Summary
هذه المادة تفاصيل الأساليب التي يتم استخدامها لتوسيع نطاق الخلايا الجذعية العصبية الدماغ الجنين البشري في الثقافة، فضلا عن كيفية التفريق بينها في مختلف أنواع فرعية الخلايا العصبية وأستروسيتيس، مع تركيز على استخدام الخلايا الجذعية العصبية لدراسة زكى الإصابة بعدوى الفيروس.
Abstract
الخلايا الجذعية العصبية في مخ الجنين البشري نظام نموذج فريد غير معدلة وراثيا لدراسة تأثير المحفزات المختلفة في بيولوجيا الأعصاب التنموية البشرية. بدلاً من استخدام نموذج حيوان أو الخلايا المحورة وراثيا المستحثة pluripotent، الخلايا الجذعية العصبية البشرية توفير نظام فعال في المختبر دراسة آثار المعالجات، المخدرات الشاشة، أو دراسة الفروق الفردية. هنا، نحن نقدم بروتوكولات مفصلة للأساليب المستخدمة لتوسيع نطاق الخلايا الجذعية العصبية الدماغ الجنين البشري في الثقافة مع وسائل الإعلام خالية من المصل، إلى التفريق بينهم في مختلف أنواع فرعية الخلايا العصبية وأستروسيتيس عن طريق إجراءات فتيلة مختلفة، وإلى تجميد واسترداد هذه الخلايا. وعلاوة على ذلك، يصف لنا إجراء استخدام الخلايا الجذعية العصبية في مخ الجنين البشري لدراسة زكى الإصابة بعدوى الفيروس.
Introduction
فيروس زكى (زيكف) مصفر إرسالها أما جنسياً، أو بواسطة البعوض Aedes albopictus و بعوض الزاعجة المصرية نواقل البعوض. زيكف قد حددت مؤخرا كتهديد صحة العامة شديدة بسبب سهولة انتقال وأعراض عصبية1. واحدة من الأكثر فيما يتعلق بالتأثيرات العصبية هو تطوير صغر الرأس في الأجنة يولدون للأمهات الحوامل المصابات بالفيروس2،3. صعل اضطرابات النمائية حيث الرأس أصغر من حجم نموذجي أثناء تطوير الجنين وعند الولادة، مع المحيط أقل من 2 انحراف معياري أقل من متوسط4. ويرافق محيط الرأس أصغر عادة مجموعة متنوعة من كانوا مثل تأخر النمو والمضبوطات والرؤية والسمع والتغذية صعوبة.
الدراسات التي أجريت مؤخرا قد استخدمت نماذج حيوانية أو بفعل الخلايا الجذعية pluripotent لدراسة تأثير الإصابة زيكف على النماء العصبي5،6،،من78. في حين أن هذه الدراسات قد ساهمت في معرفتنا زيكف، استخدام الأنواع المختلفة أو الخلايا المحورة وراثيا قد يكون مضيعة للوقت و/أو إضافة المتغيرات الإضافية التي قد يتيه تأثير زيكف على وضع العصبية الخلايا5، 6 , 7 , 8-ومع ذلك، الصعوبة مع الثقافة واﻻتفاقية، ولا سيما الثقافة غير ملتصقة نيوروسفيري المبينة في هذا البروتوكول، أن الثقافة حساسة للغاية للأساليب المستخدمة لإجراء الثقافة9. أي تغيير في مكونات المتوسطة، أو حتى التعامل مع السفينة، والثقافة المادية ما يكفي للحصول على رد فعل من9خلايا. ولمعالجة هذه المسائل، قمنا بتطوير ثقافة بشرية الجنينية المستمدة من الدماغ العصبية خلايا الجذعية (هنسكس) في المختبر استجواب ميتشانيستيكالي أثر زيكف على الخلايا الجذعية الجنينية العصبية. استخدام أسلوب لدينا، أبقى هنسكس لما يزيد على 80 من الممرات دون التغيرات المظهرية الظاهر10. وعلاوة على ذلك، كانت التعديلات الصبغية مثل تريسمي أما بلا أو الحد الأدنى11. هذه الثقافة واﻻتفاقية ينمو كثقافة نيوروسفيري غير ملتصقة. ميزة واحدة من نيوروسفيريس هو أن المجالات إنشاء مكانة بيئية فريدة من نوعها في الثقافة التي تتجلى أكثر في فيفو الكوّات مقارنة بالثقافات ثنائي الأبعاد9. وهناك ميزة أخرى لهذا البروتوكول أن العديد من أنواع الخلايا يمكن أن يستمد من ثقافة واﻻتفاقية، تمكين محقق لمراقبة تأثير متغير معطى على بقاء واﻻتفاقية والتمايز. هذا البروتوكول لا ينطبق على الأفراد تتطلع إلى الإجابة على الأسئلة آليا فيما يتعلق بتطوير الجهاز العصبي المركزي أو خلل وظيفي. البروتوكول التالية توضح كيفية توسيع ثقافة واﻻتفاقية تصيب مع زيكف، وبعد ذلك التفريق بين هنسكس لمراقبة تأثير الإصابة على عملية المفاضلة. ويشمل أيضا أساليب لتخزين هنسكس للاستخدام طويل الأجل، والتمييز بين هنسكس إلى أنواع مختلفة من الخلايا العصبية التي تسمح لمواصلة التحقيق في حالات العجز الناجمة عن زيكف المساهمة في الدماغ تشوه11. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول أيضا من مصلحة المحققين السعي إلى فهم الأثر المترتب على أي حافز البيئية مثل العدوى أو السموم على بقاء الخلايا الجذعية العصبية والتمايز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الخلايا الجذعية العصبية البشرية مستمدة أصلاً من كورتيكسيس الأجنة البشرية المهملة في الاثلوث الأول12. جميع إجراءات البروتوكول تلتزم بالمبادئ التوجيهية الأخلاقية فرع جامعة تكساس الطبية المتعلقة باستخدام عينات الأنسجة البشرية، وخطوط الخلية قد وافقت لجنة السلامة الأحيائية المؤسسية.
1-الأسهم استرداد إعداد والخلايا الجذعية المتوسطة
- إعداد مخزون الثقافة المتوسطة (دفهجبس) عن طريق الجمع بين الكواشف في الخطوات 1.1.1.-1.1.5.
- إضافة 210 مل "تعديل النسر متوسطة" دولبيكو مع ارتفاع الجلوكوز ولام الجلوتامين (د). قم بتخزينها في 4 ˚C.
- أضف 70 مل مزيج المغذيات F12 في لحم الخنزير مع الجلوتامين لام الملحق (و). قم بتخزينها في 4 ˚C.
- إضافة مل 4.2 من 15 ملم "حبيس المخزن المؤقت" (ح) وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة مل 4.2% 10 د-الجلوكوز الحل (ز) وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 2.88 مل من محلول البنسلين/ستربتوميسين (PS)... قاسمة الحل الأسهم إلى مختبرين 3 مل وتخزين مختبرين في-20 درجة مئوية إلى حين الحاجة.
ملاحظة: سيتم تركيز البنسلين في الأجل المتوسط النهائي 100 وحدة/مل، وسيكون تركيز ستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل. وسوف يشار إليها باسم دفهجبس لما تبقى البروتوكول هذه الوسيلة ويجب تخزينها في 4 درجات مئوية للاستخدام في غضون 1-2 أسابيع. إذا لزم الأمر، دفهجبس قد يكون الارتقاء بالتناسب.
