Summary
Denne metode er at indføre en transgen i endotelet af kanin carotis arterierne. Indførelsen af transgenet tillader vurdering af transgenet produktet enten i normal arterier eller sygdomsmodeller biologiske rolle. Metoden er også nyttige til måling af aktiviteten af regulerende DNA-sekvenser.
Abstract
Målet med denne metode er at indføre en transgen i endotelet isolerede segmenter af begge kanin fælles carotis arterierne. Metoden opnår fokale endotel-selektiv transgenese, hvorved en efterforsker til at bestemme de biologiske roller i endothelial udtrykt transgener og kvantificere in vivo transcriptional aktiviteten af DNA-sekvenser i store arterie endotelceller. Metoden bruger kirurgisk isolation af kanin fælles halspulsårer og en arteriotomy til at levere en transgen-udtrykker viral vektor i arteriel lumen. En kort inkubationstid af vektor i lumen, med efterfølgende aspiration indholdsfortegnelsen lumen er tilstrækkelig til at opnå effektive og holdbare udtryk af transgenet i endothelium, med ingen påviselige transduktion eller udtryk uden for de isolerede arteriel segment. Metoden tillader vurdering af transgene produkter biologiske aktiviteter både i normal arterier og modeller af menneskelige karsygdom, samtidig undgå systemiske virkninger, som kunne være forårsaget enten ved at målrette gen levering til andre sites (fx. leveren) eller af den alternative metode levere genetiske konstruktioner til endotelet af Kim linje transgenese. Anvendelsen af metoden er begrænset af behovet for en dygtig kirurg og anæstesi, en veludstyret operationsstuen, udgifter til indkøb og boliger kaniner, og behovet for ekspertise inden for overførsel af gener vektor konstruktion og brug. Resultater, der opnås med denne metode omfatter: transgen-relaterede ændringer i det arterielle struktur, celleforandringer, ekstracellulære matrix eller vasomotoriske funktion; tillæg og fradrag i arteriel betændelse; ændringer i vaskulære celle apoptose; og progression, retardering eller regression af sygdomme som intima hyperplasi eller åreforkalkning. Metoden giver også mulighed for måling af indfødte og syntetiske DNA regulerende sekvenser evne til at ændre transgen udtryk i endothelial celler, giver resultater, der omfatter: niveauer af transgenet mRNA, niveauer af transgenet protein og niveauer af transgenet enzymatisk aktivitet.
Introduction
Målet med denne metode er at indføre en transgen i endotelet af kanin fælles halspulsårer. Indførelsen af transgenet tillader vurdering af produktets transgen biologiske rolle både i normal arterier og kanin modeller af arteriel sygdom hos mennesker. Overekspression af transgenet i sygdomsmodeller kan afsløre, om transgenet (og dens protein produkt) viser lovende som terapeutiske agenter1,2,3,4. Optagelse af cis-handler regulerende elementer i transgene udtryk kassette muliggør vurdering af aktiviteten af disse elementer i arteriel endotel i vivo5,6. Viden om aktiviteten af specifikke cis virkende regulerende elementer kan bruges til at designe mere-aktive udtryk kassetter og at sonde mekanismer af RIBOREGULATION i store arterie endotelet in vivo7.
Kaniner er en værdifuld model for forskellige aspekter af menneskets vaskulære fysiologi og sygdom. Kaniner deler mange vaskulære funktioner med mennesker. For eksempel, er baseline hematological værdier, hæmostatisk regulering og vaskulære langsgående spændinger ens mellem kaniner og mennesker8. Kanin modeller af Vaskulære sygdomme replikere Nøglefunktioner af mange menneskelige sygdomme herunder: aneurismer (lignende geometriske og flydeegenskaber)9, vasospasme (lignende reaktion på endovaskulære behandling)10,11, og åreforkalkning (intima plaques med lignende funktioner, herunder en kerne rige i lipid, makrofager og glat muskel celler i et fibrøst cap)12,13. I overensstemmelse hermed, kanin modeller er blevet udviklet for mange kar-sygdomme såsom trombose, vasospasme, aneurisme, diabetes, vaskulære graft stenose og åreforkalkning8,13,14, 15,16.
For forskere at vælge blandt dyremodeller vaskulære fysiologi og sygdom, har kaninen flere fordele. De større fartøjer af kaniner i forhold til gnavere, giver mulighed for lettere kirurgisk manipulation, brug af Intravaskulært udstyr og en større mængde af væv til kvantitative målinger. Kaniner er meget tættere Fylogenetisk på primater end er gnavere17, og den større genetiske mangfoldighed af outbred kaniner bedre tilnærmer den genetiske variation af mennesker. Genetiske mangfoldighed er særlig vigtig for de prækliniske undersøgelser, som-af deres natur-mål om at udvikle behandlingsformer, der kan anvendes på den genetisk forskellige menneskelige befolkning. Som med mange, hvis ikke alle andre model arter, kanin gener er let klonet eller syntetiseret fordi kanin genom er blevet sekventeret med høj dækning (7.48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. Sammenlignet med andre store dyremodeller (som hunde, svin eller får), kaniner er relativt billige at købe og hus og de er nemmere at opdrætte og håndtere. Bestemt vaskulære sygdomsmodeller i kaniner hver har deres egne fordele og mangler som modeller for sygdom hos mennesker, der er uden for rammerne af dette manuskript8,12,18. En investigator skal gennemgå disse fordele og mangler at afgøre, om kaninen er den bedste model for at besvare en specifik eksperimentel spørgsmål.
Indførelsen af deoxyribonukleinsyre (DNA) regulerende sekvenser i endothelial celler i vivo giver mulighed for undersøgelse af disse sekvenser i et komplekst fysiologisk miljø aktivitet. In vitro undersøgelser i endothelial celler, transfekteret kan være nyttigt for den indledende vurdering af DNA regulerende sekvenser; dog er udtrykket niveauer i vævskultur modeller undertiden ikke gengivet når undersøgelserne er gentagne i vivo5,19,20. In vitro- systemer kan også være nyttig for at udforske grundlæggende veje af protein signalering og endotel fysiologi samt kommunikation mellem kulturperler vaskulære celler; dog studeret mere komplekse veje eller regulerende net, der er påvirket af komplekse populationer af vaskulære naboceller eller immunsystemet bedst i en i vivo system6,20. Den metode beskrevet heri giver en platform for at udforske regulering af transgenet udtryk i endotelet inden for rammerne af en intakt fartøj, med eller uden sygdom. In vivo -system også tillader undersøgelse af fysiologiske og patologiske cellulære krydstale og identifikation af bidrag af immunsystemet til regulering af gen expression6.
Kønsceller transgenese (især i mus) er en alternativ tilgang for at lede transgen udtryk i endothelial celler. Denne tilgang kan give livslang transgen udtryk, endotel målretning medieret af specifikke promotor eller regulerende regioner21,22. Men generation af Transgene mus er tidskrævende og dyrt, flere transgene linjer skal afprøves ofte for at sikre målretning af transgenet ønskede celletype og opnåelse af tilstrækkelig transgen udtryk niveauer, og eksperimenterende resultater i murine systemer kan være stamme-afhængige. Murine transgene modeller med endotel-målrettet transgener har mange fordele: der er ingen grund til at udføre kirurgi på hver eksperimentelle dyr for at opnå transgenese, eksperimentelle mus kan være opdrættet med talrige andre tilgængelige Transgene mus i for at teste genetiske og fænotypiske interaktioner, og der er et bredt udvalg af antistoffer, der reagerer med murine proteiner, lette karakterisering af fænotyper. Men målretning af transgener til endotelet via germinallinjen typisk resulterer i transgene udtryk i hele Vaskulaturen,22 gør det vanskeligt at bestemme det sted hvor transgen produkt handler. Dette er især tilfældet, når produktets transgen udskilles, fordi en transgen produkt udskilles af endothelceller hele Vaskulaturen kunne have biologisk aktivitet på et vilkårligt antal steder inden for et dyr. Selv om metoden i dette manuskript kræver teknisk ekspertise og specialiserede faciliteter, kan det være mindre tidskrævende og billigere end udvikle en endotel-specifikke Transgene mus linje. Det giver mulighed for vurdering af funktionen af en protein selektivt i endothelial celler af et segment af store arterie, og den tillader brug af de kontralaterale fælles carotis som parret kontrol (fjerne systemiske faktorer, der kan variere mellem eksperimentelle dyr-eksempelvis blodtrykket eller kolesteroltallet-som ukontrolleret variabler).
