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Genetics

एक Optogenetic विधि को नियंत्रित करने और सेल में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने वाली सेल बातचीत

Published: March 22, 2018 doi: 10.3791/57149
Automatic Translation
1,2, 1,3,4,5
1Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University, 2Japan Science and Technology Agency, PRESTO, 3Institute for Integrated Cell-Material Sciences, Kyoto University, 4Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Graduate School of Biostudies, Kyoto University

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान optogenetic नियंत्रण और जीन अभिव्यक्ति के रहते निगरानी द्वारा थरथरानवाला जानकारी के सेल के हस्तांतरण का विश्लेषण करने के लिए प्रस्तुत करते हैं । यह दृष्टिकोण कोशिकीय प्रणालियों में गतिशील जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रमों के एक कार्यात्मक महत्व का परीक्षण करने के लिए एक अनूठा मंच प्रदान करता है ।

Abstract

कोशिकाओं को अस्थाई रूप से बदलने के वातावरण, जो आसपास के कोशिकाओं से विभिंन कारकों से प्रभावित कर रहे है ठीक से जवाब देना चाहिए । पायदान संकेतन मार्ग सेल के लिए ऐसी आवश्यक आणविक मशीनरी में से एक है करने वाली सेल संचार, जो भ्रूण के सामांय विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । इस मार्ग ultradian लय के साथ थरथरानवाला जानकारी के एक सेल के लिए सेल हस्तांतरण शामिल है, लेकिन आणविक जीव विज्ञान की तकनीक में प्रगति के बावजूद, यह थरथरानवाला जीन पर कोशिकीय बातचीत के प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो गया है dynamics. यहां, हम एक सटीक लौकिक तरीके से optogenetic नियंत्रण और जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के रहने की निगरानी परमिट एक प्रोटोकॉल मौजूद । इस विधि सफलतापूर्वक आवृत्ति ट्यूनिंग और चरण एकल-कक्ष रिज़ॉल्यूशन पर स्थानांतरण द्वारा पायदान संकेतन चढ़ना आंतरिक दोलनों की कि intracellular और सेलुलर आवधिक आदानों से पता चला. यह दृष्टिकोण कोशिकीय प्रणालियों में गतिशील जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रमों के एक कार्यात्मक महत्व का परीक्षण करने के लिए एक अनूठा मंच प्रदान करने, विभिन्न सिग्नलिंग रास्ते की गतिशील सुविधाओं के विश्लेषण के लिए लागू है.

Introduction

सेल के लिए सेल संचार विकास प्रक्रियाओं में भ्रूण नमूनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । हड्डीवाला भ्रूण में, metameric संरचनाओं बुलाया somites पूर्वकाल के साथ गठन कर रहे हैं-पीछे एक सटीक लौकिक सटीकता के साथ एक समय रखने घड़ी के नियंत्रण के अंतर्गत शरीर धुरी, फॉल्ट घड़ी1कहा जाता है. इस प्रक्रिया के दौरान, presomitic मध्य त्वक स्तर (PSM) कक्षों का एक समूह में सिंक्रोनस तरीके से somites में परिवर्तित समय है । इस प्रक्रिया सिंक्रनाइज़ थरथरानवाला जीन अभिव्यक्ति और PSM कोशिकाओं है कि चरण में दोलन के रूप में एक ही somites शामिल हैं । थरथरानवाला जीन अभिव्यक्ति की अवधि के आसपास चूहों में 2 से 3 ज और zebrafish में के बारे में 30 मिनट है । जब असंबद्ध, PSM कोशिकाओं synchrony2,3खो, लेकिन जब वे फिर से एकत्रित कर रहे हैं, वे स्वयं को संगठित करने और जनसंख्या synchrony4की वसूली कर सकते हैं, सुझाव है कि सेल-सेल युग्मन सिंक्रनाइज़ के लिए एक महत्वपूर्ण है दोलनों.

व्यापक प्रयासों से पता चला कि डेल्टा पायदान मार्ग में अणुओं संकेत कसकर विभाजन घड़ी जीन के सिंक्रनाइज़ दोलनों से जुड़े हैं । या तो औषधीय अवरोधकों या पायदान संकेत के आनुवंशिक उत्परिवर्तनों oscillators की आबादी को सिंक्रनाइज़. zebrafish में, DeltaC, डेल्टा, और Notch1a जैसे पायदान संकेतन घटकों के म्यूटेंट, एसिंक्रोनस दोलनों5,6प्रदर्शित करें । लड़की या माउस भ्रूण में, न केवल पायदान ligand डेल्टा-like1 (Dll1) लेकिन यह भी पायदान मॉडुलन पागल फ्रिंज (Lfng) सिंक्रनाइज़ दोलनों के लिए आवश्यक है7,8,9. तथापि, यह गया है सेल से गतिशील सूचना हस्तांतरण के लिए सेल के लिए इस तरह के अणुओं के कार्यात्मक क्षमता परीक्षण मुश्किल है, क्योंकि जीन विनियमन गतिशीलता के पारंपरिक गड़बड़ी के लौकिक संकल्प की जांच करने के लिए पर्याप्त नहीं थे २-३ ज (ultradian लय) के timescales की प्रक्रियाएँ.

