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Immunology and Infection

मानव परिशुद्धता में पदार्थों के साइटोटोक्सिक और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रभाव का आकलन-कट फेफड़ों के स्लाइस

Published: May 9, 2018 doi: 10.3791/57042
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 4, 4, 5, 1,6, 1
1Fraunhofer Institute for Toxicology and Experimental Medicine (ITEM), German Center for Lung Research (DZL), Biomedical Research in Endstage and Obstructive Lung Disease Hannover (BREATH), Member of REBIRTH Cluster of Excellence, 2Institute for Pathology, Hannover Medical School, German Center for Lung Research (DZL), Biomedical Research in Endstage and Obstructive Lung Disease Hannover (BREATH), 3Division of Thoracic and Vascular Surgery, Klinikum Region Hannover (KRH), 4Department of Cardiothoracic, Transplantation and Vascular Surgery (HTTG), Hannover Medical School, German Center for Lung Research (DZL), Biomedical Research in Endstage and Obstructive Lung Disease Hannover (BREATH), 5Institute of Pharmacology and Toxicology, RWTH Aachen University, 6Institute for Immunology, Hannover Medical School
* These authors contributed equally

Summary

3Rs सिद्धांत को ध्यान में रखते हुए, पशु अध्ययन के लिए विकल्प के रूप में श्वसन मॉडल विकसित कर रहे हैं । विशेष रूप से श्वसन पदार्थों के जोखिम आकलन के लिए, वहाँ उचित परख की कमी है । यहां, हम हवाई पदार्थों के आकलन के लिए मानव परिशुद्धता कटौती फेफड़ों के स्लाइस के उपयोग का वर्णन ।

Abstract

उनके व्यापक विविधता में श्वसन रोगों अंतर्निहित तंत्र को समझने और नए चिकित्सीय चिकित्सा के विकास को सक्षम करने के लिए उपयुक्त मॉडल प्रणालियों की जरूरत है । इसके अतिरिक्त, नए पदार्थों के पंजीकरण के लिए पर्याप्त परीक्षण प्रणालियों के साथ उचित जोखिम मूल्यांकन की आवश्यकता है व्यक्तियों के जोखिम से बचने के लिए, उदाहरण के लिए, काम के माहौल में नुकसान पहुंचाया जा रहा है । इस तरह के जोखिम मूल्यांकन आमतौर पर पशु अध्ययन में आयोजित की जाती हैं । 3Rs सिद्धांत और पशु प्रयोगों के खिलाफ सार्वजनिक उलझन को ध्यान में रखते हुए, मानव वैकल्पिक तरीकों, जैसे परिशुद्धता-कट फेफड़ों के स्लाइस (PCLS), विकसित किया गया है । वर्तमान पत्र में अमोनियम hexachloroplatinate (HClPt) जैसे कम आणविक भार वाले पदार्थों की इम्यूनोमॉड्यूलेटरी क्षमता का अध्ययन करने के लिए मानव PCLS की पूर्व वीवो तकनीक का वर्णन है । मापा समापन व्यवहार्यता और स्थानीय श्वसन सूजन, साइटोकिंस और chemokines के बदल स्राव द्वारा चिह्नित शामिल हैं । प्रो भड़काऊ साइटोकिंस, ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNF-α), और interleukin 1 अल्फा (IL-1α) PCLS की एक उप विषैले एकाग्रता के लिए जोखिम के बाद मानव HClPt में काफी बढ़ गए थे. हालांकि PCLS की तकनीक काफी पिछले दशकों में अनुकूलित किया गया है, चुहियों के परीक्षण के लिए अपनी प्रयोज्यता विकास में अभी भी है । इसलिए, यहां प्रस्तुत परिणाम प्रारंभिक हैं, भले ही वे श्वसन अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में मानव PCLS की क्षमता दिखाते हैं ।

Introduction

श्वसन रोग जैसे एलर्जी अस्थमा, व्यावसायिक अस्थमा, जीर्ण प्रतिरोधी फेफड़ों के रोग (सीओपीडी), वातस्फीति, और ऊपरी और निचली एयरवेज के संक्रमण बढ़ रहे हैं और एक विश्वव्यापी स्वास्थ्य बोझ1,2का प्रतिनिधित्व करते हैं । उपयुक्त परीक्षण प्रणालियों की आवश्यकता है, क्रम में बुनियादी इन रोगों अंतर्निहित तंत्र के कुछ की पहचान करने के लिए, विकास और उचित पदार्थों के परीक्षण के अलावा । बुनियादी अनुसंधान के रूप में अच्छी तरह से नैदानिक दवा विकास के रूप में इन विट्रो में या vivo में परख में प्राप्त परिणामों पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं । इन परख, तथापि, उनकी सीमाएं है3। सबसे पहले, इन विट्रो परख मानव कोशिकाओं है कि अलग थे और आसन्न ऊतक या अंगों से हटा दिया और इस प्रकार अब के साथ बातचीत करने के लिए या अन्य कोशिकाओं के द्वारा संरक्षित किया जा करने में सक्षम नहीं हैं का उपयोग3. दूसरे, पशु मॉडल अक्सर शरीर विज्ञान और जैव रासायनिक विचलन में मतभेद के कारण मनुष्यों के लिए अनुवाद नहीं कर रहे है4। आदेश में इन सीमाओं को कम करने के लिए, और 3Rs के संदर्भ में (प्रतिस्थापन, शोधन, कमी) सिद्धांत5, नए वैकल्पिक मॉडल लगातार विकसित कर रहे हैं ।

वैकल्पिक मानव ऐसे PCLS के रूप में 3 डी ऊतक मॉडल, मानव के बीच एक कड़ी है इन विट्रो और vivo मॉडल में जटिल जानवर के आधार पर । PCLS श्वसन तंत्र6में मौजूद सभी प्रासंगिक सेल प्रकारों के साथ कार्यात्मक विविधता को प्रतिबिंबित करते हैं । इसके अतिरिक्त, PCLS तकनीक एक भी जानवर या मानव ऊतक दाता से सटीक मोटाई के कई पतले स्लाइस की reproducible तैयारी का लाभ है । यह एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अलग सांद्रता या दवाओं का परीक्षण किया जा अनुमति देता है ।

के बाद से आगर के पहले परिचय-भर में मानव फेफड़ों के स्लाइस फिशर एट अल द्वारा १९९४ में । 7 टुकड़ा करने की क्रिया और फेफड़ों के ऊतकों की संवर्धन के लिए तकनीक में काफी सुधार किया गया है । क्रिश्चियन मार्टिन एट अल । आगे रासायनिक और औषधीय अनुप्रयोगों के लिए इस तकनीक में सुधार हुआ है8। हमारे समूह २००७ में ईसाई मार्टिन ने इस तकनीक के लिए शुरू की गई थी । तब से, अनुसंधान में PCLS के आवेदन कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं के परीक्षण से व्यापक है, जैसे airway9,10 और वाहिकासंकीर्णन11, प्रतिरक्षा, औषधीय12,13, और कई प्रयोगशालाओं में विभिन्न प्रजातियों में विषाक्तता7 परीक्षण । मसलन, Schlepütz एट अल. 14 जांच की प्रजातियों के मतभेदों के लिए airway प्रतिक्रियाओं और परिधीय ंयूरॉन सक्रियकरण की तुलना में या तो विद्युत क्षेत्र उत्तेजना (EFS) द्वारा या चूहों, चूहों, गिनी सूअर, भेड़, marmosets, और मनुष्यों में capsaicin द्वारा । वे विभिंन प्रजातियों के लिए अलग है लेकिन तंत्रिका की मध्यस्थता ब्रोन्कोकन्सट्रिक्शन के विभिंन पैटर्न पाया और निष्कर्ष निकाला है कि आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रयोगशाला जानवरों (चूहों और चूहों) हमेशा मानव प्रतिक्रिया को प्रतिबिंबित नहीं करते । फेफड़ों विषाक्तता परीक्षण के लिए और इस संदर्भ में जानवरों की संख्या को कम करने के लिए, हेस एट अल. 15 पूर्व मांय चूहा सांस लेना विषाक्तता अध्ययन के लिए एक पूर्व vivo विकल्प के रूप में PCLS । इस बहु केंद्रिक पूर्व मांयता अध्ययन दो भविष्यवाणी मॉडल के विकास के परिणामस्वरूप PCLS का उपयोग कर आशाजनक परिणाम के साथ ।

इसके अलावा, बुनियादी अनुसंधान में, PCLS16, जल्दी एलर्जी प्रतिक्रियाओं17, और वायरल संक्रमण प्रतिक्रियाओं18,19संकेत कैल्शियम स्पष्ट के लिए इस्तेमाल किया गया है । तकनीकी प्रगति चल रही है और आगे अग्रिम पड़ताल की जा रही है. उदाहरण के लिए, फ़ील्ड भंडारण और जमे हुए ऊतक के पुनः प्रयोग द्वारा मानव ऊतक के लाभ बढ़ रही है । Rosner एट अल. ठंड और गल murine PCLS कि उत्तेजना पर अनुबंध करने के लिए एयरवेज की क्षमता को बरकरार रखता है की एक तकनीक का वर्णन: इसलिए, तकनीक के भीतर सीमित समय खिड़की जो ऊतकों व्यवहार्य रहते हैं, और इसलिए आगे तक परख समय पर लागू किया जा सकता है एक ही दाता20। इन अनुसंधान अग्रिमों के अलावा, Lauenstein एट अल । 21 हाल ही में विभिंन रसायनों कि मानव PCLS में व्यावसायिक अस्थमा के लिए संभावित संवेदीकरण के रूप में कार्य हो सकता है जोखिम मूल्यांकन की जांच की ।

व्यावसायिक अस्थमा, जिसके लक्षण airflow रुकावट और airway hyperresponsiveness, एलर्जी अस्थमा के समान हैं, उच्च आणविक वजन (HMW)22 या कम आणविक वजन (LMW) पदार्थों के लिए जोखिम से प्रेरित है23 (उदा. , कार्यस्थल वातावरण में प्लैटिनम यौगिकों). LMW एजेंटों एक उच्च संवेदीकरण क्षमता है जब haptens बनाने और वाहक प्रोटीन के लिए बांध21। नए HMW या LMW रसायनों का पंजीकरण इन विट्रो में की आवश्यकता है और vivo जोखिम मूल्यांकन में उनके ख्यात संवेदीकरण क्षमता (उदा., ओईसीडी दिशानिर्देश ४२९)24के बारे में । ख्यात संवेदीकरण क्षमता निर्धारित करने के लिए उपयोग किए गए परीक्षण, तथापि, मूल रूप से श्वसन संवेदी पदार्थों के जोखिम मूल्यांकन के लिए तैयार नहीं थे, लेकिन संपर्क संवेदीकरण के लिए, हालांकि वहां पदार्थ के एक छोटे सबसेट के लिए कुछ अनुरूपता लग रहा था25 . Lauenstein एट अल द्वारा काम यूरोपीय संघ परियोजना संवेदन-आईटी-iv के हिस्से के रूप में डिजाइन किया गया था, ख्यात संपर्क या फेफड़े संवेदीकरण के जोखिम मूल्यांकन के लिए वैकल्पिक परीक्षण रणनीतियों को विकसित करने के लिए21। इस परियोजना के लिए, हम एक वैकल्पिक परीक्षण उपकरण के रूप में मानव PCLS के प्रयोज्य परीक्षण पर ध्यान केंद्रित किया । इसलिए, इम्यूनोमॉड्यूलेटरी अंतिमबिंदु का एक सेट (जैसे, व्यवहार्यता और cytokine स्राव) LMW प्लैटिनम यौगिकों जैसे रसायनों की अड़चन या भड़काऊ क्षमता निर्धारित करने के लिए चुना गया था । Lauenstein एट अल. कोई सामान्य पैटर्न है कि सभी श्वसन संवेदीकरण के लिए लागू किया जा सकता पाया; हालांकि, उनके काम को हाल ही में प्रकाशित प्रोटोकॉल26के लिए नींव प्रदान की है ।

संक्षेप में, तैयार करने के लिए यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल और मानव PCLS के बाद जोखिम संभावित फेफड़े के मूल्यांकन के लिए एक उपयोगी तरीका विषाक्त और/या इम्यूनोमॉड्यूलेटरी पदार्थ है कि श्वसन के विकास में शामिल हो सकता है प्रदान करता है रोग, जैसे व्यावसायिक अस्थमा ।

Protocol

मानव PCLS के साथ प्रयोगों का प्रदर्शन विश्व चिकित्सा संघ की आचार संहिता के अनुसार किया जाना चाहिए और स्थानीय नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित (अनुकरणीय PCLS प्रयोगों को यहाँ दिखाई गई स्थानीय नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया हनोवर मेडिकल स्कूल; नंबर 2701-2015) । मानव फेफड़ों की सामग्री के उपयोग के लिए लिखित सूचित सहमति सभी दाता रोगियों या उनके परिजनों के अगले से आवश्यक है । इस पांडुलिपि में वर्णित परिणाम अलग उंर, लिंग, चिकित्सा के इतिहास के दाताओं से ऊतक स्लाइस के साथ प्राप्त किए गए, और लकीर का कारण है, हालांकि ऊतक के अधिकांश फेफड़ों के कैंसर से पीड़ित रोगियों से था प्राप्त किया । केवल ट्यूमर मुक्त ऊतक प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

