Summary
Nous décrivons ici une méthode pour isoler et purifier les cellules dendritiques de différents compartiments anatomiques dans le tractus reproducteur femelle humain pour l’évaluation de leurs caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles. Cette méthode peut être adaptée pour isoler des autres cellules immunitaires ou autres tissus muqueux, les cellules dendritiques.
Abstract
Il est difficile en raison de la difficulté à obtenir des échantillons de la caractérisation des cellules dendritiques humaines (DCs) résidents dans les tissus muqueux, et le faible nombre de DCs présents par tissu. Pourtant, que le phénotype et la fonction des contrôleurs de domaine n’est modifiée par l’environnement tissulaire, il est nécessaire d’analyser les populations résidentes de DC tissu, puisque le sang provenant DCs incomplètement refléter les complexités des contrôleurs de domaine dans les tissus. Nous présentons ici un protocole visant à isoler les contrôleurs de domaine de l’humain appareil reproducteur féminin (FRT) à l’aide de spécimens de l’hystérectomie qui permet des analyses phénotypiques et fonctionnelles. Le protocole se compose de digestion de tissu pour générer une seule cellule mixé suspension cellulaire, suivie par la sélection des billes magnétiques positifs. Notre protocole de digestion du tissu ne pas se fendent de marqueurs de surface, ce qui permet une analyse phénotypique et fonctionnelle des contrôleurs de domaine dans l’état d’équilibre, sans une nuit d’incubation ou cellule d’activation. Ce protocole peut être adapté pour l’isolement des autres types de cellules immunitaires ou l’isolement des contrôleurs de domaine provenant d’autres tissus.
Introduction
La DRF a la double fonction de protection contre les agents pathogènes tout en permettant l’implantation et la grossesse1. Pour ce faire, le TRAF est compartimenté, avec chaque région anatomique affiche des caractéristiques histologiques, immunologiques et fonctionnelle unique1.
DCs présents à surfaces muqueuses prendre contact avec les microbes dans les poumons, le tube digestif et l’appareil génital et assurer la surveillance immunitaire d’éventuels agents pathogènes2. Contrôleurs de domaine ont la capacité unique apprêter naïf T-cellules et de déclencher des réponses immunes adaptatives3. Contrôleurs de domaine dans le TRAF sont également spécialisés pour tolérer les antigènes étrangers, comme ceux que l'on trouve dans le sperme et le développement du fœtus, pour permettre une grossesse réussie4. Par conséquent, selon l’emplacement, le phénotype DC et la fonction seront dérouleront séparément. On sait que DCs sont fortement influencées par l’environnement tissulaire, telle que leur nombre, leur phénotype et fonctions sont modifiées par l’environnement tissulaire dans lequel ils résident3. Par conséquent, pour comprendre le rôle que jouent les FRT DCs en maladies infectieuses, la grossesse et le cancer dans le TRAF, DCs résidents doivent être étudiés, depuis le sang dérivées des modèles cc ne suffisent pas à résoudre les complexités réglementaires trouvées dans les tissus FRT.
La caractérisation des tissus humains DCs résidents est difficile en raison du faible nombre de cellules présentes dans les tissus muqueux et de la difficulté à obtenir des échantillons de tissus humains. Contrôleurs de domaine ont été étudiés dans le TRAF utilisant immunohistochimie5,6, qui renseigne sur l’emplacement de cellules dans les tissus, mais s’oppose à des études fonctionnelles et est limité dans le numéro d’identification de marqueurs de cellules qui peuvent être analysés Tout de suite. Par ailleurs, des protocoles d’isolement cellulaire unique pour cytométrie ont été développés7,8,9. Certains de ces protocoles tirer parti de la capacité migratoire de DCs pour isoler ces cellules qui migrent. Ces méthodes généralement nécessitent des incubations durant la nuit et sélection de DCs activés, mais ne permettent pas pour l’étude des contrôleurs de domaine à l’état stationnaire.
