Summary
Ein Protokoll für die Isolierung von primären Mikroglia aus murine Gehirn wird vorgestellt. Diese Technik hilft bei der Förderung des gegenwärtigen Verständnis von neurologischen Erkrankungen. Dichte-Gradienten-Zentrifugierung und magnetische Trennung werden kombiniert, um genügend Ertrag einer hochreinen Probe zu produzieren. Darüber hinaus erläutern wir die Schritte zur Charakterisierung der Mikroglia.
Abstract
Mikroglia, die ansässigen Immunzellen im Gehirn, sind die first Responder, Entzündungen oder Verletzungen in das zentrale Nervensystem. Neuere Forschungen haben Mikroglia, dynamisch, fähig, Pro-inflammatorische und Anti-inflammatory Phänotypen gezeigt. (Pro-inflammatorischen) M1 und M2 (Pro-reparative) Phänotypen spielen eine wichtige Rolle in schwere Erkrankungen wie perinatale Hirnschädigung und Ausstellung unterschiedliche in Reaktion auf bestimmte Reize aus der Umwelt Funktionen. Die Modulation der Mikroglia-Aktivierung wurde festgestellt, Neuroprotektion hindeutet, Mikroglia therapeutisches Potenzial im Hirn-Trauma haben zu verleihen. Jedoch mehr Forschung ist erforderlich, um die Rolle der Mikroglia bei der Krankheit besser zu verstehen, und dieses Protokoll ermöglicht. Das Protokoll beschriebenen verbindet einen Dichte Steigung Zentrifugierung Prozess zur Reduzierung Zelltrümmer, magnetische Trennung, Herstellung von hochreinen Probe von primären Mikroglia-Zellen, die für in-vitro- Experimente, ohne verwendet werden kann die für 2-3 Wochen Kultivierung benötigen. Darüber hinaus ergeben die Charakterisierung Schritte robuste Funktionsdaten über Mikroglia, Studien, unser Verständnis von der Polarisation besser helfen und Grundieren dieser Zellen, die starke Auswirkungen auf dem Gebiet der regenerativen Medizin hat.
Introduction
Schäden, die während der Perinatalperiode von Entzündungen, hypoxische Ischämie und Blutungen kann ein Array von langfristig Folgeerscheinungen haben. Die komplexen Pathophysiologie der perinatalen Hirnschädigung ist die Theorie, Entzündungen und Ischämie mit daraus resultierenden neuronalen und axonalen Tod1einzubeziehen. Die angeborene Immunantwort spielt eine wichtige Rolle in der Kaskade von Ereignissen führen zu Verletzungen2.
Mikroglia, die ansässigen Immunzellen in das zentrale Nervensystem (ZNS), sind die first Responder auf Verletzungen3. Mikroglia sind Kunststoff Zelltypen mit einer Kapazität von Schutz- oder giftig, abhängig von der Umgebung4sein. Sie engagieren sich in der Produktion von Zytokinen und reaktive Sauerstoff Spezies4,5, Chemotaxis, Phagozytose und Antigenpräsentation. Alternde Mikroglia ständig Umfrage Umwelt und sind durch die Anwesenheit eines fremden oder schädliche Substanz4aktiviert. Aktivierung führt zu einer Pro-inflammatorischen Reaktion, kritische CNS Schutz4. Diese M1 "Pro-inflammatorischen" Phänotyp Mikroglia sind in erster Linie Antigenpräsentation und Tod von Krankheitserregern4beteiligt. Trotz der wichtigen Rolle der Entzündungsreaktion in Neuroprotektion kann unkontrollierte oder längerer Entzündung schädlich und führen zu einer neuronalen Schaden4sein. Jedoch kann bestimmte Reize aus der Umwelt ausgesetzt, Mikroglia eine entzündungshemmende Phänotyp aufweisen. Diese Pro-reparative M2 Mikroglia haben eine entscheidende Rolle bei der Wundheilung und reparieren6, veröffentlicht eine Reihe von Zytokinen und anderen löslichen Mediatoren, dass Downregulate Entzündung, Phagozytose zu erhöhen und fördern Reparatur4, 7. die Rolle der Mikroglia sind vielfältig und umfassen treibende Oligodendrozyt Differenzierung während Re-Myelinisierung8, Neuronen während Sauerstoff und Glukose Erschöpfung in Takt Modelle9 Schutz und Förderung der Neurit Auswuchs in Verletzung des Rückenmarks Modelle10.
Die Studie von diese Gliazellen ist einen wichtigen Aspekt beim Verständnis und bei die Reaktion auf Neuroinflammation zu manipulieren. Das beschriebene Protokoll kann zur weiteren Untersuchung in das therapeutische Potenzial der Mikroglia Modulation in schwere Erkrankungen.
Die Modulation der Mikroglia-Aktivierung auf eine neuroprotektive Rolle ist in einer Reihe von Bedingungen11,12,13beobachtet worden. Verbesserung der aktuellen Verständnis und weiter studieren Modulation der Mikroglia-Aktivierung ist kritisch, die den Einsatz von verschiedenen Modellen, darunter sowohl in Vitro und in Vivo. In-vitro- Studien sind ein wichtiges Instrument durch größere Effizienz, niedrigere Kosten und Fähigkeit zu eine isolierten Zellenbevölkerung zu untersuchen.