1. सामांय मानव PCLS और रसायनों के लिए बाद में जोखिम की तैयारी

नोट: दो व्यक्तियों को एक फेफड़े भरना आवश्यक है । हेपेटाइटिस ए और बी के लिए एक अप करने की तारीख टीकाकरण रिकॉर्ड की सिफारिश की है । मरीजों को नियमित रूप से HCV और एचआईवी फेफड़ों प्रत्यारोपण करने से पहले के लिए जांच कर रहे हैं । यदि माइकोबैक्टीरियम तपेदिक के साथ एक सक्रिय संक्रमण का निदान या संदिग्ध है, फेफड़े खारिज कर दिया जाना चाहिए । फिर भी, सभी ताजा मानव फेफड़े के ऊतकों और यह से व्युत्पंन नमूने संभावित संक्रामक और इसी सुरक्षात्मक उपायों के रूप में इलाज किया जाना चाहिए (कण फिल्टर मास्क (FFP2), सुरक्षात्मक eyewear, दस्ताने) के व्यावसायिक सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए कर्मचारियों. प्रक्रिया लेता है ६०-९० मिनट ।

  1. मानव फेफड़ों के पालि की अक्षुण्णता की पुष्टि करें ।
    नोट: फुफ्फुस में एक आंसू ऊतक के सजातीय भरने को रोकता है । मानव फेफड़ों सामग्री लकीर के दिन से होना चाहिए । कमरे के तापमान पर के बारे में 2 घंटे की भंडारण अवधि (RT) इससे पहले कि यह बर्फ पर agarose के साथ भरने के लिए सहन कर रहे हैं । ऊतक है कि हम इस प्रोटोकॉल में उपयोग लकीर के दौर से गुजर रोगियों से प्राप्त की है । यह मृतक मरीजों से नहीं है । यदि ऊतक बर्फ पर संग्रहीत किया गया है, इसे भरने से पहले आरटी के लिए पूर्व गर्म, अंयथा agarose तुरंत polymerize होगा, और कोई सजातीय भरने संभव हो जाएगा ।
    चेतावनी: सुनिश्चित करें कि देशी मानव सामग्री के साथ संपर्क में सभी व्यक्तियों सुरक्षात्मक एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने के दो जोड़े, टोपी, चेहरा मुखौटा से मिलकर कपड़ों पर डाल दिया, और सुरक्षा चश्मे की एक जोड़ी । मानव सामग्री संभावित संक्रामक है ।
  2. कम बीच बढ़िया तालमेल agarose के ७.५ g वजन और यह द्वि-आसुत पानी की २५० मिलीलीटर के लिए जोड़ें । agarose को माइक्रोवेव में तब तक उबालें जब तक कि agarose घुल न जाए. यह लगभग ४० डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा, पिघलने और agarose के बीच बढ़िया तालमेल बिंदु पर निर्भर करता है ।
    नोट: कई कुप्पी, पालि आकार पर निर्भर करता है की आवश्यकता है ।
  3. पूर्व गर्म और ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति मध्यम (सामग्री की तालिका) रखें ।
    नोट: यदि agarose बहुत गर्म है, संस्कृति माध्यम में विटामिन प्रभाव खो देंगे और कोशिकाओं को क्षतिग्रस्त हो जाएगा । यदि मध्यम/agarose समाधान का तापमान ३७ डिग्री सेल्सियस से नीचे है, बीच बढ़िया तालमेल प्रक्रिया शुरू और फेफड़ों के सजातीय भरने ख़राब होगा । केवल ३७ डिग्री सेल्सियस से ३९ डिग्री सेल्सियस की एक तापमान सीमा की सिफारिश की है ।
  4. शुरू करने से पहले पहुंच के भीतर सभी आवश्यक सामग्री प्लेस: 5-10 clamps, लगभग 1 मीटर लंबाई के लचीले कैथेटर, एक उपयुक्त सिरिंज(उदा, ५० मिलीलीटर) कैथेटर के लिए कनेक्शन फिटिंग, और एक बर्फ बर्फ से भरा बॉक्स ।
  5. Cannulate श्वासनली/मुख्य श्वसनी के साथ सिलिकॉन ट्यूब डालने और इसे एक दबाना ट्यूब के समानांतर उंमुख के साथ निर्धारण, इतना है कि क्लैंप के साथ ऊतक निचोड़ा सिलिकॉन ट्यूब के साथ इसे बंद चुटकी के बिना । सत्यापित करें कि सिलिकॉन ट्यूब के अंदर उतारना है और भरने की प्रक्रिया के दौरान बाहर पर्ची नहीं कर सकता । बंद अंय सभी ब्रांकाई, रक्त वाहिकाओं और clamps के साथ चोटों, ताकि कोई agarose भरने की प्रक्रिया के दौरान बाहर रिसाव कर सकते हैं ।
  6. एक चोंच में संस्कृति माध्यम के साथ 3% कम-बीच बढ़िया तालमेल agarose के बराबर मात्रा में मिलाएं । एक ५०-एमएल सिरिंज का उपयोग कर फेफड़ों में मिश्रण टपकाना । पहले माध्यम से सिरिंज को भरने के लिए, दबाना उंगलियों या हवा के बुलबुले और agarose भाटा से बचने के लिए एक दबाना के साथ कैथेटर बंद । फेफड़ों पालि भरें जब तक यह पूरी तरह से फुलाया है । ध्यान से फेफड़ों की फुफ्फुस को स्पर्श करें; फुफ्फुस भी और कठिन होना चाहिए ।
    नोट: फेफड़ों पालि के आकार के आधार पर, agarose/मध्यम समाधान के 2 या 3 एल के लिए आवश्यक हो सकता है ।
  7. दोहराएं चरण १.५-१.६ प्रत्येक श्वसनी के लिए एक एकल नमूना के भीतर कई ब्रांकाई के मामले में ।
  8. agarose के बहुलकीकरण के लिए बर्फ पर फेफड़े रखो 20-40 मिनट के लिए जेल, जगाकर agarose की मात्रा पर निर्भर करता है । ध्यान से कई पक्षों पर फुफ्फुस को छूने के लिए जांच करें कि क्या यह कठिन है और शांत है, यह दर्शाता है कि बहुलकीकरण पूरा हो गया है, अंयथा प्रतीक्षा जारी है । पैथोलॉजिस्ट को स्लाइस में फेफड़े में कटौती, उनके नमूने लेने और परिवहन के लिए बर्फ पर फेफड़ों की सामग्री की दुकान करेंगे ।
  9. एक तेज चाकू के साथ 3-5 सेमी स्लैब में मानव फेफड़ों के ऊतकों में कटौती ।
    नोट: तीक्ष्णता सुनिश्चित करने के लिए हर फेफड़ों के लिए एक नया ब्लेड का प्रयोग करें ।
  10. ऊतक स्लाइसर को ४०० मिलीलीटर आइस-कोल्ड अर्ल के संतुलित नमक समाधान (EBSS) के साथ भरें । तुरंत पसंदीदा व्यास के एक coring उपकरण के साथ एक अर्द्ध स्वचालित पेचकश का उपयोग कर फेफड़ों के स्लैब से बाहर बेलनाकार ऊतक कोर काट (उदा., 8 मिमी; 10 मिमी) ।
    नोट: यह व्यास मशीन के अंदर ऊतक धारक के व्यास के बराबर होना चाहिए ।
  11. वांछित मोटाई मूल्य के लिए फेफड़ों के स्लाइस की मोटाई समायोजित करें ।
    नोट: लगभग २५० µm की मोटाई सामांयतः PCLS प्रयोगों में प्रयोग किया जाता है । ऊतक स्लाइसर के निर्माता टुकड़ा मोटाई के सत्यापन के लिए उनके ऊतक टुकड़ा मोटाई गेज की सिफारिश की । वैकल्पिक रूप से, पूरे-माउंट फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त धुंधला Brismar एट अल द्वारा वर्णित के रूप में टुकड़ा मोटाई निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । 27
  12. ऊतक स्लाइसर के ऊतक धारक में टिशू कोर स्थानांतरण । ऊतक कोर के शीर्ष पर वजन (ऊतक धारक का हिस्सा) रखो । ऊतक स्लाइसर पर बांह की गति और ब्लेड गति को 6 पर सेट करें । PCLS में ऊतक कोर टुकड़ा करने की क्रिया शुरू करो ।
  13. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के पूरक ५०० मिलीलीटर: पोषक तत्व मिश्रण एफ 12 DMEM/F12 (1:1) के साथ 5 मिलीलीटर पेनिसिलिन (१०,००० इकाइयों/एमएल) और streptomycin (१०,००० µ g/एमएल) । एक रेफ्रिजरेटर में बाँझ शर्तों के तहत कई दिनों के लिए संस्कृति माध्यम की दुकान । पूर्व गर्म केवल मध्यम की आवश्यक मात्रा ।
    नोट: पेनिसिलिन ३७ डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय के लिए रखा अगर निष्क्रिय किया जाएगा । सीरम मुक्त और डाई मुक्त संस्कृति माध्यम का प्रयोग करें, के रूप में सीरम संरचना बैच और इस तरह के phenol के रूप में रंजक, के लिए बदलता है लाल, परख के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं ।
  14. 25 मिलीलीटर बर्फ-शीत संस्कृति माध्यम के साथ एक पेट्री डिश (१०० x 15 मिमी) भरें । मध्यम ऊतक स्लाइसर के बाहर एक चोंच में गिलास सिलेंडर की क्लैंप खोलने के द्वारा सूखा होना चाहिए । एक चोंच से स्लाइस को पेट्री डिश में कल्चरल मीडियम के साथ एक applicator (उदा., टीका लूप) का उपयोग करके स्थानांतरित करें । एक मशीन में पेट्री पकवान रखो (३७ ° c, 5% CO2, १००% आर्द्रता) । मध्यम गर्म करने के लिए कदम धोने से पहले की अनुमति दें ।
    नोट: सभी आगे कदम बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं.
  15. PCLS को धोने के लिए पेट्री डिश में एक सेल छलनी रखें । सेल छलनी के माध्यम से एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ संस्कृति माध्यम पूरी तरह से हटा दें और ३७ डिग्री सेल्सियस पूर्व गर्म ताजा माध्यम के 25 मिलीलीटर जोड़ें । इस चरण को दोहराएं 3-4 बार हर 30 मिनट ।
    नोट: सेल छलनी स्लाइस को पिपेट में चूसा जा रहा है, स्लाइस करने के लिए किसी भी नुकसान से बचने के लिए से बचाता है ।
  16. फेफड़े के स्लाइस को ध्यान से एक 24-well कल्चर प्लेट में एक ंयूनतम के साथ ५०० µ एल संस्कृति मध्यम के लिए दो स्लाइसें प्रति अच्छी तरह से हस्तांतरण । पदार्थों को फेफड़ों के ऊतकों बेनकाब (चरण ३.१-३.४ देखें), उदा, के लिए 24 घंटे में ३७ ° c, 5% CO2.
    नोट: हस्तांतरण के लिए, अधिमानतः एक टीका पाश का उपयोग करें और स्लाइसें ऊतक नुकसान को रोकने के क्रम में पाश पर फ्लोट करते हैं । स्लाइस की कोई आगे जुदाई की जरूरत है, पर्याप्त ताजा माध्यम की ही कमी के रूप में ऊतक के स्लाइस में कोशिका मृत्यु को प्रेरित करेगा । स्लाइस ओवरलैप या अच्छी तरह से एक दूसरे को छूने कर सकते हैं: यह ऊतक व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव नहीं है ।
  17. एक निर्धारण के साथ एक प्लास्टिक की कुप्पी में सभी अवशिष्ट मानव सामग्री रखो (उदा., 10% बफ़र्ड formaldehyde) कम से 24 h के लिए और निपटान प्रक्रिया में इस जला ।
    चेतावनी: Formaldehyde विषाक्त है, एक डाकू के तहत इस कदम का प्रदर्शन ।