Ici, à l’aide de spécimens de l’hystérectomie, nous avons optimisé un protocole visant à isoler les contrôleurs de domaine de différents sites anatomiques de la FRT, l’endomètre (EM), l’endocol (CX) et l’exocol (ECX), qui permet des analyses phénotypiques et fonctionnelles. En utilisant un protocole non protéolytiques digestion enzymatique, nous pouvons procéder immédiatement après digestion de tissu à la caractérisation des cellule d’isolement et de flux par cytométrie en flux sans activation de la cellule. Cytométrie multicolore et en adaptant des études fonctionnelles pour les faibles nombres de cellules, nous pouvons identifier et caractériser les sous-ensembles rares de contrôleurs de domaine dans les différents sites de la FRT.
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Protocol
Études sur des sujets humains ont été menées selon les principes exprimés dans la déclaration d’Helsinki. Études ont été approuvées par le Comité pour la Protection des sujets humains (SSPC) et Dartmouth College Institutional Review Board. Consentement éclairé a été obtenu avant l’intervention de femmes séronégatives subissant des hystérectomies au Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Lebanon, NH). Pathologistes formés sélectionné des échantillons de tissus de l’EM, CX et ECX, exempte de lésions pathologiques et éloigné des sites de pathologie. Des échantillons de sang ont été prélevés de donneurs sains volontaires recrutés à Dartmouth Hitchcock Medical Center. Les donneurs de sang étaient anonymes. Des tissus EM, CX et ECX fraîchement isolées de la salle d’opération ont été transférés à la pathologie d’isolement et de classement préalable de transférer à notre laboratoire dans des tubes en polypropylène distincts, stériles.
1. enzymatique Digestion des tissus
Remarque : Utilisez le matériel stérile et travailler sous une hotte de sécurité biologique.
- Préparer Balanced Salt Solution (HBSS de Hank a mis à jour le) avec 1 x HBSS rouge de phénol, 100 U/mL la pénicilline-streptomycine, 0,35 g/L NaHCO3et 20 mM HEPES.
- Préparer le cocktail enzymatique (modifié désoxyribonucléase 0,01 % [wt/vol] HBSS, 450 U/mL collagénase IV, I et 2 mg/mL D-glucose). Passer la solution à travers un filtre de 0,22 µm stérile. Idéalement, préparer l’enzyme de digestion sur la journée d’utilisation, mais il peut être congelé à-20 ° C pour le stockage. Éviter répétés de gel et de dégel des cycles.
- Rincer le tissu avec mis à jour le HBSS et placez-les dans un plat de Pétri 100 x 15 mm2 . Ajuster la taille de boîte de Pétri basée sur la quantité de tissu disponible et le volume de cocktail enzymatique utilisé (Voir l’étape 1.4.2 ci-dessous).
Remarque : Les tissus varient en taille selon l’échantillon chirurgicaux issu de la pathologie, allant de 1 à 10 g. - Traitement physique avec scalpel jetable et forceps :
- Ajouter environ 3 mL d’enzyme de digestion cocktail au tissu pour éviter le dessèchement pendant la coupe.
- Utiliser les pinces pour stabiliser le tissu et découper avec un scalpel pour augmenter la surface des tissus exposés à l’enzyme de digestion cocktail. Couper le tissu en petits morceaux (< 2 mm sur un côté). Ajouter suffisamment cocktail d’enzyme de digestion pour couvrir tous les morceaux de tissus (5 mL/g de tissu). Placez le couvercle sur la boîte de Pétri.
- Incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2 sur un rotateur à environ 80 tr/min pendant 45 min. veiller à ce que la vitesse de la coiffe mélange soigneusement le cocktail d’enzyme de digestion sans renverser ou produisant des bulles.
- Visualiser la préparation du tissu avec un microscope inversé léger avec le 4 X et 10 X objectifs.
Remarque : Après digestion, petits fragments de tissus ou une suspension de cellules mixtes comprenant des glandes épithéliales visibles doivent être présents (voir la Figure 1 a).
2. physique séparation des cellules individuelles
- Dans un environnement stérile, placer une maille tendue 250 µm avec support dans un plat de Pétri de2 150 x 15 mm. Veiller à ce que le maillage est environ 0,5 cm au-dessus de la surface de la boîte de Pétri.
- Mouiller la maille avec 2 mL de HBSS mis à jour l’et transférer les tissus digérés sur le maillage.
- À l’aide de la surface plane d’un piston de la seringue de 10 mL, doucement mais fermement, moudre les tissus digérés hachées à travers les mailles.
