Summary
여기, 우리 optogenetic 컨트롤의 진동 정보 셀 전송 분석 및 유전자 발현의 모니터링 라이브 프로토콜을 제시. 이 방법은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 합니다.
Abstract
셀은 일시적으로 셀 주변에서 다양 한 요인에 의해 영향을 환경 변화에 제대로 응답 해야 합니다. 노치 신호 전달 경로 같은 필수 분자 기계 셀 통신, 태아의 정상적인 발전에 핵심 역할 중 하나입니다. 이 통로 포함 ultradian 리듬, 진동 정보 셀을 전송 하지만 분자 생물학 기술에 있는 진도도 불구 하 고 그것은 되었습니다 도전 진동 유전자에 다세포 상호 작용의 영향을 명료 하 게 역학입니다. 여기, 우리는 optogenetic 제어 및 정확한 시간적으로 유전자 표현 패턴을 라이브 감시를 허용 하는 프로토콜을 제시. 이 메서드는 성공적으로 노치 신호의 세포내와 세포 주기 입력 기본 진동 주파수 튜닝 및 위상 단일 셀 해상도에서 이동 하 여 끌고가 다 밝혔다. 이 방식은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 하는 다양 한 신호 통로의 동적 특징의 분석에 적용 합니다.
Introduction
셀 통신 발달 과정에서 배아 패턴에 중요 한 역할을 재생합니다. 척추 동물 배아 metameric 구조 somites 라는 세분화 시계1시간 유지 시계의 통제 정확한 시간 정확도 이전 후부 몸 축 형성 된다. 이 과정 presomitic mesoderm (PSM) 세포의 그룹 동기 방식에서 somites로 주기적으로 변환 됩니다. 이 프로세스 동기화 진동 유전자 발현 포함 하 고 단계에 진동 하는 PSM 셀 같은 somites 형성. 진동 유전자 발현의 기간은 약 2 ~ 3 h 쥐와 제 브라에서 약 30 분입니다. 해리, PSM 셀 손실 synchrony2,3, 하지만 그들은 다시 집계 하는 때, 그들은 자체 구성 하 고 인구 synchrony4, 셀 커플링 하자는 동기화에 대 한 키 복구 진동입니다.
광범위 한 노력 델타-노치 통로 신호 분자 세분화 시계 유전자의 동기화 된 진동에 단단히 연결 되어 있는지 밝혀. 약리학 억제제 또는 노치 신호의 유전자 변이 발진기의 인구 desynchronize. Zebrafish, 노치 신호 구성 요소, DeltaC, DeltaD, Notch1a, 등의 돌연변이 비동기 진동5,6표시 합니다. 여자 또는 마우스 배아에서 노치 ligand 델타-like1 (Dll1) 뿐만 아니라 노치 변조기 미치광이 프린지 (Lfng)는 동기화 된 진동7,,89필요 합니다. 그러나 유전자 규칙 역학의 기존의 섭 동의 시간적 해상도 조사 하는 데 충분 하지 않았기 때문에, 그것은 셀을 동적 정보 전송에 대 한 이러한 분자의 기능 기능을 테스트 하기 어려운 되었습니다는 2-3 h (ultradian 리듬)의 계획의 프로세스.
최근 포유류 세포10제어 및 모니터 유전자 표현 패턴을 통합된 방법을 개발 했습니다. 이 기술은 ultradian 시간의 척도에 주기적인 빛 조명에 의해 유도를 유전자 식 펄스의 수 있습니다. 이 프로토콜은 감광 세포 선 확립 및 라이브 셀 발광 셀 통신의 문맥에서 모니터링 하 여 기자 세포의 동적 응답을 관찰 하는 방법을 나타냅니다. 이 방법은 많은 다른 신호 통로의 분석에 적용 됩니다.
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Protocol
1. Tol2 시스템으로 안정적인 셀 라인의 세대
-
C2C12 셀에 transposase (Tol2) 식 벡터 (pCAGGS-mT2TP)와 Tol2 기반의 optogenetic 모듈의 플라스 미드 벡터 (그림 1A)를 transfect. 모든 단계, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 37 ° C (표 1), 5% CO2, 그렇지 않으면 표시의 존재에서 페니실린 스 보충 DMEM 매체와 문화 셀.
