Summary
Este método describe la colocación de injertos de interposición de la vena en conejos, la transducción de los injertos y el logro de la expresión del transgen resistente. Esto permite la investigación de funciones fisiológicas y patológicas de los transgenes y sus productos proteicos en las venas injertadas y pruebas de terapias genéticas para la enfermedad de injerto de vena.
Abstract
Cirugía de bypass de vena del injerto es un tratamiento común para la enfermedad arterial oclusiva; sin embargo, el éxito a largo plazo está limitada por la falta del injerto por trombosis, hiperplasia intimal y aterosclerosis. El objetivo de este artículo es demostrar un método para colocar injertos de interposición venosa bilateral en un conejo, luego transducing los injertos con un vector de transferencia génica que alcanza expresión transgen resistente. El método permite la investigación de las funciones biológicas de los genes y sus productos de proteína en la homeostasis de injerto de vena normal. También permite la prueba de transgenes para las actividades que podrían evitar el fracaso del injerto de vena, por ejemplo., si la expresión de un transgen previene el crecimiento neointimal, reduce la inflamación vascular y reduce la aterosclerosis en conejos alimentados con una dieta alta en grasas. Durante una cirugía inicial de supervivencia, los segmentos de la vena yugular externa izquierda y derecha son suprimidos y colocados bilateralmente como invertida fin-a-lado de la arteria carótida común interposición injertos. Durante una segunda cirugía de supervivencia, realizada 28 días después, cada uno de los injertos es aislado de la circulación con clips vasculares y los lúmenes están llenos (a través de una arteriotomía) con una solución que contiene un vector adenoviral de (HDAd) dependiente de la ayuda. Después de una incubación de 20 min, se aspira la solución del vector, se repara la arteriotomía y se restaura el flujo. Las venas son cosechadas en momentos de protocolos experimentales individuales. El retraso de 28 días entre la colocación del injerto y la transducción de señales es necesario para asegurar la adaptación del injerto de la vena a la circulación arterial. Esta adaptación evita la rápida pérdida de transgene expresión que ocurre en injertos de vena transduced antes o inmediatamente después de injertar. El método es único en su capacidad para lograr la expresión del transgen durable, estable en las venas injertadas. En comparación con otros modelos de injerto de vena de animal grande, los conejos tienen ventajas de bajo costo y fácil manejo. En comparación con modelos de injerto de vena roedores, los conejos tienen vasos más grandes y más fácil de manipular que proporcionan abundante tejido para análisis.
Introduction
La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica en la que acumulación del lípido y la inflamación en la pared de los vasos sanguíneos conducen a estrechamiento del lumen del vaso, ataques cardíacos, trazos y pérdida de extremidades1,2. Intervenciones percutáneas (por ej., angioplastia y stenting) y terapia médica (e.g., agentes estatinas y antiagregantes) son tratamientos útiles para la ateroesclerosis; sin embargo, a menudo son ineficaces en el tratamiento de enfermedad obstructiva severa tanto en las circulaciones coronarias y periféricas. Injertos de derivación, con segmentos de vena autógena, sigue siendo un procedimiento común para el tratamiento de pacientes con enfermedad vascular periférica y coronaria severa, difusa3,4. Sin embargo, la vena injertos colocados en ambos la coronaria y circulaciones periféricas tienen pobres tasas de permeabilidad a largo plazo. En la circulación coronaria, aproximadamente 10-20% de los injertos se ocluyen en 1 año y 50% de la vena se ocluyen por 10 años5,6. En la circulación periférica, las tasas de fracaso del injerto de la vena son 30-50% en 5 años7.
La terapia génica es un método atractivo para la prevención de fracaso del injerto de vena porque puede entregar un producto del gene terapéutico precisamente en el sitio de la enfermedad. En consecuencia, numerosos estudios preclínicos han probado la vena del injerto gene terapia8,9. Sin embargo, esencialmente todos estos estudios han examinado la eficacia en el temprano tiempo puntos (2-12 semanas)10,11,12,13,14,15, 16 , 17. somos conscientes de ninguna evidencia de que intervenciones de terapia del gene pueden proporcionar una duradera protección (años) contra el último fracaso del injerto de vena que típicamente resulta de neointimal hiperplasia y aterosclerosis4. Hemos desarrollado un método que permite la expresión del transgen durable en las venas injertadas y así permite la prueba de las intervenciones de terapia génica en momentos finales y principios. Para lograr la expresión del transgen durable, el método incorpora HDAd vectores y una estrategia de transducción retrasada. Vectores de HDAd proporcionan expresión transgénica prolongada porque carecen de genes virales, evitar el reconocimiento y rechazo de células transduced por el sistema inmune18,19,20, 21. transducción retrasado (realizadas 28 días después de la colocación de un injerto) previene la pérdida de células transduced durante el proceso de arterialización que ocurre pronto después del injerto22.
