Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a transferência de célula a célula de informação oscilatória pelo controle de optogenetic e viver monitoramento da expressão do gene. Essa abordagem fornece uma plataforma única para testar um significado funcional dos programas de expressão do gene dinâmico em sistemas multicelulares.
Abstract
Células devem responder corretamente a temporalmente mudar ambientes, que são influenciadas por diversos fatores do entorno de células. O via de sinalização Notch é um dos tais máquinas moleculares essenciais para comunicação célula a célula, que tem um papel chave no desenvolvimento normal de embriões. Este caminho envolve uma transferência de célula para célula de informação oscilatória com ritmos ultradian, mas apesar do progresso em técnicas de biologia molecular, tem sido desafiador para elucidar o impacto das interações multicelulares no gene oscilatório dinâmica. Aqui, apresentamos um protocolo que permite o controle de optogenetic e monitoramento ao vivo de padrões de expressão de gene de forma temporal precisa. Esse método com êxito revelou que o intracelulares e intercelulares entradas periódicas de sinalização Notch entrain oscilações intrínsecas por ajuste de frequência e fase de deslocamento para a resolução de célula única. Esta abordagem é aplicável para a análise das características dinâmicas de várias vias de sinalização, fornecendo uma plataforma única para testar um significado funcional dos programas de expressão do gene dinâmico em sistemas multicelulares.
Introduction
Comunicação célula a célula desempenham um papel crítico na padronização embrionária em processos de desenvolvimento. Em embriões de vertebrados, as estruturas metameric chamadas somitas são formadas ao longo do eixo ântero-posterior corpo, com uma precisão temporal precisa sob o controle de um relógio de tempo de manutenção, o relógio de segmentação1. Durante este processo, um grupo de células mesoderm presomitic (PSM) periodicamente são convertidos em somitas de forma síncrona. Este processo envolve a expressão de gene oscilatório sincronizada e células PSM que oscilam em fase formam as mesmas somitas. O período da expressão gene oscilatório é cerca de 2 a 3 h em camundongos e cerca de 30 min no zebrafish. Quando dissociado, células PSM perdem a sincronia de2,3, mas quando eles são re-agregados, podem se auto-organizar e recuperar a população sincronia4, sugerindo que o acoplamento de celular é uma chave para o sincronizado oscilações.
Extensos esforços revelaram que moléculas sinalizadoras na via Notch-Delta estão firmemente conectadas a oscilações sincronizadas dos genes do tempo de segmentação. Ou inibidores farmacológicos ou mutações genéticas de sinalização Notch desynchronize a população dos osciladores. No zebrafish, mutantes de entalhe sinalização componentes, tais como DeltaC, DeltaD e Notch1a, exibem oscilações assíncronas5,6. Em embriões de pintinho ou mouse, não só o ligante de entalhe Delta-like1 (Dll1), mas também o entalhe modulador Lunatic fringe (Lfng) é necessária para oscilações sincronizadas7,8,9. No entanto, tem sido difícil testar a capacidade funcional de tais moléculas para transferência de informação dinâmica de uma célula para outra, porque resoluções temporais de perturbação convencional da dinâmica de regulamento do gene não foram suficientes para investigar o processos de escalas de tempo de 2 – 3 h (ritmos ultradian).
Recentemente desenvolvemos um método integrado para controlar e monitorar padrões de expressão de gene em células de mamíferos,10. Esta tecnologia permite que a indução de pulsos de expressão do gene por iluminação periódica em escalas de tempo ultradian. Este protocolo representa os métodos para estabelecer linhas de células fotossensíveis e observar respostas dinâmicas de células repórter por viver-pilha luminescência monitoramento nos contextos de comunicação célula a célula. Este método é aplicável para a análise de muitas outras vias de sinalização.