2. PCLS का ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण

  1. दो फोम पैड निर्धारण में लथपथ के साथ बायोप्सी कैसेट तैयार (उदा, 4% buffered formaldehyde) । बायोप्सी कैसेट में फोम पैड के बीच PCLS प्लेस और तुरंत निर्धारण समाधान में ऊतक हस्तांतरण । 4% बफ़र्ड formaldehyde में रातोंरात ऊतक ठीक ।
  2. इथेनॉल में निर्जलीकरण नमूने द्वारा तेल embedding के लिए ऊतक प्रक्रिया (७०%, ९०%, १००%, १००%, १००%, 1 ज प्रत्येक के लिए १००%, xylene में धोने के बाद (3 एक्स 1 एच) और तरल आयल (3 x 1 h) मानक histopathology प्रोटोकॉल के अनुसार ।
  3. एक एंबेडिंग मोल्ड में PCLS स्थानांतरण । एक टीका लूप का उपयोग करें । तरल तेल में PCLS ऊतक एंबेड । जब तेल ब्लॉक कास्टिंग मोल्ड में समान रूप से ऊतक जगह सुनिश्चित करें ।
  4. एक रोटरी microtome के साथ PCLS युक्त ऊतक ब्लॉक कट जब तक यह एक फ्लैट और यहां तक कि सतह है । वांछित मोटाई के धारावाहिक वर्गों लो (उदा, 4 µm), उन्हें व्यक्तिगत रूप से लगातार गिने लेपित कांच स्लाइड पर रखने (आमतौर पर 25-30 वर्गों लिया जा सकता है) जब तक पूरे PCLS संसाधित किया गया है.
  5. दाग एकल ग्लास स्लाइड (हर 8-10 वर्गों) hematoxylin और eosin दाग (एच एंड ई) के साथ उंमुखीकरण के लिए । ओरिएंटेशन स्लाइड्स के आधार पर प्रयोग के लिए अनुभागों का चयन करें (प्रथम और अंतिम 8 अनुभाग सामांयत: अपूर्ण होते हैं) ।
    नोट: (वैकल्पिक) लंबे समय तक भंडारण के लिए, स्लाइड संरक्षण के लिए तरल तेल में डूबा जा सकता है ।

3. पदार्थों के लिए समाधानों की तैयारी

नोट: उपयोग करने से पहले कार्य समाधान और नियंत्रण तुरंत तैयार करें ।

सावधानी: सुरक्षा निर्देशों के अनुसार पदार्थों को संभालना या, यदि अज्ञात है, के रूप में संभावित हानिकारक है और नियमित सुरक्षा सावधानियों का पालन करें ।

  1. जल-घुलनशील पदार्थों को सीधे संस्कृति माध्यम में भंग करें. अघुलनशील या खराब घुलनशील रसायनों के लिए, पहले पदार्थ घुलनशीलता के आधार पर उपयुक्त सॉल्वैंट्स में पदार्थ को भंग करें । सीमित जल घुलनशीलता के साथ पदार्थ (< 0.1 mg/एमएल) को भंग किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, DMSO या इथेनॉल में । गैर विषैले विलायक सांद्रता पहले से अनुमापन द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए । सुनिश्चित करें कि पदार्थों को मध्यम में पतला होने पर समाधान से बाहर न निकलें ।
    नोट: HClPt और सोडियम laureth सल्फेट (SLS) समाधान तैयार हैं ।
  2. १०० पर पदार्थ स्टॉक समाधान तैयार-संस्कृति मध्यम या विलायक में वांछित उच्चतम एकाग्रता के गुना । वजन १२.५ मिलीग्राम HClPt और ३४.४ मिलीग्राम SLS और 1 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम में रसायनों को भंग करके स्टॉक समाधान तैयार करते हैं ।
    नोट: कोई विलायक इन रसायनों के लिए आवश्यक है ।
  3. पूर्व गरम मध्यम में 1:100 के एक अंतिम कमजोर पड़ने तैयार । विलायक के पूर्व उपयोग के मामले में, सभी पदार्थ सांद्रता के लिए एक ही अंतिम विलायक एकाग्रता में इस दृष्टिकोण परिणाम ।
  4. PCLS के संदर्भ उपचार के लिए अंतिम विलायक एकाग्रता का प्रयोग करें (उदा., 1% ३.३ चरण में वर्णित के रूप में) । परिणाम अनुभाग में उल्लिखित रसायनों के लिए कोई विलायक नियंत्रण आवश्यक नहीं था ।

4. Cytotoxicity परख के लिए सकारात्मक और नकारात्मक संदर्भ

  1. सभी व्यवहार्यता परख के लिए, निंनलिखित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण तैयार:
    1. ऊतक नियंत्रण: संस्कृति मध्यम में केवल अनुपचारित PCLS के लिए एक संदर्भ के रूप में सेल संस्कृति शर्तों पर 24 ज के लिए PCLS (३७ ° c, 5% CO2, १००% आर्द्रता) ।
    2. वाहन नियंत्रण (यदि आवश्यक हो): PCLS वाहन के साथ इलाज के लिए एक संदर्भ के रूप में अंतिम विलायक एकाग्रता के साथ PCLS मशीन (चरण ३.४ देखें) सेल संस्कृति की स्थिति में 24 घंटे के लिए (३७ ° c, 5% CO2, १००% आर्द्रता) ।
    3. सकारात्मक नियंत्रण: 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए बफर समाधान में 1% डिटर्जेंट के साथ मशीन PCLS ।
      नोट: यदि PCLS बेरंग हो, ऊतक मर चुका है । कुल एल स्तनपान डिहाइड्रोजनेज (LDH) supernatant में निर्धारित किया जाता है, लगभग १.९-२.३ के एक अवशोषण के साथ (चरण ६.१-६.४ देखें) । ऊतक WST-1 परख के लिए प्रयोग किया जाता है (५.१-५.५ कदम देखें), लगभग 0 के एक अवशोषण के साथ ।

5. WST-1 परख द्वारा मानव PCLS में रासायनिक रूप से प्रेरित Cytotoxicity का मापन

नोट: WST-1 परख अच्छी तरह से प्रति दो PCLS के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली में किया जाता है । अधिमानतः, प्रत्येक पैरामीटर के लिए डुप्लिकेट का उपयोग करें और माप के बाद इन डुप्लिकेट के परिणाम पूल ।

  1. कमजोर शुरू करने से तुरंत पहले मीडियम में WST-1 रिएजेंट बनाकर वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें । काम समाधान के लिए आवश्यक राशि है २५० µ एल एक 24-खैर थाली के/ इसलिए, एक अच्छी तरह के लिए संस्कृति माध्यम के २२५ µ एल के साथ रिएजेंट के 25 µ एल मिश्रण ।
  2. १.१६ कदम से PCLS की मशीन के बाद, त्याग या cytokine माप या ऐसे LDH परख के रूप में अंय परीक्षणों के लिए supernatant का उपयोग करें । शेष ऊतक अगले चरण के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  3. प्लास्टिक २५० µ एल के काम एकाग्रता के WST-1 reagent के प्रति अच्छी तरह से और ३७ ° c और 5% सह पर थाली मशीन 1 h. सुनिश्चित करें कि PCLS के लिए पूरी तरह से WST-1 रिएजेंट द्वारा कवर कर रहे है के लिए मशीन ।
  4. एक कक्षीय शेखर (२०० rpm) पर प्लेट प्लेस और 30 एस के लिए ध्यान से मिलाने के लिए WST-1 रिएजेंट का पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करते हैं । एक नया फ्लैट-नीचे ९६-अच्छी तरह से प्लेट और प्लास्टिक १०० µ एल लो 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं के supernatant से डुप्लिकेट में ।
  5. एक microplate रीडर का उपयोग कर ४५० एनएम (संदर्भ: ६३० एनएम) में प्रत्येक कुआं के अवशोषण को मापने । ४५० एनएम से ६३० एनएम पर अवशोषण घटाना । ये मान ५.६ चरण में परिकलन के लिए उपयोग किया जाएगा) ।
    नोट: cytotoxicity आकलन के लिए विश्वसनीय डेटा केवल व्यवहार्य ऊतक से प्राप्त किया जा सकता है । इसलिए, इन स्वीकृति हेस एट अल द्वारा प्रकाशित मानदंड । प्रत्येक प्रयोग में 15 मुलाकात करनी चाहिए । यदि इन मानदंडों को पूरा नहीं कर रहे हैं, प्रयोग दोहराया जाना चाहिए ।
  6. अनुपचारित मध्यम नियंत्रण के अवशोषण ०.६ से ऊपर होना चाहिए, अंयथा प्रयोग दोहराया जाना चाहिए । यदि डेटा इस आवश्यकता को पूरा, ऊतक नियंत्रण के अवशोषण मूल्य १००% करने के लिए सेट और ऊतक नियंत्रण के संबंध में इलाज के नमूनों की WST-1 कमी की गणना.

6. LDH परख

नोट: LDH परख एक ९६ में किया जाता है १०० µ एल संस्कृति supernatant के साथ अच्छी तरह से थाली के बाद के बाद मशीन की अवधि ।

  1. PCLS के साथ या परीक्षण एजेंटों के बिना की मशीन के बाद, ले ५० १.१६ कदम से supernatant के µ एल और यह एक नया ९६-अच्छी तरह से प्लेट में डुप्लिकेट में स्थानांतरण । यह एक 24 अच्छी तरह से प्लेट की एक अच्छी तरह से इलाज से डुप्लिकेट उत्पंन करता है ।
  2. LDH एजेंट के काम समाधान तुरंत परख से पहले तैयार । काम समाधान उत्प्रेरक समाधान (lyophilisate 1 मिलीलीटर bidistilled पानी में भंग) के होते है और डाई समाधान निर्माता द्वारा आपूर्ति की । १ ९६-अच्छी तरह से थाली के लिए, अच्छी तरह से डाई समाधान की ६.२५ मिलीलीटर के साथ उत्प्रेरक समाधान के १२५ µ एल मिश्रण ।
    चेतावनी: प्रत्यक्ष प्रकाश के समाधान का पर्दाफाश नहीं है ।
  3. प्लास्टिक ५० एक अच्छी तरह से पहले से ही supernatant के ५० µ एल युक्त में काम समाधान के µ एल और अंधेरे में आर टी पर 20 मिनट के लिए थाली मशीन । कोई और अधिक मिश्रण की आवश्यकता है ।
  4. एक microplate रीडर का उपयोग कर ४९२ एनएम (संदर्भ: ६३० एनएम) में प्रत्येक कुआं के अवशोषण को मापने । ४९२ एनएम से ६३० एनएम पर अवशोषण घटाना । ये मान चरण ६.५ में परिकलन के लिए उपयोग किया जाएगा ।
    नोट: cytotoxicity आकलन के लिए विश्वसनीय डेटा केवल व्यवहार्य ऊतक से प्राप्त किया जा सकता है । डिटर्जेंट-इलाज नियंत्रण का अवशोषण 1 से अधिक होना चाहिए ।
  5. विश्लेषण के लिए, चरण ४.१ से १००% के रूप में सकारात्मक नियंत्रण के अवशोषण मूल्य सेट और सकारात्मक नियंत्रण (यानी, अधिकतम LDH रिलीज) के संबंध में इलाज के नमूनों में LDH रिहाई की गणना ।

7. फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के साथ सूक्ष्म व्यवहार्यता परख (cLSM)

नोट: सूक्ष्म व्यवहार्यता परख के लिए, सामांय २५० के दो-µm-मोटी PCLS २५० µ में दाग रहे है एक 24 अच्छी तरह से थाली के एल/ प्रत्येक स्लाइस अलग से imaged है के रूप में, कोई आगे डुप्लिकेट की आवश्यकता है ।