ATTENTION : Rectification trop agressivement endommagera le maillage et augmentent la mortalité cellulaire. Cette étape se séparera les cellules épithéliales et les cellules du stroma (y compris les cellules immunitaires) du tissu conjonctif et de mucus. - Une fois que les fragments de tissus ont été soigneusement dispersés, élever le maillage et le porte-2-3 cm au-dessus de la boîte de Pétri et rincer avec 3 mL de modification HBSS pour récupérer des cellules supplémentaires.
- Recueillir la suspension cellulaire. Placez le maillage de 20 µm avec support dans une boîte de Pétri et mouillé avec 2 mL de HBSS modifiés. Versez la suspension cellulaire à travers les mailles tenant la maille 2-3 cm au-dessus de la boîte de Pétri et rinçage avec 6 mL de HBSS modifiés.
Remarque : Cette étape va se séparer les feuilles épithéliales, qui sont conservés sur le dessus, à partir de cellules uniques qui passent à travers les mailles. Le cheminement est une suspension de cellules mixtes, qui comprend les cellules immunitaires et fibroblastes stromales. - Recueillir la suspension cellulaire mixte et centrifuger à 500 x g pendant 10 min. aspirer le liquide et Resuspendre le culot dans 4 mL de HBSS modifiés pour la centrifugation en gradient de densité.
- Couche la suspension de cellules mixtes plus de 3 mL de solution de polysucrose et centrifuger à température ambiante à 500 x g pendant 30 min avec pas de frein. Recueillir la bande blanche du haut de la solution de polysucrose et laver avec du PBS.
Remarque : Cette fraction est la suspension de cellules mixtes enrichi, qui est riche en cellules immunitaires et contient quelques fibroblastes stromales.
3. mort cellulaire Removal
Remarque : Si un grand pourcentage de cellules mortes (> 20 %) est présent dans la suspension de cellules mixtes enrichi après centrifugation en gradient de densité, il est recommandée d’élimination des cellules mortes avec billes magnétiques. Les cellules mortes doivent être supprimés car ils peuvent interférer avec le processus de sélection des billes magnétiques positifs.
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre sur un microscope optique avec l’objectif 10 X. Tournez en bas toutes les cellules de la suspension de cellules mixtes enrichi (500 x g, 10 min, 4 ° C). Totalement aspirer et éliminer le surnageant. Ajouter 100 µL de perles élimination des cellules mortes par 1 x 107 total des cellules (vivants ou morts), selon les instructions du fabricant. Incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
- Placer un filtre de 30 µm sur la colonne magnétique, appliquez la suspension cellulaire et laissez les cellules marquées perle de tomber à travers la colonne magnétique.
- Rincer la colonne avec tampon élimination des cellules mortes comme recommandé (3 mL). Recueillir les intermédiaires contenant les cellules vivantes. La gamme de récupération de la cellule après l’élimination des cellules mortes, est présentée dans la Figure 1 b.
Remarque : Ces cellules peuvent être utilisées pour effectuer la cytométrie en flux, la coloration des études phénotypiques (section 5) ou de continuer avec l’isolement de DC (section 4).
4. DC Purification par sélection Positive billes magnétiques
- Après élimination des cellules mortes (étape 3.2), faire tourner les cellules vers le bas, retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 80 µL de tampon de sélection magnétique par 1 x 107 cellules (PBS, 0,5 % inactivés par la chaleur humaine sérum AB (HS), 2 mM EDTA).
- Pour la sélection positive des populations de DC, ajouter des billes magnétiques CD1a ou CD14 selon les instructions du fabricant (20 billes magnétiques µL par 1 x 107 cellules). Incuber pendant 15 min à 4° C.
- Laver les cellules avec le tampon de sélection magnétique, tournez en bas et enlever le tampon complètement. Remettre en suspension les cellules dans un minimum de 500 µL de tampon de sélection magnétique.
- Fixer la colonne sur l’aimant et ajouter un filtre de 30 µm sur le dessus de la colonne de conserver tout amas de cellules restantes. Rincez le filtre et la colonne avec le tampon de sélection magnétique tel que recommandé.
- S’appliquent à la suspension de cellules de la colonne. Rincer 3 fois avec le tampon de sélection magnétique.
