Summary
Burada, tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeüzerinden değiştirilmiş Histon Kromatin immunoprecipitation için bir protokol açıklayın. Immunoprecipitated DNA kantitatif PCR için daha sonra bereket ve Histon translasyonel modifikasyonlar genom boyunca yerelleştirilmesini sorguya eskiden.
Abstract
Histon translasyonel modifikasyonlar (PTMs), metilasyon, fosforilasyon ve asetilasyon gibi dinamik olarak bir dizi hücre tarafından alınan sinyaller yanıt olarak bu işaretleri ekleyip enzimler tarafından düzenlenmektedir. Bu PTMS gibi işlemleri gen ifadesi denetim Yönetmeliği için önemli katkı kaynağı sağlamaktadır ve DNA tamir. Kromatin immunoprecipitation (çip) bolluk ve çeşitli tedirginlikler hücreye karşılık olarak genom boyunca birçok Histon PTMs lokalizasyonu dissekan için enstrümantal bir yaklaşım oldu. Burada, post-translationally değiştirilmiş Histon da tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) gerçekleştirmek için çok yönlü bir yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem proteinler ve DNA formaldehit tedavi maya kültürleri kullanarak polietilenin dayanır mantar lysates yenerek, solubilization, Kromatin parçacıkları tarafından micrococcal nükleaz ve Histon DNA'ın immunoprecipitation boncuk tarafından nesil kompleksleri. Faiz Histon işareti ile ilgili DNA saflaştırılmış ve onun zenginleştirme genom boyunca birden çok loci, değerlendirmek için kantitatif PCR analize tabi. Histon işaretleri H3K4me2 ve H4K16ac wildtype ve mutant Maya lokalizasyonu sondalama temsilcisi deneyler veri analizi ve yorumu göstermek için ele alınmıştır. Bu yöntem Histon PTMs çeşitli için uygundur ve farklı mutant suşları ile veya değişiklikleri Kromatin dinamikleri farklı koşullar altında soruşturma için mükemmel bir araç yapma farklı çevresel stresleri varlığında yapılabilir.
Introduction
Histon dinamik translasyonel modifikasyon (PTM) transkripsiyon, çoğaltma ve DNA onarım1,2de dahil olmak üzere birçok DNA şablonu esas alan işlemler için anahtar yasal bir mekanizmadır. Bereket ve değiştirilmiş Histon bu işlemlerle eşlik eden hassas yerelleştirme belirlemek için bu nedenle onların yönetmelik hücrenin farklı koşullar altında anlamak için kritik yeteneğidir. Kromatin immunoprecipitation (çip) gelişimi büyük ölçüde protein etkileşimler DNA, biyokimyasal çalışmalar özellikle vitro yöntemleri kullanarak kimyasal crosslinkers kaynaklandığını bir yöntem olarak değerlendirmek için ihtiyaç ile birleştiğinde dinamik yapısı protein-DNA etkileşimleri vivo içinde ve özel bölgeler genom3,4,5. Kantitatif PCR (qPCR) ve sıralama teknolojileri gelişme da çip deneyler ile kantitatif karşılaştırmalar ve bütün genleri, DNA-protein etkileşimleri, anatomi için güçlü bir araç yapma arasında gerçekleştirme olanağı genişledi birden çok düzeyi.
Doğrudan bir değiştirilmiş Histon ve içinde belirli genomik locus arasındaki fiziksel bağlantıyı sorguya için karşılaştırılabilir hiçbir yöntem olduğundan şu anda, genom kopyası Kromatin aracılı yönetmelikte baktılar herhangi bir araştırma grubu için gerekli bir yöntem yongadır vivo. Histon değişiklikler genom6,7 boyunca eşlemek için sonraki nesil sıralama kullanma bu yöntem varyasyonları mevcut olmasına rağmen bu yaklaşımların adresi olabilir farklı bilimsel sorular ve ölçek, maliyet ve teknik kaynaklar için bazı araştırma grupları sınırlama. Buna ek olarak, hedeflenen chIP-qPCR bunlar tamamlayacak gereklidir yaklaşımlar yöntemleri her ikisine de sağlayarak en iyi duruma getirme çip protokol sıralama öncesinde ve epigenomic veri kümesinden gelen sonuçları doğrulamak için. Kütle spektrometresi dayalı yaklaşımlar genomik bölgeleri ile ilişkili işaretleri var Ayrıca Histon tam Kompleman belirlenmesi8,9,10,11, ancak, ortaya için bunlar yaklaşımlar ile ilgili hangi bölgelerinde genom probed ve teknik uzmanlık ve tüm araştırma gruplarına kullanılamaz araçları gerektirir bazı kısıtlamalar bulunmaktadır. Bu nedenle, çip bolluk ve dağıtım Histon değişiklikler tüm araştırma grupları epigenetik, Kromatin ve genomik fonksiyonları düzenleme ilgi için çeşitli koşullar altında analiz etmek için temel bir yöntem kalır.