  1. PCLS के साथ या परीक्षण मदों के बिना की मशीन के बाद, supernatant त्यागें या cytokine माप या ऐसे LDH परख के रूप में अंय परीक्षणों के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं । शेष ऊतक यहां वर्णित प्रक्रिया के लिए उपयोग करें ।
  2. calcein-एएम और ethidium homodimer 1 (EthD-1) के वर्किंग कमजोरियां संस्कृति माध्यम में 4 µ मीटर के दोनों रिएजेंट के एक काम एकाग्रता के साथ तैयार करें । इस प्रयोजन के लिए, calcein-एएम (4 मिमी) के 1 µ l को जोड़ें और EthD-1 (2 मिमी) के 2 µ l को ९९७ µ l संस्कृति माध्यम से जोड़ सकते हैं । यह मात्रा दो PCLS प्रत्येक के साथ 4 कुओं दाग करने के लिए आवश्यक है ।
    नोट: सीधे प्रकाश के लिए रिएजेंट के जोखिम से बचें ।
  3. प्लास्टिक २५० µ एक अच्छी तरह से काम करने में कमजोर पड़ने के एल और अंधेरे में आरटी में ४५ मिनट के लिए 24 अच्छी तरह से थाली मशीन । १५० rpm पर एक कक्षीय शेखर पर थाली की मशीन के दौरान प्लेस करने के लिए दाग समाधान के लिए ऊतक के बेहतर प्रदर्शन सुनिश्चित करते हैं ।
  4. ४५ मिनट के बाद, धुंधला समाधान त्यागें और अंधेरे में आर टी पर 3-5 मिनट के लिए १५० rpm पर झटकों के माध्यम से 1 मिलीलीटर बफर समाधान के साथ PCLS धो लो । इस चरण को दो बार दोहराएं ।
  5. PCLS संस्कृति माध्यम से autofluorescence से बचने के लिए दाग वाले एक अच्छी तरह से युक्त करने के लिए बफर समाधान के ५०० µ एल लागू करें । सूक्ष्म आकलन के लिए, एक cLSM के साथ कम से कम दो बेतरतीब ढंग से वितरित जेड-ढेर प्रदर्शन करते हैं ।
  6. नेत्र पट्टी पर क्लिक करें एक 10x/0.3 उद्देश्य का चयन और ऑनलाइन पर क्लिक करने के लिए एक मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप के रूप में cLSM का उपयोग करने के लिए PCLS की सतह को खोजने के लिए । नेत्र सेटिंग से बाहर निकलने के लिए ऑफ़लाइन पर क्लिक करें ।
  7. अधिग्रहण टैब पर क्लिक करें और fluorophores के लिए उपयुक्त पराबैंगनीकिरण पर बारी ।
    नोट: हम polyanionic डाई calcein के लिए ४८८ एनएम के एक तरंग दैर्ध्य के साथ एक आर्गन लेजर का इस्तेमाल किया (४९५ एनएम के उत्तेजना तरंग दैर्ध्य) और EthD-1/डीएनए परिसर का पता लगाने के लिए ५४३ एनएम के एक तरंग दैर्ध्य के साथ एक HeNe लेजर (५३३ एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य) । आर्गन लेजर आम तौर पर अधिकतम वर्तमान के 30-50% पर चलने के लिए लगभग ५.७ एक के एक ट्यूब वर्तमान सक्षम करना चाहिए, के रूप में यह लंबे समय तक लेजर जीवनकाल काफी ।
  8. प्राप्ति टैब के अंतर्गत प्रकाश पथ पर क्लिक करें और प्रयोग के लिए आवश्यक फ़िल्टर और मिरर्स को सेट करे ।
    नोट: वर्तमान अध्ययन में, एक फिल्टर आधारित प्रणाली एक मुख्य dichroic बीम अलगानेवाला के साथ प्रयोग किया जाता था (उदा, HFT 488/543) उत्तेजना और उत्सर्जन प्रकाश को अलग । एक प्रतिबिंबित दर्पण के माध्यम से इस प्रकाश माध्यमिक dichroic बीम अलगानेवाला के लिए निर्देशित है (उदा, NFT ५४५) और दो चैनलों में नमूने से उत्सर्जित प्रकाश को अलग करने के लिए ।
  9. बैंड पास फिल्टर सेट अप (उदा., calcein संकेत और EthD-1/डीएनए जटिल संकेत के लिए बीपी 560-615 के लिए बीपी 505-530) कि तरंग दैर्ध्य की केवल एक निश्चित सीमा संचारित और 2 चैनल और EthD-1 के लिए calcein संकेत आवंटित/
  10. सूक्ष्म वॉल्यूम के लिए ऊपरी और निचली सीमाएं सेट करने के लिए Z-स्टैक्स बॉक्स चेक करें । स्क्रीन पर इसी परत के एक लाइव दृश्य देखने के लिए लाइव बटन दबाएँ. एक तेज संकेत के साथ PCLS की सतह को खोजने के लिए ध्यान ऊपर या नीचे ले जाएँ.
  11. चैनल उप-खंड पर क्लिक करें और बॉक्स सभी दिखाएँचेक । लाइव छवि के नीचे इसी चैनल के बटन पर दबाकर तालिका ताला और चैनल रंग सक्रिय करें.
    नोट: लाइव छवि में एक नीले रंग का संकेत होगा कि वहाँ कोई संकेत नहीं है, जबकि एक उच्च संकेत सफेद में दिखाई देगा और एक उजागर संकेत लाल रंग में दिखाई देगा.
  12. pinhole के लिए लाल EthD-1 चैनल के लिए 1 हवादार इकाई के लिए सबसे अच्छा व्यापार बंद प्रकाश संग्रह और ऑप्टिकल अनुभाग की दक्षता के बीच सेट और तदनुसार calcein चैनल को समायोजित । इस तरह है कि यह सफेद दिखाई देता है लेकिन सक्रिय चैनल रंग लॉकअप तालिका के साथ लाइव छवि में लाल नहीं लाभ का पता लगाया संकेत बढ़ाएँ ।
    नोट: मास्टर लाभ ६०० इकाइयों से अधिक नहीं होना चाहिए ।
  13. बढ़ाने या इस तरह है कि यह सक्रिय चैनल रंग लॉकअप तालिका के साथ लाइव छवि में नीले रंग में प्रकट होता है पृष्ठभूमि को समायोजित करने के लिए डिजिटल ऑफसेट घटाएं ।
  14. बहुआयामी अधिग्रहण के तहत जेड-स्टैक टैब पर क्लिक करें और ध्यान का उपयोग करने के लिए एक z-ब्याज की परत को शिफ्ट । बाद में प्राप्ति के लिए इस स्थिति को सहेजने के लिए पहले सेट करें दबाएं । 30 µm की एक सीमा तक पहुंच गया है और सहेजें करने के लिए अंतिम सेट दबाएँ जब तक धीमे फ़ोकस ऊपर या नीचे shift ।
  15. लाइव छवि को निष्क्रिय करने के लिए एक बार फिर से लाइव पर क्लिक करें और इमेजिंग प्रारंभ करने के लिए प्रारंभ प्रयोग पर दबाएं ।
    नोट: व्यवहार्य ऊतक polyanionic डाई calcein के प्रतिदीप्ति के माध्यम से पता चला है । मृत कोशिकाओं EthD-1 और न्यूक्लिक एसिड के जटिल गठन द्वारा भेदभाव कर रहे हैं ।

8. छवि प्रतिपादन

नोट: इस प्रोग्राम को उपयुक्त हार्डवेयर की आवश्यकता है के रूप में छवि रेंडरिंग सॉफ़्टवेयर की कंप्यूटर अनुशंसा को ध्यान में रखा जाना चाहिए ।

  1. लोड LSM सूक्ष्म व्यवहार्यता PCLS के धुंधला से प्राप्त फ़ाइल छवि प्रतिपादन सॉफ्टवेयर में (7 अनुभाग देखें) । आगे बढ़ने से पहले इसे. आईएमएस फ़ाइल के रूप में सहेजें । ऊतक नियंत्रण पर सभी मापदंडों सेट और सभी छवियों के लिए इन लागू होते हैं । आगे कोई परिवर्तन की अनुमति नहीं है ।
  2. व्यवहार्य ऊतक (calcein धुंधला) (अनुपूरक आंकड़ा 1a) और मृत सेल नाभिक के लिए धब्बे बटन (अनुपूरक आंकड़ा1) के सतह पुनर्निर्माण के लिए वॉल्यूम बटन का प्रयोग करें । एक चैनल प्रतिपादन करते हैं, प्रदर्शन समायोजन विंडो में अन्य चैनल बंद स्विच.
  3. महत्वपूर्ण ऊतक की मात्रा प्रतिपादन द्वारा शुरू: सतह के चैनल सेट, पूरी छवि प्रक्रिया, ०.५ µm के लिए चिकनी कारक सेट, और दहलीज के लिए निरपेक्ष तीव्रता का उपयोग करें (अनुपूरक आंकड़ा 1b, सी) । नीले आगे तीर दबाएँ.
  4. खंगाला गया वॉल्यूम का निरपेक्ष तीव्रता थ्रेशोल्ड समायोजित करें; शोर और पृष्ठभूमि तीव्रता घटाया जाना चाहिए । सतह ओवरले ग्रे में दिखाया गया है और सतह कवरेज की सटीकता की जांच की जानी चाहिए (अनुपूरक आंकड़ा 1 डी). समायोजन पूरा करने के बाद, नीले आगे तीर दबाएँ. इस कदम के अधिकांश समय सेटिंग्स की गणना के लिए आवश्यक है । अगर सॉफ्टवेयर वॉल्यूम की गणना करने में सक्षम नहीं है, तो स्मूथ फैक्टर को बढ़ाएं ।
  5. अंतिम चरण में, कोई फ़िल्टर चुनें. वायुकोशीय अंतरिक्ष (अनुपूरक आंकड़ा 1E) में मैक्रोफेज बाहर फिल्टर करने के लिए सतह प्रतिपादन के लिए sphericity फ़िल्टर (लगभग 10 µm के साथ) का उपयोग करें । हरे आगे बटन दबाएँ.
  6. ऑप्टिकली आउटपुट छवि और. xls फ़ाइलों के रूप में निर्यात आँकड़े समायोजित करें । कुल मात्रा (sum) का उपयोग आगे के विश्लेषण (अनुपूरक आंकड़ा 1F, G) के लिए किया जाएगा । सेटिंग्स को सहेजें और एक ही cLSM सेटिंग्स (अनुपूरक आंकड़ा 1I) के साथ एक ही दिन में लिया z-पोट के सभी आगे विश्लेषण के लिए उन्हें का उपयोग करें ।
  7. डेड सेल नाभिक के लिए रेड चैनल (स्पॉट) को खंगाला । बेतरतीब ढंग से पार खिड़की में µm स्केलिंग में डॉट आकार को मापने; डॉट आकार लगभग 5 µm. Mark सक्षम करें और डॉट आकार सेट करें । जांचें कि क्या सभी डॉट्स चिह्नित है और प्रत्येक बिंदु केवल एक बार गिना जाता है । यदि आवश्यक हो तो मैन्युअल रूप से सही (अनुपूरक आंकड़ा 1b, H, J). नीले आगे तीर दबाएँ.
  8. प्रेस हरी आगे बटन के लिए कार्यक्रम की गणना/मानकों के अनुसार स्थानों की कुल संख्या निर्धारित और निर्यात के रूप में. xls फ़ाइल (अनुपूरक आंकड़ा १, एल, एम) के परिणाम के रूप में । छवि के चित्रमय या सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण ऊतक की मात्रा के अनुपात में गणना मृत कोशिका नाभिक की संख्या निर्धारित किया है ।

9. मानव PCLS में साइटोकिंस और Chemokines का मापन

नोट: cytokine और chemokine प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया संस्कृति supernatant में extracellularly मापा जा सकता है और intracellularly में ऊतक lysates के बाद मशीन समय । एलिसा डुप्लिकेट में एक ९६ अच्छी तरह से १०० µ एल के साथ थाली में मापा जाता है/

  1. बफर समाधान के ४९५ मिलीलीटर के साथ डिटर्जेंट के 5 मिलीलीटर मिश्रण से एक 1% डिटर्जेंट समाधान तैयार करें । समाधान आरटी पर कई महीनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
  2. 1:500 के अनुपात में छेड़ने अवरोधक (PI) के साथ 1% डिटर्जेंट समाधान मिक्स । आवश्यक राशि संस्कृति प्लेट पर निर्भर करता है; उदाहरण के लिए, 24-वेल प्लेट के लिए ५०० µ l/ एक अच्छी तरह के लिए, मिश्रण 1 PI के µ l के साथ ४९९ µ डिटर्जेंट समाधान के एल.
  3. PI समाधान के 1 µ एल के साथ ट्यूबों तैयार है और इन ट्यूबों में संस्कृति supernatant के ५०० µ एल इकट्ठा । तुरंत माध्यम की जगह 24-well थाली द्वारा ५०० µ l डिटर्जेंट समाधान PI युक्त के रूप में चरण ९.२ में तैयार. 1 ज के लिए लाइसे 4 डिग्री सेल्सियस पर में 24 अच्छी तरह से थाली रखकर ऊतक । प्लास्टिक एक नई ट्यूब में ऊतक lysate और इन ट्यूबों की दुकान पर-८० ° c आगे विश्लेषण तक ।
    नोट: एलिसा प्रोटोकॉल अत्यधिक निर्माता पर निर्भर करता है और निर्माता के निर्देशों का पालन किया जाना चाहिए । एक मानक एलिसा प्रोटोकॉल निंनलिखित में वर्णित है ।
  4. एलिसा करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार supernatant या lysate में cytokine के स्तर को मापने के लिए करते हैं । को मापने के IL-1α और TNF-α, कोट a96-अच्छी तरह से प्लेट pipetting १०० µ एल कैप्चर एंटीबॉडी के (के लिए कमजोर पड़ने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें) और आरटी पर रात भर गर्मी ।
  5. 1 L bidistilled पानी में एक वाशिंग बफर टैबलेट को भंग करके वाशिंग बफर तैयार करें । एक अच्छी तरह से कब्जा एंटीबॉडी और प्लास्टिक ४०० µ एल धोने बफर निकालें । इस खंड को तीन बार बदलें । ब्लॉकिंग समाधान (उदा., 1% BSA बफ़र समाधान में, निर्माता के निर्देशों के अनुसार) जोड़कर प्लेट अवरोधित करें । 1 एच के लिए आरटी पर मशीन ।
    नोट: मानक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलिसा के ऊतक supernatant या lysate के 2 x १०० µ l की आवश्यकता होती है । नमूने एक बार और बस का उपयोग करने से पहले गल जाना चाहिए । परख की संवेदनशीलता पर और जारी cytokine पर निर्भर करता है, नमूनों माप से पहले पतला होना चाहिए । इसलिए, परख द्वारा प्रदान की एजेंट में नमूना पतला ।
  6. ब्लॉकिंग समाधान निकालें और मानक वक्र के लिए पतला नमूनों को जोड़ें (निर्माता के निर्देशों का पालन करने के लिए) और ऊतक supernatant के १०० µ एल या ऊतक lysate के १०० µ l के चरण ९.३ में एकत्र डुप्लिकेट में । आरटी में 2 एच के लिए मशीन ।
  7. नमूनों को निकालें और प्लास्टिक ४०० µ एल धोने बफर एक अच्छी तरह से । इस खंड को तीन बार बदलें । प्लास्टिक १०० µ l biotinylated डिटेक्शन एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें) और आरटी में 2 एच के लिए मशीन ।
  8. एक अच्छी तरह से एंटीबॉडी और प्लास्टिक ४०० µ एल धोने बफर निकालें । इस खंड को तीन बार बदलें । जोड़ें १०० µ एचआरपी-लेबल streptavidin (के लिए कमजोर पड़ने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें) और आरटी में 20 मिनट के लिए मशीन (निर्माता के निर्देशों की जांच) ।
  9. एक अच्छी तरह से streptavidin और प्लास्टिक ४०० µ एल धोने बफर निकालें । इस खंड को तीन बार बदलें ।
  10. सब्सट्रेट के १०० µ l जोड़ें (निर्माता द्वारा अनुशंसित) और अंधेरे में 20 मिनट के लिए मशीन (निर्माता के निर्देशों की जाँच करें).
    नोट: यह चरण हल्का-संवेदी है । सब्सट्रेट और प्लेट के प्रकाश जोखिम से बचें ।
  11. ५० µ l रोकें समाधान (1 M H2तो4) जोड़कर प्रतिक्रिया रोकें । एक microplate रीडर का उपयोग कर ४५० एनएम (संदर्भ: ५७० एनएम) में प्रत्येक कुआं के अवशोषण को मापने । ४५० एनएम से ५७० एनएम पर अवशोषण घटाना ।
    नोट: अनुपचारित और/या वाहन ऊतक नियंत्रण नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं । फेफड़ों के ऊतकों में एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रेरित करने के लिए, उचित उत्तेजना का उपयोग करें (उदा, १०० एनजी/एमएल lipopolysaccharide (एलपीएस)) एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में । १०० एनजी/एमएल एलपीएस के साथ दो PLCS के साथ दो कुओं की मशीन संस्कृति माध्यम में, उदाहरण के लिए, 24 ज के लिए, और supernatant और ऊतक lysate चरण ९.३ में वर्णित के रूप में इकट्ठा ।
    नोट: मापा परिणाम स्वीकार किए जाते हैं, यदि उच्चतम मानक के अवशोषण के बराबर या १.० से ऊपर है; अंयथा माप को दोहराया जाना चाहिए । मानक वक्र sigmoidal खुराक का पालन करना चाहिए-प्रतिक्रिया वक्र फिटिंग ।
  12. चरण ९.११ में एलिसा द्वारा निर्धारित Cytokine सांद्रता (स्नातकोत्तर) प्रत्येक नमूने के ऊतक lysate में निर्धारित कुल प्रोटीन सामग्री को सामान्यीकृत कर रहे हैं (अनुभाग 10 देखें).