- قبل الخلايا يتم استردادها ومعطف قارورة T75 مع 5 مل متوسطة مكيفة والتي تم الحصول عليها من الثقافات السابقة من خط خلية واﻻتفاقية وتترك في حاضنة 37 درجة مئوية بنسبة 8.5 في المائة اليوم من ثاني أكسيد الكربون (CO2) بين عشية وضحاها.
ملاحظة: إذا كان حاليا استزراع هنسكس، حفظ المتوسطة التي ظلت تنمو الخلايا في أثناء تغيير متوسطة. وهذا المتوسط مكيفة كما أنه قد تم "مشروطة" بالخلايا. يمكن حفظها في أنبوب ملولبة المتوسطة مكيفة وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة 7 أيام تقريبا. اتصل بكاتب المقابلة للحصول على هنسكس. المتوسطة مكيفة المفضل لكنه غير مطلوب على الإطلاق، لا سيما عندما تبدأ أولاً ثقافة هنسكس. - الحارة 20 مل دفهجبس في أنبوب 50 مل سداده ملولبة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل يوم الانتعاش، واحتفظ بها في حوض ماء حتى جاهزة للاستخدام.
- في أنبوب ملولبة منفصلة 15 مل، الحارة 10 مل دفهجبس في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل والاحتفاظ به في حوض ماء حتى جاهزة للاستخدام في الخطوة 1، 13.
- استرداد حاوية من الثلج وجميع مكونات متوسطة (الجدول 1). ذوبان الجليد كافة مكونات متوسطة على الجليد وتركها على الجليد بينما كان يستعد للتغير المتوسط.
- الحصول على 5 مل أسهم المتوسطة مكيفة (المخزنة على 4 درجة مئوية) والاحتفاظ بها في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام في الخطوة 1، 14. راجع الملاحظة بعد الخطوة 1، 2 إذا كان هناك لا ثقافة مكيفة متوسطة أو الحالية البشرية الجنين العصبية الخلايا الجذعية.
- استرداد أنبوب ملولبة 50 مل من الخطوة 1، 3 ثم ضعه في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء (BSC). نقل 10 مل دفهجبس في أنبوب ملولبة 15 مل جديدة، ومن ثم ضع 50 مل أنبوب يحتوي على 10 مل المتبقية من متوسطة دفهجبس مرة أخرى في حوض ماء 37 درجة مئوية.
- الحصول على البرد قنينة هنسكس المخزنة في نيتروجين سائل. راجع الملاحظة بعد الخطوة 1، 2 إذا كان هناك لا ثقافة الخلايا الجذعية العصبية الجنينية البشرية الحالية.
ملاحظة: الخلايا الجذعية العصبية البشرية كانت أصلاً مشتقة من أدمغة الأجنة البشرية المهملة12 وصيانتها في الثقافة دون التعديلات الوراثية10. وينبغي إذابة 5 × 106 خلايا ومطلي في قارورة T75. ينبغي أن تتضمن كل قنينة cryo-5 × 106 خلايا؛ ولذلك، هناك حاجة إلى قنينة واحدة كل قارورة. - ذوبان الجليد قنينة خلايا في حمام الماء 37 درجة مئوية بعكس القنينة كل 10 ثانية لحوالي 1 دقيقة أو حتى ذاب الجليد ومحتويات القنينة السائل تماما. لا تغرق القنينة كلها تحت الماء لتفادي التلوث المحتملة.
- في البحرين، استخدام P1000 الصغرى-ماصة لنضح الحل خلية المذابة وإضافة دروبويسي إلى أنبوب 15 مل من الخطوة 1، 7، التي تحتوي على 10 مل دفهجبس. لإضافة حل خلية المذابة دروبويسي، ببطء اضغط على المكبس حيث أنه يتم تحريرها إلا قطره أو اثنتين في وقت واحد. وفي الوقت نفسه، دوامة الأنبوبة 15 مل للسماح لخليط سريع.
- الطرد المركزي بتعليق خلية في 200 غ س لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المادة طافية، مع التأكد من الاحتفاظ ببيليه الخلية.
- خلال الخطوة 1.11، استرداد أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل المتبقية من الخطوة 1، 7. بعد الطرد المركزي، ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل دفهجبس وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 200 غ س لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- أثناء الدوران النهائية، إعداد متوسطة النمو الجديدة ب التالي الجدول 1 لإضافة عوامل النمو إلى 10 مل المتوسطة دفهجبس من الخطوة 1، 4 (الجدول 1) في البحرين. اترك هذه الوسيلة الجديدة التي تحتوي على عوامل النمو في بكالوريوس العلوم حتى جاهزة للاستخدام.
- استرداد قارورة T75 من الخطوة 1، 2، وتجاهل المتوسطة مكيفة طلاء قارورة من الطموح. ثم قم بإضافة 5 مل من وسائل الإعلام مكيفة من الخطوة 1، 6. إلى قارورة استخدام ماصة مصلية. احرص على عدم خدش الجزء السفلي قارورة.
- استرداد أنبوب الخلايا من أجهزة الطرد المركزي وتجاهل المادة طافية بواسطة يسفط، ترك بيليه خلية سليمة.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل من وسائط الإعلام الجديدة من الخطوة 1، 13 باستخدام ماصة مصلية 5 مل وبيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات. إضافة التعليق إلى قارورة T75 المغلفة من الخطوة 1، 14. استخدم 5 مل المتبقية شطف الأنبوب الذي يتضمن بيليه الخلية ثم قم بإضافة تلك 5 مل بقارورة كذلك.
- روك قارورة T75 3 مرات ذهابا وإيابا تأمين الخلايا موزعة بالتساوي قارورة. تأكد من أن الحد الأقصى لقارورة فضفاضة للسماح بتدفق الهواء. تحت مجهر خفيفة مراقبة الخلايا وتقديم الملاحظات والتقاط صور إذا أمكن.
ملاحظة: ينبغي أن ننظر الخلايا شفافة والكروية. جعل ملاحظة إذا كانت هناك خلايا معتمة مظلمة، أن نظرة، أو الحدود غير متناظرة كما يمكن أن يشير هذا إلى موت الخلية. أيضا لمشاهدة أي تلوث الفطرية أو البكتيرية، مثل وسائط الإعلام أن يصبح أصفر اللون. - ضع قارورة الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 8.5% CO2.
ملاحظة: استخدم 8.5 في المائة بدلاً من 5.0% CO2 للحفاظ على درجة الحموضة من هذه الوسائط ثقافة خالية من المصل في نطاق 7.1-7.4.
2-واﻻتفاقية تغير متوسط
ملاحظة: تغيير متوسطة كل 3-4 أيام.
- بدوره على بكالوريوس في العلوم وتنظيف جيدا مع الإيثانول 70%. مراقبة الخلايا تحت مجهر خفيفة.
ملاحظة: تقديم الملاحظات على مظهر الخلايا والمجال الأحجام. ثلاثة أيام بعد الشفاء أو مرور، سوف الخلايا المجموعة معا والبدء في تشكيل نيوروسفيريس غير ملتصقة.
