Summary
여기, 우리는 고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 유입의 측정에 대 한 두 개의 프로토콜을 제시. 고립 된 미토 콘 드리 아에 대 한 우리는 플레이트 리더 기반 Ca2 + 가져오기 세부 분석 결과 사용 하 여 Ca2 + 민감한 염색 칼슘 그린-5N. 경작된 한 세포에 대 한 우리 confocal 현미경 검사 법 방법 Ca2 + 염료 오전-2/로드를 사용 하 여 설명 합니다.
Abstract
캘리포니아2 + 미토 콘 드리 아에 의해 처리 광범위 한 셀에서에서 생리 및 병 태 생리 과정을 조절 하는 중요 한 기능 이다. 정확 하 게 유입 및 캘리포니아2 + 미토 콘 드리 아에서의 경과 측정 하는 능력은 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 이러한 프로세스에 처리의 역할을 결정 하기 위한 중요 합니다. 이 보고서에서 우리는 고립 된 미토 콘 드리 아와 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 처리의 측정을 위한 두 가지 방법을 제시. 우리는 먼저 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 통풍 관은 Ca2 + 민감한 염료 칼슘 그린-5N을 사용 하 여 측정 하기 위한 플레이트 리더 기반 플랫폼을 선발. 플레이트 리더 기반 형식 circumvents 특수 장비에 대 한 필요 그리고 칼슘 그린-5N 염료 측정 캘리포니아2 + 절연된 조직 미토 콘 드리 아에서 적합. 우리의 응용 프로그램에 대 한 설명 통풍 관 Ca 미토 콘 드 리아2 + 마우스 심 혼 직물;에서 고립 된 미토 콘 드리 아에서의 측정 그러나,이 절차 간, 골격 근육, 뇌 등 다른 조직에서 격리 하는 미토 콘 드리 아에서 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 + 이해 측정에 적용할 수 있습니다. 둘째, 우리는 미토 콘 드 리아 캘리포니아의2 + permeabilized 셀 Ca2 + 민감한 염료 오전-2/로드를 사용 하 여 2 차원 레이저 스캔 현미경을 사용 하 여 이미징 측정 confocal 현미경 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 permeabilization 프로토콜 cytosolic 염료 오염, 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 +에서 변화의 특정 기록에 대 한 허용을 제거 합니다. 또한, 레이저 스캔 현미경 높은 프레임 속도를 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 다양 한 약물 이나 외부 솔루션에서 적용 시 약에 대 한 응답에서의 빠른 변화를 캡처 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 심장 myocytes 및 신경, 불멸 하 게 셀 선 등 1 차 셀을 포함 하 여 많은 세포 유형에 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 + 글귀를 측정에 적용할 수 있습니다.
Introduction
미토 콘 드리 아의 세포내 캘리포니아2 + 저장과 신호 중요 한 사이트입니다. 연구의 십 년간은 미토 콘 드리 아를 가져오고 캘리포니아2 + 1,2격리 능력을가지고 설명 했다. 그러나 미토 콘 드리 아,, 단지 수동 사이트의 캘리포니아2 + 저장 되지 않습니다. 미토 콘 드 리아 구획에서 캘리포니아2 + 대사 출력의 규칙을 포함 하 여 기본적인 신호 기능을 수행 하 고 있다 중재 미토 콘 드리 아 세포 죽음 통로의 활성화 검토 이전3. 신진 대사 조절에 대 한 캘리포니아2 + 의 활동을 강화 3 매트릭스 지역화 dehydrogenases tricarboxylic 산 주기 뿐만 아니라 호흡 사슬 복합물, 미토 콘 드 리아 에너지 생산4,5 증가 . 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 과부하 및 dysregulated 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 처리, 캘리포니아2 + 트리거 미토 콘 드 리아 침투성 전환 기 미토 콘 드리 아 내 막 permeabilization, 선도 (MPTP) 오프닝 공 막 잠재적인 손실, 미토 콘 드 리아 기능 장애, 부 종, 파열 하 고 궁극적으로, 죽음6,7,,89셀. 따라서, 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 신호 직접 영향을 미칩니다 셀룰러 삶과 죽음 통로 통해 대사 제어 및 MPTP 죽음 축.