- 셀 카운터, trypsinized 세포와 당 12-잘 접시에 잘 플레이트 5 x 104 C2C12 세포 transfection 전에 1 일 계산.
- Lipofection 시 약을 사용 하 여 optogenetic Tol2 기반 벡터 (pAI177 또는 pAI218), 약물 선택 벡터 (pAI170)의 0.125 μ g과 pCAGGS mT2TP 벡터의 0.5 μ g의 0.375 μ g를 transfect 공동.
- Transfected 세포, trypsinize 그리고 그들을 transfection 후 1 일 100mm 문화 요리에 접시.
- 문화 매체 100 mg/mL hygromycin 보충 transfected 세포에 대 한 문화 매체를 교환 합니다.
- 3 일 취소 transfected 세포를 제거 하기 위한 문화 셀. 참고 중간 변경 필요 하지 않습니다.
- Trypsinize transfected 세포 고 정화 선택을 위해 형광 단백질을 표현 하는 세포의 인구. 수신기 세포 pAI177를 들고, 그린 PE 채널 mCherry-긍정적인 세포 인구의 정화에 대 한 정렬 게이트를 설정 합니다. 사진에 민감한 보낸 셀 pAI218 운반, 송출 채널 iRFP713-긍정적인 세포 인구의 정화에 대 한 정렬 게이트를 설정 합니다.
- (선택 사항) 표준 메서드를 제한 희석 또는 단일 셀 FACS에 의해 정렬 하 여 클론 세포 인구를 구축.
2. 사진-감도 인구 수준에서 설계 된 셀의 평가
참고:이 부분에서는 생 화 확 적인 분석 실험, 정량 등 서양 blotting에 의해 블루 빛 조명에 따라 Dll1 ligand 단백질의 동적 유도 확인 하려면 프로토콜을 설명 합니다.
- 각각 두 가지 유형의 광원 없이 incubators 빛 유도 조건 또는 어두운 상태에 대 한 설정. 설치는 파란 LED 트랜스-조명 기, 그림 1B와 같이 노출 계를 사용 하 여의 빛 강도. 프로그램 타이밍 및 조명 (그림 1C)에 대 한 프로그래밍 가능한 일정 수를 단일 보드 마이크로-컨트롤러 제어 스크립트를 로드 하 여 빛 조명 기간
- 셀 카운터 trypsinized 셀과 판 1.0 x 105 사진-민감한 보낸 셀 pAI218과 pAI170 35 m m 직경 플라스틱 문화 요리 (빛 조건에 대 한 이상 12 요리와 어두운 조건에 대 한 1 접시)에 고 요리를 설정 어둠/빛의 조건에 대 한 incubators 구분 합니다. 요리를 설정한 후 세포 lysates 수집까지 산부인과의 문을 유지.
- 도금, 후 하나 30 일 시작 빛 조명 (셀 80% 이상이 될 것으로 예상 된다 confluent). 셀을 바람직하지 않은 사진-자극을 피하기 위해 빛을 노출 하지 마십시오.
참고: 일정 조명에 대 한 실험의 목적에 따라 달라 집니다. 지속적인된 조명 조건 (예. 1-분 기간 및 10 분 간격으로 40 µ / m2/s 빛 강도) 사진-유도, 그리고 그 강한 빛 조명에 대 한 간단한 검사는 셀에 대 한 충분 한가. 따라서, 조명에 대 한 무해 매개 변수 선택 되어 있는지 확인 합니다. - 도금, 후에 2 일 약 30 분 간격으로 세포 lysate 준비. 얼음, 그리고 세포 lysates 추가 분석을 위해 준비 시작을 인큐베이터에서 샘플 요리를 이동 합니다.
3. 인구 수준에서 분석 결과 동적 발신자-수신자: PMT에 의해 광 자극에 세포질 응답의 실시간 모니터링
- Trypsinize 및 발신자와 수신기 셀의 숫자 표준 방법. 혼합 104 수신기와 1.25 x 10 x 2.5의5 보낸 셀 (1:5 비율)의 1 mL 전체 볼륨을 준비 합니다.
참고: 2:1, 1:1 또는 1:2 보낸 사람 수신기 비율 또한 작동 1.5 x 10의 전체 휴대폰 번호5. 10 - 플레이트 1 m m의 소를 포함 하는 문화 매체와 셀에 24-잘 블랙 플레이트의 각 잘 혼합.