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Protocol
1. geração de linhas de célula estável pelo sistema Tol2
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Transfect vetores do plasmídeo (figura 1A) de módulos baseados em Tol2 optogenetic juntamente com o vetor de expressão transposase (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) em células de C2C12. Em todas as etapas, as células de cultura com meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e penicilina-estreptomicina a 37 ° C (tabela 1), na presença de 5% CO2, caso contrário indicado.
- Conte células trypsinized com um contador de célula e placa de 5 x 104 C2C12 células por poço em uma placa de 12 um dia antes do transfection.
- Co transfect 0,375 μg de vetores baseados em Tol2 optogenetic (pAI177 ou pAI218), 0.125 μg de um vetor de seleção de drogas (pAI170) e 0.5 μg de vetor de pCAGGS-mT2TP usando o reagente de lipofection.
- Trypsinize células transfectadas e placa-los em pratos de cultura de 100 mm, um dia depois do transfection.
- Troca de meio de cultura para células transfectadas com meio de cultura suplementado com 100 mg/mL hptII.
- Células de cultura por 3 dias para eliminar as células transfectadas un. Note-se que a mudança média não é necessária.
- Trypsinize células transfectadas e purificar a uma população de células expressando proteínas fluorescentes para a seleção. Para as células do receptor carregando pAI177, defina o classificação portão ao canal verde-PE para a purificação da população celular mCherry-positivo. Para as células foto-sensíveis ao remetente carregando pAI218, conjunto o portão classificação para canal APC para a purificação da população celular iRFP713-positivo.
- (opcional) Estabelece uma população clonal de célula por métodos padrão, tais como diluição limitada ou célula única classificação por FACS.
2. avaliação de foto-sensibilidade das células projetadas a nível da população
Nota: Esta parte descreve um protocolo para verificar a dinâmica da indução de proteínas de ligante Dll1 com luz azul iluminação pelos ensaios bioquímicos, tais como qPCR e mancha ocidental.
- Configurar dois tipos de incubadoras com ou sem fontes de luz para uma condição induzida por luz ou uma condição de escura, respectivamente. Set-up-intensidade de luz de um LED azul trans-iluminador, como mostrado na figura 1B, usando um medidor de luz. Horários do programa e a duração da iluminação por carregar um script de controle para um microcontrolador de placa única que permite horários programáveis para iluminação (Figura 1).
- Contar células trypsinized com um contador de célula e placa de 1,0 x 105 remetente foto-sensível células carregando pAI218 e pAI170 em pratos de plástico cultura de 35 mm de diâmetro (mais de 12 pratos para condição de luz e 1 prato para condição de escuro) e definir os pratos separar incubadoras para condições de claro/escuro. Após a criação de pratos, manter portas das incubadoras fechadas até coletando lisados celulares.
- Dias de um ano e meio depois de chapeamento, começar a iluminação (células espera-se que mais de 80% confluentes). Não exponha as células à luz para evitar indesejáveis de foto-estimulação.
Nota: Horários para iluminação depende da finalidade de experimentos. Observe que uma condição de iluminação sustentado (ex. 1-min duração e 10 min de intervalo com 40 µmol/m2/s-intensidade de luz) é suficiente para a verificação simples do foto-indução e essa iluminação forte é prejudicial para as células. Assim, certifique-se que inofensivo parâmetros para iluminação são selecionados. - Cerca de 2 dias após o chapeamento, prepare célula-lisado com intervalos de 30 minutos. Se provar pratos de incubadoras no gelo e começar a preparar lisados celulares para posterior análise.
3. dinâmica do remetente-receptor ensaio a nível de população: monitoramento em tempo real de respostas celulares após estimulação óptica por PGTO
- Trypsinize e contar o número de remetente e as células do receptor com métodos padrão. Prepare um volume total de 1 mL da mistura a suspensão de 2.5 x 104 receptor e 1,25 x 105 células de remetente (proporção de 1:5).