हमने हाल ही में स्तनधारी कोशिकाओं10में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को नियंत्रित करने और मॉनीटर करने के लिए एक एकीकृत विधि विकसित की है । इस प्रौद्योगिकी ultradian समय तराजू पर आवधिक प्रकाश रोशनी से जीन अभिव्यक्ति दालों की प्रेरण सक्षम बनाता है । यह प्रोटोकॉल सहज कक्ष-रेखाओं को स्थापित करने की विधियों का प्रतिनिधित्व करता है और सेल-टू-सेल संचार के संदर्भों में लाइव-सेल luminescence मॉनिटरिंग द्वारा रिपोर्टर कक्षों की डायनेमिक प्रतिक्रियाओं का निरीक्षण करते हैं । यह विधि कई अन्य सिग्नलिंग मार्ग के विश्लेषण के लिए लागू है ।

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Protocol

1. Tol2 प्रणाली द्वारा स्थिर सेल लाइनों की जनरेशन

  1. Transfect प्लाज्मिड वैक्टर (figure 1a) Tol2-आधारित optogenetic मॉड्यूल के साथ साथ transposase (Tol2) अभिव्यक्ति वेक्टर (pCAGGS-mT2TP) C2C12 कोशिकाओं में । सभी चरणों में, DMEM माध्यम के साथ संस्कृति कोशिकाओं को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और पेनिसिलिन-streptomycin 37 डिग्री सेल्सियस (तालिका 1), 5% CO2, अंयथा चिह्नित की उपस्थिति में के साथ पूरक ।
    1. एक सेल काउंटर के साथ trypsinized कोशिकाओं गिनती, और प्लेट 5 एक्स 104 C2C12 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से एक 12-अच्छी तरह से प्लेट में एक दिन अभिकर्मक से पहले.
    2. Co-transfect ०.३७५ μg of Tol2-based optogenetic वैक्टर (pAI177 or pAI218), ०.१२५ μg ऑफ़ ए ड्रग सेलेक्शन वेक्टर (pAI170) और 0.5 μg ऑफ़ pCAGGS-mT2TP वेक्टर का उपयोग करके lipofection रिएजेंट.
    3. Trypsinize transfected कोशिकाओं, और उंहें 100 मिमी संस्कृति व्यंजन में एक दिन अभिकर्मक के बाद थाली ।
    4. संस्कृति माध्यम के लिए transfected कोशिकाओं के लिए विनिमय संस्कृति माध्यम 100 मिलीग्राम/एमएल hygromycin के साथ पूरक ।
    5. संयुक्त राष्ट्र transfected कोशिकाओं को खत्म करने के लिए 3 दिनों के लिए संस्कृति कोशिकाओं. ध्यान दें कि मध्यम परिवर्तन आवश्यक नहीं है ।
  2. Trypsinize transfected कोशिकाओं, और चयन के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं की आबादी को शुद्ध । रिसीवर कोशिकाओं pAI177 ले जाने के लिए, mCherry पॉजिटिव सेल जनसंख्या की शुद्धि के लिए ग्रीन-पीई चैनल के लिए छंटाई फाटक सेट । फोटो के प्रति संवेदनशील प्रेषक pAI218 ले जाने वाले कोशिकाओं के लिए, iRFP713 के शुद्धि के लिए APC चैनल के लिए छंटाई गेट सेट-सकारात्मक सेल जनसंख्या ।
  3. वैकल्पिक) मानक विधियों द्वारा एक क्लोनिंग सेल जनसंख्या स्थापित करना, जैसे कि सीमित कमजोर पड़ने या एकल-सेल FACS द्वारा छंटाई ।

2. फोटो का मूल्यांकन-जनसंख्या स्तर पर इंजीनियर कोशिकाओं की संवेदनशीलता

नोट: यह हिस्सा एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए नीले प्रकाश रोशनी पर Dll1 ligand प्रोटीन की गतिशील प्रेरण की जांच करने के लिए जैव रासायनिक परख, ऐसे qPCR और पश्चिमी सोख्ता के रूप में ।