Burada, mayası kullanarak çip Histon PTMs, Kromatin dağılımı araştırmaya Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) model için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım bir dizi çekirdek bileşen Maya geliştirilen ve aynı zamanda çeşitli model sistemleri12,13için uygulanan çip iletişim kuralları kullanır. Değiştirilmiş Histon ve hücredeki DNA arasındaki etkileşimler crosslinking formaldehit ile tarafından korunur. Lysate hazırlık Kromatin parçaları sindirim micrococcal nükleaz ile eşit büyüklükte parçalara çözündürüldükten. Değiştirilmiş Histon Immunoprecipitation ticari veya laboratuvar tarafından üretilen antikorlar ile gerçekleştirilir ve ilişkili herhangi bir DNA izole ve zenginleştirme, qPCR (şekil 1) kullanarak belirli genomik bölge için analiz. Birçok Histon değişiklikler için bu protokolü elde edilen DNA miktarı 25'ten fazla farklı genomik loci qPCR tarafından test etmek için yeterlidir.
Bu çip yöntem çok yönlü bir tek Histon değişiklik dağıtımını birden fazla mutant suşları veya çevre koşulları üzerinde izlemek için veya birden fazla Histon değişiklik, genomik loci birkaç wildtype hücrelerinde test etmek için kullanılabilir. Ayrıca, çok sayıda protokol ya da son derece - veya aşağı-bol Histon işaretleri tespiti en iyi duruma getirmek için kolayca ayarlanabilir bileşenleridir. Son olarak, değiştirilmiş Histon parçasının içinde mayası gerçekleştirmek büyük ölçüde diğer sistemlerde kullanılamaz antikor özgüllük için anahtar denetimlerini kullanmak için fırsat sağlar. Yani, Maya suşları değiştirilmesi için hedeflenir Histon artıkları nokta mutasyon taşıyan oluşturulabilir ve, bazı durumlarda, orada belirli Histon kalıntısı üzerinde değişiklik tromboksan yalnızca tek bir enzim (örn. Histon lizin methyltransferases). Bu nedenle, çip için non-spesifik antikor bağlanması olabilir meydana gelen ve yanlış pozitif sonuçlar üreten ölçüde tahlil için her iki Histon mutant veya enzim silme suşları içinde gerçekleştirilir. Bu denetim yeni geliştirilmiş antikorlar için özellikle değerlidir ve hatta antikor özgüllük bunların kullanımı öncesi korunmuş Histon değişiklikler için diğer sistemlerde doğrulamak için kullanılabilir. Bu yaklaşım (mono-, di - ve gibi tri-metilasyonu), farklı değişiklik devletler arasında ayırt antikor özgüllük test etmek için diğer yöntemleri tamamlar sondalama değiştirilmiş peptidler dizileri ve Histon Batı lekesi gerçekleştirmek de dahil olmak üzere veya oluşturarlar tanımlanmış değişiklikler ile. Genel olarak, mayası yongasında Histon PTMs genom boyunca dinamikleri değerlendirilmesi ve onların yönetmelik yönetim mekanizmaları dissekan için güçlü bir yöntemdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ön bağlama antikor manyetik boncuklar için
- Protein A/G manyetik boncuklar karıştırın ve bir 1,5 mL tüp manyetik boncuklar bir immunoprecipitation (IP) örnek başına 20 µL aktarın.
Not: boncuk pipetting, geniş-geçişli, yüksek tutma ipuçları kullanın. - Boncuk ile tüp manyetik bir stand içine yerleştirin ve boncuk tüp tarafında toplamak sağlar. Süpernatant kaldırın.
- Boncuk 3 kez 1 mL soğuk Tris tamponlu tuz (TBS) (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl) ile yıkayın.
- TBS 200 µL boncuk ve uygun miktarda antikor ekleyin. Gecede 4 ° C'de 8 RPM döndürme
Not: birçok Histon PTM antikor antikor IP başına 1-3 µg yeterlidir. Ancak, titrasyon deneyler uygun konsantrasyonlarda belirlemek için tavsiye edilir. İyi karakterize, ticari Histon PTM antikorlar için önerilen konsantrasyonları çoğu kez doğru ve yayımlanmış bir rapor veya ürün belgeleri içinde bulunabilir. - Boncuk manyetik tribünde yer ve süpernatant kaldırın. TBS ile 1 mL yıkar
- TBS IP örnek başına 20 µL artı TBS. (pipetting hata) durumunda ek bir 5 µL boncuk resuspend
Not: Boncuk kadar kullanmak 4 ° C, kısa süreli depolanabilir.
2. Maya hücreleri büyümek
- 10 mL YPD (% 10 Maya ekstresi, % 20 pepton ve % 20 dekstroz) uygun zorlanma bir koloni ile aşılamak ve titreyen bir kuluçka makinesi 220 rpm'de geceleme 30 ° C'de büyür.
- 600 optik yoğunluk ölçmek nm (OD600) bir Spektrofotometre kullanarak Maya kültür. Kültür bir OD600 seyreltik 0,2 100 ml YPD yeni bir şişe içinde =.
- Onlar orta log fazı ulaşana kadar 220 devirde titreyen bir kuluçka 30 ° C'de hücrelerin büyümesine (OD600 = 0,6-0,8).
3. proteinler DNA için polietilenin Vivo içinde
- Kültürler orta log fazı ulaştığınızda, 2.7 mL % 37 formaldehit doğrudan orta, % 1 formaldehit son konsantrasyonu için ekleyin. Bir shaker 25 ° C (ya da oda sıcaklığında) şişeye aktarmak ve 50 devirde 15 dakika salla.
