Summary
यहां, हम अलग mitochondria और प्रसंस्कृत कोशिकाओं में mitochondrial Ca2 + आमद के माप के लिए दो प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । पृथक mitochondria के लिए, हम विस्तार से एक प्लेट रीडर-ca के आधार2 + आयात परख ca2 + संवेदनशील डाई कैल्शियम ग्रीन-5N का उपयोग कर । प्रसंस्कृत कोशिकाओं के लिए, हम Ca का उपयोग कर एक फोकल माइक्रोस्कोपी विधि का वर्णन2 + डाई Rhod-2/
Abstract
Ca2 + mitochondria द्वारा हैंडलिंग एक महत्वपूर्ण कार्य कोशिकाओं की एक व्यापक स्पेक्ट्रम में दोनों शारीरिक और pathophysiological प्रक्रियाओं को विनियमित है । सही करने के लिए प्रवाह की क्षमता और ca के समाप्ति2 + से mitochondria की भूमिका का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है mitochondrial ca2 + इन प्रक्रियाओं में हैंडलिंग । इस रिपोर्ट में, हम mitochondrial Ca के माप के लिए दो विधियाँ मौजूद2 + दोनों पृथक mitochondria और कल्चर्ड कक्षों में हैंडलिंग । हम पहले विस्तार एक प्लेट रीडर-mitochondrial ca को मापने के लिए मंच आधारित2 + सीए2 + संवेदनशील डाई कैल्शियम ग्रीन-5N का उपयोग कर ले । प्लेट रीडर आधारित स्वरूप विशेष उपकरणों के लिए की जरूरत को दरकिनार, और कैल्शियम ग्रीन-5N डाई आदर्श अलग ऊतक mitochondria से सीए2 + को मापने के लिए अनुकूल है । हमारे आवेदन के लिए, हम mitochondrial Ca के माप का वर्णन2 + mitochondria में ले लो माउस दिल के ऊतकों से पृथक; हालांकि, इस प्रक्रिया को मापने के लिए लागू किया जा सकता mitochondrial Ca2 + ऐसे जिगर, कंकाल की मांसपेशी, और मस्तिष्क के रूप में अंय ऊतकों से पृथक mitochondria में ले । दूसरे, हम mitochondrial ca के माप के लिए एक फोकल माइक्रोस्कोपी आधारित परख का वर्णन2 + permeabilized कोशिकाओं में ca2 + संवेदनशील डाई Rhod-2/AM और 2-आयामी लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर इमेजिंग. इस permeabilization प्रोटोकॉल cytosolic डाई संदूषण समाप्त, mitochondrial Ca में परिवर्तन के विशिष्ट रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है2 +। इसके अलावा, लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी उच्च फ्रेम दर के लिए अनुमति देता है mitochondrial Ca2 + में तेजी से परिवर्तन पर कब्जा करने के लिए विभिन्न दवाओं या बाह्य समाधान में लागू एजेंट के जवाब में + । इस प्रोटोकॉल को मापने के लिए लागू किया जा सकता mitochondrial Ca2 + ऐसे कार्डियक myocytes और न्यूरॉन्स, और अमर सेल लाइनों के रूप में प्राथमिक कोशिकाओं सहित कई प्रकार के सेल में ।
Introduction
Mitochondria intracellular Ca2 + भंडारण और संकेतन की महत्वपूर्ण साइटों रहे हैं । अनुसंधान के दशकों का प्रदर्शन किया है कि mitochondria के लिए आयात और एकांत Ca2 + 1,2की क्षमता है । Mitochondria, हालांकि, केवल Ca के निष्क्रिय साइटों2 + भंडारण नहीं कर रहे हैं । Ca2 + mitochondrial डिब्बे में चयापचय उत्पादन और mitochondrial के सक्रियकरण-मध्यस्थता कोशिका मौत रास्ते, जो पहले से समीक्षा की गई है के विनियमन सहित मौलिक संकेत कार्य करता है3. चयापचय विनियमन के लिए, Ca2 + tricarboxylic एसिड चक्र के साथ ही श्वसन श्रृंखला परिसरों के तीन मैट्रिक्स-स्थानीयकृत dehydrogenases की गतिविधि को बढ़ाता है, mitochondrial ऊर्जा उत्पादन