최근 몇 년 동안, 거기는 급속 하 게 확장에 따른 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 역학의 연구에 관심 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + uniporter 복잡 한의 분자 성분의 식별에 큰 부분, 미토 콘 드리 아 내 캘리포니아2 + 의 기본 모드는 막 운송업 자 미토 콘 드 리아 매트릭스 10,,1112로 가져옵니다. 이러한 구조 및 규제 소 단위는 uniporter의의 앞뒤로 유전자 타겟팅 미토 콘 드리 아 기능 및 역 기능 변조를 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 유입의 가능성을 가져 신분증과의 연구를 촉진 합니다 uniporter 복잡 하 고 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 + 유입 질병13,,1415의 기여 금. 실제로, 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 신호는에 연루 되어 neurodegeneration, 그리고 암16,,1718, 심장 질환에서 배열 하는 질병의 다양 한 배열의 병 리 19,20.
미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 신호 물질 대사와 세포 죽음의 근본적인 중요성을 감안할 때 및 생물 학적 시스템의 광범위 한 도달 범위와 함께 해당 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 신호 영향, 미토 콘 드 리아 Ca2 + 평가 하는 방법 큰 관심의 유입은. 아니나 다를까, 다양 한 기술 및 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 + 측정 도구 개발 되었습니다. 이러한 형광 캘리포니아2 +같은 도구를 사용 하는 메서드가 포함-민감한 염료21,22 및 유전자 인코딩 캘리포니아2 + 센서 미토 콘 드리 아, cameleon 및 aequorin23, 등을 대상으로 24. 이 기사의 목적은 다른 방법 및 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 + 통풍 관 측정 될 수 있는 모델 시스템을 강조 하는. 우리는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 유입 용량을 평가 하기 위해 두 가지 실험 방법을 제시. 예를 들어 심장 미토 콘 드리 아를 사용 하 여, 우리 플레이트 리더 기반 플랫폼 세부 측정 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 통풍 관을 사용 하 여 Ca2 + 민감한 염색 칼슘 그린-5N 절연된 조직 미토 콘 드리 아14에 적합 . 경작된 한 NIH 3T3 세포를 사용 하 여, 우리 또한 confocal 현미경 이미징 기반 분석 결과 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 캘리포니아2 + 민감한 염료 로드-2/오전25를 사용 하 여 permeabilized 셀에서의 측정에 대 한 설명.
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Protocol
이 프로토콜에서 설명 하는 모든 방법 기관 동물 관리 및 사용 위원회의에 모리 대학에 의해 승인 되었습니다가지고.
참고: 첫 번째 부분은 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 + 유입 플레이트 리더를 사용 하 여 격리 된 심장 미토 콘 드리 아에서 측정 하기 위한 실험 절차 이다.
1. 시 약 및 솔루션
- 미토 콘 드 리아 격리에 대 한 MS EGTA 버퍼의 500 mL 확인: 225 m m 마 니 톨, 75mm 자당, 5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), 1 mM 에틸렌 글리콜-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic 산 (EGTA), pH 7.4에 조정 와 코. 0.22 μ m 필터를 통해 그것을 소독 및 4 ° c.에 그것을 저장합니다 MS EGTA 버퍼 사용 하기 전에 4 ° C에 미리 냉장 인지 확인 합니다.
- 100 mL KCl 버퍼의 준비: 125 m m KCl, 20 mM HEPES, 1mm KH2포4, 2 mM MgCl2, 40 μ EGTA 및 pH 7.2 코와 함께 조정. 실 온에서 보관 합니다.
- 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 그린-5N 주식 1 m m 칼슘을 준비 합니다. 칼슘 그린-5N 주식 aliquotted 수 고-20 ° c.에 저장
-
캘리포니아2 + 글귀 기판 준비.
- 1 M 나트륨 pyruvate, pH 7.4 준비 합니다. -20 ° c.에 aliquots에 저장
- 500 mM malate, pH 7.4 준비 합니다. -20 ° c.에 aliquots에 저장
2입니다. 심장 미토 콘 드리 아의 격리
- 기관 기준에 따라 마우스를 안락사
참고: 안락사의 우리의 제도 승인 방법, 마우스 isofluorane 흡입에 의해 취 되었고 자 궁 경부 전위에 의해 희생. - 흉, 늑 골의 양쪽을 따라 절단, 측면에 서는 마음, 횡 경 막, 멀리 절단 열고 심장 조직을 절 개 하 여 마음을 수집 합니다.