تنبيه: إذا كانت خلايا تنضم إلى أسفل قارورة، الثقافة ستحتاج إلى تجاهل انضمام الخلية سوف يزيد من تمييز سابق لأوانه، وسوف تكون الخلايا غير قادر على المحافظة على وقف. إذا كان هناك عدد كبير جداً من الخلايا في قارورة، الخلايا قد تشكل مجالات كبيرة (أكبر من 2 مم في القطر) في هذه الحالة، سوف تبدأ الخلايا في وسط المجال التفريق بسبب عدم إمكانية الحصول على عوامل النمو في الأجل المتوسط. إذا لوحظت مجالات أكبر من 1 مم في القطر، يمكن أن تكون الخلايا باساجيد (خطوات 3.1 3.22). - اتبع الخطوات 1-4 و 1.5، وإعداد 10 مل متوسطة جديدة (راجع الخطوة 1، 13).
- قارورة الميل إلى الجانب، مما يتيح مجالات تنزل إلى أسفل قارورة.
- إزالة 5 مل من وسائل الإعلام مكيفة من الأعلى من المتوسط المجمعة باستخدام ماصة مصلية 5 مل، مع الحرص على عدم نضح أي نيوروسفيريس. ضع 5 مل من وسائل الإعلام مكيفة في أنبوب نظيف 15 مل.
- إزالة مل 5 إضافية وسائط مكيفة من قارورة، تجنب بعناية مرة أخرى في المجالين، ووضع 5 مل في أنبوب 15 مل نفس.
- إضافة 10 مل من وسائط الإعلام الجديدة من الخطوة 2، 2 إلى 5 مل المتبقية وسائل الإعلام المكيفة والخلايا في قارورة. تعيين قارورة أسفل مسطحة ومراقبة الخلايا تحت مجهر خفيفة.
- إذا كان يبدو أن الخلايا قد تم يستنشق خلال جمع المتوسطة مكيفة، تدور المتوسطة مكيفة في 100 غ س لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إعادة تعليق أي الخلايا التي تتراكم في الجزء السفلي في 1 مل متوسطة مكيفة، ومن ثم إضافتها إلى قارورة الثقافة.
- تخزين 10 مل وسائط غير مستخدمة مكيفة من الخطوات 2.5/2.6 في 4 ˚C في أنبوب ملولبة 15 مل.
- كرر الخطوات 1.17/1.18.
3-واﻻتفاقية مرور
ملاحظة: يجب أن يكون هنسكس مرور كل أيام 9-11 إذا كانت الخلايا ينمو بشكل طبيعي، كالسكان مضاعفة الوقت هو تقريبا 3 أيام13.
- إذا كان التوسع الود إلى قارورة جديدة، تأكد من المغلفة كل قوارير جديدة كما هو الحال في الخطوة 1.2.
- تنظيف BSC كما في الخطوة 2، 1، والقيام بخطوات 1.4 و 1.5.
- تعد المتوسطة كما هو الحال في الخطوة 1، 13. ويتطلب كل قارورة T75 10 مل متوسطة. لقوارير T75 متعددة، قم بضرب 10 مل من وسائل الإعلام بعدد من قوارير.
- إعداد مل أما 1 أو 3 من دولبيكو للفوسفات مخزنة المالحة (دببس) والجلوكوز ومكان في حمام مائي 37 درجة مئوية الحارة لمدة 10 دقيقة (لحل التربسين) وفقا لوحدات التخزين في الجدول 2. لا تقم بإضافة التربسين أو الدناز في هذا الوقت. قد يلزم الدناز لكسر أي الحمض النووي أطلق سراحهم من الخلايا الميتة بسبب تفكك خلية الميكانيكية أو الكيميائية.
ملاحظة: لأحد قارورة T75 باساجيد بعد 9-10 أيام نمو سيكون هناك حوالي 30 × 106 خلايا، إذا كانت أصلاً المصنف 5 × 106 على قارورة. نموذجياً، يتم استخدام 1 مل من محلول دببس 10 × 106 خلايا. ولذلك، مطلوب 3 مل من محلول دببس لقارورة T75 باساجيد بعد 9-10 أيام. - مكان نظيف الصغيرة تزن القارب وهيموسيتوميتير في غطاء محرك السيارة. تنظيف مع الإيثانول 70% والسماح للهواء الجاف في غطاء محرك السيارة لمدة 5 دقائق تقريبا.
ملاحظة: سيتم استخدام القارب تزن في الخطوات 3.17.1. - استرداد قارورة الخلايا التي سوف باساجيد من الحاضنة وتجلب إلى بكالوريوس العلوم. إمالة قارورة السماح بلطف خلايا تنزل إلى الأسفل لوسائط الإعلام المجمعة. وهناك حوالي 15 مل من وسائل الإعلام في قارورة.
- قم بإزالة حوالي 10 مل من وسائل الإعلام في الأجزاء 5 مل (أي 5 مل + 5 مل). ضع هذا 10 مل من وسائل الإعلام في أنبوب نظيف 15 مل المسمى "سم" "مكيفة المتوسطة". يجب الحرص على عدم نضح أي من الخلايا استقر في 5 مل المتبقية لوسائل الإعلام في قارورة؛ سوف تخضع هذه الخلايا و 5 مل من وسائل الإعلام إلى الخطوة 3.8.
- تأخذ 3 مل وسائط مكيفة من الأنبوب "سم" (من الخطوة 3، 7) ووضع في أنبوب 15 مل المسمى "التربسين مثبط للحل". سيتم استخدام هذا في الخطوة 3، 12. بعد إزالة 3 مل، هناك 7 مل يسار الإعلام مكيفة في الأنبوب "سم". وضع أنبوب "سم" جانبا حتى الخطوة 3.9.
- إزالة 5 مل من وسائل الإعلام والخلايا المتبقية في قارورة T75، ووضعه في أنبوب نظيف 15 مل المسماة "خلايا".
- يأخذ الأنبوب "سم" التي تحتوي على 7 مل من وسائل الإعلام مشروطة (من الخطوة 3.7.1) وشطف أسفل قارورة T75 مرتين مع أجزاء 3.5 مل مكيفة الوسائط، باستخدام ماصة مصلية 5 مل. بعد كل شطف، ضع الأجزاء 3.5 مل في الأنبوب "الخلايا". والغرض من هذه الخطوة إزالة جميع نيوروسفيريس (الخلايا) من قارورة T75.
- الطرد المركزي الأنبوب "خلايا" في 100 غ س لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بينما هي الغزل الخلايا، الحصول على حل دببس/الجلوكوز من حمام الماء 37 درجة مئوية وإضافة كمية مناسبة من التربسين والدناز وفقا الجدول 2.
- بعد توقف الأنبوب "الخلايا" الغزل، إزالة جميع المتوسطة مكيفة طافية ونقل إلى الأنبوب "سم".
- أخذ الأنبوبة المسماة "التربسين مثبط الحل" من الخطوة 3.7.1. وإضافة حجم مثبط التربسين المشار إليها في الجدول 3. استخدم نفس الحجم من التربسين مثبط الحل كما كان يستخدم لحل التربسين.
- ضع الحل مثبط التربسين في حمام الماء 37 درجة مئوية إلى حين الحاجة.