Genterapi er en lovende metode til behandling af Vaskulære sygdomme, specielt kroniske sygdomme, fordi en enkelt ansøgning kan give vedvarende eller eventuelt livslang udtryk for en terapeutisk gen23. Den terapeutiske løfte om genterapi er blevet undersøgt i dyremodeller for overførsel af somatiske gener, ofte rettet mod de lever24,25, hvilket er en forholdsvis let mål, fordi mange blodbårne virale vektorer er hepatotropic. Dog for at have en effekt på kar-sygdomme, skal genterapi målrettet til leveren opnå systemisk overekspression af proteiner. Dette kræver typisk store doser af vektor, som kan være giftige eller endog dødelig26. Desuden øget systemiske niveau af et protein raise risikoen for bivirkninger, off-mål, som kunne komplicere eller endda skjule fortolkning af eksperimentelle resultater. Lokale genterapi målretning vaskulære endotel som beskrevet i dette manuskript kunne undgå systemiske bivirkninger, fordi infunderes vektoren ikke formidlet bredt ud over den transduced arteriel segment, og lokale vaskulære effekter kan opnås uden ændringer i systemisk plasmaniveauer af protein. 27 desuden et langt lavere antal vektor for at transduce en arteriel segment end er nødvendig for at opnå robuste hepatisk transduktion. Transgenets udtryk fra leveren er blevet rapporteret at falde over tid, sandsynligvis på grund af cellefornyelsen, der kræver gentagen dosering hvis højtstående transgen udtryk skal opretholdes. 28 derimod en lav omsætningshastighed af endotelet giver stabil udtryk for mindst 48 uger i chow-fed kaniner og mindst 24 uger i aterosklerotiske læsioner af kolesterol-fed kaniner. 1 , 27
For at afgøre, om denne metode til genoverførsel til kanin fælles carotis endotelet er passende, bør fordele og ulemper (tabel 1) overvejes i forbindelse med de specifikke forskningsmål. Fordele ved denne metode omfatter: outbred kaniner er bedre repræsentant af menneskers genetiske diversitet end er indavlede mus (vigtigt for prækliniske arbejde); kaniner giver større fartøjer til lettere manipulation og mere væv til analyse. metoden kan opnå endotel-målrettet transgen udtryk langt hurtigere end gør kønsceller endotel målretning i Transgene mus; vektor dosis kan justeres nemt til model variable niveauer af transgenet udtryk; processer, der er specifikke for store-arterie endotelet kan undersøges; og lokale vaskulære transgenese tillader den modsatte carotis i det samme dyr som bruges som en kontrol, at fjerne systemiske faktorer som ukontrolleret variabler. Ulemper omfatter: særlige faciliteter og ekspertise er påkrævet; færre genetisk modificerede baggrunde som at eksperimentere er tilgængelige i kaniner end i mus; og der er en mindre omfattende udvalg af antistoffer mod kanin versus mus proteiner (for immunodetection af transgenet protein og andre antigener, der kan være vigtige i fortolkning af eksperimentelle resultater).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der beskrives her blev godkendt ved University of Washington Office for dyrevelfærd og tilknyttede institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC), og blev afsluttet i overensstemmelse og overensstemmelse med alle relevante lovgivningsmæssige og institutionelle retningslinjer.
Bemærk: Overførsel af gener til kanin fælles halspulsårer udføres på kaniner af en kirurg ved hjælp af en anæstesilæge eller assistent.
1. genoverførsel til kanin fælles halspulsårer: før operation
- Bedøver kanin. Veje kaninen. Kombinere 30 mg/kg ketamin og 2 mg/kg xylazin i en sprøjte. Injicere ketamin/xylazin intramuskulær (IM) i paraspinous muskler til at fremkalde anæstesi.
- Mens vi venter kanin at blive bedøvede, forberede forberedelseslokalet og operationsstuen (OR) tabeller.
- I forberedelseslokalet OR: placere den oftalmologiske salve og fentanyl plaster inden for rækkevidde af tabellen forberedelse; Opsætning af hårklippemaskiner og et vakuum for barbering kanins hals og øre; der er afsat en prep alkoholserviet, en 24G x ¾" kateter, en injektion port og kirurgisk tape til at sikre linjen intravenøs (IV) i den kanin øre vene.
- I OR: oprettet den overvågningsudstyr og placere sonder [elektrokardiogram (EKG), iltmætning (SpO2), temperatur] på tabellen OR; forberede ilt og isofluran; binde gaze strip til ansigtsmaske til at fastgøre den til kanin og placere masken på hovedet ende af bordet.
Bemærk: Gaze strimler bundet på ansigtsmaske bør have 2 haler på omkring 45 cm. - Tænd den opvarmning vand tæppe på tabellen OR. På toppen af vandet tæppe, placere en sammenrullet håndklæde for nakkestøtte og en dispersive elektrode plade (senere lægges under kaninens tilbage).
- Oprette eller IV pumpe med 100 mL af en saltvand IV taske med en 18-19G kanyle knyttet og indstille flowet til 10 mL/h pr. kg.
- Kombiner 1 mL lidocain HCl (2% stamopløsning) og 1 mL af bupivicaine HCl (0,5% stamopløsning) i en sprøjte, der skal bruges som en lokal analgetikum.
- Når kanin er fuldt bedøvede, forberede kirurgi kanin.
Bemærk: Kontroller, om manglen på en pedal refleks (hugge en tå, kigge efter lemmer tilbagetrækning) at sikre bedøvelsesmiddel dybde, og fortsætte med at overvåge den pedal refleks i hele operationen.- Anvende oftalmologiske salve til øjne. Fjern afføring fra den kanin endetarmen ved at trykke med behandskede fingre på det forreste underlivet (ovenfor endetarmen) og bevægelige fingre mod anus. Dette vil give mulighed for senere placering af en rektal temperatur sonde.
- Barbere forreste nakken fra brystbenet hak på kant af mandiblen mens du bruger et vakuum til at holde området rent. Også barbere begge ører for IV placering og fentanyl plaster udlæg, og barbere en venstre bageste midterste tå for pulsoximetri sonden.
Bemærk: Protokollen antager, at kirurgen er kanins højre side under hele proceduren. Hvis opsætningen OR steder kirurgen på den modsatte side, vende sider i dette skridt til at holde ledninger og IV overfor af kirurgen. Siderne af fremtidige skridt skal også skiftes efter behov. - Tør det venstre øre med en prep alkoholserviet, placere en 24G IV kateter ind i venstre øre vene, cap med havnens injektion og tape kateter/port til den kanin øre til at fastgøre den. Anvende et fentanyl plaster (25 µg/h) på kanins højre øre.
- Transportere kaninen i OR og placere liggende på operationsbordet med en rullet hals støtte håndklæde under den kanin halsen lige under hovedet. Forsigtigt udvide kanins hals, indtil det er glat og omtrent vandret.
- Krog kanin op til ansigtsmaske med O2 på 1 L/min., og starte isofluran administration. Secure masken af indpakning enderne af gaze strip bundet til maske omkring hals støtte håndklæde under kanin. Justere isofluran (typisk 1-2%), efter behov (baseret på puls, respirationsfrekvens og pedal refleks) at opretholde ordentlig anæstesi for resten af proceduren.
- Sikre, at dispersive elektrode plade er centreret under den kanin tilbage. Temperatur og puls oximeter sonder og anvende EKG fører til kaninen.
- Hook op IV saltvand til kateter-porten i den kanin øre, starter saltvand pumpen på 10 mL/h pr. kg.
Bemærk: Efter 1 h, saltvand pumpen kan reduceres til 5 mL/h pr. kg. - Begrænse den kanin forbenene af løst binde dem til tabellen. Valgfrit, placere en lille plast bord over kanin til at beskytte kaninen fra bliver udsat for brystet/abdominal pres fra kirurgen hælder på kanins brystet/maven.
Bemærk: Den lille tabel kan hjælpe med at forhindre tvungen gylp af abdominal indholdet. - Injicere 2 mL af tidligere forberedt lidocain (2% stock) / bupivacaine (0,5% stock) (50/50 mix) subcutaneously langs den planlagte hals indsnit linje for lokalbedøvelse.