  1. के साथ या प्रकाश स्रोतों के बिना एक प्रकाश प्रेरित हालत या एक अंधेरी हालत, क्रमशः के लिए मशीन के दो प्रकार की स्थापना की । लाइट मीटर का उपयोग करके, चित्र 1bमें दिखाए गए अनुसार, नीली-LED ट्रांस-प्रकाशक की हल्की तीव्रता सेट करें । कार्यक्रम के समय और प्रकाश रोशनी की अवधि एक नियंत्रण एक एकल बोर्ड माइक्रो नियंत्रक है कि रोशनी के लिए प्रोग्राम कार्यक्रम की अनुमति देता है (चित्रा 1C) के लिए स्क्रिप्ट लोड हो रहा है ।
  2. एक सेल काउंटर के साथ trypsinized कोशिकाओं गिनती, और प्लेट 1.0 x 105 फोटो-संवेदनशील प्रेषक कोशिकाओं 35 मिमी व्यास प्लास्टिक संस्कृति व्यंजन पर pAI218 और pAI170 ले जा (प्रकाश हालत और अंधेरे हालत के लिए 1 पकवान के लिए 12 से अधिक व्यंजन) और में पकवान सेट अंधेरे के लिए अलग मशीन/ बर्तन की स्थापना के बाद, मशीन के दरवाजे रखने के सेल lysates इकट्ठा जब तक बंद कर दिया ।
  3. एक और एक आधा दिन चढ़ाना के बाद, प्रकाश रोशनी शुरू (कोशिकाओं से अधिक 80% धाराप्रवाह होने की उंमीद कर रहे हैं) । अवांछनीय फोटो-उत्तेजना से बचने के लिए कोशिकाओं को प्रकाश में न दिखाएं ।
    नोट: रोशनी के लिए कार्यक्रम प्रयोगों के उद्देश्य पर निर्भर करता है । ध्यान दें कि एक निरंतर रोशनी हालत (उदा1-ंयूनतम अवधि और 40 µmol/एम2के साथ 10 मिनट के अंतराल प्रकाश तीव्रता) फोटो प्रेरण की एक साधारण जांच के लिए पर्याप्त है, और है कि मजबूत प्रकाश रोशनी कोशिकाओं के लिए हानिकारक है । इस प्रकार, सुनिश्चित करें कि प्रबुद्ध के लिए हानिरहित मापदंडों का चयन कर रहे हैं ।
  4. चढ़ाना के बाद के बारे में 2 दिन, 30 मिनट के अंतराल के साथ सेल-lysate तैयार । पर बर्फ के लिए मशीन से नमूना व्यंजन ले जाएँ, और आगे विश्लेषण के लिए सेल lysates की तैयारी शुरू.

3. गतिशील प्रेषक-जनसंख्या स्तर पर रिसीवर परख: पीएमटी द्वारा ऑप्टिकल उत्तेजना पर सेलुलर प्रतिक्रियाओं की वास्तविक समय की निगरानी

  1. Trypsinize और मानक तरीकों के साथ प्रेषक और रिसीवर कोशिकाओं की संख्या गिनती । 2.5 x 104 रिसीवर और 1.25 x 105 प्रेषक कोशिकाओं (1:5 अनुपात) के निलंबन के मिश्रण की एक 1 मिलीलीटर कुल मात्रा तैयार करें ।
    नोट: 2:1, 1:1, या 1:2 प्रेषक-रिसीवर अनुपात भी 1.5 x 105की कुल कक्ष संख्या के साथ काम करते हैं । 10
  2. प्लेट 1 मिमी luciferin युक्त संस्कृति माध्यम के साथ अच्छी तरह से काले प्लेटों के प्रत्येक कुआं में मिश्रित कोशिकाओं ।
  3. luciferase परख के लिए प्लेट रीडर पर कोशिकाओं का विश्लेषण, और पुष्टि करते है कि उत्पादन संकेतों रिकॉर्डिंग प्रणाली के लिए बहुत अधिक नहीं हैं ।
    नोट: यदि आउटपुट संकेतों से अधिक है 1 x 106 फोटॉन गिनती/एस, वे संतृप्त किया जा सकता है । इस मामले में, luciferin की एकाग्रता इष्टतम मूल्यों को कम करने के लिए इतना है कि उत्पादन संकेतों से कम कर रहे हैं 1 x 106 फोटॉन गिनती/
  4. रिकॉर्डिंग सिस्टम पर प्लेट सेट करें, और एक रिकॉर्डिंग प्रोग्राम (चित्रा 1 डी) शुरू करते हैं । उदाहरण के लिए, रिकॉर्डिंग की स्थापना के बाद 18 ज पर प्रकाश रोशनी शुरू करते हैं ।
    नोट: इस तरह के औसत और Savitzky-Golay फ़िल्टरिंग चलती के साथ विट्रेंडिंग संकेतों के रूप में अस्थाई फ़िल्टरिंग, तरंग रूपों और चोटी का पता लगाने के दृश्य के लिए उपयोगी होते हैं ।