- 5 mL 2.5 M glisin de orta olarak ekleyin ve formaldehit gidermek 5 min için oda sıcaklığında 50 RPM sallayarak devam edin.
- Şişe santrifüj kapasitesi ve hücreleri 5800 x g 4 ° C'de 5 min için de spin için hücreleri transferi Süpernatant dikkatle boşaltmak.
- 45 mL soğuk TBS resuspending tarafından hücreleri yıkayın ve süspansiyon 50 mL konik tüp içine aktarın. Tüp 2800 x g 4 ° C'de 3 dk de spin Süpernatant kaldırın.
- 10 mL soğuk hücrelerinde lizis arabellek (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA), %1 nonidet Oktil phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), 4 ° C'de depolanan) chIP yıkama.
- Hücreleri 2800 x g 4 ° C'de 3 dk de spin Süpernatant kaldırın.
Not: Hücreler sıvı azot ile dondurulmuş ve başka işleme kadar-80 ° C'de depolanan.
4. Maya Lysates olun
- 1 mL 1 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) ile soğuk çip lizis tampon ve Maya proteaz inhibitörü kokteyl 1:1,000 seyreltme hücrelerde resuspend. Süspansiyon cam boncuk 200 µL içeren 2.0 mL vidalı kapak tüp aktarın.
- Boncuk için 30 6 kere yendi ve hücreleri cihazları, yüksek hızlı ajitasyon için 4 ° C'de yenerek bir boncuk transfer her s. Hücreler yenerek her boncuk arasında en az 1 dk. için buz üzerinde tutmak.
- Lysate jel ipuçları yükleme kullanarak bir 1,5 mL tüp aktarın. Lysate 4 ° C'de 20 dk için 15.500 x g, santrifüj kapasitesi
- Süpernatant atmak ve Pelet MNase sindirim arabellek 250 µL içinde resuspend (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 21 mM CaCl2, % 1 NP-40, depolanan 4 ° C'de) tarafından hafifçe yukarı ve aşağı pipetting.
- MNase 2.5 µL reaksiyonlar için ekleyin. Onları karışımı yavaşça ters çevirme tarafından 4 - 6 kez ve hemen 20 dk 37 ° C su banyosunda kuluçkaya.
Not: MNase yeni bir hazır kullanıldığında Özet koşulları optimize edilmelidir. Adım 10 iletişim kuralı bkz:. - Hemen tüpler reaksiyonu durdurmak ve 0,5 M EDTA 10 mM EDTA son bir konsantrasyon için 5 µL eklemek için buz üzerine yerleştirin. Onları karışımı yavaşça INVERSION tarafından.
- 15,500 x g 4 ° C'de 15 dakika de tepki santrifüj kapasitesi ve süpernatant yeni bir 1,5 mL tüp aktarın.
Not: Çözünür (sindirilir) Kromatin süpernatant içinde olacaktır. Pelet bir şey sindirilmemiş ve çözünmez hücre artıkları içerir.
5. Immunoprecipitate (IP) Histon modifiye
- Bir Bradford tahlil kullanarak her MNase yayımlanan Kromatin kesir protein konsantrasyonu belirlemek. Her 8 tek kullanımlık cuvettes artı test edilecek her protein örneği için 1 ek küvet Bradford reaktifi 1 mL ekleyin.
- 2 mg/mL sığır serum albumin (BSA) stok çözeltisi hazırlamak.
- BSA aşağıdaki konsantrasyonları Bradford reaktifi 1 ml elde etmek için uygun birim ekleme: 0 μg/mL, 0.5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL, 6 μg/mL, 8 μg/mL ve 10 μg/mL. MNase serbest bırakmak Kromatin fraksiyonunun 2 μL ek cuvettes ekleyin.
- Her küvet parafilm küçük bir parça ile üst kapak ve 4 - 6 kez cuvettes ters çözüm de karıştırmak için. 15 dakika oda sıcaklığında cuvettes kuluçkaya.
- Görünür ışık Spektrofotometre kullanarak ölçmek 595 Absorbans nm standart eğri ve deneysel örnekleri için.
Not: küvet BSA olmadan kullanın (0 μg/e doğru önce ilk ölçüm alarak Spektrofotometre boş mL). - BSA farklı konsantrasyonları Spektrofotometre ile ilişkili yazılım veya elektronik tablo yazılımı için Absorbans değerleri kullanarak standart bir eğri çizmek. Standart eğri ve kullanılan seyreltme faktörü (1:500) göre Absorbans değerleri her Kromatin kesir örnekleri için protein konsantrasyonu hesaplamak için kullanın.
- Her IP için toplam protein 50 µg çip lizis son hacim 1 ml ulaşmak için arabellek için MNase serbest Kromatin kesir ekleyin.
Not: lysate başına birden fazla IP ayarlıyorsanız, lysate ana bir karışımını yapmak ve ChIP lizis tampon ve IP için bireysel tüpler için aliquot 1 mL. - 100 µL giriş örnek olarak işlemek için IP karışımı çıkarın. -20 ° C'de giriş örnek adım kadar 7.1 dondur.