Es gibt eine Reihe von Protokollen beschrieben in der Literatur für die Isolierung von Microglia von murinen Gehirne, die Herausforderung, eine high-Yield-Probe mit guter Wirtschaftlichkeit und hoher Reinheit effizient zu produzieren. Häufig verwendete Methoden der Isolierung des primären Mikroglia sind durch magnetische Trennung und längeren schütteln von Gliazellen Mischkulturen. Durch persönliche Erfahrung wurde festgestellt, dass gab es ein hohes Maß an Zelltrümmer die magnetische Spalte behindert. So wurde das folgende Protokoll verwendet, die enthält eine Anfangsdichte gradient Zentrifugationsschritt gefolgt von CD11b magnetische Trennung. Die nachfolgend beschriebene Protokoll wurde optimiert, um eine hochreine Probe in ausreichender Menge zu produzieren. Aufgrund seiner hohen Reinheit und die kurze Zeit vorteilhaft ist — man kann Assays innerhalb von 2 Tagen auszuführen, ohne Kultur für ca. 2-3 Wochen. Dieses Protokoll kann potenziell für die Isolierung von primären murinen Astrozyten angepasst werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Die folgenden Verfahren wurden von der Tier-Ethik-Kommission an der Monash Universität genehmigt. Gesunde Neugeborene unbehandelten C57Bl6/J P3-6 Mäuse wurden verwendet, um repräsentative Ergebnisse zu generieren.
(1) enzymatische Verdauung
Hinweis: Es ist wichtig zu überlegen, Sterilität bei der Isolierung und Kultivierung von Primärzellen. Während sicherstellen, dass die Umwelt so steril wie möglich ist, können die ersten Dissektion und Ernte der murine Gehirn außerhalb laminal Fluss Kapuze, mit allen weiteren Schritten innerhalb einer Laminar-Flow-Haube abgeschlossen werden.
- Verwendung von sterilen Instrumenten, einschläfern der Maus durch zervikale Dislokation, das Tier zu enthaupten und Spülen mit 100 % Ethanol. Mit kleinen sterile Schere, machen Sie kleine Einschnitte entlang der rechten und linken Seite des Kopfes. In diesem Alter schält sich die Haut leicht entfernt. Mit den Tipps der gebogenen Zange, schieben Sie das Gewebe auf der Tribüne, Schädel, einschließlich die Bregma verfügbar zu machen.
- Führen Sie die Spitze der Schere in die Öffnung des Wirbelkanals und ein seitlicher Einschnitt in den Gehörgang. Machen Sie einen Schnitt entlang der sagittale Naht zu Bregma, sanft auf die Spitze der Schere nach oben, damit das Gehirn nicht beschädigt. Spitze der Schere am Bregma einfügen und die rechten und linken Seite des Kopfes entlang der Kranznaht seitliche Einschnitte vornehmen.
- Mit Pinzette, vorsichtig abziehen des Schädels, die das Gehirn aussetzen. Dazu fassen Sie die Kanten des Schädels durch die seitlichen Hautschnitt freigelegt, und ziehen Sie vorsichtig den Schädel zur Seite. Der Schädel sollte leicht abschälen. Schaufel mit gebogenen Pinzette, sanft unter dem Gehirn zu entfernen.
- Legen Sie das Gehirn in einen sterilen Behälter 5 mL, waschen Sie 2-3 Mal mit eiskalten waschen Medien (niedrige Glukose Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) mit 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt), ca. 5 mL Medien pro Waschgang, um Blut zu entfernen.
- Positionieren Sie in einem laminaren Luftstrom Haube den Inhalt des Behälters 5 mL in eine kleine Petrischale (35 mm), ruht auf dem Eis. Entfernen Sie mit einem sterilen Skalpellklinge oder sterile Schere, das Kleinhirn und der Riechkolben. Machen Sie eine Mittellinie geschnitten, um die beiden Hemisphären getrennt.
- Vorsichtig abziehen der meningealen Schicht mit feinen Zangen, kümmert sich nicht um die Rinde zu beschädigen. Identifizieren Sie die meningealen Schicht als eine sehr dünne Schicht von Zellen mit einem roten Schimmer auf der Oberfläche des Gehirns, mit sichtbaren Blutgefäße. Halten das Gehirn kalt ist wesentlich für die richtige Hirnhaut Entfernung. Wenn die meningealen Schicht bricht, weiter peeling entfernt die zerrissenen Fragmente, bis es vollständig entfernt wird.
- Übertragen Sie die Halbkugeln auf eine neue kleine Petrischale (auf Eis) und einfüllen waschen Medien. Hacken Sie das Gehirn klein mit sterilen Skalpell Messer/Schere.