4. गतिशील प्रेषक-एकल कक्ष स्तर पर रिसीवर परख: Optogenetic गड़बड़ी के नियंत्रण के तहत एकल-कक्ष प्रतिक्रियाओं का रीयल-टाइम इमेजिंग

  1. प्लेट 0.5 x 105 रिसीवर और 2.5 x 105 प्रेषक कोशिकाओं पर 27-mm-व्यास-गिलास-बेस 35 मिमी व्यास व्यंजन । सुनिश्चित करें कि मिश्रण अनुपात और कुल सेल संख्या (एक कोशिका घनत्व) सही ढंग से समायोजित कर रहे हैं ।
  2. चढ़ाना के बाद एक दिन, रिकॉर्डिंग मध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ विनिमय मध्यम (phenol-लाल मुक्त DMEM मध्यम 5% FBS, पेनिसिलिन-streptomycin और 1 मिमी luciferin के साथ पूरक), और माइक्रोस्कोप पर कांच आधार पकवान सेट । यदि आवश्यक हो, तो पंजाबियों (-) के साथ मृत कोशिकाओं के मलबे को धो लें ।
    नोट: यह एक अंधेरे हालत में यह कदम करने के लिए बेहतर है ।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर एक पर्यावरण चैंबर से सुसज्जित एक औंधा माइक्रोस्कोप की स्थापना की2.
  4. एक ठंडा सीसीडी कैमरा सेट करें । सीसीडी संवेदक के तापमान गंतव्य मूल्य (आमतौर पर,-90 डिग्री सेल्सियस) के लिए नीचे ठंडा है सुनिश्चित करें ।
  5. 5 मिनट के अंतराल और 288 से अधिक बार (एक से अधिक रातोंरात रिकॉर्डिंग) के साथ छवियों को पकड़ने के लिए स्वत: अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में "बहु आयामी डीकॉक" खिड़की के लिए पैरामीटर सेट करें ।
    1. खुला "बहु आयामी डीकॉक" खिड़की, एक luminescence चैनल का चयन करें और पुल-डाउन मेनू से एक धीमी 50 kHz पढ़ने के लिए मोड और 4-मिन जोखिम के साथ 4 x 4 बिन्नी सेट. यह सुनिश्चित करें कि पठन-आउट मोड धीमी 50 kHz मोड पर सेट किया गया है, जो पढ़ने-आउट शोर को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है bioluminescent प्रकाश उत्सर्जित करने का पता लगाने के लिए ।
    2. "बहु-आयामी डीकॉक" विंडो खोलें, पुल-डाउन मेनू से प्रतिदीप्ति चैनलों और एक तेजी से 1 मेगाहर्ट्ज रीडिंग आउट मोड का चयन करें और 400 ms एक्सपोज़र के साथ 2 x 2 बिन्नी सेट । सुनिश्चित करें कि पठन-आउट मोड प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए तेज़ 1 MHz मोड पर सेट है ।
    3. "मोल" बटन पर क्लिक करके समय चूक रिकॉर्डिंग शुरू.
  6. इस प्रकार के रूप में छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा समय चूक फिल्मों से luminescence चैनलों के एकल सेल निशान निकालें । सबसे पहले, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए छवि डेटा आयात करके luminescence और प्रतिदीप्ति ढेर छवियों बनाओ । luminescence छवियों के लिए, अस्थायी आसंन छवियों में पिक्सल की तीव्रता की तुलना करके लौकिक किरणों से व्युत्पंन गर्म पिक्सल को हटा दें, पिछले और अगले फ्रेम के लौकिक औसत को पिक्सेल मूल्यों की जगह ("SpikeNoise फिल्टर" के रूप में कार्यान्वित), इन संसाधित छवियों को स्थानिकी रूप से स्मूथ करने वाले फ़िल्टर पर लागू करें और प्रत्येक फ़्रेम से आउट-फ़ील्ड दृश्यों की पृष्ठभूमि पिक्सेल मानों को घटाएँ. फिर, प्रत्येक समय बिंदु पर एक फ्लोरोसेंट छवि पर प्रत्येक कोशिका के लिए ब्याज की एक "क्षेत्र" (roi) का निर्धारण, luminescent छवियों पर रॉय लागू करते हैं, और प्रत्येक रॉय के luminescent तीव्रता को मापने.