- Transférer la colonne dans un tube de 15 mL, ajouter 5 mL de tampon de sélection magnétique et d’appliquer le piston pour libérer les cellules sélectionnées dans la colonne.
- Pour augmenter la pureté, répétez les étapes 4,4 – 4,6 avec les cellules récupérées à l’aide d’une nouvelle colonne. La gamme de récupération cellulaire après sélection de billes magnétiques est présentée en Figure 1.
5. évaluation de la pureté de la cellule : Flow Cytometry et microscopie
- Anticorps de coloration pour la cytométrie en flux :
- Remettre jusqu'à 1 x 106 cellules dans 100 µL de PBS contenant 20 % inactivés par la chaleur HS à bloquer les récepteurs Fc et incuber pendant 10 minutes sur la glace.
- Ajouter le désiré fluorescent étiquetée anticorps et le réactif pour l’identification de cellules mortes (pour obtenir un exemple, voir la section 6.5). Définissez la fluorescence moins un (FMO) contrôles à mettre en place les portes et perles de compensation permet de préparer les contrôles tache unique d’indemnisation. Exemples d’anticorps utilisés sont donnés dans le tableau 1. Incuber pendant 20 min à 4 ° C, abri de la lumière.
- Laver les cellules avec 2 mL de tampon de sélection magnétique.
Remarque : La présence d’EDTA est important pour éviter la formation de cellule s’agglutiner pour analyse en cytométrie en flux. Tournez en bas et éliminer le surnageant. - Fixer les cellules en ajoutant 100 µL de solution de paraformaldéhyde de 2 % par tube.
- Analyser les échantillons par un écoulement cytomètre10,11.
- Spin de la colonne (par exemple, cytospin) et utiliser pour analyser la morphologie de coloration de Giemsa :
- Remettre en suspension les cellules dans 200 µL de tampon de sélection magnétique.
- Charger dans une colonne et un essorage pendant 5 min. Faites entrer le sécher complètement.
- Difficulté la diapositive par immersion dans du méthanol 100 % pendant 2 min. Rincer la lame avec de l’eau désionisée et laisser sécher à l’air.
- Effectuer une coloration standard de Wrights-Giemsa. Couvrir les cellules avec l’éosine et incuber pendant 10 min, rincer à l’eau désionisée et laissez-le sécher. Couvrir les cellules avec Wrights-Geimsa tache, incuber pendant 1 min, rincer à l’eau déminéralisée et sécher à l’air.
- Examiner les préparatifs avec un microscope inversé (Figure 2 a, objectif 40).
6. allogéniques Stimulation Assay pour évaluer la fonction des cellules DC
- Décongeler les cellules mononucléaires de sang périphérique congelé (PBMC)
- Réchauffer les milieux de culture cellulaire avec 10 % HS à 37 ° C.
- Décongeler les PBMC en plaçant le cryotube dans un bain d’eau de 37 ° C, jusqu'à ce qu’une petite quantité de milieux cellulaires congelés reste dans le cryotube. Dans un environnement stérile, transférer le contenu du cryotube à 10 mL de milieu de culture cellulaire pré chauffé avec 10 % HS dans un tube de 15mL.
- Centrifuger à ~ 500 g pendant 7 min. Retirez le support, disperse le culot, remettre en suspension les PBMC dans 10 mL de milieux de culture cellulaire avec 10 % HS et centrifuger les cellules.
- Répétez l’étape de lavage une troisième fois. Compter les cellules non vides.
- Sélection de cellules T Naïve :
- Utilisez un kit de sélection une sélection négative anticorps MAGNETIQUE cellule pour isoler naïf lymphocytes T selon le protocole du fabricant.
- Après l’isolement, vérifier la pureté à l’aide d’anticorps CD45RA et CCR7.
NOTE : Pureté typique est > 99 % naïf T-cellules.
- Naïve lymphocytes prolifération coloration :
- Préparez 600 µL de solution de x 2 de colorant de prolifération cellulaire, protégeant le colorant à l’exposition à la lumière.
- Laver les naïfs de lymphocytes-T 2 x avec du PBS. Remettre en suspension les cellules dans 500 µL de PBS.
- Tout en douceur de Vortex les cellules dans la prévention des risques biotechnologiques armoire, ajouter 500 µL de prolifération colorant pour les naïfs de lymphocytes T.