- إضافة حل التربسين لبيليه الخلية في أنبوب 15 مل و "الماصة؛" صعودا وهبوطاً حوالي 5-10 مرات مع ماصة 5 مل. أغلق غطاء الأنبوب واحتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. وبعد 5 دقائق، استرداد الخلايا و "الماصة؛" صعودا وهبوطاً 5-10 مرات. ثم احتضانها في حمام الماء 37 درجة مئوية 10-15 دقيقة إضافية.
- في آخر 5 دقائق، حرك الحل مثبط التربسين على بكالوريوس العلوم.
- استرداد الخلايا بعد الانتهاء من الخطوة 2، 14 و "الماصة؛" الخلايا صعودا ونزولاً حتى المجالات يتم فصلها تماما (20-30 مرة). ثم فورا إضافة الحل مثبط التربسين وماصة صعودا وهبوطاً 10 مرات. هذا الحل من خلايا معزولة ومثبط التربسين وسوف يشار إليها باسم "تعليق خلية".
- حساب عدد الخلايا في تعليق خلية بالخطوات التالية.
- "الماصة؛" 15 ميليلتر من الخليط قبل تريبان الأزرق (التي تحتوي على 5 ميليلتر من 0.4% تريبان الأزرق و 10 ميليلتر من دببس) على قارب صغير وزنها، ثم قم بإضافة 5 ميليلتر من تعليق خلية. "الماصة؛" 3-5 مرات صعودا ونزولاً إلى المزيج. ثم، مغطاة ماصة 10 ميليلتر من تعليق تريبان الأزرق/خلية على أي من جانبي هيموسيتوميتير ساترة زجاجية.
- مراقبة الخلايا تحت مجهر خفيفة وحساب إجمالي عدد الخلايا في كل زاوية أربع شبكات. إضافة هذه الأرقام معا.
- تكرار العد للجانب الآخر ومتوسط بين الجانبين معا.
- تضاعف هذا العدد ب 10 آلاف لإعطاء العدد الإجمالي لخلايا كل مل. تضاعف هذا العدد بالعدد الإجمالي لمل لحساب إجمالي عدد الخلايا في تعليق خلية. حساب كم حجم تعليق خلية ستكون هناك حاجة إلى بذور الخلايا 5 مليون كل قارورة T75.
ملاحظة: عادة، بعد 9-10 أيام، T75 سيكون 25-30 × 106 خلايا. ولذلك، إذا باساجينج كافة الخلايا في قوارير جديدة، هناك حاجة مجموعة قوارير 5-6. - إضافة حجم تعليق خلية المحسوبة في الخطوة 3.19 لكل قارورة T75 للحصول على 5 × 106خلايا كل قارورة. إذا كانت وحدة التخزين أقل من 5 مل، إضافة شرط إضافي المتوسطة لجعل إلى ما مجموعة 5 مل. ثم أضف 10 مل من جديد دفهجفبس الوسائط التي تحتوي على عوامل النمو (الجدول 1) إلى قارورة.
- كرر الخطوتين 1.17 و 1.18 وضمان هو المسمى قارورة مع النوع من الخلايا والتواريخ، وعدد الخلايا في قارورة وعدد مرور (وهذا هو عدد المرات التي قد تم باساجيد الخلية). ثم الانتقال إلى الخطوات من 4 إلى 9.
- إذا كانت الخلايا الإضافية المطلوبة، والبذور في قارورة T75 واحد في الكثافة تصل إلى 30 × 106خلايا كل قارورة بين عشية وضحاها، وتجميد في اليوم التالي وفقا للخطوة 4.
4-واﻻتفاقية تجميد وتخزين
- في اليوم التالي باساجينج، استرداد قارورة من الحاضنة التي تحتوي على الخلايا لتجميد (من الخطوة 3.19 و 3.22). إمالة قارورة وإزالة جميع خلايا والمتوسطة من قارورة ومكان في أنبوب 15 مل. ثم الطرد المركزي الأنبوب في 216 س ز لمدة 5 دقائق.
- أثناء عملية الطرد المركزي، إعداد تجميد المتوسطة (الجدول 4). لكل 5 × 10 إعداد الخلايا6 1 مل من تجميد المتوسطة. تم تحديد عدد الخلايا في خطوة 3.19 عند تحديد كم عدد الخلايا في كل قارورة. سوف يتم تغيير هذا العدد بين عشية وضحاها.
- تحضير القنينات حكرا على البرد مع تسميات اسم الخلية ومرور عدد، وعدد الخلايا، والأحرف الأولى من اسم وتاريخ. بعد الطرد المركزي، إزالة المادة طافية بالشفط وإعادة تعليق خلية بيليه في تجميد المتوسطة حيث أن هناك 5 × 106 خلايا/مل. استخدام ماصة 5 مل، الكوة 1 مل كل قنينة والختم محكم (5 × 106 خلايا، كل قنينة).
- ضع قارورة في حاوية حكرا على البرد مع 250 مل الايزوبروبانول (استخدام ماكس 5 مرات في استبدال الايزوبروبانول). تخزين في الثلاجة-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها، ومن ثم نقلها إلى نظام تخزين خزان النتروجين سائل.
5-طلاء واﻻتفاقية ملتصقة للتحقق من صحة
- قبل باساجينج اليوم (الخطوات 3.1-3.22)، تنظيف BSC كما في الخطوة 2، 2، والحصول على لوحة 24-جيدا وزجاج معقمة 12 مم كوفيرسليبس.
- استخدام الملقط، ضع ساترة مفردة في الجزء السفلي من كل بئر من اللوحة.
- معطف الآبار التي تحتوي على كشوف الغطاء مع 0.01 ٪ بولي-د-يسين (PDL) في الماء المعقم واحتضانها ح 1 في 37 ˚C. لوحة 24-حسنا، استخدام 250 ميكروليتر من PDL لكل بئر.
- إزالة PDL من الآبار، ومن ثم معطف مع 1 ميكروغرام/سم2 لامينين/دببس (ميكروليتر 250 كل بئر). احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. إذا لم يكن بحاجة في اليوم التالي، ختم اللوحة مع بارافيلم بالالتفاف بارافيلم حول حواف اللوحة وتخزين في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: لوحات مغطاة بطبقة لامينين يمكن تخزين إلى 2 أسابيع إذا كانت مختومة مع بارافيلم ما دام لا جاف تغطية كشوف. - مرور الخلايا كما هو موضح في الخطوات 3.1-3.22، وثم تحديد عدد الخلايا للبذور في لوحة 24-جيدا مع كوفيرسليبس المغلفة.
- إزالة أي حل laminin الزائد من الآبار عن طريق الاستنشاق، وشطف مرة واحدة مع 0.5 مل دببس. ثم البذور الخلايا في الآبار في كثافة من 0.6-1 × 105 خلايا/سم2 لكل بئر. استخدام أي الخلايا المتبقية وفقا للخطوات 3.16-3.21.
- إصلاح أتفاريوس مرات خلال ثقافة لوحة 24-جيدا، ووصمة عار الخلايا لمختلف علامات الخلايا الجذعية بعد الخطوة 9.
6-فتيلة للحصول على الخلايا العصبية غابا وغلوتامات
- مرور الخلايا كما هو موضح في 3.1-3.22، ومن ثم تحديد عدد الخلايا للبذور في لوحة 24-جيدا كما هو الحال في الخطوة 5، 6.