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Representative Results

हम अनुकूलित LightOn प्रणाली11,12, जो स्तनधारी कोशिकाओं में फोटो प्रेरित जीन अभिव्यक्ति सक्षम बनाता है, 2 के साथ आनुवंशिक oscillators के अध्ययन के लिए 3-एच आवधिकता. इस प्रणाली के दो भागों के शामिल हैं: फोटो-inducible transcriptional उत्प्रेरक hGAVPO और एक यूएएस-प्रमोटर कैसेट ब्याज की मनमानी जीन की प्रतिलिपि ड्राइव । फोटो-प्रेरित जीन अभिव्यक्ति के गुणवाला कैनेटीक्स में तेजी लाने के लिए यूएएस-प्रवर्तक कैसेट में polyA अनुक्रम को murine Hes1 ३ ' UTR द्वारा प्रतिस्थापित किया गया, जो mRNA आधा जीवन को murine fibroblasts में २० मिनट तक छोटा कर देता है.

स्थिर सेल लाइन स्थापित करने के लिए, Tol2 transposase सिस्टम पर आधारित त्रि-cistronic वैक्टर13 (चित्र 1a) का प्रयोग किया गया । Tol2 अभिव्यक्ति वेक्टर प्लाज्मिड कैसेट्स के गुणसूत्र एकीकरण की दक्षता को बढ़ाने के लिए आवश्यक है14. उन वैक्टर न केवल प्रकाश की अभिव्यक्ति कैसेट ले-inducible यूएएस द्वारा संचालित जीन-प्रमोटर लेकिन यह भी फोटो के प्रति संवेदनशील प्रोटीन hGAVPO और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति कैसेटों (iRFP71315 या mCherry) । इस डिजाइन हमें कोशिकाओं है कि प्रभावी रूप से मेजबान जीनोम में plasmids एकीकृत की आबादी को शुद्ध करने के लिए अनुमति दी ।

हम नीले प्रकाश रोशनी पर Dll1 ligand प्रोटीन का उत्पादन है कि फोटो के प्रति संवेदनशील प्रेषक कोशिकाओं की स्थापना की (चित्रा 2a). यह अंत करने के लिए, एक Tol2 सिस्टम-आधारित द्वि-cistronic वेक्टर (pAI218) का उपयोग किया गया था । प्रकाश रोशनी पर Dll1 ligand की प्रेरण की जांच करने के लिए, कोशिकाओं क्रमादेशित एलईडी नीले प्रकाश आंकड़ा 1b और 1Cमें दिखाए गए स्रोतों से सुसज्जित मशीन में संस्कृति थे । पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण द्वारा पाया फोटो प्रेरित Dll1 प्रोटीन अभिव्यक्ति गतिशीलता के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2 बी और 2cमें दिखाए जाते हैं ।

कोशिकाओं है कि संकेत आदानों का जवाब स्थापित करने के लिए, हम एक Tol2 प्रणाली आधारित द्वि-cistronic वेक्टर (pAI177) पायदान प्रभाव जीन Hes1 और phosphoglycerate के प्रवर्तक के नियंत्रण में अस्थिर luciferase संवाददाता ले जाने के लिए इस्तेमाल किया कळेनासे (PGK) प्रवर्तक चालित नाभिक-स्थानीयकृत रेड फ्लोरोसेंट रिपोर्टर H2B-mCherry । इस मामले में, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर दोनों शुद्धि और समय चूक माइक्रोस्कोपी में एक सेल ट्रैकिंग के लिए उपयोगी है ।

एक बार फोटो-inducible प्रेषक कोशिकाओं और रिसीवर कोशिकाओं को सफलतापूर्वक स्थापित कर रहे हैं, यह सह द्वारा गतिशील प्रेषक रिसीवर परख प्रदर्शन करने के लिए तैयार है-संवर्धन इन कोशिकाओं (चित्र 2a) । इस परख में, फोटो संवेदनशील प्रेषक कोशिकाओं है कि नीले प्रकाश रोशनी पर पायदान ligand प्रोटीन Dll1 व्यक्त सह रहे थे फोटो असंवेदनशील रिसीवर कोशिकाओं है कि अंतर्जात Hes1 थरथरानवाला ले और एक bioluminescence Hes1 रिपोर्टर के साथ संस्कृति ( pHes1-dLuc) (चित्र 2d) । रिसीवर कोशिकाओं endogenously पायदान रिसेप्टर, जो पड़ोसी कोशिकाओं द्वारा प्रस्तुत Dll1 के लिए उत्तरदायी है व्यक्त करते हैं.