- Incuber les cellules pendant 10 min à 37° C.
- Arrêter le marquage cellulaire en ajoutant 5 mL de milieux de culture cellulaire avec 10 % HS aux cellules. Incuber sur glace pendant 5 min, abri de la lumière.
- Centrifuger les cellules à ~ 500 g x 7 mn, aspirer les médias et remettre en suspension les cellules à 4 ° C, des milieux de culture cellulaire avec 10 % HS. Répétez deux fois plus pour un total de 3 lavages. Prélever une partie aliquote de cellules à compter avant la centrifugation dernier.
NOTE : En général, naïve final nombre de T-cellules variera entre 5 % et 15 % du nombre initial d’éléments PBMC. - Remettre en suspension les cellules avec les milieux de culture cellulaire avec 10 % HS à la concentration de la cellule souhaitée.
- DC-allogénique naïf T-cell culture mixte :
- Plaque l’isolé DCs et naïf T-cellules dans une plaque 96 puits, fond rond, à un 01:15 rapport d’accident de décompression à lymphocytes T. S’assurer que le nombre optimal pour DCs varie entre 3 000 et 5 000 cellules par puits.
- Centrifuger la plaque à ~ 500 x g pendant 3 minutes pour s’assurer que les cellules sont trouvent au centre du puits. Contact cellule-cellule est important pour la signalisation appropriée de se produire.
- Incuber à 37 ° C pendant 6 jours. Surveiller l’amas de cellules qui apparaissent dans les puits comme la prolifération se produit, avec la microscopie (Figure 3 a).
- Cytométrie en flux coloration afin d’évaluer la prolifération :
- Après 6 jours, les cellules peuvent être examinés par cytométrie en flux. Détachant la co-culture de cytométrie en flux.
- Préparer une solution de 2 x de colorant jaune viabilité (émission maximale 572 nm) dans du PBS.
Remarque : L’utilisation de PBS sans sérum est importante, comme sérum protéines interfèrent avec le colorant). - Centrifuger la plaque avec les cellules à ~ 500 g pendant 5 min.
- Déposer 100 µL de liquide surnageant.
Remarque : À ce stade recueillir et stocker le surnageant pour analyse séparée des facteurs solubles. - Laver les cellules deux fois avec du PBS : Ajouter 150 µL/puits de PBS, centrifuger à ~ 500 g pendant 5 min, retirer 150 µL de liquide surnageant avec une pipette. Veiller à ce qu’il y a 50 µL de liquide surnageant restant dans chaque puits.
- Ajouter 50 µL de colorant de viabilité 2 x dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 10 min, abri de la lumière.
- Pendant l’incubation, préparer un mélange maître des marqueurs de l’anticorps désiré. Par exemple : CD3 APC/Cy7, PE de CD4, CD8 FITC, etc.
- Ajouter le mélange d’anticorps à chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 10 min, abri de la lumière.
- Laver les cellules 2 x avec PBS + 2 % HS : Ajouter 150 µL/puits de PBS + 2 % HS. Centrifuger à ~ 500 g pendant 5 min. Retirer 150 µL de liquide surnageant avec une pipette.
- Fixer les cellules en ajoutant 100 µL/puits de 2 % de para-formaldéhyde. Si nécessaire : transférer les cellules et les médias aux tubes de cytométrie en flux en polypropylène. Tubes peuvent être conservés à 4 ° C et abri de la lumière, jusqu'à ce que la cytométrie.
- Lire les tubes dans un cytomètre en flux.