10. मानव PCLS में कुल प्रोटीन सामग्री का मापन

नोट: PCLS कुल प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए लीजड ड होने की जरूरत है । इस चरण के लिए ९.३ चरण से ऊतक lysates का उपयोग किया जाता है । परख एक फ्लैट ९६ में किया जाता है-अच्छी तरह से प्लेट 25 µ एल के साथ/अच्छी तरह से ऊतक lysate, pipetted के डुप्लिकेट में ।

  1. २,००० µ जी/एमएल, १,५०० µ जी/एमएल, १,००० µ जी/एमएल, ७५० µ जी/एमएल, ५०० µ जी/एमएल, २५० µ जी/एमएल, और १२५ µ जी/एमएल के BSA सांद्रता के साथ एक 7-पॉइंट BSA मानक तैयार करें । प्रत्येक मानक के लिए डुप्लिकेट में 25 µ एल लागू करें और एक ९६-well प्लेट पर एक खाली के रूप में 25 µ एल बफर समाधान का उपयोग करें (एक प्लेट कवर के साथ एक थाली का उपयोग करें) ।
  2. प्लास्टिक के 25 µ l lysates (चरण ९.३ देखें) डुप्लिकेट में एक अच्छी तरह से एक ९६ प्लेट में अच्छी तरह से । कुल में, प्रत्येक कुआं के ५० µ l की आवश्यकता है । बीसीए रिएजेंट ए में कमजोर बीसीए रिएजेंट बी 1:50 द्वारा बीसीए सॉल्यूशन का वर्किंग एजेंट तैयार करें । एक ९६ के लिए अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करें ४०० रिएजेंट बी और २०,००० µ एल के µ l
  3. ध्यान से एक अच्छी तरह से, हवा के बुलबुले से परहेज में काम कर रहे एजेंट के २०० µ एल प्लास्टिक । 30 एस के लिए एक कक्षीय शेखर (१५० rpm) पर प्लेट प्लेस lysates और काम कर रहे एजेंट की उचित मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए, और प्लेट पर एक थाली कवर डाल दिया । अंधेरे में 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली मशीन । एक microplate रीडर का उपयोग कर ५४०-५९० एनएम पर एक अच्छी तरह के अवशोषण को मापने ।
    नोट: मापन परिणाम स्वीकार किए जाते हैं, यदि उच्चतम BSA मानक का अवशोषण ०.८ के बराबर या इसके ऊपर होता है; अंयथा माप को दोहराया जाना चाहिए । मानक वक्र sigmoidal खुराक का पालन करना चाहिए-प्रतिक्रिया वक्र फिटिंग ।
  4. विश्लेषण के लिए, मानक वक्र रिक्त के घटाव के बाद एक 4-पैरामीटर Marquardt समीकरण का उपयोग कर परिकलित करें । मानक वक्र फिट का उपयोग करके अज्ञात नमूनों की प्रोटीन सांद्रता की गणना ।

Representative Results

वर्तमान अनुसंधान विधि के साथ, मानव PCLS तैयार किया और मानव फेफड़ों की सामग्री में रासायनिक प्रेरित इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रभाव का आकलन करने के लिए औद्योगिक पदार्थों की पांच सांद्रता के संपर्क में थे । फेफड़ों के ऊतकों 24 घंटे के लिए स्थाई संस्कृति के रूप में जलमग्न शर्तों के तहत उजागर किया गया था जारी LDH, mitochondrial गतिविधि, और सूक्ष्म व्यवहार्यता धुंधला के माप द्वारा मूल्यांकन किया गया । इसके अलावा, सामांय और समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस के लिए कुल प्रोटीन सामग्री मापा गया । जब भी संभव हो, निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी) ७५ मूल्यों गैर रेखीय sigmoidal वक्र फिटिंग द्वारा गणना की गई । सकारात्मक संदर्भ पदार्थ, सहज cytokine प्रतिक्रिया के लिए cytotoxicity और एलपीएस के लिए डिटर्जेंट, प्रत्येक रन के सत्यापन के लिए इस्तेमाल किया गया । logarithmically रूपांतरित IC75 [µ m] मूल्यों (log IC50) बाद cytokine रिलीज माप के लिए "अड़चन" सांद्रता के रूप में इस्तेमाल किया गया ।

चित्रा 1 और चित्रा 2 मानव PCLS के मानवीय फेफड़ों की सामग्री और अनुकरणीय एच और ई धुंधला भरने की प्रक्रिया दिखाते हैं । नियमित रूप से स्वच्छ प्रक्रियाओं के लिए स्वास्थ्य पर प्रतिकूल प्रभाव से बचने और मानव फेफड़ों की सामग्री से निपटने के कर्मचारियों की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए पीछा किया जाना है । तकनीक कर्मियों प्रशिक्षण और अभ्यास की आवश्यकता है । विभिन्न क्षेत्रों (ऊपरी/निचली पालियों और अधिक केंद्रीय बनाम) और रोगग्रस्त बनाम स्वस्थ क्षेत्रों में भेद करने वाले अनुभवी पैथोलॉजिस्ट मानव फेफड़ों की सामग्री के रोग की स्थिति का आकलन करने के लिए आवश्यक हैं । जनरेटेड मानव PCLS को H & E-सना हुआ पतले अनुभागों को तैयार करने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए, जो एक पैथोलॉजिस्ट द्वारा पुनः मूल्यांकित किया जा सकता है । यह प्रक्रिया उपयोगकर्ताओं को फेफड़ों के भीतर अलग रोगग्रस्त क्षेत्रों और स्थानों भेदभाव में अभ्यास हासिल करने में मदद करता है ।

चित्रा 3 SLS के साथ 24 एच मशीन के बाद मानव PCLS में LDH और WST-1 गतिविधि के लिए माप परिणाम प्रस्तुत करता है । SLS बिना अनुपचारित मध्यम नियंत्रण, 0 µ g/एमएल SLS पर दिखाया गया है, एक महत्वपूर्ण गुणवत्ता नियंत्रण है । मूल्यों LDH के लिए 20% से नीचे डिटर्जेंट-लीजड ड ऊतक और > 0.7 WST-1 परख के लिए अवशोषक इकाइयों की तुलना में होना चाहिए । इन गुणवत्ता नियंत्रण भी अपर्याप्त ऊतक व्यवहार्यता के संकेतक के रूप में सेवा । डिटर्जेंट समाधान की दिशा में मानव ऊतक की जवाबदेही, एक प्रभावी विषाक्त पदार्थ के रूप में, सकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल किया जाना चाहिए । यह ३००-५००% (> 2.0 अवशोषक इकाइयों) LDH के अनुपचारित ऊतक के साथ तुलना में और WST-1 परख के लिए < 0.1 अवशोषक इकाइयों के मूल्यों में वृद्धि में परिणाम होना चाहिए । SLS कोशिका व्यवहार्यता के एक खुराक पर निर्भर कमी के रूप में LDH में वृद्धि के द्वारा मापा और WST में चयापचय गतिविधि की कमी-1 सांद्रता पर परख > 87 µ g/ एक अवग्रह एकाग्रता-प्रतिक्रिया मॉडल डेटा के लिए फिट किया गया था, ताकि यह IC75 या IC50 मूल्यों की गणना करने के लिए संभव है. इन मूल्यों को बाद में cytokine और chemokine स्तर के लिए सांद्रता का चयन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: अत्यधिक विषाक्त सांद्रता पर, आमतौर पर कोई या केवल कम साइटोकिंस और chemokines का पता लगाया जा सकता है । इसलिए, गैर विषैले या केवल थोड़ा विषाक्त सांद्रता (IC75) की सिफारिश कर रहे हैं । यह यहां ध्यान दें कि कोशिका संस्कृति supernatant में LDH गतिविधि में अपेक्षित वृद्धि अक्सर लागू पदार्थ21से प्रभावित है महत्वपूर्ण है । अक्सर, हस्तक्षेप पदार्थ और एंजाइम गतिविधि के बीच होते हैं, परिणामों की अशुद्ध व्याख्या करने के लिए अग्रणी अगर LDH परख केवल cytotoxicity परख इस्तेमाल किया गया था । इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है और आवश्यक करने के लिए कई cytotoxicity परख करने के लिए विश्वसनीय और वैध परिणाम प्राप्त करते हैं । इसके अलावा, यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि LDH और WST की संवेदनशीलता-1 परख अत्यधिक तुलनीय है ।

चित्रा 4में, PCLS के सूक्ष्म व्यवहार्यता छवियों एक प्रभावी विषाक्त पदार्थ के रूप में डिटर्जेंट को मानव ऊतक की जवाबदेही का प्रदर्शन । परिणाम अंय व्यवहार्यता डेटा की पुष्टि करने के लिए बहुत उपयोगी होते हैं, लेकिन यह अतिरिक्त उपकरणों की आवश्यकता है । विषाक्त प्रभाव नेत्रहीन EthD-1-सकारात्मक कोशिका नाभिक की तुलना में calcein-सकारात्मक ऊतक के मूल्यांकन द्वारा आकलन कर रहे हैं । पैरेन्काइमा के भीतर बेतरतीब ढंग से चुना खंडों आम तौर पर तुलनीय डेटा में परिणाम है, जबकि वायुमार्ग या रक्त वाहिकाओं से बचना चाहिए, के रूप में बड़ा गुहा परिणामों को स्थानांतरित कर सकते हैं. हमारे अनुभव से और सूक्ष्म ऊपर वर्णित सेटिंग्स के साथ, १.५ x 106 के बीच एक औसत मात्रा और 5 x 106 µm नियंत्रण ऊतक के3 मापा जाता है । मूल्यों फेफड़ों सामग्री की गुणवत्ता पर निर्भर, PCLS गुणवत्ता, और भी फेफड़ों के ऊतकों दाता की बीमारी पर । हालांकि मानव फेफड़े के ऊतकों की व्यवहार्यता दाताओं के बीच बदलता है, व्यवहार्य ऊतक के साथ तुलना में मृत कोशिका नाभिक की संख्या ऊतक नियंत्रण के 15% से अधिक नहीं होना चाहिए । यदि मृत कोशिका नाभिक ऊतक नियंत्रण में मुख्य रूप से मौजूद हैं, तथापि, प्रयोग छोड़ दिया जाना चाहिए ।