- Lad assistenten forberede operationsstedet med 3 skiftevis scrubs af klorhexidin og isopropanol, og derefter en spray med betadine. Krat, kjole og handske, efter korrekt aseptisk teknik.
Bemærk: Kirurgen skal være iført 2 x kirurgisk loupes at støtte med den første halvdel af kirurgi. Under overlevelse kirurgi er det afgørende at bevare steriliteten af kirurgen og feltet kirurgisk. Kun assistent skal håndtere eventuelle ikke-sterile elementer, og steriliseret materialer skal være aseptisk videre til kirurgen eller placeret på tabellen draperet instrument. Sterile håndklæder kan bruges af kirurgen for at bevare steriliteten mens manipulere med ikke-sterile udstyr såsom mikroskop.
2. overlevelse kirurgi (genoverførsel)
- Udarbejde instrumenter og sterilt felt.
- Lad assistenten åbne steril drapere pakke som indeholder en tabel drapere, et papir drapere for kaninen, og flere håndklæder. Aseptisk overføre varerne til kirurgen.
- Drapere tabellen instrument. Sted 6 sterile håndklæder og papir drapere på draperet bordet.
- Med 4 håndklæder, drapere kanins hals, forlader kun operationsstedet udsat (ca 4 cm x 10 cm). Lægge papir drapere over kanin.
- Lad assistent åbne steriliseret instrument pakke og placere aseptisk på instrument bordet.
- Lad assistent åbne følgende udstyr og aseptisk sted på instrument bordet eller hånd til kirurgen: tre 1-mL sprøjter (og en nål hvis sprøjter ikke allerede er indlæst med nåle), en 20 mL sprøjte, en 21G kanyle, en 19G kanyle, 3-0 polyglycolic syre (PGA) sutur, 5-0 PGA sutur, 7-0 polypropylen sutur og to 24 G IV-katetre.
- Sikre Elektrokauterisation kabel til kanin drapere benytter den 7.25" Kantrowitz pincet og så drop stikket ende ud af bordet. Lad assistent Tilslut kablet til elektrokirurgiske enhed, og tænd for strømmen.
- Fylde en 20 mL sprøjte med sterilt saltvand, trukket fra en IV taske eller hætteglas afholdt af assistenten. Brug denne saltvand efter behov for at holde udsatte væv fugtig under fremgangsmåden.
- Forberede en 1 mL sprøjte med 1 mL af Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM, til vask arterie). For hver halspulsåren, der vil være transduced, med henblik på 0,35 mL fortyndet virus. Hvis den samme virus bruges til begge sider, udarbejde en 1 mL sprøjte med virus fortyndet i DMEM til et volumen på 0,7 mL. Hvis forskellige sider modtager forskellige vira [for eksempel et "Null" virus kontrol på den ene side], forberede to 1 mL sprøjter, hver med 0,35 mL af virus løsning. For hjælperen-afhængige adenovirus, virus fusionen er 2 x 1011 viruspartikler (vp) / mL.
Bemærk: Lad assistenten forberede virus. Kirurgen udarbejder DMEM og virus suspension i sterile sprøjter. - Skær et hul i drapere. Størrelsen af hullet skal være af samme størrelse som operationsstedet på kanins hals, der er indrammet af håndklæder i trin 2.1.3. Klem hjørnerne af hullet i papiret drapere til de underliggende håndklæder, der er draperet over kanins nakke med håndklæde klemmer.
- Isolere de fælles halspulsårer.
Bemærk: 2 x kirurgisk loupes skal bruges til denne del.- Skære huden med en Elektrokauterisation langs midterlinjen udvide ca 7-9 cm cranially mod mandiblen og klemme huden open med håndklæde klemmer.
- Gøre et kort laterale snit gennem fascia med Elektrokauterisation caudale enden. Derefter indsætte den store saks i snittet og uden omsvøb dissekere fascia langs hele midterlinjen. Skære dissekeret fascia ned midterlinjen med Elektrokauterisation.
- Med små dissekere saks, dissekere mellem de V-formede muskler (sternocephalic muskel) og sternohyoid muskler over i luftrøret, at udsætte de fælles halspulsårer, starter på højre side.
- Dissekere gratis fra omkringliggende væv, dividere alle grene fra bunden af halsen caudally til passage af svælg nerve cranially højre fælles halspulsåren. Brug kirurgisk silicium sløjfer til støtte i tilbagetrækningskraften arterien under dissektion.
Bemærk: Pleje bør tages ikke forstyrrer den vagus nerve, som løber parallelt med den fælles carotis, eller mindre nerver, der krydser over den fælles carotis. - Ligate store filialer, som kommer fra den fælles halspulsåren (1-2 per side) med 5-0 silke suturer før opskæring gren distalt for at frigøre en 4-5 cm segment af carotis. Skåret sammenskrevne grene 1-2 mm fra slips, så uafgjort ikke glider ud.
- Gentag dissektion i venstre side (trin 2.2.3 - 2.2.5).
- Indgyde vektorer i fælles halspulsårer.
Bemærk: En kirurgisk mikroskop (16 X) bruges efter behov for at udføre arteriotomy, infusion af vektor/kontrol løsning og arteriotomy reparation.- Lad assistent fjerne de kirurgiske loupes fra kirurgen og flytte den kirurgisk mikroskop i position. Drapere et sterilt håndklæde over mikroskop til at tillade manipulation af mikroskopet uden at forurene det sterile felt.
- Injicere heparin [150 internationale enheder (IU) /kg] i IV kateter og skyl med 10 mL saltvand.
- Vender tilbage til den isolerede lige fælles carotis, sætte to silke bånd omkring midten del af de mobiliserede carotis segment og binde en enkelt overhånd knude på hver - uden at stramme disse.
- Bøje 19G nålen lige over facetten til ca. 80° stor nål-driveren (ikke bøje facet; Figur 1).
- Klemme arterie i hver ende af den isoleret segment med vaskulære clips, placere kraniel klippet første at muliggøre arterie påfyldning og derefter placere den caudale klip.
- Punktere den fælles halspulsåren med bøjet 19G nålen bare kranie til den caudale vaskulære klip, at tage stor omhu at ikke punktere de tilbage eller side vægge. Rykke nål-spidsen ind i lumen og trække det to gange for at sikre arteriotomy helt krydser arterievæggen. Derefter forsigtigt trække nålen.
Noter: Det er vigtigt at skabe en arteriotomy, der trænger alle lag af arterievæggen renlig og ikke dissekere arterievæggen (ved at passere aksialt gennem adventitia og medier). For at opnå dette, bør carotis punkteret med nål spidsen placeret så tæt som muligt til en 90° vinkel mod arterievæggen (figur 1). Carotis punktering i en 90° vinkel er hjulpet på vej af sensationsprægede arterie ved adventitia med fine pincet og forsigtigt løfte arterie overflade mens du trykker på spidsen af nålen kun caudale til punktet, lift. Denne manøvre også reducerer risikoen for at ramme bagvæggen (figur 1). - Udfolde og bunke-up flere gaze puder i en rede som at lægge sprøjten bruges til infusioner. Placere reden på kanins bryst caudale til snit.
- Sætte en IV-kateter på sprøjten, der indeholder DMEM, der kun (ikke for stram) og bøje kateter ~ 4 mm fra spids, så bøje holder på ca 75° efter det er frigivet.
- Indsæt IV-kateter i arteria indtil punktet, bøje og udviske alle blod fra arterie med DMEM (~ 2 x 0,25 mL). For hver vask, fylde arterien med DMEM, og fjern derefter resterende DMEM fra fartøj lumen ved forsigtigt at trykke på arterie med en behandsket finger, begynder lige caudale kraniel vaskulære klip. Samtidig opretholde blide tryk, skub fingeren fra kranie til caudale. De luminale indhold vil vaske ud via arteriotomy.
- Holde kateteret i arteria og udveksle DMEM sprøjten til sprøjte indeholdende virus løsning. Sørg for, at ingen luft ind kateteret.
- Skub de silke bånd ned arterie, således at de omgiver arterie på placeringen af kateter tip, men ikke stramme dem.
- Indgyde 0,03 mL af virus løsningen presse de resterende DMEM ud af kateteret og derefter tømme arterie. Skjule det ved igen at fjerne alle væske fra lumen med en finger, kranie til caudale (som i trin 2.3.9).