Nota: 2:1, 1:1, ou 1:2 rácios de remetente-receptor também trabalham com um número de celular total de 1,5 x 105. 10 - Prato misturada de células em cada poço de 24-poço pretos placas com meio de cultura contendo Luciferina de 1 mM.
- Analisar as células no leitor de placas para ensaio de luciferase e confirmar que os sinais de saída não são demasiado elevados para o sistema de gravação.
Nota: Se os sinais de saída são superiores a 1 x 106 fóton contagens/s, eles podem ser saturados. Nesse caso, reduza a concentração de Luciferina de valores ótimos para que os sinais de saída são inferiores a 1 x 106 fóton contagens/s. - Coloque a placa sobre o sistema de gravação e iniciar um programa de gravação (Figura 1). Por exemplo, inicie a iluminação às 18 h, depois de definir a gravação.
Nota: Filtragem Temporal, tais como sinais detrending com móveis em média e Savitzky-Golay, filtragem, são úteis para visualização das formas de onda e detecções de pico.
4. ensaio de remetente-receptor dinâmico a nível de célula única: em tempo real imagens de célula única respostas sob o controle de Optogenetic das perturbações
- Placa de 0,5 x 105 receptor e 2,5 x 105 células de remetente para pratos de diâmetro de 27 mm-diâmetro-vidro-base de 35mm. Certifique-se de que proporções de mistura e um número de celular total (uma densidade de célula) são ajustados corretamente.
- Um dia depois de chapeamento, trocar o meio com 2 mL de meio de gravação (vermelho de fenol livre DMEM suplementado com 5% FBS, penicilina-estreptomicina e Luciferina de 1mm) e definir o prato de vidro-base no microscópio. Se necessário, lave os restos de células mortas com PBS (-).
Nota: É preferível fazer esta etapa em uma condição de escura. - Configure um microscópio invertido equipado com uma câmara ambiental em 37 ° C e 5% de CO2.
- Colocar uma câmera CCD resfriada. Certifique-se de que a temperatura do sensor CCD é refrigerada para baixo para o valor de destino (normalmente, de-90 ° C).
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Definir parâmetros para a janela de "Multi-Dimensional Timelapse" no software de aquisição automático para capturar imagens com intervalos de 5 min e mais de 288 vezes (mais do que uma gravação durante a noite).
- Abra a janela "Timelapse multi-dimensional", selecione um canal de luminescência e um modo de leitura de 50 kHz lento no menu suspenso e conjunto 4x4 binning com exposição de 4 min. Certifique-se de que o modo de leitura é definido como o modo lento de 50 kHz, que é fundamental para reduzir ruídos de leitura para detectar fracamente emitindo luz bioluminescente.
- Abra a janela "Timelapse multi-dimensional", selecione o menu pull-down canais de fluorescência e de um modo rápido de leitura de 1 MHz e defina 2x2 binning com exposição de 400 ms. Certifique-se de que o modo de leitura é definido como o modo rápido de 1 MHz para reduzir o tempo necessário para a imagem latente de fluorescência.
- Inicie o lapso de tempo de gravação clicando o botão "Adquirir".
- Extrai monocelulares vestígios de canais de luminescência de lapso de tempo filmes pelo software de análise de imagem, como segue. Em primeiro lugar, fazer imagens de pilha de luminescência e fluorescência importando os dados de imagem de software de análise de imagem. Para imagens de luminescência, remover pixels quentes derivados de raios cósmicos, comparando as intensidades de pixels em imagens temporalmente adjacentes, substituindo os valores de pixel para a média temporal dos quadros anteriores e posteriores (implementado como "Filtro SpikeNoise"), aplicar estas imagens processadas a um filtro de suavização espacialmente e subtrair valores de pixel de fundo de out-field vistas de cada quadro. Em seguida, determinar uma "região de interesse" (ROI) para cada célula em uma imagem fluorescente em cada ponto de tempo, aplicar o ROI para imagens luminescentes, e medir a intensidade luminescente de cada ROI.