चित्रा 5 मानव फेफड़े के ऊतकों पर HClPt और SLS के इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रभाव के लिए प्रतिनिधि डेटा प्रदर्शित करता है । समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस IL-1α और TNF-α सूजन के निशान हैं, उत्तेजक पदार्थों के लिए जोखिम के बाद भड़काऊ प्रक्रियाओं की शुरुआत का संकेत है । दोनों साइटोकिंस एलिसा द्वारा मापा गया । Extracellular आईएल-1α आमतौर पर मानव PCLS में कम है, जबकि intracellular आईएल-1α १,००० स्नातकोत्तर के स्तर तक पहुंचता है/ intracellular IL-1α में कमी चल रही साइटोटोक्सिक प्रक्रियाओं को इंगित करता है-और ज्यादातर रसायनों के लिए मानव PCLS के जोखिम के बाद मनाया जाता है । ऊतक एलपीएस के साथ उत्तेजित है, तो सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के एक उत्प्रेरक और इस तरह के सकारात्मक उपचार नियंत्रण के रूप में, तो प्रेरित IL-1α के अधिकांश केवल 24 ज के बाद intracellularly पता लगाया जा सकता है । इसके विपरीत, TNF-α स्राव एलपीएस उत्तेजना द्वारा प्रेरित मुख्य रूप से extracellularly मापा जा सकता है । एक उपयुक्त सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग, जैसे एलपीएस, एक विधि की वैधता को दर्शाता है । वर्तमान अनुसंधान विधि के साथ, मानव PCLS HClPt के तीन सांद्रता (३२, ६४, और १२५ µ g/एमएल) या SLS के दो सांद्रता (1 और 10 µ जी/Cytokine स्राव के लिए उजागर किया गया था extracellular और intracellular के एक योग के रूप में निर्धारित किया गया था साइटोकिंस चित्रा 5में चित्रित के रूप में कुल प्रोटीन सांद्रता को सामान्यीकृत । यह यहां उल्लेख लायक है कि बीसीए परख आम तौर पर कुल प्रोटीन सामग्री के निर्धारण के लिए प्रयोग किया जाता है, तथापि, यह भी पदार्थ प्रेरित cytotoxicity को दर्शाता है । इसलिए, अत्यधिक विषाक्त सांद्रता पर कुल प्रोटीन सामग्री cytokine डेटा के सामान्यीकरण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता. IL-1α का स्राव २६३ ± ३८ स्नातकोत्तर/मिलीग्राम से ८८७ ± २१६ स्नातकोत्तर/मिलीग्राम के लिए और TNF-α से २६३ ± ३८ स्नातकोत्तर/मिलीग्राम से १,१६० ± २८६ स्नातकोत्तर/मिलीग्राम (चित्रा 5ए, बी) । इसके अलावा, एलपीएस-प्रेरित आईएल-1α और TNF-α स्राव एक उत्तेजित ऊतक नियंत्रण की तुलना में प्रस्तुत किया जाता है । एलपीएस के रूप में रोगज़नक़-जुड़े आणविक पैटर्न, द्वारा समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस की प्रेरण, एक विधि की वैधता को दर्शाता है और अत्यधिक इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रभाव की जांच करने के लिए मानव PCLS के साथ काम करते समय इस्तेमाल किया जा करने के लिए सिफारिश की है. HClPt और SLS डेटा के बारे में अधिक जानकारी के लिए, कृपया Lauenstein एट अल द्वारा अध्ययन देखें. 21

Figure 1
चित्र 1 : मानव फेफड़ों सामग्री भरने के लिए प्रक्रिया । मानव फेफड़ों लकीर के बाद तुरंत तैयार है । फेफड़ों agarose के साथ लगातार भरने के लिए और भरने के दौरान अचानक agarose बहुलकीकरण से बचने के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जाना चाहिए । फेफड़े क्षैतिज रूप से तैनात है, पालियों मुख्य श्वसनी या ब्रांकाई पर एक इष्टतम दृष्टिकोण के लिए बाहर फैला के साथ (एक और श्वसनी पर closeup के लिए बी ) । ब्रांकाई एक लचीला सिलिकॉन ट्यूब के साथ cannulated रहे है और clamps के साथ तय (ग) । भरने की प्रक्रिया और ऊतक में agarose बहुलकीकरण के बाद, प्रशिक्षित पैथोलॉजिस्ट के बारे में 3-5 सेमी मोटाई के स्लाइस में फेफड़ों में कटौती(D) । इन स्लाइस बेलनाकार ऊतक कोर (Ø उदा., 8 मिमी) से एक coring उपकरण (ई) के साथ तैयार कर रहे हैं । इन ऊतक कोर PCLS में एक ऊतक स्लाइसर के साथ काट रहे हैं, जो तुरंत सामान्य कोशिका संस्कृति की स्थिति (ई) के तहत गर्मी के लिए मध्यम से भरे पेट्री व्यंजन में स्थानांतरित कर रहे हैं । कई धोने कदम PCLS सेल संस्कृति प्लेटों में स्थानांतरित कर रहे है के बाद (उदा, 24-अच्छी तरह से थाली के साथ दो PCLS और ५०० µ एल मध्यम) अवशिष्ट कोशिका मलबे को हटाने और सेल मध्यस्थों जारी (एफ) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : मानव PCLS के स्वास्थ्य की स्थिति का निर्धारण एच एंड ई धुंधला से । इस छवि में PCLS, एक फेफड़े के ट्यूमर के साथ एक दाता से तैयार, वायुकोशीय पैरेन्काइमा, परिधीय एयरवेज (* * *) के साथ बरकरार फेफड़े के ऊतकों को दिखाता है, और रक्त वाहिकाओं (ऐरोहेड) सिंहावलोकन (a) में । उच्च आवर्धन पर, बरकरार ciliated श्वसन उपकला (ऐरोहेड) के साथ एयरवेज का आयोजन (ख), एक बरकरार वायुकोशीय संरचना व्यवहार्य pneumocytes के साथ लाइन में खड़ा है, जिसमें कई एरिथ्रोसाइट्स (ऐरोहेड) (सी) के साथ एक केशिका शामिल है, वायुकोशीय मैक्रोफेज युक्त वायुकोशीय रिक्त स्थान (CD68 immunohistochemistry) (D), और साथ ही बरकरार endothelium (CD31 immunohistochemistry) (ई) के साथ रक्त वाहिकाओं को मनाया जा सकता है । केवल ट्यूमर मुक्त ऊतक PCLS के लिए इस्तेमाल किया गया था, यही वजह है कि कोई macroscopically रोगग्रस्त क्षेत्रों दिखाई दे रहे हैं । इस तरह के वातस्फीति या फाइब्रोसिस के रूप में अन्य फेफड़ों के रोगों के साथ दानदाताओं से तैयार PCLS के विपरीत, वायुकोशीय संरचना बाधित नहीं है और PCLS केवल थोड़ा बाहरी बोर्डर पर मैदान में है, सबसे तैयारी कदम के कारण की संभावना है । स्केल पट्टियां क्रमशः १,००० µm (A) और ५० µm (B-E), इंगित करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : मानव PCLS में SLS द्वारा प्रेरित cytotoxicity का निर्धारण, संस्कृति माध्यम में एंजाइम LDH के रिसाव से मापा (क) और चयापचय एंजाइम डाई WST-1 (ख) के साथ मूल्यांकन गतिविधि के नुकसान. मानव PCLS SLS की सांद्रता बढ़ाने के लिए अवगत कराया गया. एक अवग्रह एकाग्रता-प्रतिक्रिया मॉडल बाद में डेटा के लिए फिट था, ताकि IC75 या IC50 मूल्यों (निरोधात्मक एकाग्रता में 25% और सेल व्यवहार्यता के ५०% कमी) की गणना की जा सकती है (सही आंकड़े) । डेटा के रूप में प्रस्तुत कर रहे है मतलब ± SEM, n = 3-5 । LDH परख के अवशोषक ४९२ एनएम पर मापा गया था (संदर्भ में ६३० एनएम) और WST-1 ४५० एनएम पर परख (संदर्भ में ६३० एनएम) । डेटा अनुकूलित और Lauenstein एट अल से संशोधित किया गया. 21 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : तीन आयामी सूक्ष्म धुंधला और मानव PCLS की छवि प्रतिपादन के प्रतिनिधि छवियां । लाइव ऊतक नियंत्रण और डिटर्जेंट के लिए ऊतक की जवाबदेही, एक प्रभावी विषाक्त पदार्थ के रूप में, calcein के साथ मानव PCLS के दाग के बाद दिखाया गया है (पीला) और EthD-1 (लाल) । 30 µm के ढेर एक 10x उद्देश्य (a) और गाया (बी) के साथ ले जाया गया । स्केल बार १०० µm. उत्तेजना तरंग दैर्ध्य ४८८ एनएम और ५४३ एनएम, उत्सर्जन फिल्टर बीपी 505-550 एनएम और एल. पी. ५६० एनएम इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : अमोनियम hexachloroplatinate (HClPt)-प्रेरित आईएल-1α और मानव α में TNF-PCLS स्राव 24 एच जोखिम के बाद । PCLS को तीन सांद्रता (३२ µ g/ml, ६४ µ g/एमएल, और १२५ µ g/एमएल) के HClPt और दो अलग सांद्रता (1 µ g/ml और 10 µ g/एमएल) के SLS से अवगत कराया गया । Extracellular और intracellular आईएल-1α (ए) और TNF-α (बी) एलिसा द्वारा निर्धारित किया गया और कुल प्रोटीन सामग्री के लिए सामान्यीकृत । विधि की वैधता दिखाने के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के एक सकारात्मक उत्प्रेरक, एलपीएस, intracellular IL-1α (ए) के लिए एक संदर्भ के रूप में दिखाया गया है और extracellular TNF-α (ख) रिलीज के लिए, कुल प्रोटीन सामग्री को सामान्यीकृत । डेटा को अर्थ ± SEM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, *p < 0.05 और * * *p < 0.001; HClPt और SLS: n = 9, IL-1αएलपीएस: n = 5, TNF-αएलपीएस: n = 4 तकनीकी डुप्लिकेट में (मान-Whitney test) । यह आंकड़ा Lauenstein एट अल से संशोधित किया गया है । 21 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplementary Figure 1
अनुपूरक आंकड़ा 1: प्रतिपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग दाग सूक्ष्म व्यवहार्यता की छवियों के लिए विस्तृत गणनात्मक प्रसंस्करण । calcein-सना हुआ व्यवहार्य ऊतक (ए-जी, मैं) और ethidium homodimer-सना हुआ सेल नाभिक के स्पॉट का पता लगाने के लिए अपलोड की गई LSM छवियों के छवि विश्लेषण के लिए कदम दर कदम ऑपरेटिंग प्रक्रिया (एच, जे-एम). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplementary Figure 2
अनुपूरक चित्रा 2: मानव फेफड़ों के ऊतकों के दाग सूक्ष्म व्यवहार्यता की गणना की छवि विश्लेषण का अवलोकन । व्यवहार्य ऊतक (पीला) भूतल प्रतिपादन (बी-I) द्वारा विश्लेषण किया गया था और मृत सेल नाभिक (लाल) स्पॉट डिटेक्शन (J-P) द्वारा पाया गया । स्नैपशॉट मोड का उपयोग छवि (Q) को निर्यात करने के लिए किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

मानव PCLS तकनीक अच्छी तरह से हमारी प्रयोगशाला में स्थापित है । वर्तमान कागज फेफड़ों के ऊतकों में मादक पदार्थों की विषाक्तता परीक्षण के लिए इस तकनीक और इसके उपयोग का विवरण देता है पूर्व vivo. सामांय में, इस तकनीक का उपयोग कर किसी भी प्रयोगशाला को quantifiable पर्वतमाला, variabilities का आकलन की एक परख संबंधित परिभाषा की स्थापना की तलाश, और गुणवत्ता नियंत्रण प्रयोग की वैधता की गारंटी चाहिए । संभव मानक प्रक्रियाओं हो सकता है, उदाहरण के लिए, प्रत्येक समापन बिंदु दोहराने के लिए, उदा, cytotoxicity परख, तीन जैविक दाताओं की एक ंयूनतम में (व्यक्तिगत चलाता है) के साथ दो से तीन तकनीकी की प्रतिकृतियां प्रति नमूना सहित सकारात्मक और नकारात्मक संदर्भ । प्रयोगशाला कर्मियों को परख निरंतरता बढ़ाने और परख परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए प्रशिक्षित किया जाना चाहिए ।

अंतिमबिंदु अक्सर फेफड़ों के ऊतकों पर पदार्थों के इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया cytotoxicity माप शामिल विभिन्न परख का उपयोग (उदा, LDH परख, WST-1 परख, सूक्ष्म धुंधला परख), cytokine रिलीज की परख, के रूप में अच्छी तरह के रूप में अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में परिवर्तन और सेलुलर आबादी में परिवर्तन के लक्षण वर्णन immunohistopathological तरीकों से6। इसके अलावा, वहां ऐसे फुफ्फुसीय वृक्ष कोशिकाओं के रूप में कोशिकाओं के दृश्य का वर्णन तकनीक है, murine PCLS में28 कि भी मानव PCLS को हस्तांतरित किया जा सकता है और इस प्रकार सेलुलर संरचना में और अधिक विस्तृत जानकारी प्रदान करने से पहले और ख्यात साइटोटोक्सिक पदार्थों के साथ उपचार के बाद ।