- Spænd de to bånd omkring kateteret tip til at forsegle lumen. Indgyde virus løsningen (~ 0,25 mL; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus) ved at trykke på sprøjten stemplet forsigtigt, indtil arterien er udspilet til fysiologiske kaliber.
Bemærk: Det er vigtigt, at arterien udvider til fysiologiske kaliber og forbliver udspilet under virus infusion. Hvis ikke, graden af genoverførsel vil falde betydeligt. - Forsigtigt lægge sprøjten på reden af gaze.
- Placer en 7-0 polypropylen sutur i fælles carotis adventitia bare caudale af kraniel vaskulære klippet for at markere den kranielle grænse af genet transduktion
- Når virus-holdige løsningen har været i arterie lumen i 20 min., fjerne virus-holdige sprøjten og erstatte det med en tom sprøjte. Opsug den virus-holdige løsning forsigtigt, indtil fartøjet kollapser og fjern sprøjten. Skære eller fortryde de silke bånd og forsigtigt fjerne kateteret.
Bemærk: Skære båndene meget korte aids i at fjerne dem. Fjerne kateter omhyggeligt for at undgå at beskadige carotis endotelet. - Bruger kirurgisk mikroskop, Luk arteriotomy med 7-0 polypropylen ved hjælp af en X-mønster (figur 2).
- Gøre en first-pass ind nederst til højre i arteriotomy og spændende fartøj nederst til venstre. Derefter krydser åbningen og gøre en anden pass fra øverste højre til øverste venstre.
- Før binde ned sutur, skylle ud arterie ved at frigive meget kort kranie vaskulære klippet. Blodet vil flyde ud af arteriotomy når klippet er frigivet, at fjerne luft og resterende virus fra lumen.
- Trække sutur for at forsigtigt lukke arteriotomy og binde en sutur med 2 pladsen knob.
Bemærk: Trække sutur for stram vil forårsage bunching af væv, der vil forstyrre flow, øger blodprop-risiko og skiftende flow, som kan være en vigtig ukontrolleret variabel i sygdomsmodeller.
- Frigive kraniel vaskulære klippet, og derefter den caudale vaskulære klip med let tryk med gaze til at standse eventuelle blødninger. Hvis blødningen fortsætter, fortsat pres for 1-2 min. Hvis arteriotomy var korrekt lukket, stopper blødningen altid inden for denne tidsramme.
- Lad assistenten injicere buprenorphin [0,02 mg/kg; subkutan (SQ)] på omkring dette tidspunkt at give postoperative analgesi indtil fentanyl plasmaniveauer blive terapeutisk.
NOTE: En anden buprenorphin injektion (0,02 mg/kg; SQ) kan være nødvendigt 6 h efter den første injektion at opretholde analgesi indtil fentanyl plasmaniveauer blive terapeutisk. - Gentag virus infusion protokol på venstre side efter trin 2.3.2 - 2.3.19.
- Såret lukning
- Brug en 5-0 PGA sutur lukke midterlinjen fascia med en fortløbende sutur.
- Med en 3-0 PGA sutur, lukke huden med en intradermal mønster ved hjælp af en nedgravet knude i begge ender.
- Postoperativ nyttiggørelse og oprydning.
Bemærk: Kaninen skal overvåges konstant for ordentlig iltning og krop temperatur mens inddrive fra anæstesi. Genoprettelse bør finde sted i et roligt og roligt miljø.- Slå isofluran og ilt flow og fjerne ansigtsmaske fra kanin.
- Løsne IV væsker men forlade IV havn i stedet for adgang til beredskabstjenester IV.
- Tage kaninen til området recovery og lå på sin side i et bur med en opvarmning vand tæppe tændt (eller eventuelt en Bair Hugger varmelegeme).
- Give O2 af maske, indtil SpO2 er stabil.
- Lad kaninen inddrive i et bur, flipping det til anden siden hver 15 min, indtil kaninen kan sidde op på bagbenene og flytte rundt.
- Når kaninen er mobile, skal du fjerne IV fra dens øre før han vendte tilbage til buret.
Bemærk: Returnere ikke en kanin til selskab med andre dyr, indtil det er fuldt tilbagebetalt fra anæstesi.
- Disponere over noget, der havde kontakt med vektoren eller var i feltet udløsende, følgende passende biologisk og klid affald protokoller.
3. genoverførsel til kanin fælles halspulsårer: postoperativ pleje
- Vurdere den kaninens generelle tilstand dagligt efter kirurgi, kontrol for sårheling, tegn på infektion, appetitløshed, respiration og tegn på smerte.
- Tjek den kanin øre position (ører ned kan være et tegn på smerte eller lidelse, især når kombineret med en sjusket udseende). Kontroller, at kaninen forbliver mobil og aktiv. Kontrollere kanin normal respiration uden stridor. Kontroller, at såret er ren, tør og intakt. Kontrollere kanin for en normal kropstemperatur. Konsultere veterinære tjenester, hvis kaninen ikke er mobil og aktiv, med normal kropstemperatur, et ryddeligt udseende, et rent sår og normal respiration.
- Check for normal fødeindtagelse og beviser af frisk fæces og urin.
Bemærk: Fødeindtagelse kan være nedsat efter operationen, men bør vende tilbage til normal inden 2 dage. give supplerende mad efter behov.
- Fjerne fentanyl plaster på postoperative dag 3.
Bemærk: Buprenorphin kan administreres, som er nødvendig for postoperativ smerte, der ikke administreres af fentanyl plaster, eller i tilfælde af fentanyl plaster er fjernet tidligt.
4. terminal høste kirurgi: før operation
- Bedøver kanin. Se afsnit 1.3 og 1.3.5 vedrørende præstation og vedligeholdelse af anæstesi.
- Veje kaninen. Kombinere 30 mg/kg ketamin og 2 mg/kg xylazin i en sprøjte. Injicere ketamin/xylazin IM i paraspinous muskler til at fremkalde anæstesi.
- Forberede forberedelseslokalet og eller borde samtidigt med at venter nemlig kaninen at blive bedøvede.
- I forberedelseslokalet OR: setup hårklippemaskiner og et vakuum for barbering kanins hals og øre.
- På operationsstuen: setup overvågningsudstyr og placere sonder (SpO2, temperatur) på tabellen OR; forberede ilt og isofluran; binde gaze strip til ansigtsmaske til at fastgøre den til kanin og placere masken på hovedet ende af bordet.
Bemærk: Gaze strimler bundet på ansigtsmaske bør have 2 haler på omkring 45 cm. - Drej på opvarmning vand tæppe på tabellen OR. Oven på vand tæppet, placere en sammenrullet håndklæde for nakkestøtte og en dispersive elektrode plade (senere lægges under kaninens tilbage).
- Kombiner 1 mL lidocain HCl (2% stock) og 1 mL af bupivicaine HCl (0,5% stock) (50/50 mix) i en sprøjte som en lokal analgetikum.
- Når kaninen er fuldt bedøvede, forberede kirurgi kanin.
- Fjern afføring fra endetarmen, som beskrevet i 1.3.1, at give mulighed for senere placering af en temperatur sonde.
- Barbere kanin fra brystbenet hak til vinklen af mandiblen mens du bruger et vakuum til at holde området rent. Også barbere den venstre bageste midterste tå for pulsoximetri sonden.
Bemærk: Protokollen forudsætter, at kirurgen vil være kanins højre side. Hvis opsætningen OR vil placere kirurg på den modsatte side, vende sider i dette skridt til at holde ledninger overfor af kirurgen. Siderne af fremtidige skridt skal også skiftes efter behov. - Transportere kaninen i OR og placere liggende på operationsbordet med en rullet hals støtte håndklæde under den kanin halsen lige under hovedet. Forsigtigt udvide kanins hals, indtil det er glat og omtrent vandret.
- Krog kanin op til ansigtsmaske med O2 på 1 L/min., og starte isofluran administration. Secure masken af indpakning enderne af gaze strip bundet til maske omkring hals støtte håndklæde under kanin. Justere isofluran (typisk 1-2%), som kræves for at opretholde ordentlig anæstesi for resten af proceduren.
- Sikre, at dispersive elektrode plade er centreret under kanins tilbage. Placer temperatur og pulsoximeter sonder.
- Begrænse den kanin forbenene af løst binde dem til tabellen.