참고:이 프로토콜에 미토 콘 드리 아 격리는 성인 마우스 (약 120 m g), 3-4 실험에 대 한 충분 한 되어야에서 수집 된 전체 마음에서 수행 됩니다. 간 등 다른 미토 콘 드리 아 풍부한 조직에서 미토 콘 드리 아 격리에 대 한 조직의 200mg까지 설명 하는 프로토콜에 따라 사용할 수 있습니다. - 린스 차가운 1 x 인산 25 mL에 철저 하 게 조직 염 (PBS) 보장 모든 혈액은 심에서 압착 버퍼링.
참고: 마음 것입니다 될 충분히 씻어 서 심장에서 압착 하는 액체 실행 취소 될 때. - 날카로운가 위를 사용 하 여 차가운 1 x PBS의 5 mL에 작은 조각으로 마음을 말하다.
- PBS를 삭제 하 고 다진된 심장 조직의 0.10 0.15 m m의 허가 함께 미리 냉장된 7 mL 유리 테 플 론 dounce 균질 화기에 전송.
- 얼음 처럼 차가운 MS EGTA 버퍼의 5 mL을 추가 하 고 조직 조각 표시 (약 11 획) 더 이상 때까지 샘플을 균질.
참고: 않습니다 하지-균질 조직 손상과 기능 미토 콘 드리 아를 목표는. - 15 mL 튜브에는 homogenate를 전송.
- Homogenate 작은 핵 및 손상 되지 않은 세포를 5 분 동안 4 ° C에서 600 x g에서 원심
- 신선한 15 mL 튜브에는 상쾌한 전송 및 펠 렛의 미토 콘 드리 아를 10 분 동안 4 ° C에서 10000 x g에서 원심.
- 삭제는 상쾌한 고 얼음에 미토 콘 드리 아 펠 릿을 유지.
- 미토 콘 드리 아 펠 릿 차가운 MS EGTA 버퍼를 사용 하 여 두 번 씻는 다. 각 세척에 대 한 MS EGTA 버퍼의 5 mL에 미토 콘 드리 아 펠 릿을 resuspend 하 고 10 분, 4 ° C에서 10000 x g에서 원심은 상쾌한 삭제.
- 최종 세척 후 삭제는 상쾌한 고 얼음 차가운 MS EGTA 버퍼의 100 μ에는 미토 콘 드리 아를 resuspend. 얼음에 미토 콘 드리 아를 유지 합니다.
참고: 미토 콘 드리 아 실험 1 시간 이내에 사용 해야 합니다. - Bradford 단백질 분석 실험26를 사용 하 여 미토 콘 드리 아 단백질 농도 측정 합니다.
3. 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관의 플레이트 리더 기반 측정
참고: 여기, 그것은 설명 하는 프로토콜 분석 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 통풍 관 다중 플레이트 리더를 사용 하 여 인젝터를 장착. 어떤 칼슘 그린-5N 형광을 읽는 기능 리더 접시 (여기/방출 506/532 nm) 자동된 시 약으로 운동 모드에서 반응 빛 으로부터 보호를 유지 하는 인젝터를 사용할 수 있습니다.
- 플레이트 리더는 운동 수행을 칼슘 그린-5N 형광의 측정 1, 000의 총 시험 시간에 대 한 초당 읽기 프로그램 또한 s., 30에서 CaCl2 솔루션의 5 μ 분배 하 시 약 인젝터 프로그램 s 150 s, 300 s 480, 및 690 시간 포인트.
참고: CaCl2 주사의 타이밍 사용자 정의 그리고 실험 필요에 따라 조정할 수 있습니다. - 프라임 사용할 CaCl2 솔루션 시 인젝터.
참고: CaCl2 용액의 농도 사용자 정의 그리고 캘리포니아2 + MPTP 열기를 실행 하는 데 필요한 금액을 적정 하 후속 실행에서 조정 될 수 있다. - 미토 콘 드리 아의 200 μ g 96 잘 접시의 개별 음을 추가 합니다.
- 미토 콘 드리 아와 KCl 버퍼의 총 볼륨 197 μ에 오는 그런 잘 KCl 버퍼의 적절 한 볼륨을 추가 합니다.
- 1 M pyruvate의 1 μ 및 1 μ 500mm malate의 미토 콘 드리 아 혼합물에 추가 합니다. 피펫으로 부드럽게 혼합 하, 미토 콘 드리 아에 활성화 될 수 있도록 실내 온도에 2 분 동안 기판으로 미토 콘 드리 아를 품 어.
- 1mm 칼슘 그린-5N 주식의 1 μ를 추가 합니다. 부드럽게 pipetting으로 혼합.