- 플레이트 리더 luciferase 분석 결과 대 한 셀을 분석 하 고 출력 신호 기록 시스템에 대 한 너무 높은 되는지 확인.
참고: 출력 신호 1 x 106 광자 수/s 보다 더 높은 경우에, 그들은 수 수 포화. 이 경우, 출력 신호는 1 x 106 광자 수/s 보다 낮은 최적의 값으로 소의 농도 줄일. - 기록 시스템에 접시를 설정 하 고 녹음 프로그램 (그림 1D) 시작. 예를 들어 녹음 후 18 h에서 빛 조명을 시작 합니다.
참고: 임시 필터링와 같은 이동 평균 및 Savitzky Golay 필터링, 신호 트렌딩 웨이브 폼의 시각화를 위한 유용 피크 탐지.
4. 단일 셀 수준에서 분석 결과 동적 발신자-수신자: 실시간 Optogenetic 섭 동 통제 단일 세포 응답의 이미징
- 플레이트 0.5 x 105 수신기 그리고 2.5 x 27 mm 직경 유리 베이스 35 m m 직경 요리에 105 보낸 사람 세포. 그 혼합 비율 및 총 세포 수 (셀 밀도) 올바르게 조정 됩니다 확인 하십시오.
- 도금, 후에 1 일 교환 기록 매체의 2 mL와 매체 (페 놀 레드 무료 DMEM 매체 보충 5 %FBS, 페니실린-스와 1mm 소), 현미경에 유리-기본 요리를 설정. 필요한 경우, PBS (-)와 죽은 세포의 파편 세척 한다.
참고: 그것은 어두운 상태에서이 단계를 수행 하는 것이 좋습니다. - 37 ° C, 5% CO2환경 챔버를 장착 한 거꾸로 한 현미경을 설정 합니다.
- 냉각된 CCD 카메라를 설정 합니다. 대상 값 (일반적으로-90 ° C) CCD 센서의 온도 아래로 냉각은 확인 하십시오.
-
5 분 간격으로 이미지와 보다 더 288를 자동 수집 소프트웨어에 "다차원 Timelapse" 창에 대 한 매개 변수 설정 (하나 이상의 야간 녹화) 시간.
- "다차원 Timelapse" 창을 열고, 풀 다운 메뉴에서 발광 채널 및 느린 50 kHz 읽기 모드를 선택 하 고 4 × 4 4 민 노출 binning 설정. 읽기 모드 읽어 소리를 약하게 발광 발광 빛을 감지를 줄이기 위한 중요 한 느린 50 kHz 모드로 설정 되어 있는지 확인 하십시오.
- "다차원 Timelapse" 창을 열고, 풀 다운 메뉴에서 형광 채널 및 고속 1mhz 읽기 모드를 선택 하 고 2 x 2 400 ms 노출 binning 설정. 읽기 모드 형광 영상에 필요한 시간을 줄이기 위해 빠른 1 MHz 모드로 설정 되어 있는지 확인 합니다.
- 시간 경과 "취득" 버튼을 클릭 하 여 녹음 시작 합니다.
- 다음과 같이 이미지 분석 소프트웨어, 시간 경과 영화에서 발광 채널의 단일 셀 자취를 추출 합니다. 먼저, 이미지 분석 소프트웨어를 이미지 데이터를 가져와서 발광 및 형광 스택 이미지를 확인 합니다. 발광 이미지에 대 한 ("SpikeNoise 필터"로 구현), 이전 및 다음 프레임의 시간 평균을 픽셀 값으로 바꿔 일시적으로 인접 한 이미지에서 픽셀의 농도 비교 하 여 우주선에서 파생 된 핫 픽셀 제거 이러한 처리 이미지 공간 스무 딩 필터를 적용 하 고 각 프레임에서 out-field 뷰의 배경 픽셀 값을 뺍니다. 그런 다음, "관심 영역"을 결정 (투자 수익) 각 시간 지점에서 형광 이미지에 각 셀에 대 한 투자 수익 발광 이미지를 적용 하 고 각 투자 수익의 발광 강도 측정.