Otros métodos que alcanzan expresión transgen terapéutico en la pared de la vena del injerto se basan en la transducción del injerto de vena en el momento del injerto colocación10,11,12,15,16 ,17. Cuando se mide en serie, expresión del transgen mediante este enfoque declina rápidamente después de la transducción de la22,23. Por consiguiente, desde este enfoque los estudios no han examinado la eficacia más allá de 12 semanas tras el injerto de vena, con más no evaluaban eficacia más allá de 4 semanas. En cambio, nuestro método logra injerto vena transgene expresión que persiste estable durante al menos 24 semanas y basados en estudios similares realizados en arterias probablemente continúa mucho más de22,24. Somos conscientes de ninguna otra vena injerto gene terapia intervención que alcanza expresión del transgén estable de esta duración.
Hemos utilizado un modelo de conejo para desarrollar nuestro método. Otros han utilizado roedores, conejos o animales más grandes para poner a prueba la vena del injerto gene terapia10,11,12,15,16,17,25, 26. En comparación con modelos de roedores, los conejos son más caros y están sujetos a requisitos regulatorios más estrictos. Sin embargo, en comparación con los animales más grandes (por ej., cerdos y perros), los conejos son mucho menos caros de comprar y de la casa y mucho más fácil de manejar. Por otra parte, buques de conejo se asemejan a los vasos humanos fisiológicamente27, son lo suficientemente grandes que pueden ser utilizados para las pruebas de intervencionismo percutáneo28,29, y proporcionan suficiente tejido que múltiples criterios de valoración (e.g., histología, RNA de la proteína) puede ser examinado usando un solo vaso sanguíneo muestra22,30. Además, cuando los conejos con injertos venosos son alimentados con una dieta alta en grasas, se convierten de la vena del injerto aterosclerosis31,32, que es una causa común de la arteria coronaria bypass vena del injerto fracaso4,5 . Estos injertos de vena de conejo aterosclerótica pueden servir como sustrato para las intervenciones de terapia génica con este método de prueba. El protocolo siempre puede ayudar a los investigadores a dominar las habilidades técnicas necesarias para lograr la expresión del transgen durable en injertos de vena de conejo.
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Protocol
Todos los protocolos de animales y los estudios fueron aprobados por la Universidad de Washington oficina de bienestar de los animales.
1. antes de la operación (para todas las cirugías)
- Anestesiar al conejo con 30 mg/kg ketamina y 1,5 mg/kg xilacina por inyección intramuscular (IM) en los músculos paraspinous.
Nota: Los alimentos y el agua no se limitan antes de la cirugía. - Espera de suficiente profundidad de la anestesia, configurar las tablas de la sala de preparación y la sala de operaciones (OR).
- Preparar la sala de preparación para afeitar el cuello del conejo y la colocación del puerto vía intravenosa (IV) en el oído (sólo cirugía de supervivencia). Coloque el ungüento oftálmico, parche de fentanilo (cirugía de supervivencia), cortapelos, almohadilla de preparación alcohol, 24 G x ¾" catéter, Puerto de inyección y cinta quirúrgica sobre la mesa de preparación.
- En la o, el equipo de monitoreo y asociados sondas (electrocardiograma (ECG), oximetría de pulso (SpO2) y la temperatura). Preparación de la bomba IV con una bolsa de IV salina de 100 mL con una aguja de 18 G o 19 G y fijar el caudal como 10 mL/h/kg (sólo cirugía de supervivencia). Configurar el equipo de oxígeno e isoflurano con una ojiva (vena cirugías de injerto o de la cosecha).
- Para ayudar a asegurar la nariz a los conejos, enrolle una tira de gasa alrededor del tubo que suministra gas a la nariz. Este bucle debe rodear el tubo donde se conecta a la nariz. Los extremos libres de la franja de Gasa ambos deben ser aproximadamente 45 cm de largo. Poner la nariz (con una gasa atada) en la cabecera de la mesa.
- Encienda el agua circulante o manta sobre la mesa OR de calentamiento de aire forzado. En la cobija, coloque una toalla enrollada como un soporte de cuello y coloque la placa de electrodo dispersivo de electrocauterización.
- Como un analgésico local, combinar en una jeringa de 1 mL de lidocaína HCl al 2% y 1 mL de bupivacaína 0.5% HCl. diluir el virus a la concentración deseada (aquí, utilice 2 x 1011 partículas virales/mL para la HDAd) en DMEM estéril y mantener en hielo (sólo cirugía de transferencia de genes).
- Después de alcanza una adecuada profundidad anestésica, preparar el conejo para la cirugía.