Hinweis: Diese soll ~ 1 mm2 in Größe und sollte darauf geachtet werden, nicht um sie in zu kleine Stücke zu schneiden, da dies Ertrag verringern kann. - Hinzufügen von 100 µL Papain (17 U/mg bestand) und 150 µL DNase I in den Medien und 30 min bei 37 ° C inkubieren
- Nach Verdauung genannte Gewebe mit einer Pipette P1000. Wenn Gewebe Stücke zu groß, um die Pipette zu geben sind, erwägen Sie ein paar oder sterile Schere die Pipettenspitze zu erweitern. Während dieses Prozesses achten Sie darauf, keine Luftblasen in den Medien einzuführen, da dies Zellviabilität verringern kann.
(2) Myelin Schmutzentfernung
- Unter einem Laminar-Flow-Haube verwenden Sie sterilen Ausrüstung, bereiten Sie eine 50 mL konische Rohr mit 100 µm Zelle Sieb, für jedes Gehirn. Gießen Sie Inhalt der Petrischale mit der Digest-Medium und Gehirn Stück auf ein Sieb. Drücken Sie durch die Teile des Gehirns mithilfe des Kolbens einer sterilen 3 mL Spritze mit reibende Bewegungen bis gibt es keine mehr Gewebe sichtbar. Nach Verdauung sollte das Hirngewebe leicht auseinander fallen.
- Waschen Sie den Filter mit den Medien waschen kontinuierlich durch Nachfüllen der Zelle Sieb im Laufe dieses Prozesses. Dies wird durch jede Zelle gefangen im Sieb waschen.
Hinweis: Dies sollte bis gibt es etwa ~ 15 mL in der Tube. Dies ist um sicherzustellen, dass das Sieb durch ausreichend gespült wird und die Höhe der Zellen gesammelt zu maximieren. -
Zentrifugieren Sie die einzelnen Zellsuspension bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C. Während dieser Zeit bereiten Sie das Dichte-Gradienten-Medium wie beschrieben.
- Bereiten Sie das Lager isotonische Percoll (SIP), das Dichte Gradienten Medium verwendet wird. Tun Sie dies indem Sie 10 x sterile Hanks ausgeglichene Salzlösung (HBSS) 9:1-Verhältnis von Dichte Gradienten Medium hinzufügen.
- Bereiten Sie Steigungen wie 30 % SIP in DMEM und 70 % SIP in 1 X HBSS. Beispielsweise zur Vorbereitung 10 mL 30 % SIP, SIP 3 mL zu 7 mL DMEM hinzufügen.
- Aspirieren Sie den Überstand von der konischen Rohren und Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 8 mL 30 % SIP in DMEM. Übertragen Sie das volle Volumen auf ein frisches 15 mL konische Rohr.
- Unterlegen Sie die SIP-Lösung 70 %. Dazu füllen Sie ein Transferpipette mit 70 % SIP und vorsichtig durchdrücken der Transferpipette an der Unterseite des konischen Rohres. Sobald die Spitze in der Nähe der Unterseite ist, drücken Sie vorsichtig durch den Inhalt der Transferpipette.
Hinweis: Dies langsam tun um nicht die 30/70-Schnittstelle zu stören. Es muss eine klare Trennlinie zwischen die beiden Schichten. - Zentrifugieren Sie die SIP-Schichten, einschließlich der Zellen bei 650 X g mit Bremse 0 und Beschleunigung 4, 25 min bei Raumtemperatur.
Anmerkung: Es ist wichtig, den Spin mit Bremse ab abzuschließen und die Zentrifuge zu langsam zum Stillstand kommen, wie Anwendung der Bremse die Interphase stören und drastisch die Zellentnahme zwischen den SIP-Schichten reduzieren zu ermöglichen. - Aspirieren Sie Zelltrümmer an der Spitze des Rohres, und entfernen Sie etwa 4 mL Medium von oben. Dies erleichtert das Entfernen der mononukleären Zellen im folgenden Schritt. Setzen Sie die Pipettenspitze in Richtung der Interphase mit Hilfe einer Pipette P1000, vorsichtig. Isolieren Sie die mononukleären Zellen vom 30/70 Dichte Gradienten mittlere Interface. Sammeln Sie ca. 3 mL vom bewölkten Schnittstelle und Transfer zu einem neuen 15 mL konische Rohr. Im Anschluss daran verdünnen Sie die Mischung mit 9 mL HBSS um Entfernung des Mediums Dichte-Gradienten zu unterstützen.
- Zentrifugieren Sie die verdünnte Dichte Gradienten mittlere Interphase, mit mononukleären Zellen bei 500 X g für 5 min. Überstands Aspirieren und Aufschwemmen mit 1 mL Wachstumsmedium (DMEM mit 10 % fetalen bovine Serum und 1 % Antibiotika ergänzt). Im Anschluss daran färben Sie die resuspendierte Zellen mit Trypan blau und führen Sie eine Zellzahl mit einem Zählkammern.
3. magnetische aktivierte Zellsortierung
Hinweis: Diese Schritte sind vom Hersteller Protokoll geändert.