참고: 칼슘 그린-5N 염료의 추가 따라 빛에서 반응을 보호 합니다. - 미리 프로그램 된 운동 프로토콜 및 모니터 칼슘 그린-5N 형광을 시작 합니다.
4. 시 약 및 솔루션
참고: 두 번째 부분은 confocal 영상의 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 + 경작된 한 세포에 대 한 실험 절차
- Tyrode의 솔루션 (130 mM NaCl, KCl 4mm, 2mm CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 m m 포도 당, 및 10 mM HEPES, 코와 pH 7.2)을 확인 합니다. 4 ° c.에 그것을 저장합니다 사용 하기 전에 실내 온도에 그것을 따뜻하게.
- 세척 솔루션 (100 mM 칼륨 아세테이트, 15 m KCl, 5mm KH2포4, 5 mM Mg-ATP, 0.35 m m EGTA, 0.12 m m CaCl2, 0.75 m m MgCl2, 10 m m phosphocreatine, 10 mM HEPES, 코와 pH 7.2 m)를 준비 합니다. 4 ° c.에 그것을 저장합니다 사용 하기 전에 실내 온도에 그것을 따뜻하게.
- 세척 솔루션에 0.005% 사포닌을 포함 하는 Permeabilization 솔루션을 준비 합니다. 그것은 신선한 매일을 준비 합니다.
- 0 준비 캘리포니아2 + 내부 솔루션 (100 mM 칼륨 아세테이트, 15 m m KCl, 0.35 mM EGTA, 0.75 m m MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.2 코와 조정). 4 ° c.에 그것을 저장합니다 사용 하기 전에 실내 온도에 그것을 따뜻하게.
- 포함 된 캘리포니아2 +내부 솔루션을 준비 합니다. 무료 캘리포니아2 +의 원하는 농도 도달 CaCl2 위의 내부 솔루션에 추가 합니다. CaCl2 추가 금액 MaxChelator 프로그램 (maxchelator.stanford.edu)를 사용 하 여 계산 됩니다.
- 1mm DMSO에 오전 로드-2 재고를 준비 하 고 사용까지-20 ° C에서 그것을 저장.
- 1mm MitoTracker DMSO에 녹색 재고를 준비 하 고 사용까지-20 ° C에서 그것을 저장.
5. 도금 셀 이미징에 대 한
- 22 x 22 cm2 유리 coverslips 100% 에탄올으로 세척 하 고 건조 공기를 coverslips 있습니다.
- 6 잘 조직 배양 접시의 개별 우물으로 유리 coverslips를 놓습니다.
참고: Coverslips laminin, 폴 리-L-리 신, 또는 유사한 매트릭스 셀 첨부 파일 홍보를 코팅 될 수 있습니다. - Trypsinize 및 이미징의 하루에 약 70% 합류를 목표로 하는 coverslips에 셀 접시.
6. 로드 로드-2/오전와 MitoTracker 그린 셀
- 로드-2/오전-MitoTracker 준비 작업 솔루션을 그린. 추가 로드-2/오전 1 m m 재고 20 μ의 MitoTracker 녹색 1 m m, 0.2 μ와 Tyrode의 솔루션의 1 mL에 20% pluronic F-127의 2.5 μ. 작업 솔루션에 로드 2의 최종 농도 20 µ M 이며 MitoTracker 녹색의 최종 농도 200 nM.
- 부드럽게는 coverslip에서 성장 매체를 제거 합니다.
참고: 세척 단계 염료 솔루션 추가 하기 전에 필요 하지 않습니다. - 추가 로드-2/오전-MitoTracker는 coverslip 될 때까지 그냥 coverslip에 dropwise 패션에서 녹색 솔루션 적용 (coverslip 당 약 3-4 방울).
- 염료와 로드 셀 수 있도록 빛에서 보호 하는 실 온에서 30 분 동안 그것을 품 어.
- 드 로드-2/오전 esterify. 로드-2/오전-MitoTracker 제거 솔루션 그린 신선한 실내 온도 Tyrode 솔루션으로 대체 하 고 빛 으로부터 보호 하는 실 온에서 30 분 동안 품 어.
7. 미토 콘 드 리아 로드-2/오전 및 MitoTracker 녹색 형광의 confocal 영상
- 현미경 이미징 챔버는 coverslip 전송 하 고 세척 솔루션 챔버를 입력 합니다.
- 40 X에서 위상 대조에 세포 관찰에 대 한 설정 아래에서 셀 표시 될 때까지 및 초점에서 초점을 조정 합니다.