को बढ़ाने के लिए4,5 . mitochondrial ca के साथ2 + अधिभार और dysregulated mitochondrial ca2 + हैंडलिंग, ca2 + ट्रिगर mitochondrial पारगम्यता संक्रमण ताकना (MPTP) खोलने, mitochondrial भीतरी झिल्ली permeabilization करने के लिए अग्रणी, झिल्ली संभावित हानि, mitochondrial रोग, सूजन, टूटना और अंत में, कोशिका मृत्यु6,7,8,9. इस प्रकार, mitochondrial Ca2 + संकेत सीधे चयापचय नियंत्रण और MPTP-मौत धुरी के माध्यम से सेलुलर जीवन और मौत रास्ते दोनों प्रभावों ।
हाल के वर्षों में, वहां तेजी से mitochondrial ca के अध्ययन में ब्याज का विस्तार किया गया है2 + बड़े हिस्से में गतिशीलता के कारण mitochondrial ca के आणविक घटकों की पहचान के लिए2 + uniporter परिसर, एक mitochondrial इनर झिल्ली ट्रांसपोर्टर कि Ca के एक प्राथमिक मोड है2 + mitochondrial मैट्रिक्स में आयात 10,11,12. uniporter के इन संरचनात्मक और विनियामक उपइकाइयों की पहचान के लिए आनुवंशिक रूप से लक्ष्यीकरण की संभावना आगे लाया गया है mitochondrial सीए2 + mitochondrial समारोह और शिथिलता मिलाना और के अध्ययन की सुविधा का तांता uniporter परिसर और mitochondrial Ca के योगदान2 + 13,14,15रोग के लिए आमद । दरअसल, mitochondrial Ca2 + संकेत हृदय रोग से neurodegeneration को लेकर रोगों की एक विविध सरणी के विकृतियों में फंसाया गया है, और कैंसर16,17,18, 19,20.
mitochondrial ca के मौलिक महत्व को देखते हुए2 + चयापचय और कोशिका मृत्यु में संकेतन, और जैविक प्रणालियों की व्यापक पहुंच के साथ संयुक्त है कि mitochondrial ca2 + संकेतन प्रभावों, विधियों का आकलन करने के लिए mitochondrial ca2 + आमद बहुत रुचि के हैं. आश्चर्य नहीं, तकनीक और उपकरणों की एक किस्म को मापने के लिए mitochondrial Ca2 + विकसित किया गया है । इन तरीकों कि फ्लोरोसेंट ca2 +-संवेदनशील रंजक21,22 और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग ca2 + सेंसर mitochondria, जैसे cameleon और aequorin23के रूप में लक्षित के रूप में उपकरणों का उपयोग शामिल है, 24. इस अनुच्छेद के लक्ष्य के लिए विभिंन तरीकों और मॉडल सिस्टम जिसमें mitochondrial Ca2 + ले लो मापा जा सकता है पर प्रकाश डाला है । हम mitochondrial सीए2 + आमद क्षमता का आकलन करने के लिए दो प्रयोगात्मक तरीके पेश करते हैं । एक उदाहरण के रूप में कार्डियक mitochondria का उपयोग करना, हम विस्तार एक प्लेट रीडर-mitochondrial ca को मापने के लिए मंच आधारित2 + सीए2 + संवेदनशील डाई कैल्शियम ग्रीन-5N कि आदर्श पृथक ऊतक mitochondria के लिए अनुकूल है का उपयोग कर14 . NIH 3T3 कोशिकाओं का उपयोग करना, हम भी mitochondrial ca के माप के लिए एक फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग आधारित परख का वर्णन2 + permeabilized कोशिकाओं में ca का उपयोग कर2 + संवेदनशील डाई Rhod-2/
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Protocol
इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी विधियों को एमोरी विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल एवं उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
नोट: पहले भाग में mitochondrial Ca को मापने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया है2 + अलग कार्डियक mitochondria में आमद एक प्लेट रीडर का उपयोग कर.