- Zentrifugieren Sie die gesammelten mononukleären Zellen bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C das Wachstumsmedium zu entfernen, da dies die magnetische Isolierung beeinträchtigt. Verwenden die gleichen Zellzahl gewonnenen Schritt 2,8, Aufschwemmen bei 1 x 108 kernhaltigen Zellen/mL in PBS (ca.++ und Mg++ kostenlos), enthält 2 % FBS und 1 mM EDTA, innerhalb eines Volumenbereichs von 0,1-2,5 mL.
- Fügen Sie das volle Volumen von kernhaltigen Zellen mit PBS-Puffer aus dem vorherigen Schritt zu einem frischen 5 mL (12 x 75 mm) Polystyrol Rundboden-Schlauch. Fügen Sie 50 µL CD11b PE Kennzeichnung Reagenz pro 1 mL der Probe. Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min vor Licht geschützt werden.
- Fügen Sie 70 µL cocktail Auswahl (Kombination von monoklonalen Antikörpern gegen CD11b mit PBS-Puffer) pro 1 mL der Probe. Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min vor Licht geschützt werden.
- Mischen Sie magnetische Partikeln durch Pipettieren oben und unten mehr als 5 Mal. Fügen Sie 50 µL/mL der Probe. Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min vor Licht geschützt werden.
Hinweis: Diese Partikel dann bilden einen tetrameres Komplex mit den Antikörpern und bekommen die magnetische Spalte verbunden. - Wenn das Gesamtvolumen der Zelle Mischung weniger als 2,5 mL, oben bis zu dieser Band mit PBS (++ Ca und Mg++ kostenlos), enthält 2 % FBS und 1 mM EDTA und mischen, indem Sie sanft Pipettieren 2-3 Mal. Legen Sie das Rohr (ohne Deckel) in den Magneten und bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren.
- In einer kontinuierlichen Bewegung vollständig umkehren des Magnet mit dem Rohr für 2-3 s, gießt des Überstands. Den Magnet in eine aufrechte Position zurück, und entfernen Sie den Schlauch vom Magneten. Bereiten Sie die restlichen Zellen der Spalte auswaschen.
Hinweis: Der Überstand enthält ungekennzeichnete und unerwünschte Zellen, die durch invertieren das Rohr in der Magneten entfernt werden. Die Tube enthält die beigefügte Cd11b+ Zellen. - Waschen Sie die Zellen durch Wiederholen der Schritte 3.5 und 3.6 zweimal mehr. Wenn die Probe 1 mL übersteigt, empfiehlt sich eine weitere Wiederholung der Schritte 3.5 und 3.6.
- Die Zellen in eine gewünschte Wachstumsmedium aufzuwirbeln. Spülen Sie die Seite des Schiffes sowie Sammlung (zB. eine 15 mL Tube) Zellen von den Seiten des Rohres zu sammeln und Erträge zu maximieren.
4. Überprüfung der Mikroglia Reinheit
Hinweis: Die primären Mikroglia isoliert von 3 L (n = 5 Tiere insgesamt) wurden per Fluoreszenz aktivierte Zelle sortieren (FACS) ermitteln Reinheit für die repräsentativen Ergebnisse überprüft.
- Zellkulturen in einem t-25 Kolben mittelfristig mit 10 %, die FBS in der Nacht bei einer Dichte von 1-2 x 106 Zellen pro Flasche Aussaat, Wachstum.
- Waschen Sie die Zellen in der t-25 Flaschen mit PBS 3 X 5 min alle verbleibenden Wachstumsmedien zu entfernen, die die Trypsinization beeinträchtigen könnte.
- Fügen Sie 2 mL von 0,25 % Trypsin, die Zellen aus den Kolben zu lösen. Sicherstellen Sie, dass die Lautstärke von Trypsin ausreicht, um die gesamte Oberfläche des Kolbens. Im Anschluss an sanfte Verwirbelung des Kolbens Trypsin einheitlich abzudecken, 5 min bei 37 ° c inkubieren
- Den Trypsinization-Prozess durch Zugabe von 2 mL mit 10 % Wachstum-Medien zu stillen FBS in den Kolben.
- Sammeln des Überstands enthält die trypsiniert Zellen und Zentrifuge bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C um Zellen zu sammeln.
- Entfernen des Überstands mit dem Wachstumsmedium und Trypsin und das Pellet in 500 μl FACS Puffer aufzuwirbeln. Führen Sie die Zellzahl verwenden Trypan blau.
- Zentrifuge bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C. Führen Sie Fc-Rezeptor-Block durch Zugabe von 50 μL FACS Puffer + 1 μl FcR Blocker pro 5 x 106 Zellen. 15 min bei 4 ° c inkubieren
Hinweis: Der Fc-Rezeptor-Block ist ein entscheidender Schritt in der Färbeverfahren, unspezifische Bindung von Immunglobulinen auf Fc-Rezeptoren in immun-Zell-Populationen zu verhindern. Diese Blockade hat keinen Einfluss auf die nachgelagerten Bindung anderer Antikörper. - Durch das Verdünnen mit 500 μL FACS Puffer der blockierenden Prozess beendet. Im Anschluss daran Zentrifugieren Sie das Gemisch mit der Zellen bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C.