गतिशील प्रेषक-रिसीवर परख के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2E और 2Fमें दिखाए जाते हैं । bioluminescence रिकॉर्डिंग के साथ रिसीवर कोशिकाओं के गतिशील प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए, हम पहले एक जीवित सेल निगरानी प्रणाली फोटॉन-गिनती और प्रकाश उत्तेजना के लिए एक एलईडी नीले प्रकाश स्रोत के लिए एक उच्च संवेदनशील फोटो गुणक ट्यूब (पीएमटी) के साथ सुसज्जित इस्तेमाल किया ( चित्र 1 d) । यह प्रणाली अनुसूचित प्रकाश रोशनी के साथ जनसंख्या के स्तर पर bioluminescence संकेतों की वास्तविक समय रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है । जब कोशिकाओं के इन दो प्रकार के सह-संस्कृति और दोहराव प्रकाश रोशनी (30 एस अवधि, 2.5 एच अंतराल) को उजागर किया गया, रिसीवर कोशिकाओं के चक्रीय प्रतिक्रियाओं मिश्रण अनुपात (चित्रा 2E) की विभिन्न स्थितियों में detectable थे. इस उदाहरण में, हमने शोर संकेतों को क्षीण करने के लिए Savitzky-Golay फ़िल्टरिंग (4th क्रम और एक 13 डेटा-पॉइंट विंडो) लागू की । दोहराव प्रकाश रोशनी के साथ समय चूक माइक्रोस्कोपी (2 मिनट की अवधि, 2.75 एच अंतराल) भी एकल-कक्ष स्तर पर रिसीवर कोशिकाओं के सिंक्रनाइज़ प्रतिक्रियाओं का पता चला (ग्रे लाइनों में चित्रा 2F) और जनसंख्या स्तर पर (लाल रेखा में आंकड़ा 2F) । इन आंकड़ों का सुझाव है कि प्रेषक कोशिकाओं में Dll1 प्रोटीन की चक्रीय अभिव्यक्ति पड़ोसी रिसीवर कोशिकाओं में Hes1 दोलनों सिंक्रनाइज़ करने के लिए पर्याप्त है ।

Figure 1
चित्रा 1: optogenetic perturbations पर सेलुलर प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए रणनीति. (क) प्रतिनिधि प्लाज्मिड वैक्टर इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल की योजनाबद्ध । ये plasmids अनुरोध पर उपलब्ध हैं । (ख) एक 6-अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली के तहत एक नीली एलईडी डिवाइस के साथ सुसज्जित एक सह2 मशीन की एक तस्वीर । (ग) एक इलेक्ट्रिक सर्किट के योजनाबद्ध आरेख एलईडी प्रकाश स्रोत के लिए एक प्रोग्राम माइक्रो कंप्यूटर द्वारा बिजली की आपूर्ति को नियंत्रित करने के लिए । एक ठोस राज्य रिले (एसएसआर) पर रिले करने के लिए सेट किया गया था/ऑफ डिजिटल पिन-बाहर के राज्यों के लिए माइक्रो कंप्यूटर के बाहर एलईडी लाइट स्रोत के राज्यों/ (घ) एक तस्वीर और एक जीवित सेल bioluminescence निगरानी प्रणाली की योजनाबद्ध । मोटर चालित चरण PMT डिटेक्टर एलईडी प्रकाश स्रोत के शीर्ष पर एक रोशनी की स्थिति के लिए एक रिकॉर्डिंग की स्थिति से unidirectionally स्थानांतरित कर सकते हैं कि ध्यान दें. साथ ही, ध्यान दें कि PMT डिटेक्टर अच्छी तरह से करने के लिए व्यक्तिगत कुओं से संकेतों पर नजर रखने के लिए स्थानांतरित कर सकते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: optogenetic गड़बड़ी प्रयोगों के उदाहरण. इन उदाहरणों में murine C2C12 myoblast कक्ष रेखाओं का उपयोग किया गया था । (क) गतिशील प्रेषक की योजनाबद्ध-रिसीवर परख । (ख, ग) प्रकाश प्रेरित Dll1 अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि परिणाम पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया । Dll1 प्रोटीन एक 2.5 ज अवधि, 2 मिनट की अवधि और 24.7 डब्ल्यू की तीव्रता के साथ आवधिक प्रकाश रोशनी से प्रेरित थे/ (घ) प्रेषक और रिसीवर कोशिकाओं की सह-संस्कृति प्रणाली की प्रतिदीप्ति छवि । (E, F) गतिशील प्रेषक के प्रतिनिधि परिणाम-रिसीवर परख । (ङ) रहते सेल निगरानी प्रणाली द्वारा दर्ज की गई रिसीवर प्रतिक्रियाओं के लौकिक पैटर्न PMT के साथ सुसज्जित. कुल सेल संख्या 1.5 x 105 कोशिकाओं के लिए तय किया गया था, लेकिन प्रेषकों और रिसीवर के बीच अनुपात 5:1 से 1:2 वितरित किया गया । (एफ) एकल सेल इमेजिंग कि थरथरानवाला जानकारी है, जो आवधिक प्रकाश रोशनी (2 मिनट की अवधि, 2.75 एच अंतराल) द्वारा प्रेरित किया गया था पता चला, प्रेषक से रिसीवर कोशिकाओं को हस्तांतरित किया गया था । 5:1 के प्रेषक-रिसीवर अनुपात के साथ 1.5 x 105 कक्षों का उपयोग किया गया । रेफरी .10 से अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हम 2 से 3 एच के एक आवधिक के साथ जीन अभिव्यक्ति गतिशीलता को नियंत्रित करने के लिए एक विधि से पता चला । इस समय पैमाने पर Tet-On प्रणाली और मूल LightOn प्रणाली सहित अंय पारंपरिक प्रणालियों में लोगों की तुलना में बहुत कम है । ultradian समय-तराजू तक पहुंचने के लिए कुंजी पैरामीटर फोटो प्रेरित आणविक उत्पादों, mRNAs, और प्रोटीन के आधे जीवन हैं । इन काइनेटिक मापदंडों सेल प्रकार और प्रजातियों पर निर्भर कर सकते हैं । कैनेटीक्स ट्यूनिंग के लिए, दूसरों के साथ Hes1 3 ' UTR दृश्यों की जगह एक सीधे आगे रास्ता है, क्योंकि यह अनुक्रम और लक्ष्य प्रोटीन के कार्यों में परिवर्तन नहीं करता है । अन्य 3 ' UTRs की मांग के लिए ब्याज की विशेष कोशिकाओं में वांछनीय गुणवाला पैटर्न प्राप्त करने के लिए, प्रकाश प्रेरण द्वारा dLuc के लाइव सेल की निगरानी एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है और स्क्रीनिंग और सत्यापन के लिए इस्तेमाल किया.

अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्नों में से एक प्रकाश के प्रति संवेदनशील कोशिकाओं के दैनिक हैंडलिंग के बारे में है । गतिशील प्रेषक-संकेतन पायदान के रिसीवर परख के मामले में, हम कक्ष रोशनी के तहत दैनिक सेल मार्ग करने में सक्षम थे, क्योंकि हमारे सिस्टम (फोटो-inducible dLuc या Dll1 कोशिकाओं और रिसीवर कोशिकाओं) सेल प्रसार को बदल नहीं है और जल्दी से आराम करने के लिए वापस 6 घंटे के भीतर राज्यों के बाद कोशिकाओं को एक अंधेरे हालत में ले जाया जाता है । यदि ब्याज की जीन भाग्य निर्धारण कारक हैं, टपका हुआ अभिव्यक्ति सेलुलर भेदभाव पैदा कर सकते हैं या कोशिकाओं के विस्तार को रोकने, और इसलिए यह एक लाल बत्ती पर्यावरण के दौरान अवांछनीय optogenetic गड़बड़ी से बचने के लिए स्थापित करने के लिए आवश्यक है सेल हैंडलिंग ।

इस प्रोटोकॉल में, हम प्रक्रिया प्रस्तुत करने के लिए फोटो के साथ स्थिर सेल लाइनों-inducible जीन अभिव्यक्ति कैसेट उत्पंन करते हैं । इस गतिशील प्रेषक में विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम-रिसीवर परख है । एक optogenetic मॉड्यूल की कोशिकाओं में परिचय के लिए क्षणिक अभिकर्मक विचार कर सकते हैं, लेकिन यह अच्छी तरह से ultradian दालों की मात्रात्मक माप के लिए हमारे हाथ में काम नहीं करता है. हमने पाया है कि क्षणिक अभिकर्मक plasmids ले जाने के यूएएस-प्रवर्तक कैसेट अपेक्षाकृत उच्च स्तर पर भी एक अंधेरे हालत में टपका हुआ अभिव्यक्ति की ओर जाता है । इस टपका हुआ अभिव्यक्ति किसी भी प्रकाश उत्तेजना के बिना एक उच्च पृष्ठभूमि का कारण बनता है और समय-पाठ्यक्रम की एक विश्वसनीय माप बाधित. स्थिर कक्षों को स्थापित करने के लिए एक वैकल्पिक पद्धति एक lentivirus सिस्टम है, जो अभिकर्मक12के लिए उपयुक्त नहीं है जो कक्ष प्रकारों के लिए उपयोगी है । क्लोनल सेल लाइनों विषम कोशिका लाइनों की तुलना में अधिक सजातीय प्रतिक्रियाओं वर्तमान, लेकिन यहां तक कि एक क्लोनल जनसंख्या में, सेल प्रतिक्रियाओं हमेशा वर्दी नहीं हैं: कुछ कोशिकाओं को प्रकाश उत्तेजना का जवाब नहीं है और इसलिए प्रकाश प्रेरित के एक वितरित स्तर उपस्थित प्रोटीन अभिव्यक्ति । यह hGAVPO प्रोटीन और/या फ्लेविन के चर अंतर्जात बहुतायत, एक hGAVPO के प्रकाश संवेदन के लिए आवश्यक chromophore के चर अभिव्यक्ति के स्तर के कारण हो सकता है ।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल जीन अभिव्यक्ति गतिशीलता के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है, लेकिन कुछ सीमाएं हैं । एक खामी यह है कि लाइव सेल माइक्रोस्कोपी के लिए कुछ प्रतिदीप्ति चैनल नीली बत्ती उत्तेजना के साथ संगत नहीं हैं । नीले प्रकाश रोशनी न केवल नीले प्रकाश संवेदनशील प्रोटीन पर भी फ्लोरोसेंट प्रोटीन, हरे और पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFPs और YFPs), जो फोटो-ब्लीच करने के लिए अतिसंवेदनशील होते है सहित सक्रिय करता है । इसके विपरीत, GFP के दृश्य में नीले प्रकाश उत्तेजना की आवश्यकता होती है जो फ्लोरोसेंट छवियों पर कब्जा करने के दौरान फोटो-संवेदी कोशिकाओं के अवांछनीय सक्रियण को ट्रिगर कर सकती है । उज्ज्वल-क्षेत्र (चरण विपरीत) परिवेश प्रकाश स्रोत द्वारा इमेजिंग भी नीले प्रकाश optogenetic प्रयोगों के साथ असंगत है, लेकिन एक हरी या अब लहर-इमेजिंग के लिए लंबाई प्रकाश स्रोतों का उपयोग करके इस समस्या को दरकिनार कर सकते हैं ।