Not: Herhangi bir kalan Kromatin örnek ayrıca olabilir-20 ° C'de donmuş ve isterseniz bir sonraki IP için kullanılır. - Manyetik Protein A/G boncuk ile antikor her IP örnek için önceden bağlı 20 µL ekleyin.
6. yıkayayım IP'leri ve Histon-DNA komplekslerinde Elute
- Bir manyetik tüplerde durup boncuklar yer tüp tarafında toplayın. Bir pipet kullanarak süpernatant kaldırın. Boncuk sırayla her aşağıdaki arabelleklerinin 1 mL ile yıkayın.
- 4 ° C'de 5 min için 8 rpm'de dönen bir manyetik tribünde boncuk yerleştirerek, süpernatant kaldırarak ve sonraki arabellek ekleyerek her yıkama gerçekleştirmek: 2 x - ChIP lizis tampon, 2 x - yüksek tuz yıkama arabellek (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA % 1 NP-40, depolanan 4 ° C'de), 1 x - LiCl/deterjan yıkama arabellek (4 ° C'de depolanan 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, %1 NP-40, % 1 sodyum deoxycholate,), 1 x - TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 4 ° C'de depolanan) ve 1 x - TE.
- Son TE yıkama ile boncuk boncuk TE tüp yıkayın ve kalan boncuk aktarmak için daha sonra başka bir 0.5 mL çoğunu aktarmak için TE 0.5 mL kullanarak yeni bir tüp aktarın.
- Taze yapılmış çip elüsyon arabelleği (%1 SDS, 1 mM NaHCO3) 250 µL ekleyin. Girdap çözüm kısa bir süre. 8 devirde 15 dakika oda sıcaklığında örnekleri döndürün.
- Tüp manyetik tribünde yer ve boncuk toplamak. Dikkatle süpernatant aktarmak için yeni bir tüp ve boncuk kaçının.
Not: Eluate immunoprecipitated protein ve ilişkili DNA içerir. - Başka bir 250 µL çip elüsyon arabelleği boncuk için ekleyin. 8 devirde 15 dakika oda sıcaklığında örnekleri döndürün.
- Dikkatle süpernatant ilk elüsyon içeren tüp aktarın. Gerekirse, küçük hacim (240 µL) boncuk rahatsız edici önlemek tüm IPS kaldırın.
7. Protein-DNA Glossar ters
- Giriş örnekleri çözülme ve 400 µL çip elüsyon arabelleği her girdi için ekleyin.
- Hem giriş hem de IP örnekleri için 5 M NaCl, 20 mg/mL glikojen 5 µL ve 20 mg/ml İndinavir K. Mix 12.5 µL 20 µL de ters çevirme veya tüpler flicking ekleyin. 65 ° C su banyosu örneklerinde gecede kuluçkaya.
8. arındırmak ve DNA konsantre
- 10 mg/ml RNase A 10 µL giriş ve IP örnekleri için ekleyin. 37 ° C su banyosu için 30 dk örneklerinde kuluçkaya.
- Fenol: chlorofrom:isoamyl alkol (25:24:1 PCI) 600 µL sulu ekleyin ve iyice karıştırın. Onları 15,500 x g oda sıcaklığında 5 min için de spin.
- Yeni bir tüp sulu katmana kaldırın. PCI 600 µL ekleyin ve iyice karıştırın. Tüp 15,500 x g oda sıcaklığında 5 min için de spin. Sulu katmanı için yeni bir tüp aktarın.
Dikkat: duman mahallede çalışma ve PCI ile çalışırken uygun kişisel koruyucu ekipman giymek. Sıvı ve katı atık kurumsal kurallar tarafından talimat olarak atın.
- Yeni bir tüp sulu katmana kaldırın. PCI 600 µL ekleyin ve iyice karıştırın. Tüp 15,500 x g oda sıcaklığında 5 min için de spin. Sulu katmanı için yeni bir tüp aktarın.
- 3 M sodyum asetat ve DNA çökelti soğuk % 100 etanol 1 mL 0.1 x birim ekleme. Tüp 4 - 6 kez ters çözüm de karıştırmak için. -20 ° C'de gecede kuluçkaya.
- Tüp 4 ° C'de 20 dk için 15.500 x g de spin Dikkatli bir şekilde süpernatant bir pipet ile çıkarın.
- Pelet 1 mL soğuk % 70 etanol yıkayın. 15,500 x g 4 ° C'de 10 dakika için de spin Dikkatli bir şekilde süpernatant bir pipet ile çıkarın.
- Yaklaşık 20 dakika kadar (tamamen kuru) başlıklı granül kuruması. IP örnekleri nükleaz ücretsiz su 50 µL içinde resuspend ve giriş örnekleri nükleaz ücretsiz su 100 µL içinde resuspend. DNA örnekleri-20 ° C'de qPCR performans kadar saklayın.
9. kantitatif PCR (qPCR) genomik bölgelere zenginleştirilmiş tespit
- Astar her dizi için bir qPCR ana karışımı olun. Bir reaksiyon 5 µL 2 x qPCR mix, 0,25 µL 20 µM ileri astar ve 20 µM ters astar 0,25 µL içerir.
Not: Uygun astar tasarım ve qPCR deneyler için test başka bir14,15,16bölümünde. - Her DNA örneği DNA ana karışımları yapmak. Bir reaksiyon DNA'ın 0.5 µL ve 4.0 µL nükleaz ücretsiz su içerir.