- Im frischen 500 μL FACS Puffer aufzuwirbeln.
- Legen Sie die Mehrzahl der Zellen (z. B. wenn die Zellen in 500 μL der FACS-Puffer, Einsatz 400 μl resuspending) in ein Probenröhrchen. Verteilen Sie die restlichen Zellen unter die Kontrollröhrchen und top-bis zu 100 μl pro Kontrollröhrchen (z.B. für 6 Kontrollröhrchen Aufmachungen 16.67 μL in jedem Kontrollröhrchen und oben mit 83.33 μL FACS Puffer). Machen Sie die Gruppen (Kontrollröhrchen fettgedruckt) als Unstained, Single gefärbt (CD45, CD11b) einzigen lebenden/Toten Fleck, RGV und Probenröhrchen.
- Pellet-Zellen in allen Rohren durch Zentrifugieren bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C.
- Färben Sie die Zellen in der Röhre mit 1 μl Antikörper pro 100 μL FACS Puffer pro 5 x 106 Zellen. 20 min bei 4 ° c inkubieren
Hinweis: Verwenden Sie 50 μL Antikörper Cocktail, wenn weniger als 2 x 106 Zellen verwendet werden. - Waschen Sie die Zellen mit 500 μL FACS Puffer. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C.
- Die Zellen in 300 μL FACS Puffer aufzuwirbeln.
Hinweis: Verwenden Sie ~ 100 μl, wenn Zelle weniger als 2 x 106 beträgt. - Mit Flow-Zytometrie-Analyse, Quantifizierung der Zellen, die CD45niedrig und positiv für CD11b Färbung sind. Dieser Prozentsatz entspricht der isolierten primären Mikroglia.
(5) immunhistochemische Färbung der primären Mikroglia
- Die Zellen in einer 96-Well-Platte bei einer Dichte von 1 x 105 Zellen-Platte mit das Wachstumsmedium und inkubieren Sie über Nacht.
- Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie 3 Mal mit PBS.
- Befestigen Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd in PBS für 15 min. Entfernen der PFA mit einer Pipette P1000, dann waschen Sie sie 3 Mal mit PBS + 0,1 % Triton-X.
- Block für die unspezifische Bindung mit 3 % Rinderserumalbumin für 1 h bei Raumtemperatur.
- Mit Kaninchen Iba-1 (1: 100) für 24 h bei 4 ° c inkubieren Im Anschluss daran entfernen Sie die primären Antikörper-Mischung und waschen Sie 3 Mal mit PBS.
- Mit sekundären Anti-Kaninchen-GFP-Konjugat (1: 200) für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Im Anschluss daran die Sekundärantikörper Mischung entfernen und 3 Mal mit PBS waschen.
- Montieren Sie Folien mit einer fluoreszierenden Montage Medium und Capture Bilder mit einem fluoreszierenden Mikroskop.
(6) Quantifizierung der Mikroglia Verwendung pHrodo Assay
Hinweis: Die pHrodo-Assay ermöglicht Identifikation der Ebenen der Phagozytose in kultivierten Zellen. Bei der Aufnahme über Endozytose erhöht Internalisierung in saurer Umgebung der Fluoreszenz des Bioparticle Konjugate. Fluoreszenz-Ebenen können dann durch FACS quantifiziert werden. Die folgenden Schritte sind vom Hersteller Protokoll geändert.
- Kultur in der Nacht die Zellen in einem t-25 Kolben in das Wachstumsmedium, Aussaat bei einer Dichte von 1-2 x 106 Zellen pro Flasche. Waschen Sie die Zellen in t-25 Flaschen mit PBS 3 Mal für 5 Minuten.
- Lösen Sie die Zellen mit 2 mL 0,25 % Trypsin. 5 min bei 37 ° c inkubieren
- Den Trypsinisation-Prozess durch Zugabe von 2 mL mit 10 % Wachstum-Medien zu stillen FBS in den Kolben.
- Zentrifugieren der Zellsuspension bei 500 X g für 5 min bei 4 ° C, pellet-Zellen.
- Entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der Pellet, enthält die primären Mikroglia im Kulturmedium 106 Zellen/ml.
Hinweis: Alternativ Platte Zellen in einer 96-Well-Platte mindestens einen Tag vor und 1 x 105 lebensfähige Zellen pro Bohrloch anstreben, an dem Tag, der Test durchgeführt werden soll. - Platte Zellen in 96-Well-Platte 1 x 105 Zellen/weit, 100 μL pro Well. Platte, Steuerelemente und experimentelle Brunnen in dreifacher Ausfertigung, und lassen Sie einen leeren Brunnen pro Positivkontrolle für eine keine-Zellkontrolle Hintergrundabzug.
- Der Brunnen leer für keine-Zelle Hintergrundabzug fügen Sie 100 μL Wachstum Medien hinzu.