1. रिएजेंट और समाधान
- mitochondrial अलगाव के लिए MS-EGTA बफर के ५०० मिलीलीटर बनाएं: २२५ मिमी mannitol, ७५ मिमी सुक्रोज, 5 मिमी 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES), 1 मिमी ईथीलीन ग्लाइकोल-बीआईएस (β-aminoethyl ईथर)-n, n, n ', N'-tetraacetic एसिड (EGTA), पीएच ७.४ के लिए समायोजित KOH के साथ । यह एक ०.२२ माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से निष्फल और 4 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान । MS-EGTA बफ़र उपयोग करने से पहले 4 ° c करने के लिए पूर्व-ठंडा है कि सुनिश्चित करें ।
- KCl बफर के १०० मिलीलीटर तैयार: १२५ मिमी KCl, 20 मिमी HEPES, 1 मिमी KH2पीओ4, 2 मिमी MgCl2, ४० माइक्रोन EGTA और पीएच KOH के साथ ७.२ करने के लिए समायोजित । यह कमरे के तापमान पर स्टोर ।
- dimethyl sulfoxide (DMSO) में 1 मिमी कैल्शियम ग्रीन-5N स्टॉक तैयार करें । कैल्शियम ग्रीन-5N स्टॉक aliquotted और-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
-
सीए2 + के लिए सब्सट्रेट तैयार करें ।
- 1 मीटर सोडियम पाइरूवेट, पीएच ७.४ तैयार करें । यह aliquots में-20 ° c में स्टोर ।
- तैयार ५०० mM malate, पीएच ७.४ । यह aliquots में-20 ° c में स्टोर ।
2. कार्डियक Mitochondria का अलगाव
- संस्थागत मानकों के अनुसार माउस को Euthanize ।
नोट: इच्छामृत्यु के हमारे संस्थागत अनुमोदित विधि के लिए, चूहों isofluorane साँस लेना द्वारा anesthetized थे और गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन द्वारा बलिदान. - छाती गुहा खोलने के द्वारा दिल ले लीजिए, पसलियों के दोनों ओर के साथ काटने, दिल पार्श्व, दूर डायाफ्राम काटने, और दिल के ऊतकों उत्पाद ।
नोट: इस प्रोटोकॉल में, mitochondrial अलगाव एक पूरे दिल से किया जाता है एक वयस्क माउस से एकत्र (लगभग १२० मिलीग्राम), 3-4 प्रयोगों के लिए पर्याप्त होना चाहिए जो. जिगर के रूप में अंय mitochondria-अमीर ऊतकों से mitochondrial अलगाव के लिए, अप करने के लिए २०० ऊतक के एमजी प्रोटोकॉल के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है वर्णित है । - सभी रक्त निलय से बाहर निचोड़ा है सुनिश्चित करना है कि बर्फ ठंडा 1x फास्फेट के 25 मिलीलीटर में अच्छी तरह से कुल्ला ऊतक (पंजाब) ।
नोट: हार्ट पर्याप्त कुल्ला किया जाएगा जब तरल दिल से निचोड़ा स्पष्ट चलाता है । - तेज कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर बर्फ ठंडा 1x पंजाब के 5 मिलीलीटर में छोटे टुकड़ों में दिल कीमा बनाया हुआ ।
- पंजाबियों और हस्तांतरण कीमा बनाया हुआ दिल ऊतक एक पूर्व ठंडा 7 मिलीलीटर ग्लास-teflon dounce homogenizer एक ०.१० से ०.१५ mm मंजूरी के साथ त्यागें ।
- बर्फ के 5 मिलीलीटर-शीत MS-EGTA बफर जोड़ें, और ऊतक टुकड़े अब दिखाई दे रहे हैं जब तक नमूना homogenize (लगभग 11 स्ट्रोक).
नोट: अधिक नहीं homogenize ऊतक के रूप में लक्ष्य को बरकरार और कार्यात्मक mitochondria प्राप्त है । - homogenate को 15 एमएल ट्यूब पर ट्रांसफर करें ।
- 4 ° c पर ६०० x g पर homogenate के लिए 5 मिनट गोली नाभिक और अटूट कोशिकाओं के लिए ।
- एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण और यह १०,००० x g पर 4 ° c पर 10 गोली mitochondria को मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
- supernatant को त्यागें और mitochondrial गोली बर्फ पर रखें ।
- mitochondrial गोली दो बार धो बर्फ ठंडा MS-EGTA बफर का उपयोग कर । प्रत्येक धोने के लिए, एमएस-EGTA बफर के 5 मिलीलीटर में mitochondrial गोली reसस्पेंड, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १०,००० x g पर यह केंद्रापसारक, और supernatant त्यागें ।
- अंतिम धोने के बाद, supernatant को त्याग दें और बर्फ के ठंडे MS-EGTA बफ़र के १०० μL में mitochondria को पुनः निलंबित करें । बर्फ पर mitochondria रखें ।