इस बुनियादी प्रोटोकॉल और मानव फेफड़ों के ऊतकों को तैयार करने के लिए तकनीक की तकनीक है कि अच्छी तरह से प्रकाशन में वर्णित किया गया है तुलनीय है29। संक्षेप में, अंग सामग्री जीने से पीड़ित रोगियों से प्राप्त की है, फेफड़ों के कैंसर के रूप में पुराने रोगों की धमकी, जो लकीर या प्रत्यारोपण के लिए सर्जरी से गुजरना है । अध्ययन स्थानीय आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए । मरीजों की जानकार लिखित सहमति जरूरी है । क्लिनिक और प्रयोगशाला के बीच एक कार्यप्रवाह की स्थापना एक महत्वपूर्ण मुद्दा है और संचार, और दोनों साइटों के बीच इंटरफेस और बुनियादी सुविधाओं की परिभाषा की आवश्यकता है । मानव फेफड़ों सामग्री के लिए सीधे लकीर के बाद ऊतक की व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए संसाधित किया जाना है । यह उल्लेख है कि तकनीक मानव PCLS के लिए यहां वर्णित दोनों युवा और पुराने फेफड़े और स्वस्थ और रोगग्रस्त फेफड़ों के लिए लागू किया जा सकता लायक है । अमेरिका में, उदाहरण के लिए, यह स्वस्थ अंग दाताओं जो दुर्घटनाओं में मारे गए या जिनके अंगों प्रत्यारोपण के लिए अस्वीकार कर दिया गया है से फेफड़ों को प्राप्त करने के लिए संभव है ।

प्रोटोकॉल में पहला महत्वपूर्ण कदम agarose समाधान के साथ एयरवेज और आसपास के पैरेन्काइमा की मुद्रास्फीति है । इस चरण के बाद टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के लिए बहुत नरम ऊतक जमना आवश्यक है । मानव फेफड़ों की सामग्री की गुणवत्ता, रोग पृष्ठभूमि पर आधारित है, यहां महत्वपूर्ण है । बरकरार फुफ्फुस के साथ केवल पालियों को भरा जा सकता है । श्वसनी के पास अंतिम चरण ट्यूमर कभी-कभार भरने की प्रक्रिया को रोकते हैं । मानव सामग्री फुलाने से पहले, agarose समाधान के तापमान को अच्छी तरह से जांच की जानी चाहिए । बहुत अधिक रक्त (या अंय तरल पदार्थ, exudates) मानव फेफड़ों के ऊतकों के अंदर agarose के अवांछित कमजोर पड़ने में परिणाम होगा और बहुलकीकरण प्रक्रिया को प्रभावित करेगा । फेफड़े के ऊतकों और बर्फ पर agarose के बीच बढ़िया तालमेल की मुद्रास्फीति के बाद, फेफड़ों २०० के वर्गों में काट रहे है ३०० µm मोटाई । ऊतक की निरंतरता एक बहुत ही महत्वपूर्ण मुद्दा है । यदि ऊतक भी नरम है, बराबर वर्गों की टुकड़ा करने की क्रिया मुश्किल है । यहां तक कि अगर एक ही microtome पैरामीटर प्रत्येक दाता के लिए निर्धारित कर रहे हैं, दाताओं के बीच स्लाइस की मोटाई भिंन हो सकते हैं, व्यक्तिगत स्थितियों और प्रत्येक फेफड़ों के लिए inflating प्रक्रिया के दौरान परिवर्तन के कारण । ऊतक के सजातीय भरने अलग टुकड़ा मोटाई में परिणाम होगा । के बजाय को मापने और स्लाइस की मोटाई मानकीकरण, कुल प्रोटीन सामग्री की माप के लिए परोक्ष रूप से फेफड़े टुकड़ा मोटाई की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कई अंत चरण के रोगों टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया में बाधा; जैसे, रक्त वाहिकाओं अत्यंत फुफ्फुसीय उच्च रक्तचाप में और अधिक गाढ़ा कर रहे हैं, और fibrotic ऊतक इतना कठोर हो सकता है कि ऊतक सिलेंडर की टुकड़ा करने की क्रिया शायद ही संभव है और microtome ब्लेड बहुत बार प्रतिस्थापित किया जा करने की जरूरत है ।

मानव PCLS और गहन धुलाई कदम है, जो सेल मलबे और जारी एंजाइमों को दूर करने के लिए आवश्यक हैं की तैयारी के बाद, ऊतक वर्गों प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है29. मानव PCLS सामांय कोशिका संस्कृति की स्थिति और उजागर, उदाहरण के लिए, रसायनों, दवाओं, या lipopolysaccharides के तहत संस्कृति रहे हैं । (अज्ञात) संक्रमण के कारण PCLS के सामयिक संदूषण मानव फेफड़ों की सामग्री की संस्कृति में एक विशेष मुद्दा है । ऊतक संक्रमण दिखा संस्कृतियों छोड़ दिया जाना चाहिए और उपकरण पूरी तरह से संक्रमित होना चाहिए । एक हाथ पर तैयारी के लिए इस्तेमाल किया प्रयोगशाला स्थानों के बीच स्थानिक जुदाई और दूसरी ओर संवर्धन पार संक्रमण से बचने के लिए मदद कर सकते हैं । उपकरण के संबंध में, microtome रिसाव हो सकता है, और ढीला हेक्स शिकंजा मोटर नुकसान और ब्लेड आंदोलन के बंद करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । नहीं स्लाइसर के हर भाग स्टेनलेस स्टील से बना है, और इसलिए यह ऑक्सीकरण अगर तुरंत सफाई बदल सूख नहीं होगा । उपकरण की समस्याओं को दूर करने के लिए, यह कम एक बैकअप डिवाइस के लिए आवश्यक हो सकता है ।

पिछले प्रकाशनों में, agarose बाहर धोया और तैयारी के बाद गहन धुलाई कदम के दौरान हटा दिया गया है सूचित किया गया है । वास्तव में, यह संभव नहीं है, agarose नहीं निकाला जा सकता है । agarose को पूरा हटाने के लिए, यह उच्च तापमान पर फिर से पिघला हुआ है, जो ऊतक को नष्ट करने की जरूरत है । alveoli और एयरवेज में agarose वर्णित अंतिमबिंदु के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है । अन्य अंतिमबिंदु agarose की उपस्थिति से प्रभावित हो सकता है (यह भी सीमाएं देखें). ऊतक व्यवहार्यता संस्कृति में एक महत्वपूर्ण मुद्दा है के रूप में बहुत ताजा ऊतक वर्गों को तैयार करने की जरूरत है, पर जोर दिया है । ब्रोन्कोकन्सट्रिक्शन व्यवहार्यता के लिए एक मांय पैरामीटर नहीं है । हम अनुशंसा करते है का उपयोग करने के लिए ंयूनतम दो या तीन स्वतंत्र cytotoxicity परख आसपास के पैरेन्काइमा की व्यवहार्यता की जांच करने के लिए; यह हर प्रयोग में जांच की जानी है30। cytotoxicity परख में गुणवत्ता नियंत्रण अपर्याप्त ऊतक व्यवहार्यता के संकेतक के रूप में सेवा करते हैं । इसलिए, यह ऊतक की जवाबदेही का आकलन करने के लिए सिफारिश की है, उदाहरण के लिए, सभी cytotoxicity परख में एक डिटर्जेंट के रूप में एक प्रभावी विषाक्त पदार्थ के लिए. खुराक के आधार पर प्रतिक्रिया घटता, अवशोषण के न्यूनतम और अधिकतम मूल्यों cytotoxicity परख के लिए परिभाषित करने के लिए और बाद में प्रयोगों के लिए मुलाकात की जरूरत है. इसके अलावा प्रोटोकॉल में संशोधन ज्यादातर लागू रसायनों और ब्याज के समापन पर निर्भर करते हैं । अघुलनशील या अत्यधिक प्रतिक्रियाशील रसायनों की प्रयोज्यता सीमित है. DMSO के लिए उच्चतम विलायक एकाग्रता 1% तक सीमित है । उच्च सांद्रता इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस तरह के IL-8 के रूप में समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस, के स्पष्ट रिलीज में परिणाम हो सकता है । दूसरी ओर, इस्तेमाल उत्तेजना अपेक्षाकृत कमजोर हो सकता है । इस मामले में, ऊतक की मात्रा प्रति अच्छी तरह से दो से चार स्लाइस से बढ़ाया जा सकता है । यह दृष्टिकोण 24 एच व्यवहार्यता को सीमित करता है ।

मानव PCLS की एक प्रमुख सीमा है कि जर्मनी में वे केवल रोगग्रस्त मानव फेफड़ों की सामग्री से तैयार किया जा सकता है । रोगियों जो सर्जरी से गुजरना सामान्य रूप से कर रहे हैं ५० साल और फेफड़ों के कैंसर से पीड़ित रोगियों के ८०% कर रहे हैं या धूम्रपान करने वालों के लिए इस्तेमाल किया. रोगियों की दवा, जैसे ग्लुकोकोर्तिकोइद, भी मानव ऊतक का उपयोग कर प्रयोगों के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं. इसलिए, यह करने के लिए आवश्यक है: i) सकारात्मक संदर्भ के द्वारा प्रत्येक प्रयोग मांय व्यवहार्यता, कार्यशीलता, और व्यक्तिगत ऊतक की संवेदनशीलता की पुष्टि, और द्वितीय) पार से स्वस्थ, गैर रोगग्रस्त, मध्यम आयु फेफड़ों के ऊतकों का उपयोग कर परिणामों को मांय प्रयोगशाला जानवरों (गैर मानव रहनुमाओं जैसे cynomolgus और, यदि संभव हो तो, माउस, चूहा, गिनी पिग) । बेहतर रोग ऊतक के विकृति स्कोर, प्रयोगात्मक परिणामों को बेहतर. भारी रोगग्रस्त ऊतक शायद ही इस्तेमाल किया जा सकता है और बहुत बार सीमित व्यवहार्यता, अपर्याप्त कम या अत्यंत उच्च cytokine स्तर, बैक्टीरियल या फंगल संक्रमण, और कम ब्रोन्कोकन्सट्रिक्शन से पता चलता है । दाता से दाता भिन्नता प्रयोगशाला जानवरों से प्राप्त परिणामों के साथ तुलना में अधिक है, मनुष्यों की व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता को दर्शाती है. यह है, तथापि, नहीं एक सीमा सामांय में; जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, अंय देशों में (जैसे, अमेरिका) यह मृतक अंग प्रत्यारोपण के लिए अस्वीकार कर दिया दाताओं से स्वस्थ फेफड़ों को प्राप्त करने के लिए संभव है । ऊतक की जवाबदेही अच्छी तरह से तीव्र जोखिम प्रयोगों में ४८ एच करने के लिए पहली बार के लिए वर्णित किया गया है । व्यवहार्यता और ऊतक की कार्यक्षमता संस्कृति के कई दिनों के बाद या-८० डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के बाद कम है । यह संस्कृति मानव फेफड़े के ऊतकों के लिए लगभग 14 दिनों के लिए संभव है । व्यवहार्यता इस समय के दौरान जारी है; हालांकि, परिवर्तनशीलता में वृद्धि, के रूप में अच्छी तरह से कई कोशिका आबादी की कार्यक्षमता की हानि के रूप में, जैसे मैक्रोफेज, ऊतक में मनाया जाता है, mitogens के जवाब में सीमित cytokine रिलीज में जिसके परिणामस्वरूप. कुछ अंतिमबिंदु के लिए एक और सीमा ऊतक में agarose की उपस्थिति है, बाधा, उदाहरण के लिए, आरएनए के उच्च गुणवत्ता वाले और पर्याप्त मात्रा में अलगाव31 या बाद में प्रवाह cytometry के लिए एकल सेल निलंबन की तैयारी और कोशिकाओं की phenotyping. संभावना एकल सेल प्रतिक्रियाओं और कार्यक्षमता में यंत्रवत अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए इस प्रकार सीमित है ।

Organotypic ऊतक मॉडल, जैसे मानव PCLS, बुनियादी और गैर नैदानिक अनुसंधान पर एक उच्च प्रभाव को माना जाता है । मानव फेफड़ों की सामग्री एक जैविक संरचना है जो बारीकी से सामांय अंग वास्तुकला को दर्शाता है । यह उदाहरण के लिए शामिल हैं, आवासीय वायुकोशीय और दमा उपकला कोशिकाओं, चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं, fibroblasts, endothelial कोशिकाओं, तंत्रिका तंतुओं, और मैक्रोफेज. ऊतक व्यवहार्य है और कोशिकाओं को कई उत्तेजनाओं का जवाब । तंत्रिका तंतुओं, हालांकि कटौती, स्थानीय रूप से सक्रिय किया जा सकता है, टर्मिनल पलटा प्रतिक्रियाओं के लिए अग्रणी14. नतीजतन, इस पूर्व vivo मॉडल संभावना सेलुलर जंमजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए प्रदान करता है, रक्षा प्रतिक्रियाओं, cytokine संकेतन, और सेल सतह मार्करों की प्रेरण । तकनीक, संवर्धन में कई सुधार, और अंतिमबिंदु के सत्यापन शोधों विज्ञान में मानव PCLS के उपयोग की अनुमति देते हैं । भविष्य के दृष्टिकोण के उदाहरण हैं: i) मानव फेफड़ों के ऊतकों में नए लक्ष्यों के सत्यापन, ii) जोखिम के बाद प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन, उदाहरण के लिए, रसायनों के लिए, ड्रग्स, नैनोकणों, आदि, iii) प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ फेफड़ों के ऊतकों की पूरकता, ऐसे के रूप में T-लिम्फोसाइटों, iv) आणविक पैटर्न की पहचान और संशोधन, उदाहरण के लिए, श्वसन संवेदीकरण, रोग उत्प्रेरण पदार्थ, या सक्रिय यौगिकों रास्ते बाधा के लिए जोखिम के बाद; इसके अलावा, v) airway remodeling और vi) न्यूरॉन विनियमन३२. वैज्ञानिक क्षेत्र PCLS के साथ इन वर्तमान और भविष्य के दृष्टिकोण में रुचि है । इसके अलावा, विभिंन घटनाओं है कि इस तरह के क्रायो के रूप में PCLS तकनीक में सुधार करने में मदद मिलेगी की एक किस्म,20संरक्षण, और ऊतक सांस लेने या यांत्रिक के दौरान ऊतक के प्राकृतिक आंदोलन की नकल करने के लिए३३ खींच वेंटिलेशन.