Hinweis: Wie alle anderen in-vitro- Assay sind entsprechende Kontrollen entscheidend für die Genauigkeit der Messwerte. Neben der keine-Cell Control (Hintergrund lesen), gehören auch die negative-Kontrolle gut (pHrodo Konjugat hinzugefügt, aber auf Eis gelegt). - Die Platte abdecken und 1 Stunde in einem Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 ° c inkubieren
- Bereiten Sie experimentelle Brunnen indem Stimulans und Behandlung vor. Unbehandelte Brunnen Fahrzeug Steuerelemente (nur Wachstumsmedium) hinzufügen.
Hinweis: Lipopolysaccharid 1 µg/mL [Stimulans] und menschliche Amnion Epithelzelle (hAEC)-konditionierte Medien [Behandlung] wurden verwendet, um repräsentative Ergebnisse zu generieren. - Tauen Sie ein Fläschchen mit konjugierten Farbstoff, 2 mL-Aufnahme-Puffer und kurz Wirbel. Transfer der Rohr-Inhalt in ein sauberes Glas-Rohr und beschallen für 5 min, um sicherzustellen, dass die Partikel gleichmäßig verteilt sind.
- Das Kulturmedium aus Mikrotestplatte Brunnen Aspirieren und schnell mit 100 μl Farbstoff Suspension ersetzen. Decken und Inkubation bei 37 ° C für 1 h.
Hinweis: Denken Sie daran, die Kontrollröhrchen sowie zu beflecken. - Mit Flow-Zytometrie-Analyse, Quantifizierung Zellen Färbung positiv für die konjugierte pHrodo Perlen und prozentual (des Elternteils) aktiv phagocytosing Mikroglia präsentieren.
(7) Quantifizierung der Mikroglia Apoptose nach entzündlichen Beleidigung
- Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 7 von "Überprüfung der Mikroglia Reinheit" Abschnitt.
- Legen Sie die Mehrzahl der Zellen (z. B. wenn Sie die Zellen in 500 μL der FACS-Puffer, Einsatz 400 μl Nukleinsäuretablette) in ein Probenröhrchen. Verteilen Sie die restlichen Zellen unter die Kontrollröhrchen und oben Sie bis zu 100 μl pro Steuerrohr (z.B. für 6 Kontrollröhrchen Aufmachungen 16.67 μL in jedem Kontrollröhrchen und oben mit 83.33 μL FACS Puffer). Gruppen (Kontrollröhrchen fettgedruckt): ungefärbten, einzelne Flecken (AnnexinV, Propidium Jodid), single lebenden/Toten Fleck, RGV, Probenröhrchen.
- Die Zellen in den Rohren durch Zentrifugieren bei 500 X g für 5 min Pellet.
- Mit 1 μl Antikörper/100 μL FACS Puffer/5 x 106 Zellen für 20 min bei 4 ° c inkubieren
Hinweis: Verwenden Sie 50 μL, wenn weniger als 2 x 106 Zellen. - Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 500 μl FACS Puffer und Zentrifuge bei 500 X g für 5 Minuten.
- Die Zelle Pellet in 300 μL FACS Puffer aufzuwirbeln.
Hinweis: ~ 100 μL wenn Zelle beträgt weniger als 2 x 106. - Zellen in jedem Quadranten zu quantifizieren (Q1: nekrotische, Q2: späten Apoptotic, Q3: tragfähige, Q4: frühen Apoptotic).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mit den beschriebenen Methoden hier reine Bevölkerungen der Mikroglia können isoliert werden und können zur Charakterisierung mittels in-vitro- und FACS Analyse vorbereitet werden. Zunächst einmal können bis zu 18 Tiere pro Keulung, mit eine erwartete Rendite von ca. 450.000-600.000 Mikroglia-Zellen verwendet werden. Es ist wichtig, die Reinheit der isolierten Zellen zuerst bestätigen, und dazu FACS Analyse durchgeführt wurde, durch Färbung für die beiden Marker CD45 und CD11b Kennzeichnung der Mikroglia nachweisen kann lästig, wie viele Markierungen Mikroglia zum Ausdruck gebrachten auch zum Ausdruck gebracht werden Makrophagen und die Verwendung dieser beiden Marker ermöglicht präzise und zuverlässige Quantifizierung. Speziell, Mikroglia haben eine geringe Expression von CD45, im Vergleich zu den hohen Ausdruck im ZNS und periphere Makrophagen gesehen und sind auch positiv für CD11b (Abbildung 1). Aus dieser besonderen Isolation wurde eine Reinheit von 89,3 % berichtet. Nach der Färbung für CD11b, beachten wir, dass unsere primären Mikroglia teilen ähnliche morphologische Merkmale mit einer Reihe von Morphologien von deutlich unramified (großen kugelförmigen Zellkörper mit wenig oder gar keine längere Prozesse), die mehr verzweigten (mit kleiner, mehr ovale Somata und in der Regel bis zu sekundären Bestellvorgänge) Korrelation zu einer Reihe von Aktivierungsstatus, wie erwartet, in Vivo (Abbildung 2) zu sehen.