- 5.5 µL uygun astar ana mix ve uygun DNA ana Mix 4,5 µL 384-şey qPCR plaka üzerinde her şey ekleyin.
Not: her şey için 5.5 µL astar karışımı ekleyerek başlayın. Kalenin 200 x g oda sıcaklığında 1 dk. için de 4,5 µL DNA karışımı eklemeden önce spin. - Mühür plaka ve 200 x g oda sıcaklığında 1 dk. için spin için uygun.
- Aşağıdaki koşullar ile gerçek zamanlı qPCR sistemle qPCR gerçekleştirmek: 95 ° C 3 dakika; 40 devredir 10 95 ° c s, 30 55 ° C s; erime eğrisi 65 ° C ila 95 ° C 0,5 ° C artışlarla, 5 s.
- Her astar çifti için IP örnek qPCR içinde kullanılan % 5 giriş örnek göre yüzde giriş hesaplayın. Teknik PCR triplicates araçlarının hesaplamaları gerçekleştirmek için kullanın.
Not: önemli varyasyon gözlenen Eğer PCR triplicates ana mix kompozisyon, pipetting hataları ve kuyu 384-şey plaka arasında çapraz bulaşma için dikkat qPCR tekrarlamak daha iyi.- Cq değerleri % 100'e giriş için seyreltme faktörü çiğ Cq değerleri temsil eden döngü sayısı çıkarılarak ayarlayın.
Not: Yüzde beş giriş 20, hangi 4,32 döngüsü (2 20 = 4,32 oturum) eşittir bir seyreltme faktörü temsil eder. - 2 olarak giriş yüzdesini hesaplamak ^ (Cqgiriş - CqIP) 100 ile çarpılmış.
- Cq değerleri % 100'e giriş için seyreltme faktörü çiğ Cq değerleri temsil eden döngü sayısı çıkarılarak ayarlayın.
10. MNase Özet koşulları (önerilen öncesinde ilk tam çip deney) belirlemek
- 2.1 4.4 önceki iletişim kuralı aracılığıyla adımları. Kromatin içeren Pelet MNase hazım birden çok örnekleri için yeterince lysate oluşturmak için protokol büyütmek. 4.4. adımda granül MNase sindirim arabellek 1,25 mL resuspend. Örnekleri 5 tüpler yani her aliquot MNase sindirim arabellekte resuspended Kromatin Pelet 250 µL içerir.
- 0, 1.5, 2.5 veya 5 ekleyin MNase µL her tüp için. Onları karışımı yavaşça ters çevirme tarafından 4 - 6 kez ve hemen bir 37 ° C su banyosu için 20 dk tüplerde kuluçkaya.
- Hemen buza tüpler yerleştirerek ve 0,5 M EDTA 10 mM son yoğunlaşması 5 µL ekleyerek reaksiyonlar durdurmak.
- Yeni bir tüp sulu katmana kaldırın. PCI 300 µL ekleyin ve iyice karıştırın. 15,500 x g oda sıcaklığında 5 min için de spin. Sulu katmanı için yeni bir tüp aktarın.
- Tüp 4 ° C'de 20 dk için 15.500 x g de spin Dikkatli bir şekilde bir pipet ile süpernatant çıkarın.
- Granül 1 mL soğuk % 70 etanol yıkayın. 15,500 x g 4 ° C'de 10 dakika için de spin
- Hood yaklaşık 20 dk (veya kadar tamamen kuru) granül kurumasına izin verin. Granül nükleaz ücretsiz su 30 µL içinde resuspend.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralı bir anahtar bileşeni micrococcal nükleaz (MNase) adım 10 içinde özetlenen Kromatin çözünür parçaları sindirmek için kullanılan konsantrasyonu optimize ediyor. Bu ilgi Histon değişiklikler genomik bölgeler itibariyle dağılımı ile ilgili yüksek çözünürlüklü veri elde etmek için önemlidir. Bir MNase titrasyon öncelikle mono-oluşturarlar di-oluşturarlar çözünür Kromatin kesir daha küçük miktarda elde etmek için en uygun konsantrasyonu belirlemek için yapılmalıdır. Bu görüntülenmeyecektir DNA ayıklayarak Kromatin içeren Pelet MNase hazım takip ve özel performans Jel Elektroforez (Şekil 2). Burada kullanılan MNase hazırlanması, enzim, 20 adet/µL 2.5 µL ağırlıklı olarak mono-oluşturarlar üretilen ve bu nedenle bu miktar küçük parça için kullanıldı.