अंय 3d मॉडल के साथ तुलना में मानव PCLS का प्रमुख लाभ प्रतिरक्षा कोशिकाओं और तंत्रिका तंतुओं की उपस्थिति है । प्रयोग भी माउस, चूहा, और गैर मानव रहनुमाओं, जो पशु प्रजातियों कि अभी भी औषध विज्ञान और विषविज्ञान में सबसे अधिक बार उपयोग किया जाता है में प्रदर्शन किया जा सकता है । मानव फेफड़ों के ऊतकों की जटिलता मानव के लिए पशु से परिणाम के अनुवाद का समर्थन करता है और इन विट्रो में से vivo मेंकरने के लिए । श्वसन संवेदीकरण की पहचान के लिए मौजूदा वैकल्पिक परख के संदर्भ में, मानव PCLS बहुत जटिल हैं और एक सेल प्रतिक्रियाओं में अंतर्दृष्टि की अनुमति नहीं है । फिर भी, माइक्रोस्कोपी और फ्लो cytometry सेलुलर प्रतिक्रियाओं के बारे में जानकारी दे सकता है, अगर सही सेलुलर मार्कर संयोजन में प्रयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, apoptosis, परिगलन, या intracellular मार्करों के साथ. वहां परख जो मांय किया गया है और सूचना के लिए श्वसन संवेदीकरण की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया है प्रकाशित कर रहे हैं । हालांकि, एकल सेल परख पर अपने सभी फायदों के साथ PCLS के उपयोग में अग्रिमों अर्थ में एक मूल्यवान योगदान है कि तकनीक उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में वाटसन एट अल द्वारा वर्णित कर रहे हैं । ३४ वे एक उच्च प्रवाह जांच परख विकसित करने के लिए murine क्रायो में airway विषाक्तता की भविष्यवाणी PCLS संरक्षित । उनके लघुकृत ९६-well PCLS प्रारूप के साथ, वे murine लेवेज द्रव में इसी तरह के readouts का पता लगाया, एक व्यवहार्य उच्च प्रवाह परख PCLS बना रही है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है । Fraunhofer आइटम लागू अनुसंधान के लिए एक स्वतंत्र सार्वजनिक गैर लाभ अनुसंधान संगठन है, जैव प्रौद्योगिकी, दवा, रसायन, और सौंदर्य प्रसाधन उद्योगों की ओर से अनुबंध अनुसंधान प्रदर्शन । संस्थान की फंडिंग राष्ट्रीय और अंतर्राष्ट्रीय सार्वजनिक परियोजनाओं से आती है ।

Acknowledgments

हम उसके पूर्व के लिए लैन Lauenstein शुक्रिया अदा करना चाहूंगा मानव PCLS के साथ जोखिम मूल्यांकन के लिए वैकल्पिक परीक्षण रणनीतियों के बारे में काम करते हैं । अनुसंधान के कुछ 6वें फ्रेमवर्क प्रोग्राम सेंस के भीतर यूरोपीय आयोग से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था-आईटी-IV "उपंयास परीक्षण रणनीतियों के लिए इन विट्रो एलर्जी कारकों के आकलन के लिए" ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon hose 3.0 x 5.0 mm A. Hartenstein (Leipzig, Germany) SS04
Syringe Faust Lab Science (Klettgau, Germany) 9.410 050
Coring tools custom-made custom-made
Trimming Blade Handle (FEATHER) pfm medical ag  (Cologne, Germany) 205530001
Trimming Blades (FEATHER) pfm medical ag  (Cologne, Germany) 205500000
Microtome: Tissue Slicer Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) 303400-ADPT Krumdieck Tissue Slicer (MD6000)
Microtome blade Wilkinson Sword (Solingen, Germany) ENR-4027800011506
Tissue culture dishes Sigma (München, Germany) Z666246-420EA
Cell strainer filter (100 µm Nylon) Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) BD352360
Inoculation loop Copan Diagnostics (Murrieta, USA)  CD176S01
TPP Tissue culture plates 24wells Sigma (München, Germany) Z707791-126EA
Cassette Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 1000957
Nunc MaxiSorp flat-bottom Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) 44-2404-21
Nunc MicroWell 96-Well  Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 260836
Confocal Microscope Zeiss (Jena, Germany) Confocal LSM Meta 510
Image rendering software Bitplane AG (Zürich, Switzerland) IMARIS 7.6
LSM Image Browser Zeiss (Jena, Germany)
Multiwell-Reader Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) Tecan infinite F200Pro Plate Reader
Plate shaker Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) KM-2 Akku
BenchMark ULTRA Ventana Medical Systems (Tucson, USA) Automated IHC/ISH slide staining system
Assays
Cell Proliferation Reagent WST-1 Roche (Basel, Switzerland) 11644807001
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) Roche (Basel, Switzerland) 11644793001
Microscopical vitality staining  Invitrogen (Carlsbad, USA) L-3224 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit
BCA Protein Assay Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 23225
ELISA assay kit R & D systems various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) DuoSet
Reagents
Agarose, low gelling temperature  Sigma (München, Germany) A9414-100G
Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) Sigma (München, Germany) E2888-500ML
Penicillin and streptomycin Lonza (Verviers, Belgium) 17-602E
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) Gibco (Darmstadt, Germany) 11039-047 Culture medium
Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) Lonza (Verviers, Belgium) BE17-513F   Buffer solution
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma (München, Germany) A9647-500G
Detergent Sigma (Saint Louis, USA) X100-100ML Triton X-100
Washing buffer Merck (Darmstadt Germany) 524653  0.05% Tween 20 in PBS

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References

  1. D'Amato, G., et al. Climate change, air pollution and extreme events leading to increasing prevalence of allergic respiratory diseases. Multidiscip Respir Med. 8 (1), 12 (2013).
  2. Pawankar, R., et al. State of world allergy report 2008: allergy and chronic respiratory diseases. World Allergy Organ J. 1 (6), Suppl 4-17 (2008).
  3. Hartung, T., Daston, G. Are in vitro tests suitable for regulatory use. Toxicol Sci. 111 (2), 233-237 (2009).
  4. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460 (7252), 208-212 (2009).
  5. Balls, M., Straughan, D. W. The three Rs of Russell & Burch and the testing of biological products. Dev Biol Stand. 86, 11-18 (1996).
  6. Sewald, K., Braun, A. Assessment of immunotoxicity using precision-cut tissue slices. Xenobiotica. 43 (1), 84-97 (2013).
  7. Fisher, R. L., et al. The use of human lung slices in toxicology. Hum Exp Toxicol. 13 (7), 466-471 (1994).
  8. Ressmeyer, A. R., et al. Characterisation of guinea pig precision-cut lung slices: comparison with human tissues. Eur Respir J. 28 (3), 603-611 (2006).
  9. Donovan, C., et al. Rosiglitazone elicits in vitro relaxation in airways and precision cut lung slices from a mouse model of chronic allergic airways disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (10), 1219-1228 (2015).
  10. Koziol-White, C. J., et al. Inhibition of spleen tyrosine kinase attenuates IgE-mediated airway contraction and mediator release in human precision cut lung slices. British journal of pharmacology. 173 (21), 3080-3087 (2016).
  11. Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices. J Vis Exp. (83), e50970 (2014).
  12. Lamb, D. J., et al. Bl 1002494, a Novel Potent and Selective Oral Spleen Tyrosine Kinase Inhibitor, Displays Differential Potency in Human Basophils and B Cells. J Pharmacol Exp Ther. 357 (3), 554-561 (2016).
  13. Leus, N. G., et al. HDAC 3-selective inhibitor RGFP966 demonstrates anti-inflammatory properties in RAW 264.7 macrophages and mouse precision-cut lung slices by attenuating NF-kappaB p65 transcriptional activity. Biochem Pharmacol. 108, 58-74 (2016).
  14. Schleputz, M., et al. Neurally mediated airway constriction in human and other species: a comparative study using precision-cut lung slices (PCLS). PLoS One. 7 (10), 47344 (2012).
  15. Hess, A., et al. Prevalidation of the ex-vivo model PCLS for prediction of respiratory toxicity. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 32, 347-361 (2016).
  16. Bergner, A., Sanderson, M. J. Acetylcholine-induced calcium signaling and contraction of airway smooth muscle cells in lung slices. J Gen Physiol. 119 (2), 187-198 (2002).
  17. Wohlsen, A., et al. The early allergic response in small airways of human precision-cut lung slices. Eur Respir J. 21 (6), 1024-1032 (2003).
  18. Wu, W., et al. Innate immune response to H3N2 and H1N1 influenza virus infection in a human lung organ culture model. Virology. 396 (2), 178-188 (2010).
  19. Zmora, P., et al. Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS One. 12 (5), 0176597 (2017).
  20. Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. Am J Respir Cell Mol Biol. 50 (5), 876-881 (2014).
  21. Lauenstein, L., et al. Assessment of immunotoxicity induced by chemicals in human precision-cut lung slices (PCLS). Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 28 (4), 588-599 (2014).
  22. Wild, L. G., Lopez, M. Occupational asthma caused by high-molecular-weight substances. Immunol Allergy Clin North Am. 23 (2), 235-250 (2003).
  23. Di Stefano, F., et al. Occupational asthma due to low molecular weight agents. Int J Immunopathol Pharmacol. 17 (2), Suppl 77-82 (2004).
  24. Buonsante, V. A., Muilerman, H., Santos, T., Robinson, C., Tweedale, A. C. Risk assessment's insensitive toxicity testing may cause it to fail. Environ Res. 135, 139-147 (2014).
  25. Boverhof, D. R., et al. Respiratory sensitization and allergy: current research approaches and needs. Toxicol Appl Pharmacol. 226 (1), 1-13 (2008).
  26. Johansson, H., Albrekt, A. S., Borrebaeck, C. A., Lindstedt, M. The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 27 (3), 1163-1169 (2013).
  27. Brismar, H., Patwardhan, A., Jaremko, G., Nyengaard, J. Thickness estimation of fluorescent sections using a CSLM. Journal of Microscopy. 184 (2), 106-116 (1996).
  28. Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells. J Vis Exp. (122), (2017).
  29. Switalla, S., et al. Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 246 (3), 107-115 (2010).
  30. Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
  31. Niehof, M., et al. RNA isolation from precision-cut lung slices (PCLS) from different species. BMC Res Notes. 10 (1), 121 (2017).
  32. De Proost, I., et al. Purinergic signaling in the pulmonary neuroepithelial body microenvironment unraveled by live cell imaging. FASEB J. 23 (4), 1153-1160 (2009).
  33. Davidovich, N., Chhour, P., Margulies, S. S. Uses of Remnant Human Lung Tissue for Mechanical Stretch Studies. Cell Mol Bioeng. 6 (2), 175-182 (2013).
  34. Watson, C. Y., et al. Screening for Chemical Toxicity Using Cryopreserved Precision Cut Lung Slices. Toxicol Sci. 150 (1), 225-233 (2016).

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Neuhaus, V., Danov, O., Konzok, S., Obernolte, H., Dehmel, S., Braubach, P., Jonigk, D., Fieguth, H. G., Zardo, P., Warnecke, G., Martin, C., Braun, A., Sewald, K. Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices. J. Vis. Exp. (135), e57042, doi:10.3791/57042 (2018).

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