Im Anschluss daran wurden zwei Charakterisierung Assays für die Mikroglia-Funktion und das Überleben ausgeführt. Mikroglia sind die großen phagocytic Zelle im ZNS und der pHrodo-Test ermöglicht Quantifizierung dieses bestimmten funktionalen Eigenschaft. Eine in der Nähe von 3-fold Erhöhung phagocytic Funktion nach 24 h Kokultur mit hAEC Medium (Abbildung 3) konditioniert wurde festgestellt, die Quantifizierung der fluoreszierenden pHrodo Partikel gemessen. Schließlich wurde eine AnnexinV-PI Färbung folgende Kokultur durchgeführt, um Überleben der Mikroglia nach entzündlichen Beleidigung zu identifizieren. Ein Rückgang der Mikroglia Apoptose nach Behandlung mit konditionierten Medium (Abbildung 4) beobachtet wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass hAEC konditioniert Medium schützt Mikroglia und erhöht ihre phagocytic Aktivität, die Therapie in perinatal Gehirn Verletzungen und schwere Erkrankungen haben könnten.
Abbildung 1 : Ausdruck von CD45 und CD11b von Mikroglia. Jeder Punkt steht für eine beschriftete Zelle und FACS Analyse ermöglicht die Aufklärung der separaten Zellpopulationen. Mikroglia einen niedrigeren Ausdruck das CD45 Antigen im Vergleich zu peripheren Monocyte abgeleiteten Makrophagen und positiv sind für CD11b. Zahlen unter Antikörper Beschriftung den Anteil der geschlossenen Zellen ausgedrückt als Prozentsatz der Grundgesamtheit anzugeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Morphologie der isolierten primären Mikroglia. Wie in der Abbildung ersichtlich, Mikroglia behalten ihre kugelförmigen Zellkörper und ausgeprägte verzweigten Struktur. Maßstabsleiste = 20 µm.
Abbildung 3 : Quantifizierung der phagocytic Funktion in isolierten primären Mikroglia. pHrodo gekennzeichnet Partikel fluoreszieren nur bei sauren Umgebungen, z. B. in zellulären Endosomen nach Phagozytose. Hier ist ein Anstieg der pHrodo Partikel Aufnahme in Mikroglia behandelt mit hAEC konditioniert Medium beobachtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Analyse der Mikroglia Überleben nach entzündlichen Beleidigung. (A) repräsentative FACS Grundstücke isoliert Mikroglia. Die kombinierte Färbung des AnnexinV und Propidium Jodid ermöglicht die Einteilung in Apoptose, nekrotische, oder lebenden Zellen nach Stimulation mit LPS. (B) hAEC bedingt mittlerer deutlich reduzierten Mikroglia Apoptose im Vergleich zu Kontrollen, was auf eine Form des Schutzes auf diesen Zelltyp. * bedeutet p < 0,05, Studenten t-Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Medium zu waschen |
| Niedrige Glukose Dulbecco modifizierten Eagle Medium |
| 1 % V/V Penicillin-streptomycin |
| Digest-Medium (pro Gehirn) |
| 150 µL DNase ich |
| 100 µL Papain (17U/mg-Lager) |
| 3 ml waschen medium |
| Wachstumsmedium |
| Niedrige Glukose Dulbecco modifizierten Eagle Medium |
| 10 % fötalem Rinderserum |
| 1 % V/V Penicillin-streptomycin |
Tabelle 1: Tabelle der Lösungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroglia haben die Möglichkeit, pro- und Anti-inflammatory, werden durch Reize der Umgebung verändert. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Modulation der Mikroglia-Aktivierung Neuroprotektion verleihen kann. Ihre Fähigkeit zur Gewährung von Schutz für Neuronen und Verletzungen zu reparieren erfordert mehr Forschung, um das aktuelle Verständnis dieser komplexen Zellen zu fördern. Somit ist die Isolierung von hoher Reinheit primären Mikroglia eine wichtige und nützliche Technik. Dies ist eine relativ schnelle Methode zur Erlangung von hochreinen primären Mikroglia bereit für in-vitro- Experimente innerhalb von 2 Tagen.
Es gibt eine Reihe von Protokollen, die in der Literatur für die Isolierung von primären Mikroglia aus murine Gehirn beschrieben. Die größte Herausforderung ist es, ausreichend Probe, hohe Tragfähigkeit und Reinheit effizient zu produzieren. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die Ausbeute einer hochreinen Probe ohne die Notwendigkeit für die Zeit in Kultur. Damit die Methode von 2 Wochen auf 2 Tage verkürzt, dies erleichtert die schnelle Ergebnisse. Die Charakterisierung Schritte Ertragsdaten robuste funktionelle über Mikroglia, aktuellen Verständnis dieser komplexen Zellen. Das Protokoll vereint zwei aktuelle Ansätze - Dichte-Gradienten-Zentrifugierung und magnetische Trennung. Magnetische Trennung wurde auch in der Literatur zur Isolierung der Mikroglia relativ schonend im Vergleich zu anderen Isolierung Techniken14,15,16validiert. Zwar ohne Zweifel gibt es Änderungen der funktionellen Eigenschaften der isolierten primären Mikroglia im Vergleich zu in ihrem Heimatstaat in Vivo, alle Änderungen an Mikroglia Eigenschaften wie in der Assays entwickelt über errechnen sich aus einer Post-Verdauung Grundlinie, und als solche sind repräsentativ für direkte Modulation dieser immun Teilmenge.