गतिशील प्रेषक-रिसीवर परख अंय संकेतन रास्ते की जांच के लिए उपयोगी होगा । एक संभावना स्रावित प्रणालियों के लिए एक आवेदन पत्र है । इस तरह के विश्लेषण के लिए, सूक्ष्म द्रवित उपकरणों में शुद्ध लाइगैंडों लागू करने के लिए एक सटीक लौकिक तरीके से रिसीवर कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका है16,17. हालांकि, उन दृष्टिकोण प्रेषक कोशिकाओं में ligand अणुओं की गतिशील उत्पादन प्रक्रियाओं के लिए दुर्गम हैं । फोटो-inducible ligand अभिव्यक्ति के साथ गतिशील प्रेषक-रिसीवर परख को रोजगार प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को प्रेषक से संकेत संचरण के आगे विच्छेदन की अनुमति होगी ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम JST, सफ़ाई (एअर इंडिया), विकास विज्ञान और प्रौद्योगिकी (JPMJCR12W2 (आर.)) के लिए कोर अनुसंधान, अनुदान में सहायता अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए (शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान, और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (MEXT), जापान द्वारा समर्थित किया गया २६११९७०८ (ai) और 16H06480 (आर. ए.)), वैज्ञानिक अनुसंधान (ए) (विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (JSPS) २४२४००४९ (आर.)), और युवा वैज्ञानिकों (ए) (JSPS 15H05326 (एअर इंडिया)), और एक अनुदान में नवाचारी क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता "प्रतिदीप्ति MEXT, जापान के लाइव इमेजिंग ", और MEXT, जापान से रहने वाले सिस्टम के लिए गतिशील दृष्टिकोण के लिए मंच ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FACS Becton, Dickinson and Company FACSAriaII SORP
Camera Andor iKon M-934
Microscope Olympus IX-81 ZDC
PMT device Churitsu eletric corp. CL24B-LIC/B
Blue LED illuminator OptoCode LEDB-SBOXH
DMEM Nacalai 08459-35
Penicillin-streptomycin Nacalai 26253-84
Fetal bovine serum Sigma 172012
KRYSTAL24 (black 24 well plate ) Hi-tech 303012
D-Luciferin Potassium Salt Nacalai 20028-24
Light meter LI-COR Biosciences LI-250A
anti-HA-Peroxidase antibody Roche clone 3F10
anti-Actin-Peroxidase antibody Wako clone 2F3

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References

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आनुवंशिकी अंक 133 optogenetic विधि रीयल टाइम इमेजिंग luciferase रिपोर्टर GAVPO थरथरानवाला अभिव्यक्ति पायदान संकेतन
एक Optogenetic विधि को नियंत्रित करने और सेल में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने वाली सेल बातचीत
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Isomura, A., Kageyama, R. An… More

Isomura, A., Kageyama, R. An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions. J. Vis. Exp. (133), e57149, doi:10.3791/57149 (2018).

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