İki temsilcisi sonuçları kümesi bu çip yordamı (şekil 3) gösterilir. İlk örnekte bir Histon metil işareti wildtype hücreleri ya da bu işareti tromboksan metiltransferaz eksik hücrelerin içinde değerlendirilir. Özellikle, çip ile bir antikor H3K4me2 karşı yanı sıra Histon H3 karşı wildtype ve set1Δ hücrelerdeki bir denetim olarak gerçekleştirildi. H3K4me2 öncelikle yerelleştirir sadece aşağı, transkripsiyon site Kodlayıcı bölgeler 5' sonunda başlamak ve Set1 yokluğunda, hücreleri17,18,19' H3K4me2 tespit edilemez. Set1Δ zorlanma bu nedenle diğer Histon işaretleri veya DNA non-spesifik bağlamaya antikor ilişkilendirilebilir arka plan sinyal miktarını belirtmek için denetimi olarak hizmet vermektedir. Bu durumda, wildtype soy H3K4me2 sonunda 5' sinyal yok set1Δ gözlendi, ancak Set1, PMA1 ve ERG1120,21, doğrudan hedef olarak bilinen iki gen için açık zenginleştirme gösterdi hücreleri (şekil 3A). Beklendiği gibi hiçbir zenginleştirme telomer (TEL) 07 L, H3K4me2 işareti vardır. H3K4me2 sonunda 5' SPR3 ORF zenginlik gözlenen düzeyleri için en benzer olduğunu ancak orta sporulation gen SPR3 ifadesi de Set122,23tarafından düzenlenmiş olması bildirilmiştir TEL07L, ya PMA1 ya da ERG11ile karşılaştırıldığında. Bu metil işareti lokalizasyonu değerlendirilmesi Set1 aracılı, düzenleme, SPR3 tarafından daha önceden gözlenen22olarak farklı bir mekanizma PMA1 veya ERG11, oluşma olasılığı olduğunu gösterir.
İkinci örnekte, acetylated H4K16 da H4K16ac işaretleri kaldırır Histon göre H4 wildtype hücreleri ve hücre Histon deacetylase Sir2, eksik gösterilir. H4K16ac heterochromatic benzeri Kromatin telomer yakın tükenmiş ve telomer24,25, distal euchromatin içinde TEL07L ve TEL15L (şekil için gösterildiği zenginleştirilmiş 3B). Denetim gen PMA1nerede Sir2 bilinmemektedir yerelleştirmek için herhangi bir değişiklik görülmektedir, ancak buna ek olarak, Sir2 kaybı artış belirli bölgelerde, telomeric ve subtelomeric, H4K16ac neden olur. Çip parametreleri ise bu veri sir2Δ hücrelerdeki H4K16ac seviyelerinde net bir artış gösterirken, H3K4me2 içinde değişiklik set1Δ hücreleri karşı wildtype olarak önemli olması beklenen değil, H4K16ac tespit edilen değişiklik görünmeyebilir düzgün bir şekilde en iyi duruma getirilmiş. Optimizasyonu için öneriler tartışmaya açıklanmıştır.
Şekil 1: Çip yordamı kronolojisi. Normal zamanlama çipi protokolü için gösterilir. Olası değişimler metinde belirtilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Test MNase sindirim için mono-oluşturarlar solubilization. Özel Jel Elektroforez Kromatin Pelet MNase değişen miktarlarda ile sindirim ardından izole DNA'ın (20 adet/µL). Mononucleosomes DNA'dan geçirir yaklaşık 150 bp, polynucleosomes üzerinden yaklaşık 300 bp ve DNA dinucleosomes üzerinden giderek daha yüksek moleküler ağırlık vasıl bulundu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Cips, H3K4me2 ve H4K16ac wildtype ve mutant Maya suşları. H3K4me2 ve H3 karşı antikor kullanarak(a)ChIP wildtype ve set1Δ hücrelerde gerçekleştirilen. Yüzde giriş her astar çifti için H3K4me2 ve H3 IP adresleri için hesaplanır ve oranı H3K4me2 belirtilen loci, göreceli zenginlik belirtmek için grafiği çizilecek. TEL07L astar çift kromozom 7 Sol kolundaki telomer bitişik ise PMA1, ERG11 ve SPR3 için astar amplicons sonunda 5' her ORF oluşturmak. Üç biyolojik çoğaltır ortalaması gösterilir ve standart hata ortalamaya hata çubukları temsil eder. (B) çip H4K16ac ve wildtype ve sir2Δ hücrelerdeki H4 tanıma antikorlar ile gerçekleştirilen ve çizilen şekil 3Aiçin açıklandığı gibi. Astar çiftleri yükseltmek dizileri telomerlerin (TEL07L ve TEL15L) bitişik ve aşağı akım içinde önceden tanımlanmış her subtelomere euchromatic bölgelerinde (21 kb ve 5 kb telomer, distal sırasıyla).Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Zorlanma numarası | Genotip | Başvuru |
| yEG230 | MATα his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 | 23 |
| yEG223 | MATα sir2Δ::NATMX | Bu çalışmada |
| yEG232 | MATa set1Δ::KANMX | 23 |
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan Maya suşları.