नोट: Mitochondria 1 घंटे के भीतर प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । - उपाय mitochondrial प्रोटीन एकाग्रता का उपयोग कर एक ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख26।
3. प्लेट रीडर-Mitochondrial कैल्शियम की माप के आधार पर ले लो
नोट: यहाँ, यह mitochondrial Ca का विश्लेषण करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है2 + एक बहुपद्वति प्लेट इंजेक्टर के साथ सज्जित रीडर का उपयोग कर ले. कैल्शियम ग्रीन पढ़ने की क्षमता के साथ कोई प्लेट रीडर-5N प्रतिदीप्ति (उत्तेजना/506/532 एनएम के उत्सर्जन) स्वचालित रिएजेंट इंजेक्टर के साथ एक काइनेटिक मोड में प्रकाश से रक्षा की प्रतिक्रिया रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
- कार्यक्रम प्लेट रीडर करने के लिए कैल्शियम ग्रीन के एक काइनेटिक पढ़ा-माप के साथ 5N प्रतिदीप्ति १,००० एस के एक कुल परख समय के लिए हर दूसरे लिया प्रदर्शन करने के लिए, कार्यक्रम एजेंट इंजेक्शन के लिए 5 μL का वितरण करने के लिए CaCl2 समाधान में 30 एस, १५० एस, ३०० एस , ४८० एस, और ६९० एस समय अंक ।
नोट: CaCl2 इंजेक्शन के समय उपयोगकर्ता परिभाषित कर रहे हैं, और प्रयोगात्मक जरूरतों के अनुसार के लिए समायोजित किया जा सकता है । - प्रधानमंत्री CaCl2 समाधान के साथ रिएजेंट इंजेक्टर इस्तेमाल किया जाएगा ।
नोट: CaCl की एकाग्रता2 समाधान उपयोगकर्ता परिभाषित किया गया है, और बाद के रन में समायोजित कर सकते हैं अनुमापन की राशि Ca2 + MPTP खोलने को ट्रिगर करने के लिए आवश्यक. - जोड़ें एक ९६ अच्छी तरह से थाली के एक व्यक्ति को mitochondria के २०० μg ।
- उपयुक्त वॉल्यूम KCl बफ़र के लिए अच्छी तरह से जोड़ें कि mitochondria और KCl बफ़र का कुल वॉल्यूम १९७ μL के लिए आता है ।
- 1 मीटर पाइरूवेट के 1 μL, और mitochondria मिश्रण को ५०० mM malate की 1 μL डालें । प्लास्टिक धीरे मिश्रण करने के लिए, और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए सब्सट्रेट के साथ mitochondria मशीन mitochondria बनने के लिए अनुमति देने के लिए सक्रिय हो ।
- 1 मिमी कैल्शियम ग्रीन-5N शेयर 1 μL जोड़ें । pipetting द्वारा धीरे से मिलाएं ।
नोट: कैल्शियम ग्रीन-5N डाई के अलावा निम्नलिखित प्रकाश से प्रतिक्रिया की रक्षा. - पूर्व क्रमादेशित काइनेटिक प्रोटोकॉल शुरू और कैल्शियम ग्रीन-5N प्रतिदीप्ति की निगरानी ।
4. रिएजेंट और समाधान
नोट: दूसरा भाग mitochondrial Ca के फोकल इमेजिंग के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया है2 + संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं में
- Tyrode का समाधान करें (१३० mm NaCl, 4 mm KCl, 2 mm CaCl2, 1 mm MgCl2, 10 mm ग्लूकोज, और 10 mm HEPES, पीएच ७.२ कोह के साथ) । यह 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । यह उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान के लिए गर्म ।
- वाश सॉल्यूशन तैयार करें (१०० mM पोटेशियम एसीटेट, 15 मिमी KCl, 5 मिमी KH2पीओ4, 5 मिमी मिलीग्राम-एटीपी, ०.३५ मिमी EGTA, ०.१२ मिमी CaCl2, ०.७५ मिमी MgCl2, 10 मिमी phosphocreatine, 10 मिमी HEPES, KOH के साथ पीएच ७.२). यह 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । यह उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान के लिए गर्म ।
- Permeabilization समाधान तैयार करें, जिसमें वाश सॉल्यूशन में ०.००५% saponin हैं । इसे रोज़ ताजा तैयार करें ।
- तैयार 0 Ca2 + आंतरिक समाधान (१०० mm पोटेशियम एसीटेट, 15 मिमी KCl, ०.३५ मिमी EGTA, ०.७५ मिमी MgCl2, 10 मिमी HEPES, पीएच KOH के साथ ७.२ करने के लिए समायोजित) । यह 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । यह उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान के लिए गर्म ।
- आंतरिक समाधान तैयार करें जिसमें Ca2 +है । ऊपर आंतरिक समाधान के लिए2 CaCl जोड़ें मुक्त Ca2 +के वांछित एकाग्रता तक पहुंचने के लिए । जोड़ने के लिए CaCl2 की मात्रा MaxChelator प्रोग्राम (maxchelator.stanford.edu) का उपयोग कर परिकलित की जाती है ।