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Representative Results
우리는 LightOn 시스템11,12, 2-3 h 주기와 유전 발진기의 연구에 포유류 세포에 있는 사진 유도 유전자 발현을 가능 하 게 적응. 이 시스템은 두 부분: 사진 유도할 수 있는 transcriptional 활성 제 hGAVPO 및 드라이브의 임의 유전자의 전사를 UAS 발기인 카세트. 사진 유도 유전자 발현의 타악기 활동을 가속, UAS 발기인 카세트에 polyA 시퀀스 murine Hes1 3' UTR는 mRNA 반감기 murine fibroblasts에 20 분 단축에 의해 대체 되었다.
안정적인 셀 라인을 설정 하기 위해 Tol2 transposase 시스템에 따라 트라이 cistronic 벡터 사용된13 (그림 1A) 했다. Tol2 식 벡터 플라스 미드 카세트14의 염색체 통합의 효율성 강화를 위해 필수적 이다. 그 벡터 UAS-발기인에 의해 구동 하는 빛을 유도할 수 있는 유전자의 식 카세트 뿐만 아니라 식 카세트 (iRFP71315 또는 mCherry) 사진에 민감한 단백질 hGAVPO 및 형광 단백질의 수행. 이 설계를 사용 하 여 호스트 게놈에는 플라스 미드를 효과적으로 통합 하는 셀의 인구를 정화 수 있었습니다.
우리는 사진에 민감한 보낸 셀 블루 빛 조명 (그림 2A) 따라 Dll1 ligand 단백질을 생산 하는 설립. 이 위해, Tol2 시스템 기반 bi cistronic 벡터 (pAI218) 사용 되었다. 확인 하려면 빛 조명에 따라 Dll1 ligand의 유도, 세포 그림 1B 및 1 C에서처럼 프로그램된 LED 블루 빛 소스를 갖춘 인큐베이터에서 배양 했다. 사진 유도 Dll1 단백질 식 역학 서쪽 더 럽 히 분석 하 여 검색의 대표적인 결과 그림 2B 와 2c에 표시 됩니다.
노치 신호 입력에 응답 하는 셀을 설정 하기 위해 사용 하는 Tol2 시스템 기반 bi cistronic 벡터 (pAI177) 노치 이펙터 유전자 Hes1 와 phosphoglycerate의 발기인의 제어에서 정한 luciferase 기자를 들고 키 (PGK) 모터 구동 핵 지역화 빨간색 형광 기자 H2B-mCherry. 이 경우에, 형광 기자 정화 및 단일 셀 추적 경과 관찰에 유용 합니다.
일단 사진 유도할 수 있는 보낸 사람 세포와 수신기 세포 성공적으로 설립 하 고, 공동 경작이 세포 (그림 2A)에 의해 동적 발신자-수신자 분석 결과 수행할 준비가 되어 있습니다. 이 분석 결과에서 노치 ligand 단백질을 표현 하는 사진에 민감한 보낸 셀 블루 빛 조명에 따라 Dll1 했다 공동 경작 생 Hes1 발진기와 생물 발광 Hes1 기자 (사진 구분 수신기 세포와 pHes1 dLuc) (그림 2D) 수신기 셀 endogenously 노치 수용 체 응답 Dll1 이웃 세포에 의해 제시 하는 표현.
보낸 사람 수신기 동적 분석의 대표적인 결과 그림 2E 와 2F에 표시 됩니다. 생물 발광 녹음 수신기 세포의 동적 응답을 감지, 우리가 먼저 사용 광자 세 고 가벼운 자극 ( 에 대 한 LED 블루 빛 소스에 대 한 높은-민감한 사진 승수 관 (PMT)을 갖춘 라이브 셀 모니터링 시스템 그림 1D). 이 시스템에는 녹화를 예약 된 빛 조명으로 인구 수준에 생물 발광 신호 수 있습니다. 이러한 두 가지 유형의 셀 공동 경작 되었고 반복적인 빛 조명 (30 s 기간, 2.5 h 간격)에 노출, 수신기 세포의 순환 응답 비율 (그림 2E) 혼합의 다양 한 조건에서 감지 했다. 이 예제에서 우리는 Savitzky Golay (4번째 순서와 13 데이터 포인트 창) 시끄러운 신호를 약하게 필터링 적용. 반복적인 빛 조명 (2 분 기간, 2.75 h 간격) 시간 경과 현미경 또한 수신기 세포 ( 그림 2F에 회색 라인) 단일 셀 수준 및 인구 수준 ( 그림에에서 빨간색 라인의 동기화 응답 공개 2F).이 데이터는 것이 좋습니다 Dll1 보낸 사람 세포에서 단백질의 순환 표현 Hes1 진동 수신기 셀 인접을 동기화 하기에 충분.