- في اليوم السابق فتيلة، إعداد كشوف الغطاء ومعطف اللوحة كما هو موضح في الخطوات 5، 1-5، 4.
- في يوم فتيلة، استرداد قوارير تحتوي على خلايا 2-3 أيام. ضع في أنبوب 15 مل وبيليه الخلايا التي سينتريفوجينج في 100 غ س لمدة 5 دقائق.
- إعداد متوسطة فتيلة المثبطة عامل/لامينين (الذراع) عامل نمو البشرة/سرطان الدم وفقا الجدول 5.
- ريسوسبيند الخلايا مع المتوسطة خبرني.
- تعليق بذور الخلايا في لوحة 24-جيدا (اتبع الخطوة 5، 6).
7-فتيلة للحصول على الخلايا العصبية الحركية
- اتبع الخطوات من 6، 1-6، 4.
- تعد أساسية تنتجها الخلايا الليفية عامل النمو/الهيبارين/لامينين (FHL) فتيلة المتوسطة وفقا الجدول 6.
- اتبع الخطوة 5، 6.
8. عدوى فيروس زكى
ملاحظة: زيكف حساسة للغاية لدرجة الحرارة، وذلك تجنب حتمية الأسهم زيكف المخزنة في-80 ° C وذوبان التجميد/دورات. يبقى العامل مختبرين على الجليد.
- مرور الخلايا كما هو موضح في الخطوات 3.1-3.22. 3 مليون من الخلايا في مجموعة مطلوبة للبذور لوحة 24-جيدا، ولذلك عند باساجينج، وضع عدد الخلايا المطلوبة للعدوى والبذر في قارورة عند باساجينج.
- إذا بذر خلايا في لوحة 24-جيدا لتلطيخ، إعداد كوفيرسليبس ولوحة وفقا للخطوات 5.1 5.4.
- بعد باساجينج، ضع 1 مل تعليق خلية من الخطوة 8، 2 إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة، وأجهزة الطرد المركزي في 200 غ س في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة طافية بالطموح.
- ريسوسبيند بيليه من الخطوة 8.3 في الأسهم زيكف للحصول على عدد وافر عدوى (وزارة الداخلية) أما 1 إلى 10. يجب أن لا يتجاوز حجم الحل زيكف 0.5 مل. لتلقي العلاج الوهمي (مراقبة الخلايا)، ريسوسبيند الخلايا في نفس حجم ونوع الوسيلة المستخدمة في الأسهم زيكف.
ملاحظة: إعداد الأوراق المالية زيكف والعدوى هي مفصلة في منشور سابق11. الإصابات وهمية تجري أيضا مع المتوسطة. - احتضان أعلاه الخليط خلية/زيكف في 37 درجة مئوية حاء 1 عكس الأنبوب 2-3 مرات، وثم الطرد المركزي المخلوط لمدة 5 دقائق في ز س 216 في درجة حرارة الغرفة للحصول على بيليه خلية. ريسوسبيند بيليه في دببس وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 216 x ز في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة المادة طافية بالطموح، ريسوسبيند الخلايا مع المتوسطة المناسبة، وتحميل الخلايا المصابة في قارورة أو لوحة اللازمة للتجربة. إذا بذر الخلايا في لوحة 24-بئر ريسوسبيند بيليه في 12 مل الوسيلة الملائمة، ثم قم بإضافة 500 ميكروليتر من تعليق لكل بئر.
ملاحظة: عند هذه النقطة أما الإبقاء على الخلايا في نمو وسائل الإعلام لمراقبة آثار زيكف على الخلايا الجذعية، أو انتقل إلى الخطوات 6 أو 7 لدراسة تأثير زيكف على عملية المفاضلة.
9-تلطيخ الداخلي
- لتحديد الخلايا، إزالة المتوسطة، شطف مرة واحدة مع 0.5 مل في البئر (24-جيدا لوحة) من الجليد الباردة مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
- إزالة برنامج تلفزيوني، وتغطي الخلايا مع 0.5 مل بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني وتترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة.
- إزالة بارافورمالدهيد وشطف الخلايا ثلاث مرات مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني، تاركاً شطف PBS الثالث على لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- عند هذه النقطة أما ترك برنامج تلفزيوني في ليلة وضحاها وتخزين اللوحة في 4 ˚C، أو البدء في تلطيخ بعد شطف 10 دقيقة.
- وبعد شطف 10 دقيقة برنامج تلفزيوني، كتلة الخلايا لمدة 45-60 دقيقة في موقف ثابت مع حلاً 0.5 مل من مصل الماعز العادي 5% (خ ع)، 0.3% ألبومين المصل البقري (BSA)، 0.25% X-100 تريتون في تريس مخزنة المالحة (تبس). على سبيل المثال، لجعل 1 مل من حظر استخدام الحل: 10 ميليلتر من 25% X-100 تريتون، 50 ميليلتر من 100 ٪ خ ع، و 100 ميليلتر من جيش صرب البوسنة 3% مختلطة في 840 ميليلتر من tbs.
- أثناء هذه الخطوة عرقلة، إعداد الحل جسم الأولية، مع التأكد من أن يتم الاحتفاظ بجميع المواد الكاشفة على الجليد. للتحقق من صحة هنسكس، يمكن استهداف البروتينات مثل نيستين استخدام الأجسام المضادة المناسبة ضدهم. للتحقق من صحة الإصابة زيكف، استخدام جسم مضاد ضد زيكف معطف البروتين11. التفريق، استخدام علامات مثل الفئة الثالثة β-tubulin لتحديد الخلايا العصبية من السكان في حين يمكن استخدامها لتحديد astrocytes الدبقية فيبريلاري الحمضية البروتين (توصيني). تجريبيا مصممون تركيزات الأجسام الأولية تبعاً للمورد والكثير. وقد استخدمنا معظم الأجسام المضادة من 1: 100 إلى تمييع 1:2000.
- الطرد المركزي جسم الابتدائية في 12,000 س ز 2 دقيقة عند 4 درجة مئوية، ومن ثم جعل إضعاف؛ مثلاً جعل إضعاف 1: 1000 من الأجسام المضادة، أضف 7.2 ميليلتر من جسم المطلوب إلى 7.2 مل من 0.25% X-100 تريتون في tbs.
- إضافة حوالي 300 ميليلتر من جسم الحل لكل بئر من صفيحة 24-جيدا، واحتضان الخلايا بجسم الأولية في موقف ثابت ح 2 في درجة حرارة الغرفة أو في 4 ˚C بين عشية وضحاها في وضع ثابت.
- بعد الاحتضان، غسل الخلايا مع 0.5 مل TBS ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة عن 10 دقيقة في وضع ثابت.
- الطرد المركزي جسم الثانوية في 12,000 س ز 2 دقيقة في 4 درجات مئوية، ثم يضعف في حل تريتون العاشر-100/تبس 0.25%. جعل الحل جسم ما يكفي لإضافة 300 ميليلتر لكل بئر. هنا، تضعف الأجسام المضادة الثانوية نيون 1: 500 (الشكل 3).