- DMSO में 1 mM Rhod-2/AM शेयर तैयार करें और उपयोग करने तक-20 ° c पर इसे स्टोर ।
- DMSO में 1 mM MitoTracker ग्रीन स्टॉक तैयार करें और इसका उपयोग करने तक-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर कर लें ।
5. इमेजिंग के लिए चढ़ाना कोशिकाओं
- धो 22 एक्स 22 सेमी2 ग्लास coverslips १००% इथेनॉल के साथ और coverslips शुष्क हवा के लिए अनुमति देते हैं ।
- ग् coverslips को 6-वेल टिशू कल्चर डिश के डिब् वेल्स में रखें ।
नोट: Coverslips सेल लगाव को बढ़ावा देने के लिए laminin, पाली-एल-lysine, या इसी तरह के मैट्रिक्स के साथ लेपित किया जा सकता है । - Trypsinize और प्लेट इमेजिंग के दिन पर लगभग ७०% संगम के लिए लक्ष्य coverslips पर कोशिकाओं ।
6. Rhod-2/AM और MitoTracker ग्रीन के साथ सेल लोड हो रहा है
- Rhod-2/AM-MitoTracker ग्रीन वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें । Rhod के 20 μL जोड़ें-2/AM 1 mm stock, ०.२ μL ऑफ़ MitoTracker ग्रीन 1 एमएम स्टॉक, एंड २.५ μL ऑफ़ 20% pluronic F-१२७ to 1 मिलि of Tyrode ' s solution. कार्य समाधान में Rhod-2 की अंतिम एकाग्रता 20 µ मीटर है और MitoTracker ग्रीन के अंतिम एकाग्रता २०० एनएम है ।
- धीरे coverslip से विकास मीडिया को हटा दें ।
नोट: एक धोने कदम समाधान इसके अलावा डाई करने से पहले आवश्यक नहीं है । - जोड़ें Rhod-2/AM-MitoTracker ग्रीन समाधान coverslip पर एक dropwise फैशन में जब तक coverslip सिर्फ कवर किया जाता है (लगभग 3-4 बूंदें प्रति coverslip) ।
- कोशिकाओं को रंगों के साथ लोड करने के लिए अनुमति देने के लिए प्रकाश से सुरक्षित कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए यह मशीन ।
- De-esterify the Rhod-2/ धीरे Rhod-2/AM-MitoTracker ग्रीन समाधान निकालें, यह ताजा कमरे के तापमान Tyrode समाधान के साथ बदलें, और प्रकाश से सुरक्षित कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए यह मशीन ।
7. Mitochondrial Rhod की फोकल इमेजिंग-2/AM और MitoTracker ग्रीन प्रतिदीप्ति
- coverslip को माइक्रोस्कोप इमेजिंग चैंबर में ट्रांसफर करें और चैंबर को वॉश सॉल्यूशन के साथ भरें ।
- 40X पर चरण कंट्रास्ट में कक्ष अवलोकन के लिए सेटिंग्स के अंतर्गत, फ़ोकस समायोजित करें जब तक कक्ष दृश्यमान और फ़ोकस में हों ।
-
Rhod-स्थानीयकृत डाई को बनाए रखते हुए cytosol-स्थानीयकृत mitochondria-2 को हटाने के लिए Rhod-2/AM-MitoTracker ग्रीन लोड कोशिकाओं की प्लाज्मा झिल्ली Permeabilize ।
- coverslip से धो समाधान निकालें ।
- यह लगभग 1 मिनट के लिए Permeabilization समाधान के साथ बदलें ।
- नेत्रहीन permeabilization प्रक्रिया भर में प्लाज्मा झिल्ली आकृति विज्ञान की निगरानी । Permeabilized कोशिकाओं एक roughened सतह का विकास होगा ।
- permeabilization पूर्ण होने पर, तुरंत permeabilization समाधान निकालें और 0 Ca2 + आंतरिक समाधान के साथ प्रतिस्थापित करें ।
- इसके साथ ही छवि Rhod-2 प्रतिदीप्ति (उत्तेजना ५५९ एनएम लेजर लाइन और उत्सर्जन 575-675 एनएम के बीच तरंग दैर्ध्य पर एकत्र का उपयोग कर) और MitoTracker ग्रीन प्रतिदीप्ति (उत्तेजना लेजर लाइन और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के बीच में एकत्र का उपयोग 488nm 505-525 एनएम) । Rhod-2 और MitoTracker हरे रंग की एक स्पष्ट colocalization प्रदर्शित permeabilized कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित ।
- माइक्रोस्कोप लेजर घटाएं और ऐसी सेटिंग्स हासिल करें कि mitochondrial Rhod-2 प्रतिदीप्ति मंद और बस दिखाई दे ।
- विशिष्ट आवेदन के लिए एक उचित फ्रेम दर और समय पाठ्यक्रम में 2-आयामी स्कैन प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का चयन करें । mitochondrial Ca2 +में परिवर्तनों की कैनेटीक्स को सटीकता से कैप्चर करने के लिए कम से 30 फ़्रेम/
- कोशिकाओं या माइक्रोस्कोप फोकस परेशान बिना 0 Ca2 + आंतरिक समाधान निकालें ।
- छवि प्राप्ति प्रारंभ करें ।