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Representative Results
Digestion de tissus suivant, la sortie des feuilles épithéliales et des glandes peut être observée, comme illustré à la Figure 1 a; Il s’agit d’un contrôle positif qui indique la digestion enzymatique a été un succès. Le nombre de cellules viables totales et DCs récupérés par gramme de tissu est également indiqué dans la Figure 1 b et de la Figure 1, respectivement. Les cellules immunitaires représentent entre 5 et 30 % des cellules stromales avant densité centrifugation12,13. La figure 2 illustre la morphologie (Figure 2 a) et la pureté (Figure 2 b, C) de la DCs isolée. Lorsque deux séries de sélection sont effectuées comme il est indiqué dans le protocole, la pureté attendue varie de 85 à 92 % (Figure 2). Le nombre de cellules récupérées est variable et dépend de la variabilité de taille et donneur de tissus initial. Caractérisation des cellules isolées ont été décrits13. La figure 3 montre un test de stimulation allogéniques représentatifs pour évaluer les fonctionnalités DC. Figure 3 a montre les caractéristiques touffes de lymphocytes qui apparaissent lors de la prolifération, et Figure 3 b montre la quantification de la prolifération par cytométrie en flux. Autres tests fonctionnels, tels que la capture virale ou à la production de cytokines et de chimiokines peuvent également être effectué13. La figure 4 illustre la stratégie de blocage pour identifier les différentes populations de contrôleurs de domaine dans les compartiments anatomiques distinctes de FRT après analyse cytométriques enrichi mixte des suspensions de cellules (Figure 4 a). Le titrage des anticorps et des témoins négatifs sont importants, que les contrôleurs de domaine et les macrophages affichent autofluorescence haute. FMO contrôles sont affichés dans la Figure 4 b. La figure 4 montre des exemples de comment identifier des sous-ensembles spécifiques de DC, comme CD1c +, CD207 + ou CD103 + DCs.
Figure 1 : disponibilité de traitement et de la cellule tissu. (A) image représentative des feuilles épithéliales et libérés après digestion de tissu des glandes. Gamme (B) du nombre total de cellules viables récupérés après traitement des tissus et élimination des cellules mortes dans chaque compartiment de FRT : endomètre (EM), endocol (CX) et exocol (ECX). Chaque point représente les cellules d’un autre sujet. (C) nombre de DCs récupéré par gramme de tissu après l’isolement des billes magnétiques. B et C sont adaptées du13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : la morphologie et la pureté des cellules isolées. (A) la morphologie dendritique de cellules isolées déterminés par microscopie après coloration au Giemsa. (B) Expression de marqueurs phénotypiques avant et après l’isolement de perle, tel que déterminé par cytométrie en flux. (C) représentant pureté obtenue après CD1a + et CD14 + isolation de perle. Adapté de13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : analyse de prolifération de. Images de microscopie représentatif de (A) des lymphocytes cluster formation lors de la prolifération : contraste de phase (à gauche), prolifération de teinture coloration (au milieu) et overlay (à droite). (B) exemple représentatif de l’induction de la prolifération après co-culture d’isolé l’endomètre CD1a + ou CD14 + DCs et naïve allogénique T-cellules obtenues à partir de gelée PBMC. B est une adaptation du13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : caractérisation phénotypique des contrôleurs de domaine dans l’enrichi mélangés des suspensions cellulaires de le FRT. (A) Gating stratégie d’identification des contrôleurs de domaine dans la suspension de cellules mixtes. Chaque population fermée dans les parcelles multicolores s’affiche dans le panneau suivant. Tracés de contour montrent la CD11c CD11b + et + CD11c CD11b-gates, respectivement. Marqueurs qui identifient les cellules indésirables peuvent être colorés en utilisant le même canal pour les exclure de l’analyse ; par exemple, les cellules mortes, CD3 + et cellules CD19 +. (B), FMO contrôles à mettre en place des barrières appropriées. (C) la Discrimination des sous-ensembles DC conformément à la stratégie de blocage. Tracés de contour ont été choisis au lieu de parcelles multicolores pour représenter plus fidèlement la répartition de la population lorsque le nombre de cellules ont été bas10. Un nombre faible de cellules est attendu à la fin de la stratégie de blocage, comme tissu DCs sont rares populations. Adapté de13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Marqueur de cellules | Fluorochrome | Clone | Concentration de | Quantité d’anticorps par échantillon |