- بعد أن يغسل تبس النهائي، إضافة 300 ميليلتر من الحل جسم الثانوية لكل بئر واحتضانها في الظلام ح 1 في درجة حرارة الغرفة في وضع ثابت. من هذه النقطة، ويجب أن تجري جميع الخطوات في غرفة مظلمة.
- تغسل الخلايا ثلاث مرات مع TBS ل 10 دقيقة في وضع ثابت.
- أثناء الغسيل 10 دقيقة الماضية، تضعف العلامة النووي DAPI النووية وصمة عار للتركيز الموصى به في تبس (عادة 1:1,000-1:5، 000). جعل الحل ما يكفي لإضافة 300 ميليلتر لكل بئر.
- بعد الغسيل النهائي، إضافة 300 ميليلتر DAPI حل لكل بئر واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في وضع ثابت. ثم تغسل مرة واحدة مع 0.5 مل من tbs.
- استخدام وسيلة تصاعد تتلاشى المضادة للأسفار وقطره 1 (10-15 ميليلتر) كل ساترة التي سيتم وضعها على الشريحة. بعناية استخدام الملقط لإزالة كوفيرسليبس من آبار لوحة 24-جيدا ووضع سطح الخلية لأسفل على انخفاض المتوسط المتصاعدة على الشريحة.
- بمجرد كوفيرسليبس توضع على الشريحة، ضع الشريحة في حامل شريحة مسطحة. تأكد من تسمية الشرائح سوف كافة المعلومات ذات الصلة اللازمة لتحديد الخلايا على هذه الشريحة، ثم تغطية صاحب مع رقائق الألومنيوم للحفاظ على شرائح محمية من الضوء.
- تخزين الشرائح في 4 ˚C وتسمح المتوسطة المتصاعدة ترسيخ بين عشية وضحاها. وفي اليوم التالي مراعاة الشريحة باستخدام مجهر ابيفلوريسسينت تصفية الأشعة فوق البنفسجية--2E/C (340-380 نانومتر) أو تصفية بروتينات فلورية خضراء هيك BP (450-490 نانومتر) أو تكساس Y--2E/ج مرشح أحمر (540-580 نانومتر)، 20 X التكبير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنسكس مثقف في تلك المرحلة التكاثري ستنمو كغير ملتصقة نيوروسفيريس (الشكل 1). وفور مرور واﻻتفاقية، سيكون هناك العديد من الخلايا الفردية، التي سيتم تجميع والبدء في مجالات النموذج في الأيام القليلة القادمة (الشكل 1A و 1B). ينبغي أن تكون المجالات الصحية حوالي 1-2 ملم في القطر 9-10 أيام بعد مرور (الشكل 1). وسيضع المجالات التي تنمو أكبر من 2 مم وسط الظلام وعوامل النمو على المديين المتوسط ولن تكون قادراً على الوصول إلى الخلايا الموجودة في مركز المجال، أسفر عن التمايز غير المرغوب فيها. مجالات صحية سوف تظهر شفافة وعرض أهداب الزائفة حول حواف الكرة (الشكل 1).
طلاء نيوروسفيريس على سطح ملتصقة لأغراض المصبوغة سيؤدي إلى نمو مجالات ملتصقة (الشكل 2A). هذه المجالات سوف تلمس سطح السفينة الثقافة وبعض الإسقاطات تمتد على سطح السفينة، مع الحفاظ على مجال مركزي (الشكل 2A). فتيلة والتفريق بين الخلايا تحتاج الخلايا إلى التمسك بكشف الغطاء في الجزء السفلي من لوحة الثقافة الخلية، مثل لوحة 24-جيدا. في أعقاب الخطوات المناسبة فتيلة وإضافة متوسطة التمايز، سوف تنتشر عبر سطح السفينة الثقافة الخلايا وتنمو كأحادي الطبقة مترابطة من الخلايا (الشكل 2).
أما تأكيد صحة ثقافة واﻻتفاقية أو النمط الظاهري لخلايا متمايزة، يمكن استخدام إيمونوهيستوتشيميستري نيون. نيستين هو خيوط متوسطة عادة المعرب عنها في الود، ويمكن استخدامها للتحقق من الثقافة واﻻتفاقية (الشكل 3A). للتحقق من وجود الخلايا العصبية بعد التمايز، يمكن استخدام الفئة الثالثة β-tubulin عموما إلى تسمية الخلايا العصبية (الشكل 3B). على الرغم من أن يتم استخدام الخطوة فتيلة لتحقيق نسبة أعلى من الخلايا العصبية بعد التمايز، ستكون هناك أستروسيتيس في الثقافة. البروتين حمضية فيبريلاري الدبقية يمكن استخدام (توصيني) لتسمية astrocytes بغية تحديد أي النسبة المئوية للخلايا المتمايزة أصبح astrocytes أو الخلايا العصبية.
ووجدنا أن الخط K048 من الود كانت مصابة بالسلالات الأفريقية والآسيوية من زيكف الكشف عنها بواسطة تلطيخ إيمونوفلوريسسينت مع جسم زيكف محددة. تظهر الصور الممثل في الشكل 4. لم تثر العدوى وهمية تغييرا في مورفولوجيا واﻻتفاقية أو البقاء على قيد الحياة (الشكل 4 أ، ج 4). زيكف يميل إلى البقاء في المنطقة المحيطية لما بعد يوم واحد من الخلايا المصابة عدوى 1 ساعة، ولكن يقوم بتعبئة الخلية كلها في 3 إلى 7 أيام (الشكل 4 باء، 4 د، 4E). ملحوظة، مع نفس وزارة الداخلية (0.1)، ومعدل إصابة بنسبة 5% يقدر في الخلايا K048 أقل بكثير من تلك التي ذكرت مؤخرا زيكف معدل الإصابة (تصل إلى 80 في المائة) في البشرية الناجمة عن الجلد الود7. استخدمت هذه الدراسة، الإبلاغ عن العدوى 80%، النموذج الأولى للسلالة الأفريقية من زيكف (MR766) التي قد تكيفت النمط الظاهري تم خلال الممرات ما يزيد على 140 في خلايا الدماغ الماوس.