- जोड़ें Ca2 +-परिपूर्ण आंतरिक समाधान 10 एस समय बिंदु पर या तो मैंयुअल रूप से या एक छिड़काव प्रणाली के साथ ।
- छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में mitochondrial Rhod-2 और MitoTracker ग्रीन सिग्नल के बीच colocalization के क्षेत्रों को शामिल करने के लिए ब्याज के क्षेत्र (ROIs) का चयन करें ।
नोट: रिकॉर्डिंग के प्रत्येक समय बिंदु के लिए मनमाने ढंग से प्रतिदीप्ति (एफ) मूल्यों प्रत्येक रॉय के लिए प्राप्त कर रहे हैं । ये मान पृष्ठभूमि घटाया और सामान्यीकृत प्रारंभिक प्रतिदीप्ति करने के लिए हैं (से पहले Ca2 + इसके अलावा; एफ0) और डेटा प्रस्तुति और mitochondrial Ca2 +के परिवर्तन के आयाम के ठहराव के लिए समय के साथ f/च0 के रूप में रची ।
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Representative Results
चित्रा 1 से पता चलता है mitochondrial ca2 + अलग कार्डियक mitochondria में लो माप प्लेट रीडर आधारित मंच और Ca2 + डाई कैल्शियम ग्रीन-5N का उपयोग कर । नियंत्रण शर्तों के तहत (चित्र 1a), कार्डिएक mitochondria KCl बफर कैल्शियम ग्रीन-5N युक्त में निलंबित कर दिया और फिर CaCl की अनुक्रमिक दालों के साथ चुनौती दी गई2 (5 μL एक ०.६ मिमी CaCl2 समाधान) 30 एस, १५० एस, ३०० एस, ४८० में जोड़ा एस, और ६९० एस समय अंक । समय और CaCl की संख्या2 अतिरिक्त उपयोगकर्ता द्वारा समायोजित किया जा सकता है के लिए अनुमति देने के लिए पूर्ण mitochondrial के आगे जोड़ Ca के2 + बाद में जोड़ से पहले । इस परख में, कैल्शियम ग्रीन में बढ़ जाती है-5N संकेत ऊंचा बफर सीए2 + स्तर को प्रतिबिंबित । के रूप में mitochondria आयात ca2 +, ca2 + बफ़र से निकाल दिया गया है और कैल्शियम ग्रीन-5N प्रतिदीप्ति घटाता है । महत्वपूर्ण बात, ca के तीसरे अतिरिक्त2 +, कैल्शियम ग्रीन-5N प्रतिदीप्ति वक्र एक अचानक और तेज मोड़ ऊपर की ओर, के बजाय ca2 + बफर से दूर करने के लिए जारी रखने के लिए और चित्र 1a में लाल तीर से संकेत दिया जाता है . प्रतिदीप्ति में यह अचानक वृद्धि mitochondrial Ca2 + अधिभार और MPTP खोलने को दर्शाता है । ca की कुल राशि2 + MPTP सक्रियण से पहले mitochondria द्वारा लिया गया mitochondrial ca2 + क्षमता को प्रतिबिंबित करता है, और μmol ca2 +/mg प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया जा सकता है । समय और कैल्शियम की सांद्रता के लिए समायोजन करने से जोड़ा गया, 2 Ca की राशि+ पारगम्यता संक्रमण को ट्रिगर करने के लिए आवश्यक निर्धारित किया जा सकता. चित्रा 1bमें, mitochondria 10 माइक्रोन Ru360, mitochondrial Ca के एक अच्छी तरह से विशेषता अवरोधक के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पूर्व इलाज किया गया2 + uniporter परिसर27. Ru360 रोकता uniporter-निर्भर mitochondrial ca2 + , और यह कदम वार कैल्शियम ग्रीन-5N प्रतिदीप्ति प्रत्येक Ca2 + इसके अलावा निंनलिखित में बढ़ द्वारा सबूत है ।
Rhod का उपयोग कर mitochondrial कैल्शियम की फोकल इमेजिंग के लिए-2/AM, हम NIH 3T3 कोशिकाओं से प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं । MitoTracker ग्रीन एक mitochondria-चयनात्मक डाई है जो तरजीही दाग mitochondrial नेटवर्क (चित्र 2a) है । प्लाज्मा झिल्ली के बाद saponin-मध्यस्थता permeabilization, cytosolic Rhod-2 दूर धोया जाता है, एक Rhod-2 सना हुआ mitochondrial नेटवर्क है जो MitoTracker ग्रीन (चित्रा 2a) के साथ सह-informations छोड़ने. Rhod-2 भी गैर-mitochondrial संरचनाओं में जमा हो सकता है, इसलिए रॉय के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए MitoTracker ग्रीन और Rhod-2 के बीच सह स्थानीयकरण के क्षेत्रों का ध्यान केंद्रित करना चाहिए । नियंत्रण कोशिकाओं में, एक Ca के अलावा2 +-परिपूर्ण आंतरिक समाधान 2 माइक्रोन मुक्त ca2 + युक्त Rhod-2 प्रतिदीप्ति में तेजी से वृद्धि का कारण बनता है, जो बाधित है जब uniporter जटिल 10 माइक्रोन Ru360 (चित्रा बी2) के साथ बाधित है.