Bemærk: Valgfrit, placere en lille plast bord over kanin til at beskytte kaninen fra bliver udsat for brystet/abdominal pres fra kirurgen hælder på kanins brystet/maven. Målet her er at forhindre tvungen gylp af abdominal indholdet. - Injicere 2 mL lidocain (2% stamopløsning) / bupivacaine (0,5% stamopløsning) (50/50 mix; fra trin 2.4) subcutaneously langs den planlagte hals indsnit linje for lokalbedøvelse.
- Spray operationsstedet med betadine. Sætte på rene handsker til kirurgisk procedure.
5. terminal kirurgi (fartøj høst)
- Udarbejde instrumenter og kirurgiske felt.
- Åbne en ren drapere pack, der indeholder en tabel drapere og et papir drapere nemlig kaninen. Drapere tabellen instrument.
- Åbne instrument pakke, sted på instrument bordet og arrangere instrumenter. Placer følgende udstyr på instrument bordet: en 20 mL sprøjte og en 21G kanyle.
- Sikre Elektrokauterisation kabel til kanin drapere bruger 7.25" Kantrowitz pincet. Sæt stikket til elektrokirurgiske enhed og tænde den.
- Fylde en 20 mL sprøjte med sterilt saltvand. Brug denne saltvand efter behov til at holde de udsatte væv fugtig under fremgangsmåden.
- Placer papir drapere over kanin og skære et hul i drapere over operationsstedet på kanins hals. Klem hjørnerne af hul i sted for den kaninhud med håndklæde klemmer.
- Isolere fælles halspulsårer.
Bemærk: 2 x kirurgisk loupes skal bruges til denne del.- Skær huden med en Elektrokauterisation langs midterlinjen udvide ca 7-9 cm cranially mod underkæben og klemme huden åben med håndklæde klemmer.
Bemærk: Hvis høsten er kun et par dage efter tidligere operation, Elektrokauterisation ikke nødvendig. Bare skære suturer og træk forsigtigt åbne indsnittet fra den tidligere operation. - Gøre et kort laterale snit gennem fascia med en Elektrokauterisation caudale enden. Derefter indsætter stor saks i snittet og uden omsvøb dissekere fascia langs hele midterlinjen. Skære dissekeret fascia ned midterlinjen med Elektrokauterisation.
- Med små dissekere saks, dissekere mellem de V-formede muskler (sternocephalic muskel) og sternohyoid muskler over i luftrøret, at isolere de fælles halspulsårer, starter på højre side.
- Dissekere den rigtige arterie gratis fra omkringliggende væv fra bunden af halsen caudally til passage af svælg nerve cranially. Brug kirurgisk silicium sløjfer til støtte i tilbagetrækningskraften arterien under dissektion.
- Gentag dissektion i venstre side (trin 5.2.3 - 5.2.4).
- Med en 3-0 silke sutur, ligate den fælles halspulsåren kranie til det segment, der blev tilført med vektor (brug adventitial sutur placeret på første operation hen til lokalisere det kranielle omfanget af vektor infusion. Derefter ligate carotis caudale til den reparerede arteriotomy.
- Punktafgifter carotis segmentet mellem ligations, og skyl lumen med saltvand. Trimme væk overskydende adventitial væv fra fartøjet og skære den carotis segment i mindre stykker for de forskellige slutpunkt analyser (histologi, DNA, ribonukleinsyre (RNA), protein, explant, kultur, osv.).
- Indsprøjte 1 mL af Beuthanasia IV at aflive, og bekræfte eutanasi af kanin.
- Skær huden med en Elektrokauterisation langs midterlinjen udvide ca 7-9 cm cranially mod underkæben og klemme huden åben med håndklæde klemmer.
- Disponere over noget, der havde kontakt med vektoren eller var i feltet udløsende, følgende passende biologisk og klid affald protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at implementere denne metode med tillid, er foreløbige forsøg nødvendige for at fastslå, at erhvervsdrivende opnår effektiv og reproducerbare genoverførsel, med transgen udtryk primært i luminale endotelceller. Vores erfaring vurderes dette lettest ved hjælp af en vektor, der udtrykker β-galactosidase. 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) farvning af fælles carotis segmenter fjernet 3 dage efter vektor infusion, samt måling af β-galactosidase mRNA (messenger RNA) med kvantitative reverse transkription polymerase kæde reaktion (qRT-PCR), vil afsløre effektivitet, reproducerbarhed og placering af de transduced celler. Til eksperimenter med at undersøge virkningerne af transgenet udtryk eller måler aktiviteten af cis-handler transcriptional elementer, vi typisk måle transgen mRNA som en første indikation af niveau og reproducerbarhed af genoverførsel.
En ny operatør i vores laboratorium forsøgte at etablere færdigheder med denne metode ved transducing kanin fælles carotis arterier med en adenoviral vektor (2 x 1011 vp/mL) udtrykker en β-galactosidase transgen, drevet af en cytomegalovirus (CMV) promotor. Transduced arterier var fældet 3 dage senere og blev skåret tværs i segmenter. Enkelte segmenter var derefter enten skar aksialt eller venstre så intakt ringe. Alle segmenterne var X-gal farves i microcentrifuge rør. Segmenter, der var blevet skåret åben aksialt blev placeret på en vandret overflade og den luminale overflade maksimalt udsat, ved hjælp af stifter efter behov for at forhindre segmentet i curling op. Da ansigt billeder om de luminale overflader viste robust endotel farvning med X-gal (tal 3A og 3B). Aksial billeder af den luminale overflade af intakt carotis ringe viste X-gal farvning kun om det luminale overflade (tal 3 c og 3D). De segmenter, der havde åbnet aksialt blev forarbejdet til paraffin, sectioned og Counter farves med enten hæmatoxylin og eosin eller nukleare hurtig rød. Billeder viser X-gal farvning primært i endothelium, selv om der er en lille mængde af farvning i det adventitial lag (tal 3E og 3F). Transduktion af adventitial celler kan ske via lækage af vektor via webstedet arteriotomy eller lækage via små grene proksimalt for webstederne af side gren ligatur. 29
I en særskilt eksperiment forsøgte en ny operatør at etablere færdigheder i at opnå reproducerbare niveauer af transgenet udtryk, som en optakt til eksperimenter med henblik på at undersøge biologiske aktiviteter af transgener. Kanin fælles halspulsårer var transduced med helper-afhængige adenovirus (2 x 1011 vp/mL) der indeholder enten en apo A-jeg (HDAdApoAI) eller IL-10 (HDAdIL10) transgen, både under kontrol af en CMV promotor. Transduced arterier var fældet 3 dage efter transduktion og skær paa tvaers i segmenter. RNA blev udvundet fra fartøj segmenter og apo A-jeg og IL-10 mRNA udtryk var kvantificeres ved qRT-PCR, med normalisering til glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) mRNA i samme uddrag (figur 4). I HDAdIL10-transduced arterier, kun 1 ud af 6 arterier havde en meget lav, men påviselig apo A-jeg mRNA signal. Betyder udtrykket af apo A-jeg mRNA var 700-fold større i de fartøjer, transduced med HDAdApoAI end i fartøjer transduced med HDAdIL10. Lave niveauer af endogent IL-10 mRNA blev fundet i HDAdApoAI-transduced arterier, med middelværdi udtryk øget 6-fold i HDAdIL10-transduced arterier. Bemærk er der betydelig samhandelen og Inter-Diesel artery variation i transduktion effektivitet og transgen udtryk, som vist i figur 3 og 4, henholdsvis. Vi finde denne variabilitet selv med erfarne aktører.