-
로드-2/오전-MitoTracker의 플라즈마 멤브레인 permeabilize 그린 로드 로드 cytosol 지역화-2, 미토 콘 드리 아 지역화 염료를 유지 하면서 제거 하는 세포.
- coverslip에서 세척 솔루션을 제거 합니다.
- 약 1 분 동안 Permeabilization 솔루션으로 교체 합니다.
- Permeabilization 과정을 통해 플라즈마 멤브레인 형태는 시각적으로 모니터링 합니다. Permeabilized 셀 roughened 표면을 개발할 것입니다.
- Permeabilization 완료 되 면 즉시 Permeabilization 솔루션을 제거 하 고 0 캘리포니아2 + 내부 솔루션 그것을 바꿉니다.
- 동시에 이미지 로드 2 형광 (여기 559 nm 레이저 라인 및 방출 575-675 nm 사이의 파장에서 수집 된를 사용 하 여) 및 MitoTracker 녹색 형광 (여기 488nm 레이저 라인 방출 파장 사이 수집 된를 사용 하 여 505-525 nm). 로드-2와 MitoTracker 녹색의 명확한 colocalization를 표시 하는 permeabilized 세포에 초점.
- 현미경 레이저를 감소 하 고 미토 콘 드리 아 로드 2 형광 희미 하 고 그냥 표시 되도록 설정을 얻을.
- 특정 응용 프로그램의 적절 한 프레임 속도 및 시간 과정에 2 차원 검사를 얻으려고 현미경 설정을 선택 합니다. 적어도 30 프레임/s의 프레임 속도 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 +에서 변화의 속도 정확 하 게 캡처 하는 것이 좋습니다.
- 제거 0 캘리포니아2 + 내부 솔루션 셀 또는 현미경의 초점을 방해 하지 않고.
- 이미지 수집을 시작 합니다.
- 캘리포니아2 +추가-10 s 시간에 충만 내부 솔루션 포인트 수동으로 또는 관류 시스템.
- 관심 (ROIs) 미토 콘 드 리아 로드-2와 MitoTracker 녹색 신호는 이미지 수집 소프트웨어에서 사이 colocalization의 영역을 포괄 하는 영역을 선택 합니다.
참고: 기록의 각 시간 지점에 대 한 임의의 형광 (F) 값 각 투자 수익에 대 한 얻을 수 있습니다. 이 값은 배경 빼고 하 고 (Ca2 + 추가; 이전 초기 형광으로 정규화 F0) 데이터 프레 젠 테이 션 및 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 +의 변화의 진폭의 정량화에 대 한 시간이 지남에 F/F0 으로 표시 되 고.
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Representative Results
그림 1 에서는 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 + 통풍 관 측정 플레이트 리더 기반 플랫폼을 사용 하 여 격리 된 심장 미토 콘 드리 아 그리고 캘리포니아2 + 염색 칼슘 그린-5N. 조건 제어 (그림 1A), 심장 미토 콘 드리 아 칼슘 그린-5N 포함 된 KCl 버퍼에 중단 되었고 30에 추가 하는 CaCl2 (0.6 m m CaCl2 솔루션의 5 μ)의 순차적 펄스 다음 도전 s 150 s, 300 s, 480 s, 그리고 690 시간 포인트입니다. 타이밍 및 CaCl2 추가의 수의 추가 Ca2 + 후속 추가 하기 전에 완전 한 미토 콘 드리 아 이해에 대 한 수 있도록 사용자가 조정할 수 있습니다. 이 분석 결과에서 칼슘 그린-5N 신호 증가 높은 버퍼 캘리포니아2 + 레벨을 반영합니다. 미토 콘 드리 아 수입 캘리포니아2 +, 캘리포니아2 + 에서 제거 되는 버퍼와 칼슘 그린-5N 형광 감소 합니다. 중요 한 것은,의 캘리포니아2 +3 추가에 칼슘 그린-5N 형광 곡선 갑자기 하 고 예리한 굴절 이상, 계속 캘리포니아2 + 버퍼에서 제거 하는 대신 겪 습와 그림 1A에서에서 빨간색 화살표로 표시 됩니다. . 형광에 있는이 급격 한 증가 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 과부하 및 MPTP 개방을 반영 한다. 캘리포니아2 + MPTP 활성화 전에 미토 콘 드리 아에 의해 촬영의 총 금액 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 수 용량을 반영 하 고 μmol 단백질 캘리포니아2 +/mg 표현 될 수 있습니다. 타이밍 및 추가, 칼슘 캘리포니아2 + 실행 하는 데 필요한 금액의 농도를 조정 함으로써 침투성 전환이 확인할 수 있습니다. 그림 1B, 미토 콘 드리 아 10 μ M로 실 온에서 10 분에 대 한 사전 처리 했다 Ru360, 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + uniporter 복잡 한27의 특징이 잘 억제 물. Ru360 uniporter 종속 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 통풍 관, 억제 하 고이 칼슘 그린-5N 형광 각 Ca2 + 추가 다음에서 단계별 증가 의해 입증 됩니다.