그림 1: optogenetic 물결에 세포질 응답을 분석 하는 전략. 이 프로토콜에 사용 되는 대표적인 플라스 미드 벡터의 (A) 회로도 이 플라스 미드는 요청에 사용할 수 있습니다. (B) 6-잘 셀 문화 접시 아래 파란색 LED 장치를 갖춘 CO2 배양 기의 사진. (C) 제어 전원에 전기 회로의 회로도 LED 광원에 대 한 프로그래밍 가능한 마이크로 컴퓨터에 의해 제공 합니다. 솔리드 상태 릴레이 (SSR)은 온/오프 상태 마이크로-컴퓨터의 온/오프 LED 광원의 디지털 핀-아웃의 릴레이를 설정 했다. (D)는 사진 및 라이브 셀 생물 발광 모니터링 시스템의 개략도. 참고 자동화 한 단계 unidirectionally PMT 검출기의 정상 기록 위치에서 LED 광원 위에 조명 위치를 이동할 수 있습니다. 또한, PMT 검출기에서 이동할 수 있습니다 잘 잘 모니터는 개별 우물에서 신호. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: optogenetic 섭 동 실험의 예. 이 예에서 murine C2C12 myoblast 셀 라인 사용 되었다. 보낸 사람 수신기 동적 분석 결과의 (A) 회로도 (B, C) 빛을 이용한 Dll1 식 서쪽 더 럽 히 분석 하 여 분석의 대표적인 결과. Dll1 단백질 2.5 h 기간, 2 분 기간 24.7 W/m2의 휘도와 주기적인 빛 조명에 의해 유도 했다. 보낸 사람 및 수신기 세포의 공동 문화 시스템의 (D) 형광 이미지. (E, F) 보낸 사람 수신기 동적 분석 결과의 대표적인 결과. (E)는 PMT.을 갖춘 라이브 셀 모니터링 시스템에 의해 기록 된 수신기 응답의 시간적 패턴 총 셀 수 105 셀 x 1.5 해결 되었지만 보낸 사람 및 수신기 사이 비율 1:2 5: 1에서 배 부 되었다. (F) 단일 셀 이미징 (2 분 기간, 2.75 h 간격으로) 정기적인 빛 조명에 의해 유도 되었다, 진동 정보 수신기 셀에 보낸에서 전송 했다 밝혔다. 5: 1의 보낸 사람에 수신기 비율 105 셀 x 1.5 사용 되었다. 참고 10에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리는 유전자 식 역학 2 ~ 3 h의 주기를 제어 하는 방법을 보였다. 이 시간 단위 Tet에 시스템 및 원래 LightOn 시스템을 포함 하 여 다른 기존 시스템에 있는 것 들 보다 훨씬 짧습니다. Ultradian 시간의 척도 도달 주요 매개 변수는 분자 제품 사진 유도, mRNAs 및 단백질의 반감기. 이러한 운동 매개 변수 세포 유형 및 종에 달려 있습니다. 활동을 조정에 대 한 다른 시퀀스 Hes1 3' UTR 대체 시퀀스 및 대상 단백질의 기능 변경 되지 않습니다 때문에 스트레이트-앞으로 방법입니다. 다른 3' Utr 바람직한 타악기 패턴 특히 관심사의 세포를, 추구에 대 한 라이브 셀 모니터링 dLuc 빛 유도 의해 좋은 출발점 및 사용 검사 및 유효성 검사에 대 한.
빛에 민감한 세포의 일일 처리에 대 한 가장 자주 묻는 질문 중 하나입니다. 노치 신호 보낸 사람 수신기 동적 분석 결과 경우 우리가 우리의 시스템 (사진 유도할 수 있는 dLuc 또는 Dll1 전지와 수신기 세포) 세포 증식을 변경 및 신속 하 게 휴식을 반환 하지 않는 때문에 룸 조명 아래 셀 구절을 매일 할 수 있었다 어두운 조건 셀 이동 후 6 시간 이내 상태. 관심사의 유전자가 운명을 결정 요인, 경우 새 식 수 세포 감 별 법을 유도 또는 세포의 확장을 방지 이며 따라서 중 바람직하지 않는 optogenetic 섭 동을 피하기 위해 붉은 빛 환경 설정 필수 셀 처리입니다.
