीक वृद्धि सामग्री तालिकामें विस्तृत कारकों का उपयोग करने की सलाह देते हैं । passaging कदम (कदम 3.1-3.22) भी त्रुटि का एक आम स्रोत है । यदि पृथक्करण प्रक्रिया के बाद कई मृत कोशिकाओं रहे हैं, कोशिकाओं को अलग के लिए ऊपर और नीचे pipetting के समय की संख्या को कम, के रूप में बहुत अधिक शारीरिक पृथक्करण कोशिका मृत्यु में परिणाम कर सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, अगर वहां पृथक्करण कदम निंनलिखित कोशिकाओं के कई समूहों रहे हैं, शक्ति या pipetting के समय की संख्या में वृद्धि ऊपर और नीचे, के रूप में इन समूहों जल्दी बड़े क्षेत्रों है कि संस्कृति में व्यवहार्य नहीं रहेगा बन जाएगा । अगर संस्कृति ठीक से बनाए रखा है, ZIKV के साथ संक्रमण अपेक्षाकृत सरल है ।

जबकि ZIKV संक्रमण इस प्रोटोकॉल में विस्तृत उपचार है, यह अध्ययन की एक विस्तृत सरणी के लिए इस hNSC संस्कृति प्रणाली का उपयोग करने के लिए संभव है । इस मॉडल प्रणाली के लिए दवाओं स्क्रीन इस्तेमाल किया जा सकता है, व्यक्तिगत संवेदनशीलता की जांच, और रोगों और विकास संबंधी विकारों की एक किस्म के अंतर्निहित तंत्र की जांच14। यह प्रणाली भी जीनोमिक अध्ययन के लिए आदर्श है के बाद से संस्कृतिक कोशिकाओं आनुवंशिक रूप से हेरफेर नहीं किया गया है और कोई गुणसूत्र विषमता को थोड़ा दिखाने के लिए, यहां तक कि ८० मार्ग10,11। हमारा मानना है कि इस संस्कृति प्रणाली इन विट्रो में मॉडलिंग के लिए आदर्श है कैसे संक्रमण के रूप में पर्यावरणीय उत्तेजनाओं, ड्रग्स, शराब, विषाक्त पदार्थों, आदि तंत्रिका तंत्र के विकास को प्रभावित कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों के हित की घोषणा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

यह काम जॉन एस डन फाउंडेशन और मानव संक्रमण और प्रतिरक्षा विश्वविद्यालय के टेक्सास चिकित्सा शाखा (P.W.) के लिए संस्थान से धन द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco 11965-092
F12 Gibco 11765-054
Glucose (10%) Sigma G8644
HEPES (1M) Corning/cellgro 25-060-c1
Pen Strep (100x) Gibco 15140-122
Insulin Sigma I4011
L-Glutamine Gibco 25030-081
Transferrin Sigma T2036
Progesterone Sigma P8783
Putrescine Sigma P5780
Sodium selenite Sigma S5261
Heparin Sigma Sigma H3149
basic fibroblast growth factor R&D system 233-FB
epidermal growth factor R&D system 236-EG
leukemia inhibitory factor R&D system 7734-LF
Laminin Invitrogen 23017-015
2.5% trypsin Gibco 15090-046
Trypsin inhibitor Sigma T6522
Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) Sigma P6407-5MG
B-27 supplement Gibco/Invitrogen 17504-044
Fetal bovine serum Gibco 16000-044
Dimethyl sulfoxide Sigma D2650-100ml
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning/cellgro 21-031-CV
Bovine serum albumin Sigma A4378-25G
Normal goat serum Jackson ImmunoResearch Lab 005-000-121
Triton X-100 FisherBiotech BP151-500
Nestin antibody BD Transduction Laboratories 611659 1:200 dilution
Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) Covnce MMS-435p 1:2000 dulution
GFAP antibody Millipore AB5804 1:1000 dilution
DAPI Molecular Probes D1306 1:2000 dilution
ZIKV antibody World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch 1:2000 dilution
Fluoromount G SouthernBiotech 0100-01
CO2 incubator Thermo Forma Model# 3110
Centrifuge Thermo fisher Scientific 75004221
Biological safety cabinet Forma scientific Claas II A/B3 Model# 1284
Freezer (-80 °C) Forma scientific,Inc model# 8516
Microscope(phase contrast image) Hp 2230 workstation Product#NOE25us#ABA
Microscope (epifluorescent image) Nikon Eclipse 80i
Confocal Microscope Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १३२ तंत्रिका स्टेम सेल विभेद प्रसार न्यूरॉन Zika वायरस रोग मॉडलिंग
Immunocytochemical विश्लेषण के लिए प्रसंस्कृत मानव भ्रूण मस्तिष्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के Zika वायरस संक्रमण
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McGrath, E. L., Gao, J., Wu, P. Zika … More

McGrath, E. L., Gao, J., Wu, P. Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis. J. Vis. Exp. (132), e56917, doi:10.3791/56917 (2018).

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