Figur 1 . Arteriotomy i fælles halspulsåren. Fine pincet bruges til at forstå halspulsåren adventitia og anvende opadrettet trækkraft på arterie. Denne manøvre udvider fartøj lumen og genererer en lodret overflade som bent 19G nålen er sat, derved at minimere risikoen for punktering bagvæggen af arterie. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Lukning af fælles carotis arteriotomy. Arteriotomy er lukket med en 7-0 polypropylen sutur, ved hjælp af en X-mønster. Den første pass af nål og sutur træder arterie lumen på nederste højre hjørne af arteriotomy (side 1) og afslutter lumen nederst til venstre (side 2). Nål og sutur derefter krydser arteriotomy og genindtaste lumen øverst til højre (side 3). Nålen afslutter derefter lumen øverst til venstre (side 4). Blide trækkraft på begge ender af sutur lukker arteriotomy. Sutur enderne (ud af side 1 og side 4) er bundet med 2 pladsen knob. Grå cirkler repræsenterer lokaliteter af suturer passerer gennem karvæggen. Solid blå linjer angiver områder, hvor suturen er uden for karvæggen. Stiplede blå linjer angiver områder, hvor sutur i lumen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Effektiv endotel transgen udtryk. Kanin fælles halspulsårer var transduced med en adenoviral vektor udtrykker en β-galactosidase transgenet og høstede 3 dage senere. Transduced arterie segmenter var X-gal farves så intakt ringe eller efter åbnes med en aksial cut. (A-B) Da ansigt billeder af carotis ringe, der blev skåret åben aksialt luminale flader. (C-D) Aksial visninger til den luminale plads af intakt carotis ringe. (E-F) X-gal farves, paraffin-embedded carotis segmenter var sektionerede og Counter farves med enten (E) hæmatoxylin og eosin eller (F) nukleare hurtig rød. Skalalinjen = 100 µm. Jeg = intima; M = medier; og en = adventitia. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Kvantificering af transgenet mRNA udtryk. Kanin fælles halspulsårer var transduced med helper-afhængige adenovirus udtrykker enten apo A-jeg (HDAdApoAI) eller IL-10 (HDAdIL10) under kontrol af en CMV promotor. Arterier er høstet 3 dage senere. mRNA udtryk for (A) Apo A-jeg og (B) IL-10 var kvantificeres ved qRT-PCR, normaliseret til GAPDH mRNA i den samme arterie, og udtrykt som arbitrære enheder (AU). Bar angiver gennemsnitsværdien; P -værdi er fra rang-summen test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Fordele | Ulemper | |
| I forhold til gnavere modeller | Tættere Fylogenetisk på primater | Dyrere at købe og hus |
| Større genetisk diversitet, lempelse kliniske Oversættelse | Vanskeligere at opdrætte og håndtere | |
| Større fartøjer tillade lettere kirurgisk manipulation og giver mere væv til kvantitativ analyse | Mere omfattende lovkrav | |
| Tillader brug af Intravaskulært udstyr designet til mennesker | Færre genetisk modificerede baggrunde | |
| Mindre omfattende udvalg af antistoffer mod kanin proteiner | ||
| I forhold til større dyremodeller | Relativt billigt at købe og hus | Muligvis mindre klinisk relevante end andre store dyremodeller for nogle Vaskulære sygdomme |
| Lettere at avle og håndtere | ||
| I forhold til kønsceller transgenese | Transgenets udtrykt kun i store arterie; virkningen af transgene specifikt på webstedet af interesse kan bestemmes | Anvendelsen af metoden til celler end endotelet er vanskeligt |
| Kan anvende kontralaterale carotis som parret kontrol; eliminerer systemisk parametre (fx., blodtryk, kolesteroltal) som ukontrolleret variabler | Operationsstuen og kirurgisk ekspertise påkrævet; Core faciliteter sandsynligvis ikke tilgængelig | |
| Højere overførselshastighed for test DNA regulerende sekvens aktivitet i stort skib endotelet | Transgenet ikke kan udtrykkes i de fleste vaskulære senge | |
| Potentielt hurtigere og billigere | ||
| Systemisk eksponering for transgene protein usandsynligt — minimerer off target effekter | ||
| I forhold til systemisk genterapi tilgange (fx. Leveren transduktion via perifer vene injektion) |
Mere-stabil transgen udtryk end systemisk (lever) genterapi | Vektor levering kræver kirurgisk indgreb |
| Transgenets udtrykt i arterievæggen, muliggør lokale levering af høje niveauer af transgene protein | Operationsstuen og kirurgisk ekspertise kræves | |
| Systemisk eksponering for transgene protein usandsynligt — minimerer off target effekter | Behandling begrænset til arterier, der er specifikt målrettet til intervention; ikke behandle systemiske faktorer (fx., lipider) | |
| Kan anvende kontralaterale carotis som parret kontrol; eliminerer systemisk parametre (f.eks. blodtryk, kolesteroltal) som ukontrolleret variabler | ||
| Langt lavere vektor dosis kræves |
Tabel 1. Fordele og ulemper ved kanin fælles halspulsåren endotel-selektiv gen overføre model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Visse aspekter af kirurgisk teknik fortjener særlig opmærksomhed. Fuld eksponering og mobilisering af den fælles halspulsåren via omhyggelig dissektion vil lette gen overførsel og arteriotomy reparation. Under dissektion, bør direkte manipulation af halspulsåren minimeres for at forhindre vasospasme. Derudover eventuelle blødninger ved siden af arteria bør stoppes ved at anvende let tryk med gaze og røde blod skal renses op straks skylles området med normal saltvand. Det er også vigtigt at undgå at beskadige den vagus nerve, som løber parallelt med den fælles halspulsåren. Trimning adventitia inden for den planlagte arteriotomy vil hjælpe operatør til at udføre en ren og funktionelle arteriotomy og reparation af arteriotomy. Endelig, grene fra den fælles halspulsåren identificeret og sikkert forbundet for at forhindre udsivning af vektoren fra carotis lumen.
Der er også vigtige aspekter af vektor infusion og arteriotomy reparation. Under vektor infusion er det vigtigt at svulme op den fælles carotis til fysiologiske eller lidt større kaliber til at opnå effektiv transduktion. Når reparation af arteriotomy, bør sutur trænge ind i karvæggen så tæt som muligt til kanten af arteriotomy, og bør rent indtaste og afslutte lumen snarere end passere aksialt gennem karvæggen. Hvis kun de ydre lag af karvæggen er trukket sammen, fordi suturen passerer aksialt gennem karvæggen i stedet for radialt gennem væggen og ind i lumen, en hul vil forblive i intima og vil øge risikoen for blodpropper. Hvis sutur Gennemføringer er for bredt fordelt, eller hvis suturen over strammet når bundet, vil væv folder blive oprettet på webstedet arteriotomy. Disse folder forstyrre normale laminar blodgennemstrømning, også øget risiko for blodpropper. Opretholde konsekvent flydeegenskaber er vigtigt for eksperimenter udført i dyremodeller for sygdomme (fx., åreforkalkning) fordi ændrede flow kan bidrage til sygdommen proces30.
Nye operatører støder ofte thrombosed arterier på høst. Luminale trombose er en ødelæggende komplikation, rendering arterie ubrugelig som en eksperimentel prøve. For at forebygge blodpropper, administrere vi rutinemæssigt IV heparin før genoverførsel. Trombose er også forebygges ved omhyggelig lukning af arteriotomy, som beskrevet ovenfor. Heparin dosering kan øges for at forebygge blodpropper, eller aspirin kunne gives efter operationen. Men en højere dosis af heparin ville også øge potentialet for blødende komplikationer, og aspirin kan interferere med eksperimentelle slutpunkter, især hvis betændelse er undersøgt. Derfor er det at foretrække at fokusere på forbedrede kirurgiske teknik som et middel til at forebygge blodpropper.
Hvis manipuleret for voldsomt, kan carotis arterierne underkastes krampe, som også kunne bidrage til trombose ved at reducere flow. Hvis vasospasme er stødt på, kan det afhjælpes ved anvendelse af aktuel papaverin. Når fartøjet høsten er planlagt i mere end 2-3 dage efter transduktion, og trombose er en bekymring, kan transkutan ultralyd bruges til at noninvasively vurdere fartøj passage. Opdagelsen af thrombosed arterier kan føre til aktiv dødshjælp for at spare på boligudgifter. Dyr kan også være indskrevet straks, for at fylde eksperimentelle grupper. Peri og efter intervention dødelighed forbundet med denne metode skulle være < 1% (dvs., ikke adskiller sig fra dødelighed forbundet med andre operationer udføres på raske kaniner)31.