오전-2/로드를 사용 하 여 미토 콘 드리 아 칼슘의 confocal 영상에 대 한 우리는 NIH 3T3 세포에서 대표적인 결과 보여줍니다. MitoTracker 그린 우선적으로 미토 콘 드 리아 네트워크 (그림 2A) 얼룩 미토 콘 드리 아에 선택적인 염료입니다. 원형질 막의 사포닌 중재 permeabilization, cytosolic 로드-2는 씻어, 로드 2 스테인드 MitoTracker 그린 (그림 2A)와 함께 공동 localizes 미토 콘 드 리아 네트워크를 떠나. 로드-2 또한 비-미토 콘 드리 아 구조에 축적 수 있습니다, 그리고 그래서 ROI 분석 한다 MitoTracker 녹색과 로드-2 공동 지역화의 영역의 초점. 제어 셀, 캘리포니아2 +의 추가-2 μ M 무료 캘리포니아2 + 를 포함 하는 가득 차 내부 솔루션 로드 2 형광, 복잡 한 uniporter 10 μ M으로 저해 하는 경우 대기의 급속 한 증가 하면 Ru360 (그림 2B).
그림 1: 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 + 절연된 심장 미토 콘 드리 아에 통풍 관 (A) 그래프 컨트롤 심장 미토 콘 드리 아와 10 μ M로 미리 치료 (B) 미토 콘 드리 아의 상대적인 칼슘 그린-5N 형광의 실 온에서 10 분 동안 Ru360 0.6 m m CaCl2 (검은 화살표)의 5 μ로 도전. 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 과부하 유발 침투성 전환 빨간색 화살표와 함께 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 대표적인 분석 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + permeabilized 세포에서. (A) 3T3 세포의 대표적인 형광 이미지 로드 로드-2 (레드) MitoTracker 그린 (녹색)와 병합 된 이미지 로드-2와 MitoTracker 그린 (황색)의 사포닌과 permeabilization 후. (B) 로드 2 2 µ M 무료 캘리포니아2 + 내부 솔루션의 제어 조건 (검은 추적) 또는 10 µ M Ru360 전처리 (빨간 추적) 후 적용 하는 동안 단일 3T3 세포에서 형광 추적입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 유입 측정 하 두 가지 다른 방법을 설명 합니다. 플레이트 리더 기반 칼슘 그린-5N 방법 모니터 extramitochondrial Ca2 + 레벨 이며는 Ca2 + 이해 분석 결과 고립 된 미토 콘 드리 아에서의 측정에 적합 하다. 우리가 고립 된 murine 심장 미토 콘 드리 아에서 대표적인 결과 표시는,이 분석 결과 높은 미토 콘 드 리아 풍부한 간, 골격 근육 및 두뇌를 포함 하 여 조직에서 격리 하는 미토 콘 드리 아에 대 한 쉽게 적용할 수 있습니다. 또한, 플레이트 리더 시스템 실험실 어디 캘리포니아2 + 측정, fluorometers, 같은 전통적으로 사용 하는 특수 장비 즉시 사용할 수 있습니다 되지 않을 수 있습니다에 대 한 이상적인 옵션이 있을 수 있습니다. 그러나 플레이트 리더를 검색할 수 있습니다 및 필요 시 추가 사전 프로그램이 기술의 약점을 있을 수 있습니다 제한 된 최대 시간 범위 fluorometers,, 비용 비교와 fluorometers의이 혜택을 보다 큽니다 수 있습니다. 시 약 인젝터에 캘리포니아2 + 의 농도 변화 하 여 미토 콘 드리 아 (미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 용량)를 열고 MPTP를 트리거링 하기 전에 격리 수 있는 캘리포니아2 + 의 금액을 확인할 수 있습니다.