चित्रा 1: Mitochondrial Ca2 + अलग कार्डियक mitochondria में ले लो । (क) सापेक्ष कैल्शियम ग्रीन-5N प्रतिदीप्ति ऑफ कंट्रोल हार्ट mitochondria का रेखांकन और (ख) mitochondria पूर्व 10 माइक्रोन Ru360 के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इलाज, ०.६ mM μL2 (काले तीर) के 5 CaCl के साथ चुनौती दी । Mitochondrial Ca2 + अधिभार प्रेरित पारगम्यता संक्रमण लाल तीर के साथ संकेत दिया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: permeabilized कोशिकाओं में mitochondrial Ca के प्रतिनिधि विश्लेषण2 + । (क) 3T3 कोशिकाओं की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवि rhod-२ (लाल) और MitoTracker ग्रीन (ग्रीन) से भरी हुई और rhod के साथ MitoTracker के बाद की विलयित छवियाँ-२ और permeabilization ग्रीन (पीली) saponin. (ख) Rhod-2 फ्लोरोसेंट ट्रेस 2 µ एम नि: शुल्क Ca के आवेदन के दौरान एक एकल 3T3 सेल से2 + आंतरिक समाधान नियंत्रण शर्तों (ब्लैक ट्रेस) के तहत या 10 µ एम Ru360 पूर्व उपचार (रेड ट्रेस) के बाद । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
यहां, हम दो अलग दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए उपाय mitochondrial Ca2 + आमद । प्लेट रीडर आधारित कैल्शियम ग्रीन-5N विधि extramitochondrial ca2 + स्तर पर नज़र रखता है और एक ca2 + है कि अच्छी तरह से अलग mitochondria में माप के लिए उपयुक्त है । जब तक हम अलग murine कार्डियक mitochondria से प्रतिनिधि परिणाम दिखाया है, इस परख आसानी से जिगर, कंकाल की मांसपेशी सहित उच्च mitochondrial बहुतायत के साथ ऊतकों से पृथक mitochondria के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और मस्तिष्क । इसके अलावा, प्लेट रीडर प्रणाली प्रयोगशालाओं के लिए एक आदर्श विकल्प हो सकता है जहां विशेष उपकरण परंपरागत रूप से Ca के लिए इस्तेमाल किया2 + माप, fluorometers की तरह, तुरंत उपलब्ध नहीं हो सकता है । सीमित अधिक समय तक अवधि है कि एक प्लेट रीडर स्कैन कर सकते है और पूर्व के लिए की जरूरत कार्यक्रम एजेंट जोड़ इस तकनीक की एक कमजोरी fluorometers की तुलना में हो सकता है, तथापि, लागत और fluorometers की उपलब्धता इस लाभ पल्ला झुकना हो सकता है । सीए की एकाग्रता को अलग करके2 + रिएजेंट इंजेक्टर में, ca2 + की राशि है कि mitochondria MPTP खोलने ट्रिगर करने से पहले एकांत करने में सक्षम हैं (mitochondrial सीए2 + क्षमता) निर्धारित किया जा सकता है.