رقم 1: صور مشرقة ميدان الثقافة واﻻتفاقية. (أ-ج) صور الممثل الميداني مشرق المتخذ في 10 X التكبير من بعد باساجينج، واﻻتفاقية الثقافة 1 و 4 و 9 أيام على التوالي. تغيير حجم أشرطة: 60 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: صور مشرقة ميدان الثقافات ملتصقة. (A) الممثل الميداني مشرق الصور التي اتخذت في 10 X التكبير للثقافة واﻻتفاقية ملتصقة، 7 أيام بعد الطلاء. (ب) الصور الميدانية مشرق ممثل المتخذ في 10 X التكبير من ملتصقة متمايزة خلايا بعد خبرني فتيلة و 9 أيام من التفريق. تغيير حجم أشرطة: 60 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الصور الفلورية هنسكس والثقافات المتباينة. (أ) ممثل من الصور الفلورسنت التي اتخذت في 20 X التكبير من هنسكس ملتصقة ملطخة بالعلامة النووي، DAPI (الأزرق)، والخلايا الجذعية علامة نيستين (أحمر). شريط الحجم: 60 ميكرومتر (ب) الممثل الفلورسنت الصور التي اتخذت في 60 X التكبير من الخلايا المتمايزة ملطخة بعلامة العصبية βIII-tubulin (الأخضر)، وصانع astrocyte توصيني (أحمر)، وعلامة النووية DAPI (أزرق). تغيير حجم أشرطة: 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الإصابة زيكف في الإنسان الجنينية الدماغ المستمدة من الود. أما يعاملون البشر الود صورية تلقيح (ألف وجيم)، لمدة ساعة واحدة مع سلالة نسب أفريقية من زيكف في وزارة الداخلية 0.1 (ب ود) أو سلالة آسيوية من زيكف مؤخرا المعزولة من البعوض في المكسيك في عام 2016 (ه). تلوين إيمونوفلوريسسينت بالكشف عن تصنيف الأجسام زيكف في الود في واحد إلى سبعة أيام بعد التطعيم (1 نقطة في البوصة في ب ونقطة في البوصة 7 في د 3 نقطة في البوصة في ه). أشرطة مقياس 10 ميكرون في مكم أ-د، و 5 في هاء الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| دفهجبس وسائل الإعلام لأحد T75 | 10 مل |
| تبس * | ميليلتر 173 |
| لجلوتامين 200 ملم | 50 ميليلتر |
| 10 ملغ/مل الأنسولين * * | 25 ميليلتر |
| عامل نمو البشرة 20 ميكروغرام/مل | 10 ميليلتر |
| عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية 20 ميكروغرام/مل | 10 ميليلتر |
| عامل مثبط لسرطان الدم 10 ميكروغرام/مل | 10 ميليلتر |
| 5 ملغ/مل الهيبارين | 10 ميليلتر |
| * خليط يحتوي على 100 ميكروغرام/مل ترانسفيرين، 100 ميكرومتر بوتريسيني، 20 نانومتر البروجسترون و 30 سيلينيت الصوديوم في شمال البحر الأبيض المتوسط. الخليط من مخزونات مركزة، ومختبرين المخزنة في-80 درجة مئوية وتستخدم بريفيرابلي ضمن إعداد 6 أسابيع. الأرصدة السمكية مركزة هي ترانسفيرين 10 ملغ/مل، بوتريسسيني 30 ملم، 10 ميكرون البروجسترون و 15 سيلينيت الصوديوم ميكرومتر المخزنة في ˚C-80. | |
| * * الأنسولين يتم حله في 0.01 ن هيدروين الكلوريد، التي تمت تصفيتها من خلال 0.2 ميكرون منخفضة البروتين ملزمة تصفية، والمخزنة في 4 ˚C لمدة تصل إلى 6 أسابيع. | |
الجدول 1: عوامل النمو "الوسيلة الانتشار الجديدة".
| دببس * | 1 مل | 3 ملب |
| جلوكوز 10% | 60 ميليلتر | ميليلتر 180 |
| 2.5% التربسين | 10 ميليلتر | 30 ميليلتر |
| الدناز * * | 5 ميليلتر | 15 ميليلتر |
| * مخزنة الفوسفات المالحة دولبيكو | ||
| * * ديوكسيريبونوكليسي | ||
| للخلايا 10 مليون | ||
| ( ب ) للخلايا 30 مليون | ||
الجدول 2: إعداد التربسين.
| وسائط مكيفة | 1 مل | 3 ملب |
| مثبط التربسين | 10 ميليلتر | 30 ميليلتر |
| للخلايا 10 مليون | ||
| ( ب ) للخلايا 30 مليون |
الجدول 3: إعداد مثبط التربسين.
| دفهجبس * | 0.7 مل | 2.1 ملب |
| FBS * * 20% | 0.2 مل | 0.6 مل |
| * * * [دمس] 10% | 0.1 مل | 0.3 مل |
| * دميم، F12، حبيس، والسكر، والبنسلين والستربتوميسين | ||
| * * الجنين المصل البقري | ||
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد | ||
| أجل الخلايا 5 مليون في قنينة واحدة | ||
| ( ب ) لثلاث قنينات، 5 مليون خلايا/فيال | ||
الجدول 4: إعداد متوسطة تجميد.
| دفغبس * لبئر واحدة في لوحة 24-جيدا | 1 مل |
| تبس * * | 17.3 ميليلتر |
| 200 ملم لام الجلوتامين | 5 ميليلتر |
| 10 ملغ/مل الأنسولين | ميليلتر 2.5 |
| عامل نمو البشرة 20 ميكروغرام/مل | 1 ميليلتر |
| 10 ميكروغرام/مل اللوكيميا العوامل المثبطة | 1 ميليلتر |
| 1 ملغ/مل لامينين | 1 ميليلتر |
| * يحتوي على الجلوكوز، حبيس، البنسلين والستربتوميسين، دميم، F12 | |
| * * تحتوي على 100 ميكروغرام/مل ترانسفيرين، 100 ميكرومتر بوتريسيني، | |
| 20 نانومتر البروجسترون، و 30 سيلينيت الصوديوم في شمال البحر الأبيض المتوسط | |
الجدول 5: إعداد الذراع فتيلة المتوسطة.
| دفغبس * لبئر واحدة في لوحة 24-جيدا | 1 مل |
| تبس * * | 17.3 ميليلتر |
| 200 ملم لام الجلوتامين | 5 ميليلتر |
| 10 ملغ/مل الأنسولين | ميليلتر 2.5 |
| عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية 20 ميكروغرام/مل | 0.5 ميليلتر |
| 5 ملغ/مل الهيبارين | 0.5 ميليلتر |
| 1 ملغ/مل لامينين | 1 ميليلتر |
| * يحتوي على الجلوكوز، حبيس، البنسلين والستربتوميسين، دميم، F12 | |
| * * تحتوي على 100 ميكروغرام/مل ترانسفيرين، 100 ميكرومتر بوتريسيني، | |
| 20 نانومتر البروجسترون، و 30 سيلينيت الصوديوم في شمال البحر الأبيض المتوسط | |
الجدول 6: إعداد FHL فتيلة المتوسطة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر القدرة على الثقافة والتلاعب هنسكس أداة بالغة الأهمية التي يمكن أن تستخدم لمجموعة متنوعة من الأغراض من نمذجة الأمراض البشرية للمخدرات إنتاجية عالية فحص10،11،،من1214، 15،،من1617. أسئلة كثيرة ما زال يتعين معالجتها مثل مخ الجنين البشري كيف الود أو ذريتهم هم عرضه زيكف العدوى، وما إذا كانت تصيب سلالات مختلفة من زيكف الود مع كفاءة متساوية وكيف يؤدي إلى الإصابة خلال التنمية العصبية صعل. وقد استخدمنا هذه الثقافة واﻻتفاقية التحقيق Zika الفيروسات المرتبطة أمراض الأعصاب11،14. باستخدام ثلاث سلالات من الخلايا المعزولة من ثلاث جهات مانحة فردية، نحن قادرون أيضا على مقارنة الاختلافات الفردية إلى التعرض للعجز العصبية الملاحظة التالية زيكف العدوى11. أحد أوجه القصور في هذه التقنية هو إمكانية الحصول على عينات واﻻتفاقية والمتوسطة مكيفة أساسي للثقافة المناسبة. للالتفاف على هذا الحاجز، الرجاء الاتصال بكاتب المقابلة لترتيب نقل مواد كما الخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول غير متوفرة تجارياً.