Efter en operatør bliver fortrolig med de tekniske aspekter af kirurgisk protokollen, en evne til at udføre effektiv genoverførsel endotelet behov skal verificeres, ved hjælp af metoder, der er beskrevet i afsnittet ovenfor om repræsentative resultater. Hvis der opstår problemer med at opnå reproducerbare genoverførsel, er synderen sandsynligt i et af to områder. Efter at fartøjet er isoleret og blodet er vasket fra lumen, er det vigtigt at fjerne DMEM wash bufferen, så infunderes vektor løsning ikke er fortyndes under transduktion. Det andre vigtige aspekt er at svulme op fartøj til fysiologiske eller lidt større kaliber under vektor infusion. Fordi vores erfaring har en carotis arterie, der ikke er helt udspilet eller ikke bliver udspilet under 20 minutters infusion pålideligt lav transgen udtryk, er det sandsynligt, at udspiling af arterien til fysiologisk kaliber forbedrer transduktion effektivitet. Men vi har aldrig undersøgt dette systematisk. Det er muligt at øge infusion trykket over fysiologiske niveauer kunne øge transduktion effektivitet, og giver også mulighed for højere niveauer af transduktion af celler i det vaskulære medier. Forstyrrelser i endothelial barrieren ville dog sandsynligvis skade fartøjet og øge risikoen for blodpropper. Hvis fartøjet ikke bliver udspilet for hele 20 minutters vektor-inkubationstiden, er det sandsynligt, at vektoren er utæt fra grene af den fælles halspulsåren. Vær forsigtig under dissektion at identificere og ligate alle grene for at forhindre udsivning af vektoren fra carotis lumen.
Denne metode har flere begrænsninger, der er relateret til brugen af kaniner. Kaniner er billigere at hus og foder end andre store dyr (hunde, svin, får); udgifter til indkøb af boliger, og fodring kaniner er dog betydeligt mere end for mus og rotter. Operationsstuen faciliteter og lovgivningsmæssige krav til kanin kirurgi er også langt mere omfattende end for gnavere. Desuden betydelige tekniske ekspertise er nødvendig for at udføre kirurgisk gen overførselsprotokollen effektivt. Denne ekspertise kan erhverves af operatører, der har haft nogen formel kirurgiske uddannelse. Mindst 2 personer i vores gruppe (herunder den primære forfatter til denne manuskript) har lært de kirurgiske teknikker og anvendt dem produktivt. Ikke desto mindre er omhyggelig uddannelse og en omhyggelig validering af luftfartsforetagendets gen overførsel effektivitet og reproducerbarhed (som beskrevet i afsnittet repræsentative resultater) nødvendig, før erhvervsdrivende kan begynde at generere data af høj kvalitet.
Indespærring af transgenet udtryk næsten udelukkende til endotelet med denne metode29,32,33,34,35,36,37 er nyttigt, idet det giver mulighed for undersøgelse af transgene virkninger i endothelial celler og måling af aktiviteten af cis-handler DNA regulerende sekvenser i endothelial celler. Et lille antal adventitial eller mediale celler kan være transduced; Men, denne metode manglende evne til effektivt transduce nonendothelial celler forhindrer anvendelsen af metoden til studiet af andre typer af vaskulære væg celler (f.eks. glatte muskelceller og makrofager). Selvom overekspression af udskilles proteiner fra transduced endothelial celler kan tillade undersøgelse af virkningerne af disse proteiner på andre vaskulære celle typer, ikke udskilles proteiner i disse andre vaskulære celletyper roller (fx. receptorer eller proteiner involveret i signaltransduktion) kan ikke undersøges med denne metode.
Som et middel til at teste arterie væg-målrettet genterapi, metoden adskiller sig fra andre prækliniske metoder i to vigtige måder. Først, metoden, der udnytter en kanin model for i vivo test af genterapi i stedet mere almindeligt anvendt gnavere modeller8,12,15,38,39. Brug af kaniner tillader vurdering af transgenet udtryk og den biologiske rolle af transgenet produkt i en outbred dyremodel, som er mere repræsentativ for menneskets genetiske diversitet end er indavlede gnavere. Modellen kan bruges til at vurdere genterapi i enten normal kanin arterier eller kanin arterier, der har arteriel patologi, der svarer til, findes i syge menneskers arterier. Kanin arterier er også tættere i størrelse til human arterier end gnaver arterier og foreskrive langt mere væv analyse end der er tilgængelig fra gnaver arterier. Den anden store forskel er, at denne metode bruger en kirurgisk tilgang til at levere transgen vektor til den vaskulære endotel. Somatisk genterapi leveres ofte systemisk, hyppigst ved at målrette leveren med målet om at ændre plasmaniveauer af transgenet protein25,40. Ved at målrette vaskulære endotel, leverer metoden produktets terapeutiske transgen lokalt, med dets peak koncentration i arterievæggen, præcist hvor det er nødvendigt for vaskulær sygdom behandling. Ved at levere transgenet kun lokalt, eliminerer metoden også systemiske bivirkninger af transgenet produkt. Andre grupper er ved at udvikle metoder, der bruger peptider, antistoffer eller andre ændringer af kapsid for målretning systemisk injiceres vektorer til sunde eller syge endotelet for at give lokale vaskulære gen terapi41,42 , 43. men disse målretningsmetoder forbliver under udvikling, og er stadig kompliceret af betydelige systemiske transduktion, især i leveren42,43,44. Vores kirurgiske metode giver en præcis og effektiv introduktion af transgener til den vaskulære endotel med minimal - hvis nogen - transduktion på andre steder. 1 metoden er også en mere praktisk, effektiv og højere-hele middelværdi (sammenlignet med kønsceller transgenese eller systemisk injektion i endothelial-målrettet vektorer) til test aktivitet af regulerende DNA-sekvenser i det store fartøj endotel, for test transgen protein funktion i arterievæggen og test fartøj-væg-målrettet genterapi.
Denne metode giver mulighed for undersøgelse af den biologiske rolle af enhver transgen, når det kommer til udtryk i det store arterie endotelet. Hvis modificeret til at udtrykke tab af funktion reagenser som dominerende negativ receptorer eller korte hårnål RNA, ville det tillader undersøgelse af endogene endotel proteiner og signalering veje roller. Metoden kan også bruges til at måle den transcriptional aktivitet af enhver cis virkende DNA sekvens i store arterie endotelceller5,6,7. Derudover metoden tillader test af enhver form for gene transfer vektor for effektivitet og sikkerhed når leveret lokalt til endotelet, og vil afsløre vektoren evne til at opnå holdbare transgen udtryk. Endelig, metoden, der giver mulighed for udvikling og afprøvning af kombinationer af vektorer og transgener, der er designet til at levere vaskulære væg-målrettet genterapi. Metoden kunne tjene som en screeningsværktøj til at identificere terapeutiske gener, der måske i fremtiden-leveres til endotelet af alle store arterier (eller alle syge store arterier) af percutaneously injiceres vaskulære væg-målrettet vektorer. På grund af allerede eksisterende immunitet hos mennesker til adenovirus type 545, vil det være en udfordring for at bruge adenovirus type 5-baserede vektorer i kliniske applikationer. Engineering af adenovirus 5 kapsid, brug af alternative adenovirus serotyper46, eller brug af mindre-immunogen vektorer som AAV kan være forpligtet til at bringe vaskulære genterapi til klinikken. Som en eksperimenterende værktøj, men er vi uvidende om enhver vektor, der kan konkurrere med helper-afhængige adenovirus 5 for at opnå effektiv og holdbar transgen udtryk i blodkar1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker AdVec, Inc. for at have tilladelse til at bruge HDAd reagenser, Julia Feyk for administrativ bistand og Institut for sammenlignende medicin veterinære tjenester for kirurgisk rådgivning og støtte. Dette arbejde blev støttet af HL114541 og John L. Locke, Jr. Charitable Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery |
| 1mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery |
| 20mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24G x 3/4" | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery only |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | For 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4" x 4" | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | Gene transfer surgery only |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery only |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | Gene transfer surgery only |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | Gene transfer surgery only |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | Gene transfer surgery only |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 05098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine HCl, 2% | Pfizer | 00409427702 | |
| Bupivacaine HCl, 0.5% | Pfizer | 00409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | Gene transfer surgery only |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | 2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | Gene transfer surgery only |
| Fentanyl patch, 25 mcg/hr | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Gene transfer vector | Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | Gene transfer surgery only |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | Gene transfer surgery only |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | Gene transfer surgery only |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | Gene transfer surgery only |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | 2x for gene transfer surgery only | |
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Forced air warming unit | 3M | Bair Hugger Model 505 | Gene transfer surgery only |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | Gene transfer surgery only |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | Needs ~16x magnification |
References
- Flynn, R., et al. Expression of apolipoprotein A-I in rabbit carotid endothelium protects against atherosclerosis. Mol Ther. 19, 1833-1841 (2011).