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Representative Results
Adaptamos o LightOn sistema11,12, que permite a expressão de foto-induzido do gene em células de mamíferos, para o estudo da genéticos osciladores com periodicidade de 2 a 3 h. Este sistema é composto por duas partes: a hGAVPO de foto-inducible ativador transcricional e uma gaveta de UAS-promotor para unidade da transcrição de genes arbitrários de interesse. Para acelerar a cinética pulsátil de expressão gênica induzida por foto, a sequência de polyA na gaveta UAS-promotor foi substituída por Hes1 murino 3' UTR, que encurta o Half-Life do mRNA para 20 min em fibroblastos murino.
Para estabelecer linhas de célula estável, tri-cistronic vetores baseados no sistema transposase Tol2 foi usado13 (figura 1A). O vetor de expressão Tol2 é essencial para melhorar a eficiência da integração cromossômica do plasmídeo cassettes14. Esses vetores de levar não só as fitas de expressão de genes luz-inducible conduzidos pelo promotor-UAS, mas também as fitas de expressão das proteínas de foto-sensível hGAVPO e fluorescentes proteínas (iRFP71315 ou mCherry). Este projeto permitiu-nos purificar uma população de células que efetivamente os plasmídeos integrados os genomas de anfitrião.
Estabelecemos as células foto-sensíveis ao remetente que produzem proteínas de ligante Dll1 sobre iluminação azul (Figura 2A). Para tal, utilizou-se um Tol2 baseado no sistema bi-cistronic vetor (pAI218). Para verificar a indução de ligante Dll1 sobre iluminação, as células foram cultivadas nas incubadoras equipadas com fontes de luz azul LED programadas mostradas na figura 1B e 1C. Resultados representativos da foto-induzido Dll1 proteína expressão dinâmica detectado pela análise de mancha ocidental são mostrados na Figura 2B e 2C.
Para estabelecer as células que respondem ao entalhe sinalização entradas, usamos um Tol2 baseado no sistema bi-cistronic vetor (pAI177) carregando o repórter do luciferase desestabilizado sob o controle do promotor do gene de efetor da entalhe Hes1 e o fosfoglicerato quinase (PGK) orientado para o promotor núcleos-localizada vermelho fluorescente repórter H2B-mCherry. Neste caso, o repórter fluorescente é útil tanto para purificação e única célula de rastreamento na microscopia de lapso de tempo.
Uma vez que as células foto-inducible do remetente e o receptor células são estabelecidas com sucesso, está pronto para realizar o ensaio dinâmico de remetente-receptor por co cultivo dessas células (Figura 2A). Neste ensaio, as células foto-sensíveis ao remetente que expressam a proteína ligante de entalhe Dll1 sobre iluminação de luz azul foram co cultivadas com as células do receptor foto-insensível que carregam o oscilador Hes1 endógeno e uma bioluminescência Hes1 repórter ( pHes1-dLuc) (Figura 2D). As células do receptor endogenamente expressam o receptor do entalhe, que é sensível ao Dll1 apresentados pelas células vizinhas.
Resultados representativos dos ensaios dinâmicos remetente-receptor são mostrados na Figura 2E e 2F. Para detectar as respostas dinâmicas de células do receptor com gravação de bioluminescência, primeiro usamos um sistema de monitoramento ao vivo-celular equipado com um tubo foto-multiplicador do elevado-sensível (PMT) para contagem de fótons e uma fonte de luz azul LED para estimulação luminosa ( Figura 1). Este sistema permite a gravação em tempo real de sinais de bioluminescência em nível de população com iluminação programada. Quando estes dois tipos de células foram cultivados co e expostos a iluminação repetitiva (30 s de duração, intervalos de 2,5 h), respostas cíclicas das células do receptor foram detectáveis em várias condições de mistura rácios (Figura 2E). Neste exemplo, nós aplicamos Savitzky-Golay filtragem (ordem 4th e uma janela de dados-ponto 13) para atenuar os sinais ruidosos. Microscopia de lapso de tempo com iluminação repetitiva (duração de 2 min, intervalos de 2,75 h) também revelou as respostas sincronizadas das células do receptor a nível de célula única (linhas cinzas na Figura 2F) e a nível de população (linha vermelha no Figura 2F). esses dados sugerem que a expressão cíclica de Dll1 proteína nas células do remetente é suficiente para sincronizar Hes1 oscilações na vizinha células do receptor.