| (dans 100 µl de tampon) | ||||
| CD45 | vioblue450 | HI30 | 1,0 µg/5 µl | 0,4 µg |
| CD11b | PE | ICRF44 | 1,0 µg/5 µl | 0,4 µg |
| CD11c | PerCp/Cy5.5 | Bu15 | 200 µg/ml | 0,4 µg |
| CCR5 | PE-Cy7 | 2 7 | 0,25 µg/5 µl | 0,1 µg |
| CCR7 | PE-Cy7 | REA108 | 99 µg/ml | 0,2 µg |
| HLA-DR | BV-570 | L243 | 100 µg/ml | 0,2 µg |
| HLA-DR | FITC | AC122 | 82.5 µg/ml | 0,16 µg |
| CD3 | APC | UCHT1 | 16 µg/ml | 0,03 µg |
| CD3 | viogreen | REA614 | 137 µg/ml | 0,27 µg |
| CD163 | APC | IGS/61 | 80 µg/ml | 0,16 µg |
| CD207 | APC | 1OE2 | 200 µg/ml | 0,4 µg |
| CD1a | FITC | HI149 | 0,5 µg/5 µl | 0,2 µg |
| CD1a | AF-700 | HI149 | 0,5 mg/ml | 1,0 µg |
| CD103 | PE-Cy7 | B-Ly7 | 0,25 µg/5 µl | 0,1 µg |
| CD83 | PE | HB15e | 0,25 µg/5 µl | 0,1 µg |
| CD14 | APC-feu | 3 63 | 400 µg/ml | 0,8 µg |
| CD209 | FITC, PE, APC | 120507 | 1.25 g/0,25 ml | 0,01 µg |
| Colorant jaune viabilité Zombie | ||||
| 7AAD | 0,1 mg/ml | 0.2UG |
Tableau 1 : Exemple d’anticorps pour la caractérisation des contrôleurs de domaine dans le TRAF par cytométrie.
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Discussion
DCs muqueuses sont une population de cellules rares fortement influencée par l’environnement tissulaire, qui change leur phénotype et leurs fonctions une fois qu’ils pénètrent dans les tissus3. Bien que dérivé du sang DCs sont un modèle très utile, ils ne représentent pas complètement la diversité des populations de DC trouvé dans les tissus. Pour comprendre les caractéristiques uniques de muqueuses DCs, isolement de cellules primaires des tissus est donc nécessaire. Isolement des contrôleurs de domaine de différents sites anatomiques dans le TRAF offre la possibilité d’étudier DC fonction in vitro et de comparer entre les sous-ensembles de DC et sites anatomiques.
Ici, nous fournissons un protocole qui permet la purification du DCs de tissus humains de TRAF in vitro l’évaluation des caractéristiques fonctionnelles. Puisque DCs sont trouvent sur les sites muqueux en petits nombres, nous avons développé un protocole afin d’enrichir la préparation du tissu cellulaire par centrifugation en gradient de densité et l’élimination des cellules mortes avant l’isolement cellulaire avec billes magnétiques. Un bon démontage de cellules mortes est important, parce qu’ils n’interférera pas avec l’isolement de la perle. Cette technique assure une pureté élevée de cellules isolées positivement (≈ 90 %), dans un relativement court laps de temps (4-6 h), et sans la nécessité d’une nuit d’incubation, culture in vitro de cellules ou migration avant l’isolement, dont chacun peut activer DCs et modifier leurs caractéristiques phénotypiques. Notre protocole n’entraîne l’activation de la cellule, telle que mesurée par l’absence de régulation de la maturation des marqueurs (CD86, HLA-DR, CD83)13. Un autre avantage est l’utilisation d’une digestion enzymatique non protéolytiques, qui ne pas Cliver marqueurs de surface et permet d’isolement immédiat de cellules ou d’analyses phénotypiques suite tissulaire digestion14.
La génération d’une suspension de cellules du même afin d’éviter le blocage des colonnes magnétiques est essentielle au présent protocole. Pour ce faire, les cellules mortes doivent être enlevés avant la sélection de cellule magnétique, nécessité de filtres à utiliser sur le dessus les colonnes magnétiques, et supérieure à 3 g de tissus doivent être réparties en deux colonnes. L’utilisation d’une colonne de seconde après le premier tour de la purification est essentielle à la pureté cellulaire élevée.
Une des limites de la méthode d’isolement sont l’intrinsèque faible nombre de DCs dans les tissus de la FRT, qui habituellement ne permet pas de récupération de bon cellulaire des tissus plus petit que 1 g. Dans ces circonstances, cependant, analyses phénotypiques encore est possible en utilisant l’enrichi mixte suspension cellulaire. Ceci est possible grâce à la méthode de digestion protéolytique-non utilisée, qui ne pas Cliver marqueurs de surface et permet une analyse immédiate du phénotype cellulaire après digestion de tissu14. En outre, l’âge du patient peut être un facteur qui influe sur le nombre de cellules récupérées.