| Oligo numarası | Konumu | Sıra |
| oEG141 | TELVIIL F | AGCCCGAGCCTGTACTAAAT |
| oEG142 | TELVIIL R | CAAAAGAAACTTTTCATGGCA |
| oEG153 | 5' PMA1 F | TCAGCTCATCAGCCAACTCAAG |
| oEG154 | 5' PMA1 R | CGTCGACACCGTGATTAGATTG |
| oEG220 | TELVIIL + 21KB F | AAACAATGGGACCCTTCTGA |
| oEG221 | TELVIIL + 21KB R | AACACCTTGCAAAACACAGG |
| oEG280 | TELXVL F | ATCCTGCAATTGGGCCACTAT |
| oEG281 | TELXVL R | AGCGGAAGGCATATTAACGT |
| oEG282 | TELXVL + 5KB F | AGGCGATGTAATCTCACCAA |
| oEG283 | TELXVL + 5KB R | CATTCACACATCCTGCTACCA |
| oEG568 | ERG11 F | CCTCTTATTCCGTCGGTGAA |
| oEG569 | ERG11 R | TGTGTCTACCACCACCGAAA |
| oEG963 | SPR3 F | TCTGGATTCGCTGAGGAAGT |
| oEG964 | SPR3 R | TTTCAGTTCAGGGCTTTTCG |
Tablo 2: Bu çalışmada kullanılan astar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan yordamı immunoprecipitation tarafından değiştirilmiş Histon Maya hücreleri ile ilgili DNA'ın verimli kurtarma sağlar. Bu bölgelerde yerel zenginleştirme belirlemek ilgi veya belirli Histon değişiklikler tükenmesi yükseltmek primerler kullanılarak qPCR tarafından takip ediyor. Bir yöntem olarak varlık gelişmiş rağmen neredeyse 20 yıl önce çip Histon değişiklik durum farklı genomik bölgeler ve farklı koşullar altında soruşturma için belirleyici tahlil kalır. Her ne kadar yeni nesil sıralama teknolojileri Histon değişiklikler genom geniş ölçekli6,7sorguya çekebiliriz için çip birleştiğinde, maliyeti ve bu yaklaşımların gerekli veri analizi bazı laboratuar ortamlarında onların kullanımı sınırlayabilir. Ayrıca, bu epigenomic deneyler kez Histon değişiklik durum bazı genomik loci, gözlemleri doğrulamak için qPCR için birleştiğinde yonga tarafından takip edilmektedir. Fiziksel olarak bir Histon işareti (veya diğer protein) genom içindeki belirli bir konuma bağlantı ve bu etkileşim farklı çevresel veya biyolojik koşullar altında dinamiklerini analiz çip yarar sağlar birkaç benzer yöntem vardır . Her ne kadar Kromatin tanımlanmış genomik bölgelerden izole son başarılı olmuştur ve kütle spektrometresi8,9,10,11kullanarak yerel Histon işaretleri tanımlayan, bu yöntemler poz Teknik sorunlar ve onların yardımcı programı farklı laboratuar türleri arasında kütle spektrometresi araçları ve veri analizi kaynakları yeterli erişim sınırlı olabilir. Burada açıklanan protokol teknik olarak bir qPCR makineye erişim varlık birincil mümkün engel ile çeşitli laboratuvar ayarları için ve ekonomik olarak erişilemez. Çip değiştirilmiş Histon genomik yerelleştirme Maya ve diğer sistemleri tanımlamak için altın standart kalır.
Bu aynı anda birden fazla mutantlar veya çevresel koşullar testi dahil olmak üzere farklı deneysel koşullarına uygun hale getirilebilir adımları bir dizi ile çok yönlü bir protokoldür. Alternatif olarak, yeterli Kromatin genellikle bir lysate kadar en az dört farklı antikorlar ile çoklu IPS gerçekleştirmek için oluşturulur. Bu iletişim kuralı epitope öğesini veya antikor oluşturulmuş olan sigara Histon Kromatin proteinleri küçük parça için de kullanılabilir. Bu iletişim kuralı olmayan Histon proteinleri küçük parça için adapte için ise, fiksasyon süresi, dahil olmak üzere IP Kromatin konsantrasyon ve antikor konsantrasyon kez arka plan üzerinde zenginleştirme hedeflenen protein elde etmek için önemli parametreleridir. En sık 45 ve 60 dk arasında için formaldehit ile fiksasyon zamanı artırmak için ve IP (en fazla 200 µg toplam protein) kullanılan Kromatin miktarını artırmak için yararlıdır.
Kaliteye katkıda potansiyel değişkenlerin sayısını ve tekrarlanabilirlik Histon modifikasyon chIP deney vardır. Alt-optimal bir deney kez pozitif stark farklılıkları (örneğin, H3K4me2 şekil 3Aiçinde gösterildiği gibi wildtype veya hücrede set1Δ, düzeyi) karşılaştırırken sonuçlar verebilir rağmen daha fazla ince farklar içinde maskeli olmak büyük olasılıkla bir uygun olmayan şekilde gerçekleştirilen deneme (H4K16ac, TEL07L şekil 3B' gösterildiği gibi wildtype veya sir2Δ olan hücrelerde farklı düzeyleri gibi). Deneysel parametreleri göz önünde bulundurulacak kullanılan Maya hücre, fiksasyon zaman, IP, sindirilmiş DNA-protein kompleksleri ve antikor kalite ve parça boyutu kullanılan Kromatin kesir konsantrasyon miktarı içerir. Bu yaklaşımın bir sınırlama olduğunu deneysel parametrelerinin optimizasyonu test edilen her Histon değişiklik ve mutant suşları ve/veya koşullar altında soruşturma için genellikle gerekli. Histon işareti düzeyleri veya yerelleştirme farklı koşullar altında ince farklılıklar olabilir ve yetenek bu farklılıkları algılamak için yukarıda açıklanan parametrelere bağlıdır. Biz bazı en hassas deneysel yaklaşımlar aşağıda geliştirmek için kritik noktalar tartışıyorlar.