Figura 1: estratégia para analisar respostas celulares sobre as perturbações optogenetic. (A) esquema de vetores de plasmídeo representante usado para este protocolo. Estes plasmídeos estão disponíveis mediante pedido. (B) uma foto de uma incubadora de CO2 equipada com um dispositivo LED azul sob uma placa de cultura de células de 6-poços. (C) diagrama esquemático de um circuito elétrico de controle poder fornecer para a fonte de luz LED por um microcomputador programável. Um relé de estado sólido (SSR) foi definido para retransmitir a Estados de pino-saída digital do microcomputador de Estados da fonte de luz LED para ligar/desligar para ligar/desligar. (D) uma foto e o esquema de uma célula viva bioluminescência sistema de monitoramento. Observe que o palco motorizado pode mover unidirecionalmente de uma posição de gravação na parte superior do detector de PGTO para uma posição de iluminação na parte superior da fonte de luz LED. Além disso, observe que o detector de PGTO pode mover de bem para bem para monitorar os sinais de poços individuais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: exemplos de experimentos de perturbação de optogenetic. Nestes exemplos, murino linhas de células de myoblast de C2C12 foram usadas. (A) esquema do ensaio dinâmico remetente-receptor. (B, C) Resultados representativos de induzida por luz Dll1 expressão analisada pela análise de mancha ocidental. Dll1 proteínas foram induzidas por iluminação periódica com um período de 2,5 h, 2 min de duração e a intensidade de 24.7 W/m2. (D) imagem de fluorescência do sistema co-cultura de células de remetente e destinatário. (E, F) Resultados representativos do ensaio dinâmico remetente-receptor. (E) os padrões temporais de respostas receptor gravados pelo sistema de monitoramento ao vivo-celular equipado com o pgto. Fixou-se o número total de 1,5 x 105 células, mas as relações entre os remetentes e os receptores foram distribuídas de 5:1 a 1:2. (F) a imagem de célula única revelou que informações oscilatórias, que foi induzidas por iluminação periódica (duração de 2 min, intervalos de 2,75 h), foi transferida do remetente para células do receptor. utilizaram-se 1,5 x 105 células com proporção de 5:1 remetente-para-receptor. Adaptado de ref. 10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós mostramos um método para controlar a dinâmica de expressão de gene com uma periodicidade de 2 a 3 h. Esta escala de tempo é muito mais curta do que os de outros sistemas convencionais, incluindo o sistema de Tet-no e o sistema de luz original. Parâmetros-chave para alcançar os prazos ultradian são meias-vidas de foto-induzido moleculares produtos mRNAs e proteínas. Estes parâmetros cinéticos podem depender de espécies e tipos de células. Para afinar a cinética, substituir sequências Hes1 3' UTR com os outros é uma maneira simples e direta, porque isto não muda as sequências e funções de proteínas do alvo. Para a busca de outros 3' UTRs para obter desejável pulsátil padrões, em particular, as células de interesse, viver-pilha monitoramento de dLuc por indução de luz é um bom ponto de partida e usado para triagem e validação.
Uma das perguntas mais frequentes é sobre o tratamento diário de células sensíveis à luz. No caso do ensaio dinâmico de remetente-receptor da sinalização Notch, fomos capazes de fazer diariamente passagens de célula sob as luzes da sala, porque nossos sistemas (foto-inducible dLuc ou Dll1 células e células do receptor) não alteram a proliferação celular e retornar rapidamente ao repouso Estados dentro de 6 horas depois que as células são movidas para uma condição de escura. Se os genes de interesse são fatores de destino-determinação, expressão gotejante pode induzir a diferenciação celular ou evitar expansões das células, e, portanto, é essencial criar um ambiente de luz vermelha para evitar perturbação indesejável optogenetic durante manipulação de células.