Utilisant ce protocole, nous avons démontré précédemment que CD1a + isolation fournit une population phénotypiquement plus homogène que CD14 + sélection13; Cependant, CD1a + DCs sont difficiles à récupérer des CX et ECX. Tandis que CD14 peut également s’exprimer sur les macrophages, nous avons constaté que le FRT CD14 + population isolée est riche dans les PVD, basé sur la co-expression de marqueurs de DC et leur capacité à stimuler les naïfs allogéniques cellules T, qui est une fonction caractéristique de DCs13.
Puisque le nombre de contrôleurs de domaine récupéré est généralement faible (< 100 000 cellules total), études fonctionnelles doivent être optimisées pour un nombre faible de cellules. Nous démontrons l’optimisation d’un test de stimulation allogéniques, qui peut être effectuée avec seulement 3 000 DCs/puits. Nous avons mené d’autres études de fonction avec ces cellules, y compris la réceptivité hormonale, cytokines et la production de peptide antimicrobien sur VIH-stimulation et VIH-capture par FRT DCs13. Une fois que les contrôleurs de domaine sont isolés et plaqués, essais doivent être effectuées dans les 24 h, que la viabilité des cellules diminue après cette date.
Ce protocole peut être adapté pour isoler les différents sous-ensembles de la DC, ou autres types de cellules en sélectionnant les marqueurs bon attelé aux billes magnétiques et sélection séquentielle perle positives et négatives combinant pour supprimer des types de cellules indésirables. Une mise en garde, cependant, c’est qu’avec tous les tours de sélection quelques pourcentage de cellules seront perdus, donc pour l’isolement du FRT DCs, qui sont déjà rares, et le tissu est généralement petit, plusieurs rounds de sélection avec différents marqueurs (et le nécessaire lavages associés) ne sont pas souhaitables. En outre, le présent protocole peut être adapté pour isoler des autres cellules immunitaires ou DCs autres tissus14,15.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer
Acknowledgments
AI102838 et AI117739 (CRW) bourses d’études appuyé par les NIH. Nous remercions Richard Rossoll d’assistance technique. Analyse en cytométrie en flux a été réalisée en DartLab, la ressource partagée au Dartmouthsupported de (P30CA023108-37) et (P30GM103415-15).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Hyclone | SH30015.03 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| HEPES (1M) | Hyclone | 15630-080 | |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical | LS002140 | |
| D-glucose | Sigma Aldritch | 50-99-7 | |
| 0.22 um Stericup 500 mL filter | Millipore | SCGPU05RE | |
| 100mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | |
| 150mm x 15mm polystyrene petri dish | Fisherbrand | FB0875714 | |
| 150mm x 25mm polystyrene dish | Corning | 430599 | Treated cell culture dish |
| Isotemp Incubator | Fisher Scientific | FICO3500TABB | 5.0% CO2 |
| American Rotator V | American DADE | R4140 | |
| 250 um nylon mesh | Sefar | 03-250/50 | |
| 20 um nylon mesh | Sefar | 03-20/14 | |
| Beckman GS-6R Centrifuge | Beckman | 358702 | |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | Lonza | 04-418Q | |
| Human AB Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldritch | 10771 | |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | pH 7.4 |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Pre-separation filter (30um) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-410 | |
| Quadro MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS multi-stand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| EDTA | USB | 15694 | |
| CD1a Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-051-001 | |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| eFluor 670 cell proliferation dye | eBiosciences | 65-0840-85 | |
| 96 well round bottom plate | Falcon | 9/8/2866 | |
| Zombie yellow viability dye | Biolegend | 423104 | |
| CD3 APC/Cy7, anti-human | Tonbo Biosciences | 25-0038-T100 | |
| CD4 PE, anti-human | eBiosciences | 12-0048-42 | |
| CD8a FITC, anti-human | Tonbo Biosciences | 35-0086-T100 | |
| Gallios Flow Cytometer | Beckman Coulter Life Sciences | B43618 | 10 color, VBR |
| MACSquant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | 8 color, VBR |
References
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