이 프로토콜에서 우리는 사진 유도할 수 있는 유전자 식 카세트와 안정적인 셀 라인을 생성 하는 절차를 제시. 이것은 동적 발신자-수신자 분석 결과에서 신뢰할 수 있는 결과 얻기 위해 중요 한 단계 이다. 하나 셀, optogenetic 모듈의 도입에 대 한 과도 transfection를 고려할 수 있습니다 하지만 ultradian 펄스의 정량적 측정에 대 한 우리의 손에서 잘 작동 하지 않습니다. 우리는 그 과도 transfection 어두운 조건 에서도 상대적으로 높은 수준에서 새 식 UAS 발기인 카세트 리드를 운반 하는 플라스 미드의 발견. 이 새 식 어떤 빛 자극 없이 높은 배경 고 시간 코스의 신뢰할 수 있는 측정을 방해 합니다. 안정적인 셀을 설정 하는 대체 방법 transfection12에 적합 하지 않은 종류에 대 한 유용한 lentivirus 시스템입니다. 클론 세포 이질적인 셀 라인, 보다 더 균질 응답 제시 하지만 클론 인구에도 셀 응답 균일 하지 않습니다 항상: 일부 셀 빛 자극을 따라서 제시의 분산된 레벨 빛-유도 된 응답 하지 않습니다 단백질 식입니다. 변수 식 hGAVPO 단백질 및 변수 내 생의 풍요로 움 플 라빈, 발 색 단 hGAVPO의 빛 감지에 필요한 수준으로 인해 수 있습니다.
여기에 제시 된 프로토콜 유전자 식 역학의 분석을 위한 강력한 도구를 제공 하지만 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 하나의 단점은 일부 형광 채널 라이브 셀 현미경 검사 법에 대 한 블루 빛 자극에 호환 되지 않습니다. 블루 빛 조명 활성화는 블루 빛에 민감한 단백질 뿐만 아니라 형광 단백질, 녹색과 노란 형광 성 단백질 (GFPs와 YFPs)에 취약 등 사진 표백. 그와 반대로, GFP의 시각화 형광 이미지를 캡처 동안 사진에 민감한 세포의 바람직하지 않은 활성화를 실행할 수 있는 블루 빛 자극을 필요 합니다. 브라이트 필드 (단계 대조) 주변 광원에 의해 이미징도 블루 빛 optogenetic 실험와 호환 되지 않습니다 하지만 하나는 영상에 대 한 녹색 또는 더 긴 파장의 광원을 사용 하 여이 문제를 우회 수 있습니다.
보낸 사람 수신기 동적 분석 결과 다른 신호 경로 조사 하는 데 유용 것입니다. 하나의 가능성 신호 제어 시스템을 은닉 하는 응용 이다. 같은 분석을 위한 마이크로 유체 장치에서 정화 ligands 적용 정확한 시간 방식으로16,17수신기 세포를 자극 하는 다른 방법입니다. 그러나, 그 접근 보낸 셀에 ligand 분자의 동적 생산 프로세스에 액세스할 수 없습니다. 사진을 유도할 수 있는 리간드 식 함께 동적 발신자-수신자 분석 결과 고용 수 추가 신호 전송의 해 부 보낸에서 수신기 셀에 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 진화 과학 및 기술 (JPMJCR12W2 (R.K.)), 과학 연구 혁신 분야 (교육, 문화, 스포츠, 과학, 및 기술 (MEXT), 일본에 대 한 특정 JST, 프레스 토 (A.I.), 핵심 연구에 의해 지원 되었다 26119708 (A.I.) 및 16 H 06480 (R.K.)), 과학 연구 (A) (일본 사회 과학 (JSP) 24240049의 승진에 대 한 (R.K.)), 그리고 젊은 과학자 (A) (JSP 15 H 05326 (A.I.)), 그리고 혁신적인 지역 "형광에 대 한 과학적 연구에 대 한 특정 라이브 이미지 "문 부 과학성, 일본, 그리고 플랫폼의 동적 접근에 대 한 생활 시스템을 문 부 과학성, 일본에서에서입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
- Hubaud, A., Pourquie, O.
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
- Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
- Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
- Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141 (2012).
- Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
- Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
- Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1. S7 (2007).
- Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).
- Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
- Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).