फोकल इमेजिंग प्रोटोकॉल है कि हम Rhod के लिए वर्णन-2/AM माप के mitochondrial Ca2 + संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं के लिए आदर्श है और यह भी प्राथमिक कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इस विधि में, प्लाज्मा झिल्ली saponin के साथ permeabilized है, जो cytosolic डाई के वॉशआउट के लिए अनुमति देता है । organelles में केवल डाई फंस इस प्रक्रिया के बाद रहता है, mitochondrial प्रतिदीप्ति की सटीक और विशिष्ट माप की अनुमति । इसके अलावा, इस permeabilized सेल परख extramitochondrial Ca पर प्रायोगिक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है2 + स्तर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उपयोगकर्ता परिभाषित शर्तों जिसके तहत mitochondria उजागर कर रहे हैं. Rhod-2/AM mitochondrial Ca के फोकल इमेजिंग2 + बरकरार, गैर permeabilized कोशिकाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन इस डाई लोड हो रहा है और de-esterification के अनुकूलन की आवश्यकता है एक mitochondria-विशिष्ट Rhod-2 स्थानीयकरण सुनिश्चित करने के लिए28। Rhod-2/am विधि की ताकत है कि Rhod-2/am व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और डाई आसानी से सेल प्रकार की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू किया जा सकता है । Rhod-2 डाई के स्थानीयकरण, तथापि, एक सीमा को माना जाता है । mitochondria-विशिष्ट Rhod-2 प्रतिदीप्ति, जैसे MitoTracker ग्रीन के रूप में एक दूसरे वर्णक्रम-अलग डाई, की माप सुनिश्चित करने के लिए इमेजिंग करने से पहले mitochondria दाग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग Ca2 + mitochondria करने के लिए लक्षित सेंसर इस मुद्दे को दरकिनार कर सकते हैं, तथापि, कोशिकाओं को transfected/transduced संवेदक के निर्माण के साथ और प्रोटीन व्यक्त करने के लिए पर्याप्त समय है की जरूरत है । यह हमेशा सीमित अस्तित्व के समय के साथ प्राथमिक कोशिकाओं के लिए आदर्श नहीं है, और डाई लोडिंग एक timesaving प्रक्रिया हो सकती है ।
दोनों प्रोटोकॉल में, हम uniporter जटिल अवरोध करनेवाला Ru360 का उपयोग करने के लिए प्रभाव mitochondrial कै2 + तांता निषेध वर्णन । Ru360 uniporter अवरोध और तारीख करने के लिए सोने के मानक है, यह इस tranporter के केवल ज्ञात विशिष्ट अवरोधक है29. वैकल्पिक रूप से, ruthenium लाल भी इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, ruthenium लाल एक विशिष्ट uniporter अवरोध करनेवाला है कि यह भी बाधित करने के लिए दिखाया गया है Ca2 + sarcoplasmic जालिका से रिलीज30. बिगड़ा mitochondrial ca2 + हैंडलिंग mitochondrial शिथिलता का संकेत हो सकता है, के रूप में uniporter परिसर पर निर्भर सीए2 + परिवहन mitochondrial झिल्ली क्षमता निर्भर है, और विस्तार से, इस श्वसन श्रृंखला समारोह पर निर्भर है . इस प्रकार, mitochondrial युग्मकों, जैसे carbonyl साइनाइड-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) और carbonyl साइनाइड m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) जो mitochondrial झिल्ली क्षमता का अपव्यय करते हैं, को भी नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जा सकता है यौगिकों को बाधित करने के लिए mitochondrial Ca2 + आमद । चूंकि mitochondria intracellular ca के साइटों2 + भंडारण, mitochondria ca के रूप में कार्य कर सकते है2 + intracellular अंतरिक्ष के भीतर बफ़र्स । इस प्रकार, mitochondrial ca में परिवर्तन2 + हैंडलिंग cytosolic ca2 + परिदृश्य के आकार को प्रभावित कर सकता है । रोग की स्थिति की बढ़ती संख्या को देखते हुए जहां mitochondrial ca2 + गतिशीलता एक भूमिका निभा सकता है, यहां सचित्र तरीके mitochondrial Ca के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है2 + पशु मॉडल और के सेलुलर मॉडल में आमद रोग.
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Disclosures
लेखकों की रिपोर्ट को लेकर कोई खुलासे नहीं हुए हैं ।
Acknowledgments
इस काम को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (J.Q.K.) से ग्रांट फंडिंग द्वारा सपोर्ट किया गया ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors | Biotek | ||
| Tissue Homogenizer | Kimble | 886000-0022 | |
| 22 x 22 mm coverslips | Corning | 2850-22 | |
| 96 well plate | Corning | 3628 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| Calcium Green-5N | Invitrogen | C3737 | |
| MitoTracker green FM | Invitrogen | M7514 | |
| Rhod-2, AM | Invitrogen | R1244 | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| Sucrose | EMD Millipore | 8510 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| EGTA | Sigma | E8145 | |
| Potassium chloride | Fisher | BP366-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| L-malic acid | Sigma | M1125 | |
| Calcium chloride | Sigma | C4901 | |
| Potassium acetate | Fisher | BP364-500 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Phosphocreatine disodium salt | Sigma | P7936 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Ru360 | Calbiochem | 557440 |
References
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