İletişim kuralında açıklandığı gibi birden çok tam çip deney gerçekleştirmeden önce en yüksek konsantrasyonu belirlemek için MNase konsantrasyonları test etmek için tavsiye edilir. IP içinde DNA yeterince parçalanmış sağlanması yüksek çözünürlüklü chIP sonuçları elde etmek için bir anahtardır. QPCR ürünleri amplicon boyutunu küçük olsa bile (genellikle 100 bp), DNA parçası boyutunu önemli ölçüde daha büyük, qPCR zenginleştirme belirli bir odağı, aslında, Histon işareti yerelleştirilmiş olabilir zaman göstermek yanlış ise basepairs uzakta yüzlerce. Kromatin mono - ve di-oluşturarlar içine, solubilize MNase bu protokole dayanan diğer çip iletişim kuralları da yaygın sonication Kromatin6,7yamultmak için kullanın. Sonication de kesme boyutları daha az uniform olma eğilimindedir ve denemeleri arasında tutarlı sonuçlar elde etmek daha zor olabilir, ancak Kromatin parçaları, Çözücü için güvenilir bir yöntemdir. Sonication için bazı sigara Histon proteinleri çip tercih olabilir, ancak Kromatin öncelikle mono-oluşturarlar sindirmek için MNase kullanımını Histon modifikasyon chIP deneyler çözünürlüğü artırabilir.
Bir başarılı çip deneme için benzersiz ve yüksek benzeşimli faiz Histon modifikasyonu tanıyan bir antikor gereksinimdir. Birincil çip Histon değişiklik algılama için bir yöntem olarak bir yüksek kaliteli, doğrulanmış antikor üzerindeki güven kısıtlamasıdır; Böyle bir reaktif, küçük parça--dan elde edilen sonuçlar biyolojik olarak alakalı olacak şekilde olası değildir. Kalite ve antikorlar geçerliliğini olmasına rağmen değişken piyasada bulunan antikorlar karşı Histon değişiklikler içinde mayası, buldum bir dizi vardır. Çabaları Bu antikorlar doğrulamak için verilen deney26en iyi kullanılabilir antikor belirlenmesi için yararlı kaynaklar doğurmuştur. Bu antikorlar küçük parça için kullanılan yöntemleri tarafından değiştirilmiş ve unmodified Histon peptidler problama dizileri de dahil olmak üzere, Batı lekesi içinde ve bütün hücre özleri ve arıtılmış Histon gerçekleştirme olmalarından için bir çeşitlilik ile doğrulanır önerilir silinmiş veya değiştirilmiş Histon kalıntı nokta mutasyon taşıyan değiştirme bir enzim suşları gibi uygun denetimler ile çip deneyler. Uncharacterized işaretleri tanımak yeni antikorlar veya laboratuvar tarafından üretilen antikorlar için bu özgüllüğü deneyler antikor çip için geçerli bir reaktif olabilir olup olmadığını belirlemek için önemlidir.Antikor özgüllük doğrulama ek olarak, bir wildtype yük ve bir negatif kontrol yük IP için bir antikor titrasyonu gerçekleştirme kez (bir küme Kromatin konsantrasyon göre) gerekli antikor miktarı için belirlemek için kullanışlıdır doğru zenginleştirme suşları veya bölgelerde genom kopyası arasındaki farkları tespit. Ayrıca, bazı veri işaretinin genomik dağıtım desenleri ile ilgili bilinen, pozitif ve negatif ise denetim astar kümeleri tüm qPCR deneylerde herhangi bir bireysel deneme doğrulamak ve deneyler arasında karşılaştırma yapmayı kolaylaştırmak için eklenmelidir.
Genel olarak, bu iş için araştırmacılar Histon değişiklik durumu mayası genomik herhangi bir bölgede, sorguya baktılar temel yöntemi açıklanır. Bu iletişim kuralı ve onun uygulanabilirliği çeşitli deneysel sorulara çok yönlülük Kromatin dynamics moleküler seviyede dissekan için son derece yararlı bir araç yapar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar yararlı tartışmalar için yeşil laboratuvar üyeleri teşekkür etmek istiyorum. Bu eser kısmen NIH hibe R03AG052018 ve E.M.G. için R01GM124342 tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
| Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
| Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
| NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
| 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
| MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
| LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
| Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
| 25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
| Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
| Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
| Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
| Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
| BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
| α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
| α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
| α H3 | Abcam | ab1791 | |
| α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
| High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
| Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
| magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
| Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
| 2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
| Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |
References
- Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate. J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and combinatorial functions of histone modifications. Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Lefrançois, P., et al. Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing. BMC Genomics. 10, 37 (2009).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
- Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Meluh, P. B., Broach, J. R.
- Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).
- Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).
- Briggs, S. D., et al. Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae. Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).
- Bernstein, B. E., et al. Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes. P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).
- Pokholok, D. K., et al. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell. 122 (4), 517-527 (2005).
- Krogan, N. J., et al. The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation. Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).
- South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A. P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).
- Margaritis, T., et al. Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3'-end antisense transcription. PLoS Genet. 8 (9), e1002952 (2012).
- Jezek, M., et al. The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance. Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).
- Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin. Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).
- Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).
- Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