우리의 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 + 로드-2/오전 측정을 위한 설명 하는 confocal 이미징 프로토콜 경작된 한 세포에 이상적 이며 1 차 셀에도 적용할 수 있습니다. 이 방법에서는, 원형질 막 사포닌 cytosolic 염료의 유실 수와 permeabilized입니다. 세포에 침투 하는 염료만 미토 콘 드리 아 형광의 정확 하 고 구체적인 측정을 허용 하는이 절차 후 남아 있습니다. 또한,이 permeabilized 세포 분석 실험 extramitochondrial 캘리포니아2 + 레벨 뿐만 아니라 사용자 정의 조건에는 미토 콘 드리 아 노출 되는 실험적인 제어할 수 있습니다. 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 의 로드-2/오전 confocal 영상 그대로, 비 permeabilized 셀에서 사용할 수 있습니다 하지만이 최적화 염료 로드 및 미토 콘 드리 아 전용 로드 2 지역화28되도록 드 에스테 르 화를 필요 합니다. 오전-2/로드 방법의 강점 로드-2/오전 상용 고 염료는 다양 한 종류의 세포에 쉽게 적용 될 수 있습니다. 그러나 로드-2 염료의 지역화는, 간주 한계입니다. 미토 콘 드리 아 전용 로드 2 형광의 측정을 위해, MitoTracker 녹색, 등 두 번째 spectrally 별개 염료, 얼룩 화상 진 찰 전에 미토 콘 드리 아를 사용할 수 있습니다. 그러나 유전자 인코딩 Ca2 + 센서는 미토 콘 드리 아를 대상으로이 문제를 우회 수 있습니다, 그리고, 세포 센서 구조와 페/불리고 고 단백질을 표현 하는 충분 한 시간을가지고 해야 합니다. 이것은 항상 제한 된 생존 시간, 1 차 셀에 대 한 이상적인 그리고 염료 로드 절약해 주는 과정을 수 있습니다.
두 프로토콜 우리 효과 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 유입 억제를 설명 하기 위해 uniporter 복잡 한 억제 물 Ru360를 사용 합니다. Ru360 uniporter 억제에 대 한 황금 표준 이며 현재까지, 그것은이 tranporter29의 유일한 알려진된 특정 반응 억제제. 그러나 또는, 루 테 늄 빨강도 사용할 수 있습니다, 그리고, 루 테 늄 빨강 일반적인 uniporter 억제제 sarcoplasmic 그물30에서 캘리포니아2 + 방출 억제 하기 위해 표시 되었습니다. Uniporter 복잡 한 종속 Ca2 + 교통은 미토 콘 드리 아 막, 및 확장에 의해, 이것은 호흡 사슬의 기능에 의존 하는 잠재적인 장애인된 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 처리 미토 콘 드 리아 기능 장애의 표시 될 수 있습니다. . 따라서, 생성 시안-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) 및 생성 시안 m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 발산 하는 등 미토 콘 드리 아 uncouplers도 사용할 수 있습니다 제어로 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 유입 억제 화합물. 미토 콘 드리 아의 세포내 캘리포니아2 + 스토리지 사이트 이기 때문에, 미토 콘 드리 아 공간 내에서 세포내 캘리포니아2 + 버퍼도 작동 수 있습니다. 따라서, 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 처리 변경 cytosolic 캘리포니아2 + 프리의 모양을 떨어질 수 있습니다. 질병 조건 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 역학 역할을 할 수의 증가 고려 하 고 여기에 그림 방법에 적용할 수 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 유입의 세포 모델과 동물 모델에서의 연구는 질병입니다.
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Disclosures
저자 아무 공개 보고 있다.
Acknowledgments
이 작품 교부 미국 심장 협회 (J.Q.K.)에서 지원 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors | Biotek | ||
| Tissue Homogenizer | Kimble | 886000-0022 | |
| 22 x 22 mm coverslips | Corning | 2850-22 | |
| 96 well plate | Corning | 3628 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| Calcium Green-5N | Invitrogen | C3737 | |
| MitoTracker green FM | Invitrogen | M7514 | |
| Rhod-2, AM | Invitrogen | R1244 | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| Sucrose | EMD Millipore | 8510 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E8145 | |
| Potassium chloride | Fisher | BP366-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| L-malic acid | Sigma | M1125 | |
| Calcium chloride | Sigma | C4901 | |
| Potassium acetate | Fisher | BP364-500 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Phosphocreatine disodium salt | Sigma | P7936 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Ru360 | Calbiochem | 557440 |
References
- Deluca, H. F., Engstrom, G. W. Calcium uptake by rat kidney mitochondria. P Natl Acad Sci USA. 47, 1744-1750 (1961).