Neste protocolo, apresentamos os procedimentos para gerar linhas de células estáveis com fitas de expressão do gene induzida em foto. Este é um passo fundamental para obter resultados fiáveis no ensaio dinâmico remetente-receptor. Se pode considerar transfecção transiente para a introdução de módulos de optogenetic nas células, mas ele não funciona bem em nossas mãos para medições quantitativas de pulsos ultradian. Encontramos esse transfection transiente de plasmídeos carregando leva de cassettes UAS-promotor a expressão gotejante níveis relativamente elevados, mesmo sob uma condição de escura. Essa expressão gotejante faz com que um fundo elevado sem qualquer estimulação luminosa e dificulta uma mensuração fiável do tempo-curso. Um método alternativo para estabelecer células estáveis é um sistema de lentivirus, que é útil para os tipos de células que não são adequados para transfeccao12. Linha celular clonal apresenta respostas mais homogéneas do que linhas celulares heterogêneas, mas mesmo em uma população clonal, respostas de célula não são sempre uniformes: algumas células não respondem à estimulação de luz e, portanto, apresentar uma distribuídos os níveis de luz induzida expressão da proteína. Isto pode ser devido a níveis de expressão variável de hGAVPO proteínas e/ou variável endógena abundância de flavin, um cromóforo necessário para detecção de luz de hGAVPO.
O protocolo apresentado aqui fornece uma ferramenta poderosa para a análise da dinâmica de expressão do gene, mas existem algumas limitações. Uma desvantagem é que alguns canais de fluorescência para microscopia de viver-pilha não são compatíveis com estimulação de luz azul. Luz azul iluminação ativa não só as proteínas azul-luz-sensível, mas também proteínas fluorescentes, incluindo verdes e amarelas fluorescentes proteínas (GFPs e YFPs), que são suscetíveis a foto-branqueamento. Pelo contrário, visualização de GFP exige da excitação da luz azul que pode desencadear indesejáveis da ativação de células foto-sensíveis durante a captura de imagens fluorescentes. Bright-campo (contraste de fase) de imagem pela fonte de luz também é incompatível com os experimentos de optogenetic de luz azul, mas um pode contornar esse problema usando fontes de luz de comprimento de onda verde ou mais longo para o tratamento de imagens.
O ensaio dinâmico de remetente-receptor seria útil para investigar outras vias de sinalização. Uma possibilidade é um aplicativo para segregar sistemas de sinalização. Para tais análises, aplicar ligands purificadas em dispositivos de microfluídico é uma forma alternativa para estimular as células do receptor em uma maneira temporal precisa de16,17. No entanto, essas abordagens são inacessíveis para processos de produção dinâmica de moléculas de ligante em células de remetente. Empregar o ensaio dinâmico de remetente-receptor juntamente com expressão de foto-inducible ligante permitiria mais dissecação da transmissão do sinal de remetente para células do receptor.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela JST, PRESTO (I.A.), núcleo de pesquisa de evolutivo de ciência e tecnologia (JPMJCR12W2 (RK)), subsídio para a investigação científica em áreas inovadoras (Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT), Japão 26119708 (I.A.) e 16 H 06480 (RK)), científico (A) (Japão sociedade para a promoção da ciência (JSPS) 24240049 (RK)), a pesquisa e jovens cientistas (A) (JSPS 15 H 05326 (I.A.)) e um subsídio para a investigação científica em áreas inovadoras "fluorescência Ao vivo de imagem"do MEXT, Japão e plataforma para abordagens dinâmicas para viver sistema do MEXT, Japão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
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