- Falkenberg, M., et al. Increased expression of urokinase during atherosclerotic lesion development causes arterial constriction and lumen loss, and accelerates lesion growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 10665-10670 (2002).
- Schneider, D. B., et al. Expression of Fas ligand in arteries of hypercholesterolemic rabbits accelerates atherosclerotic lesion formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 298-308 (2000).
- Du, L., Dronadula, N., Tanaka, S., Dichek, D. A. Helper-dependent adenoviral vector achieves prolonged, stable expression of interleukin-10 in rabbit carotid arteries but does not limit early atherogenesis. Hum Gene Ther. 22, 959-968 (2011).
- Dronadula, N., et al. Construction of a novel expression cassette for increasing transgene expression in vivo in endothelial cells of large blood vessels. Gene Ther. 18, 501-508 (2011).
- Dronadula, N., Wacker, B. K., Van Der Kwast, R., Zhang, J., Dichek, D. A. Stable In Vivo Transgene Expression in Endothelial Cells with Helper-Dependent Adenovirus: Roles of Promoter and Interleukin-10. Hum Gene Ther. 28, 255-270 (2017).
- Dong, G., Schulick, A. H., DeYoung, M. B., Dichek, D. A. Identification of a cis-acting sequence in the human plasminogen activator inhibitor type-1 gene that mediates transforming growth factor-b1 responsiveness in endothelium in vivo. J Biol Chem. 271, 29969-29977 (1996).
- Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. J Vasc Surg. 52, 176-195 (2010).
- Zeng, Z., et al. Hemodynamics and anatomy of elastase-induced rabbit aneurysm models: similarity to human cerebral aneurysms. AJNR Am J Neuroradiol. 32, 595-601 (2011).
- Macdonald, R. L., Wallace, M. C., Montanera, W. J., Glen, J. A. Pathological effects of angioplasty on vasospastic carotid arteries in a rabbit model. J Neurosurg. 83, 111-117 (1995).
- Nakai, K., Numaguchi, Y., Moritani, T. Vasospasm model of a rabbit common carotid artery for endovascular research. Acad Radiol. 9, 270-275 (2002).
- Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841 (2011).
- Baumgartner, C., Brandl, J., Munch, G., Ungerer, M. Rabbit models to study atherosclerosis and its complications - Transgenic vascular protein expression in vivo. Prog Biophys Mol Biol. 121 (2), 131-141 (2016).
- Wang, K., et al. Three-Layered PCL Grafts Promoted Vascular Regeneration in a Rabbit Carotid Artery Model. Macromol Biosci. 16 (4), 608-618 (2016).
- Schachner, T., Laufer, G., Bonatti, J. In vivo (animal) models of vein graft disease. Eur J Cardiothorac Surg. 30, 451-463 (2006).
- Dornas, W. C., Oliveira, T. T., Augusto, L. E., Nagem, T. J.
- Graur, D., Duret, L., Gouy, M. Phylogenetic position of the order Lagomorpha (rabbits, hares and allies). Nature. 379 (6563), 333-335 (1996).
- Yanni, A. E. The laboratory rabbit: an animal model of atherosclerosis research. Lab Anim. 38, 246-256 (2004).
- Miao, C. H., et al. Inclusion of the hepatic locus control region, an intron, and untranslated region increases and stabilizes hepatic factor IX gene expression in vivo but not in vitro. Mol. Ther. 1, 522-532 (2000).
- Wen, S., Graf, S., Massey, P. G., Dichek, D. A. Improved vascular gene transfer with a helper-dependent adenoviral vector. Circulation. 110, 1484-1491 (2004).
- Schlaeger, T. M., et al. Uniform vascular-endothelial-cell-specific gene expression in both embryonic and adult transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3058-3063 (1997).
- Cowan, P. J., et al. Targeting gene expression to endothelial cells in transgenic mice using the human intercellular adhesion molecule 2 promoter. Transplantation. 62 (2), 155-160 (1996).
- Sehara, Y., et al. Persistent Expression of Dopamine-Synthesizing Enzymes 15 Years After Gene Transfer in a Primate Model of Parkinson's Disease. Hum Gene Ther Clin Dev. 28, 74-79 (2017).
- Tangirala, R. K., et al. Regression of atherosclerosis induced by liver-directed gene transfer of apolipoprotein A-I in mice. Circulation. 100, 1816-1822 (1999).
- Benoit, P., et al. Somatic gene transfer of human ApoA-I inhibits atherosclerosis progression in mouse models. Circulation. 99, 105-110 (1999).
- Raper, S. E., et al. Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer. Mol Genet Metab. 80, 148-158 (2003).
- Wacker, B. K., Dronadula, N., Zhang, J., Dichek, D. A. Local Vascular Gene Therapy With Apolipoprotein A-I to Promote Regression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37, 316-327 (2017).
- Brunetti-Pierri, N., et al. Transgene expression up to 7 years in nonhuman primates following hepatic transduction with helper-dependent adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 24, 761-765 (2013).
- Rome, J. J., et al. Anatomic barriers influence the distribution of in vivo. gene transfer into the arterial wall. Modeling with microscopic tracer particles and verification with a recombinant adenoviral vector. Arterioscler Thromb. 14, 148-161 (1994).
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Lab Invest. 85, 9-23 (2005).
- Brodbelt, D. Perioperative mortality in small animal anaesthesia. Vet J. 182, 152-161 (2009).
- Schulick, A. H., Dong, G., Newman, K. D., Virmani, R., Dichek, D. A.
- Vassalli, G., Agah, R., Qiao, R., Aguilar, C., Dichek, D. A. A mouse model of arterial gene transfer. Antigen-specific immunity is a minor determinant of the early loss of adenovirus-mediated transgene expression. Circ Res. 85, 25-32 (1999).
- Schneider, D. B., Fly, C. A., Dichek, D. A., Geary, R. L. Adenoviral gene transfer in arteries of hypercholesterolemic nonhuman primates. Hum Gene Ther. 9, 815-821 (1998).
- Newman, K. D., et al. Adenovirus-mediated gene transfer into normal rabbit arteries results in prolonged vascular cell activation, inflammation, and neointimal hyperplasia. J Clin Invest. 96, 2955-2965 (1995).
- Jiang, B., et al. Helper-dependent adenovirus is superior to first-generation adenovirus for expressing transgenes in atherosclerosis-prone arteries. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31, 1317-1325 (2011).
- Gruchala, M., et al. Gene transfer into rabbit arteries with adeno-associated virus and adenovirus vectors. J Gene Med. 6, 545-554 (2004).
- Lee, Y. T., et al. Mouse models of atherosclerosis: a historical perspective and recent advances. Lipids Health Dis. 16, 12 (2017).
- Manning, M. W., Cassi, L. A., Huang, J., Szilvassy, S. J., Daugherty, A. Abdominal aortic aneurysms: fresh insights from a novel animal model of the disease. Vasc Med. 7, 45-54 (2002).
- Lai, C. H., et al. Recombinant adeno-associated virus vector carrying the thrombomodulin lectin-like domain for the treatment of abdominal aortic aneurysm. Atherosclerosis. 262, 62-70 (2017).
- Tan, P. H., et al. Antibody targeted gene transfer to endothelium. J Gene Med. 5, 311-323 (2003).
- Nicklin, S. A., White, S. J., Nicol, C. G., Von Seggern, D. J., Baker, A. H. In vitro and in vivo characterisation of endothelial cell selective adenoviral vectors. J Gene Med. 6, 300-308 (2004).
- White, K., et al. Engineering adeno-associated virus 2 vectors for targeted gene delivery to atherosclerotic lesions. Gene Ther. 15, 443-451 (2008).
- Kaliberov, S. A., et al. Retargeting of gene expression using endothelium specific hexon modified adenoviral vector. Virology. 447, 312-325 (2013).
- Schulick, A. H., et al. Established immunity precludes adenovirus-mediated gene transfer in rat carotid arteries. Potential for immunosuppression and vector engineering to overcome barriers of immunity. J Clin Invest. 99, 209-219 (1997).
- Hollingdale, M. R., Sedegah, M., Limbach, K. Development of replication-deficient adenovirus malaria vaccines. Expert Rev Vaccines. 16, 261-271 (2017).