الدراسات في المختبر باستخدام هنسكس ليس فقط تقدم نظرة فريدة من نوعها في سلوك الخلايا الجذعية الأساسية، كما أنها توفر منبرا ممتازا إجراء أبحاث ما قبل السريرية. ومع ذلك، يمكن أن تكون تحديات تقنية استزراع هنسكس عائقا في استخدامها كنماذج فعالة واستنساخه. في هذا البروتوكول، وقد اوجزنا الخطوات الرئيسية والمنهجيات التي يمكن استخدامها للحد من التقلبات في استزراع الأساليب وتسفر عن ثقافة خلايا الجذعية واﻻتفاقية صحية ومستقرة. عيوب استخدام الثقافة نيوروسفيري واﻻتفاقية أن الخلايا حساسة للغاية لأي وكل المنبهات. حتى مع البروتوكول المفصلة أعلاه، من المهم إيلاء اهتمام وثيق على مدى معالجة قوارير أو أطباق من هنسكس، كما الاختلافات الألطف على البروتوكول يمكن أن تؤدي التغيرات في السلوك نيوروسفيري.
الجزء الأكثر أهمية من هذه الورقة أساليب هو مزيج عوامل النمو وإعداد وسائل الإعلام المختلفة. إذا كان الوقت مضاعفة ثقافة واﻻتفاقية منخفضة جداً، أو العديد من الخلايا عاذر بثقافة السفينة (عندما تكون غير ملتصقة)، الخطوة الأولى هي ضمان أن النمو والعوامل المستخدمة هي تركيز مناسب ولم تنته مدة صلاحيتها. جميع عوامل النمو في هذا البروتوكول لديها صلاحية قصيرة جداً مرة مذاب (5-6 أيام). بالإضافة إلى ذلك، لدينا تستخدم عوامل النمو من شركات متعددة ولاحظت اختلافات في الجودة والتركيز اللازم للحفاظ على الثقافة. ولذلك، نوصي بشدة باستخدام عوامل النمو المحدد بالتفصيل في الجدول المواد. خطوة باساجينج (خطوات 3.1-3.22) أيضا مصدر مشترك للخطأ. إذا كان هناك العديد من الخلايا الميتة بعد عملية الانفصال، تقليل عدد مرات من بيبيتينج صعودا وهبوطاً فصل الخلايا، كما الكثير الانفصال الجسدي يؤدي إلى موت الخلية. وبدلاً من ذلك، إذا كان هناك مجموعات كثيرة من الخلايا بعد خطوة الانفصال، تصبح زيادة حيوية أو عدد مرات من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، كهذه المجموعات سوف بسرعة المجالات الكبيرة التي لن تبقى قابلة للتطبيق في الثقافة. إذا تم الحفاظ الثقافة بشكل صحيح، العدوى مع زيكف بسيط نسبيا.
بينما الإصابة زيكف هو العلاج بالتفصيل في هذا البروتوكول، فمن الممكن استخدام هذا النظام واﻻتفاقية الثقافة لمجموعة واسعة من الدراسات. يمكن استخدام هذا النظام النموذجي لفحص المخدرات ودراسة قابلية الفرد للتعرض، والتحقيق فيها الآليات الكامنة لمجموعة متنوعة من الأمراض واضطرابات النمو14. هذا النظام أيضا مثالية للدراسات الجينومية نظراً لعدم التلاعب وراثيا الخلايا المستزرعة وإظهار القليل من لا تشوهات كروموسومية، مقاطع من 80 حتى يصل إلى10،11. ونحن نعتقد هذه الثقافة نظام مثالي للنمذجة في المختبر كيف المحفزات البيئية مثل العدوى، المخدرات، الكحول، والسموم، إلخ يمكن أن تؤثر على التنمية في الجهاز العصبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في إعلان.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل أموال من مؤسسة جون س. دن ومعهد الإصابات البشرية والحصانة من فرع جامعة تكساس الطبية (الأسبق).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Glucose (10%) | Sigma | G8644 | |
| HEPES (1M) | Corning/cellgro | 25-060-c1 | |
| Pen Strep (100x) | Gibco | 15140-122 | |
| Insulin | Sigma | I4011 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Transferrin | Sigma | T2036 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Heparin Sigma | Sigma | H3149 | |
| basic fibroblast growth factor | R&D system | 233-FB | |
| epidermal growth factor | R&D system | 236-EG | |
| leukemia inhibitory factor | R&D system | 7734-LF | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 2.5% trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL) | Sigma | P6407-5MG | |
| B-27 supplement | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ml | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning/cellgro | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4378-25G | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Lab | 005-000-121 | |
| Triton X-100 | FisherBiotech | BP151-500 | |
| Nestin antibody | BD Transduction Laboratories | 611659 | 1:200 dilution |
| Class III beta-tubulin antibody (TuJ1) | Covnce | MMS-435p | 1:2000 dulution |
| GFAP antibody | Millipore | AB5804 | 1:1000 dilution |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:2000 dilution |
| ZIKV antibody | World Reference Collection for Emerging Viruses and Arboviruses at the University of Texas Medical Branch | 1:2000 dilution | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| CO2 incubator | Thermo Forma | Model# 3110 | |
| Centrifuge | Thermo fisher Scientific | 75004221 | |
| Biological safety cabinet | Forma scientific Claas II A/B3 | Model# 1284 | |
| Freezer (-80 °C) | Forma scientific,Inc | model# 8516 | |
| Microscope(phase contrast image) | Hp 2230 workstation | Product#NOE25us#ABA | |
| Microscope (epifluorescent image) | Nikon Eclipse 80i | ||
| Confocal Microscope | Nikon TE2000-E microscope with C1si confocal system |
References
- Centers for Disease Control and Prevention. All countries and territories with active Zika virus transmisson. , (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro. N Engl J Med. 375 (24), 2321-2334 (2016).
- Hills, S. L., et al. Transmission of Zika Virus Through Sexual Contact with Travelers to Areas of Ongoing Transmission - Continental United States, 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (8), 215-216 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Facts about microcephaly. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18 (5), 587-590 (2016).
- Wu, K. Y., et al. Vertical transmission of Zika virus targeting the radial glial cells affects cortex development of offspring mice. Cell Res. 26 (6), 645-654 (2016).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Wu, P., et al. Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nat Neurosci. 5 (12), 1271-1278 (2002).
- McGrath, E. L., et al. Differential Responses of Human Fetal Brain Neural Stem Cells to Zika Virus Infection. Stem Cell Reports. 8 (3), 715-727 (2017).
- Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85 (2), 141-152 (1998).
- Tarasenko, Y. I., Yu, Y., Jordan, P. M., Bottenstein, J., Wu, P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells. J Neurosci Res. 78 (5), 625-636 (2004).
- Barrows, N. J., et al. A Screen of FDA-Approved Drugs for Inhibitors of Zika Virus Infection. Cell Host Microbe. 20 (2), 259-270 (2016).
- Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. Using human neural stem cells to model neurological disease. Nat Rev Genet. 5 (2), 136-144 (2004).
- Lopez-Garcia, I., et al. Development of a stretch-induced neurotrauma model for medium-throughput screening in vitro: identification of rifampicin as a neuroprotectant. Br J Pharmacol. , (2016).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