Während das Protokoll relativ einfach ist, hilft die Betreuung während der kritischen Schritte um einen guten Ertrag zu gewährleisten. Erstens ist es wichtig, niedrige Glukose Mediennutzung Glia Wachstum zu unterstützen. Darüber hinaus müssen die murinen Gehirn Eis kalt bei aller Zeiten während der Isolation gehalten werden. Daher empfiehlt es sich, vor Kälte alle Medium sowie Instrumente, wenn möglich, und führen Sie die Schritte auf dem Eis. Wichtig ist, Zeiten anhaltender Isolation führt zu schlechteren Zellgesundheit und ergeben, so ist es wichtig, schnell zu arbeiten. Ordnungsgemäße Beseitigung der meningealen Schicht ist übrigens ein entscheidender Schritt bei der Arbeit mit Erwachsenen Mäusen, ansonsten die Fibroblasten die Gliazellen in Bezug auf Wachstum verdrängen wird. Bei der enzymatischen Verdauung des Gehirns es ist wichtig, nicht um das Gehirn zu klein als das zerschnitten Zelltod erhöhen kann, Ziel ist ideal für 1 mm2 Stück des Gewebes. Beim Schleifen des Gewebes durch die Zelle Sieb gründlich mit Medien alle paar Minuten, um alle Zellen zu gewährleisten werden durch gewaschen und nicht im Sieb verfangen, zusätzlich es empfiehlt sich, ein 100 μm Zelle Sieb verwenden, kleinere Filter führen zu einer ertragsreduzierten. Ein weiterer wichtiger Schritt ist das unterlegen der 70 % Dichte mittlere Verlaufsebene, diesem Schritt vorsichtig und langsam um sicherzustellen, dass eine klare Interphase gesehen ist unerlässlich, die einer Pasteurpipette wird empfohlen. Auch empfiehlt sich die Verwendung von 15 mL konische Röhrchen wie die Trennung von Zellen weniger wirksam als 50 mL konische Röhrchen verwendet wurden. Schließlich muss der Dichte-Gradienten-Zentrifugation bei Raumtemperatur durchgeführt werden, da die Temperatur der Dichtegradient beeinflussen kann.
Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode zur Herstellung von hochreinen primären Mikroglia-Zellen, dargestellt durch hohe Expression von CD45 und positiven Ausdruck von Cd11b (im Vergleich zu geringe CD45-Expression in peripheren Monozyten gesehen). Zellen können auch relativ schnell isoliert werden, so hat es den Umfang zu deutlich erhöhten Verständnis dieser Glia-Zellen. Es kann verwendet werden, um verschiedene Mikroglia Populationen aus verschiedenen Hintergründen, Studien, die Unterschiede zwischen Mikroglia isoliert von erkrankten/verletzten und gesunden Tieren zeigen können damit zu identifizieren. Durch Isolierung einer reinen Mikroglia Bevölkerung kann therapeutischen Modulation der Immunzelle Bevölkerung bewertet werden. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass hAEC konditioniertes Medien erhöhte Phagozytose, sowie verbesserte Mikroglia Überleben während ein Entzündungsreiz, somit bieten therapeutische Vorteile17. Dies korreliert mit Apoptotic Rückstand reduziert und somit schlägt vor, Abstand von diesen Ablagerungen neuroprotektive Effekte haben kann.
Das Protokoll kann angewendet werden, Neugeborenen oder Erwachsenen Mäusen, aber ältere Mäuse einen ertragsreduzierten produzieren werden. Darüber hinaus möglicherweise angepasst, primäre Astrozyten von Neugeborenen oder Erwachsenen Mäusen zu isolieren, wieder ältere Mäuse führt zu einem geringeren Ertrag. Darüber hinaus könnte die Änderung der mechanischen Dissoziation Schritt mit einer maßgeschneiderten Nylon-Mesh mit größeren Porengrößen im Gegensatz zu den 100 μm Zelle Sieb weiter verbessern Zelle Ertrag18.
Grenzen dieses Protokolls sind die geringere Ausbeute und der Zeitaufwand für dieses Protokoll. Die Ausbeute beträgt ca. 150.000-200.000 Zellen pro Keulung von sechs Tieren, im Vergleich zu den Millionen, die über Wochen der Zellkultur abgerufen werden können. Darüber hinaus, während Zellen innerhalb von zwei Tagen abgerufen werden können, ist das Verfahren am ersten Tag ziemlich zeitaufwendig, die ca. sechs Stunden.
Diese Methode ist jedoch ein sehr nützliches Werkzeug für das Verständnis der Rolle der Mikroglia bei Krankheit, in der Lage, der Isolierung und Charakterisierung der Zellen innerhalb von zwei Tagen. Es produziert hohe Reinheit primären Mikroglia-Zellen, präzise und effiziente Forschung zu erleichtern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).
- Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O'Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).
- Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
- Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
- Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).
- Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063 (2012).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).
- Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
- Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
- Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).
- Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46 (2017).
- Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).