- Lehninger, A. L., Rossi, C. S., Greenawalt, J. W. Respiration-dependent accumulation of inorganic phosphate and Ca ions by rat liver mitochondria. Biochem Biophys Res Co. 10, 444-448 (1963).
- Kwong, J. Q. The mitochondrial calcium uniporter in the heart: energetics and beyond. J Physiol. 595 (12), 3743-3751 (2017).
- Denton, R. M. Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions. Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1309-1316 (2009).
- Jouaville, L. S., Pinton, P., Bastianutto, C., Rutter, G. A., Rizzuto, R. Regulation of mitochondrial ATP synthesis by calcium: evidence for a long-term metabolic priming. P Natl Acad Sci USA. 96 (24), 13807-13812 (1999).
- Haworth, R. A., Hunter, D. R. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Arch Biochem Biophys. 195 (2), 460-467 (1979).
- Hunter, D. R., Haworth, R. A. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms. Arch Biochem Biophys. 195 (2), 453-459 (1979).
- Kwong, J. Q., Molkentin, J. D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart. Cell Metab. 21 (2), 206-214 (2015).
- Luongo, T. S., et al. The mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger is essential for Ca2+ homeostasis and viability. Nature. 545 (7652), 93-97 (2017).
- De Stefani, D., Patron, M., Rizzuto, R. Structure and function of the mitochondrial calcium uniporter complex. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 2006-2011 (2015).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-345 (2011).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabo, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Pan, X., et al. The physiological role of mitochondrial calcium revealed by mice lacking the mitochondrial calcium uniporter. Nat Cell Biol. 15 (12), 1464-1472 (2013).
- Kwong, J. Q., et al. The Mitochondrial Calcium Uniporter Selectively Matches Metabolic Output to Acute Contractile Stress in the Heart. Cell Rep. 12 (1), 15-22 (2015).
- Luongo, T. S., et al. The Mitochondrial Calcium Uniporter Matches Energetic Supply with Cardiac Workload during Stress and Modulates Permeability Transition. Cell Rep. 12 (1), 23-34 (2015).
- Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nat Rev Cardiol. 14 (4), 238-250 (2017).
- Logan, C. V., et al. Loss-of-function mutations in MICU1 cause a brain and muscle disorder linked to primary alterations in mitochondrial calcium signaling. Nat Genet. 46 (2), 188-193 (2014).
- Lewis-Smith, D., et al. Homozygous deletion in MICU1 presenting with fatigue and lethargy in childhood. Neurol Genet. 2 (2), e59 (2016).
- Tosatto, A., et al. The mitochondrial calcium uniporter regulates breast cancer progression via HIF-1alpha. EMBO Mol Med. 8 (5), 569-585 (2016).
- Cardenas, C., et al. Selective Vulnerability of Cancer Cells by Inhibition of Ca(2+) Transfer from Endoplasmic Reticulum to Mitochondria. Cell Rep. 15 (1), 219-220 (2016).
- Dedkova, E. N., Blatter, L. A.
- Florea, S. M., Blatter, L. A. The role of mitochondria for the regulation of cardiac alternans. Front Physiol. 1, 141 (2010).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).
- Bonora, M., et al. Subcellular calcium measurements in mammalian cells using jellyfish photoprotein aequorin-based probes. Nat Protoc. 8 (11), 2105-2118 (2013).
- Zima, A. V., Kockskamper, J., Mejia-Alvarez, R., Blatter, L. A. Pyruvate modulates cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in rats via mitochondria-dependent and -independent mechanisms. J Physiol. 550 (Pt 3), 765-783 (2003).
- Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 9-15 (1994).
- Zazueta, C., Sosa-Torres, M. E., Correa, F., Garza-Ortiz, A. Inhibitory properties of ruthenium amine complexes on mitochondrial calcium uptake. J Bioenerg Biomembr. 31 (6), 551-557 (1999).
- Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol Biol. 810, 219-234 (2012).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged dinuclear ruthenium amine complex specifically inhibits Ca2+ uptake into mitochondria in vitro and in situ in single cardiac myocytes. J Biol Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Chamberlain, B. K., Volpe, P., Fleischer, S. Inhibition of calcium-induced calcium release from purified cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles. J Biol Chem. 259 (12), 7547-7553 (1984).