Nota: Para probar la falta de un reflejo pedal retirada para asegurar la adecuada profundidad anestésica. Seguir controlar el reflejo pedal a lo largo de la cirugía.- Aplicar ungüento oftálmico en ojos de conejo.
- Para permitir la colocación de una sonda de temperatura rectal, presione con los dedos enguantados justo encima del recto y mover los dedos hacia el ano para eliminar deposiciones recto del conejo.
- Afeitarse el conejo de la fosa esternal hasta el borde de la mandíbula. Afeitarse un oído para la colocación de la IV y la oreja opuesta para administración de parches de fentanilo (sólo cirugía de supervivencia). Afeitarse los dedos mediados traseros izquierdos para la colocación de la sonda de SpO2 .
- Cirugía de infusión vector intubar el conejo. Uso un 4 mm O.D./3 mm tubo endotraqueal sin manguito de diámetro interior, roscado en un artroscopio. Coloque el conejo en recumbency esternal e hiper extender el cuello. Mantenga la boca del conejo abierto y utiliza el artroscopio para visualizar los pliegues de la glotis y laringe. Durante la inspiración, inserte suavemente el tubo endotraqueal a través de la laringe y la tráquea.
- Para las cirugías de sobrevivencia, lugar y asegurar un catéter IV de 24 G en vena de oreja izquierda del conejo y la tapa con un puerto de inyección. Aplicar un parche de 25 μg/h fentanilo al oído derecho del conejo.
Nota: El protocolo es para un cirujano colocado lado derecho del conejo. Si el cirujano va a ser en el lado izquierdo del conejo, invertir los lados en este paso para guardar los cables y IV enfrente del cirujano. Cambie los lados en los futuros pasos según sea necesario. - Para las cirugías de injertos y cosecha de vena, administrar anestesia general con una ojiva; para la cirugía de infusión de vector, administrar anestesia general a través de un tubo endotraqueal.
Nota: La intubación puede utilizarse para todas las cirugías. En nuestra experiencia, sin embargo, los riesgos de complicaciones de trauma traqueal y laríngeo durante la intubación pueden superan los beneficios de la intubación. La cirugía que incluye transferencia de genes a un injerto (especialmente en conejos alimentados con colesterol) es la única cirugía que la intubación parece proporcionar un beneficio neto. - Llevar el conejo en el OR. Coloque el conejo en una posición supina en la mesa de operaciones con la toalla de apoyo cuello colocada justo debajo de la cabeza del conejo. Extender suavemente cuello de conejo hasta que quede aproximadamente horizontal y recta.
- Colocar la nariz a los conejos (cirugías de injerto y cosecha de la vena) o conectar el tubo endotraqueal (vector cirugía de infusión) O2 a 1 L/min y empezar el isoflurano. Si utiliza una ojiva, asegure envolviendo los extremos de las tiras de Gasa atado alrededor de la toalla de soporte de cuello del conejo. Ajustar la concentración de isoflurano como sea necesario (normalmente 1-2%) para mantener un nivel quirúrgico de anestesia.
- Centro de la placa del electrodo dispersivo de electrocauterización bajo parte posterior del conejo. Inserte la sonda de temperatura rectal y aplique la SpO2 sonda y plomos EKG a los conejos.
- Conecte la línea IV salina al puerto del catéter en la oreja izquierda del conejo y arranque la bomba de infusión IV a 10 mL/h/kg. Después de 1 h, reducir la tasa de infusión salina a 5 mL/h/kg.
- Libremente, ate las patas delanteras del conejo a la mesa de operaciones como una restricción.
Nota: Opcionalmente, una pequeña mesa de plástico puede ser colocada sobre el conejo para evitar que al cirujano de presionando el pecho, abdomen del conejo y puede provocar aspiración y reflujo gastroesofágico. - Inyectar la lidocaína/bupivacaína (2 mL, mezcla 50/50, paso 1.2.4) por vía subcutánea (SQ) en el cuello a lo largo de la línea de la incisión prevista, para la anestesia local.
- Tener el asistente desinfectar el quirúrgico del sitio con 3 alternando peelings de gluconato de clorhexidina y isopropanol, luego rocíe el sitio con povidona-yodo. Con el scrub de cirujano, vestido y guantes, siguiendo principios asépticos.
- Realizar cirugías de supervivencia bajo condiciones asépticas. Tener el asistente manejar cualquier elemento no estéril, pasar asépticamente material estéril al cirujano y asépticamente los coloca en la tabla del instrumento cubierto.
- Tener las toallas estériles del uso cirujano aséptico manipular equipos no estériles tales como el microscopio. Tienen el cirujano use 2 x lupas quirúrgicas durante la primera mitad de la cirugía.
2. vena del injerto cirugía (supervivencia)
- Preparar los instrumentos y un campo estéril.
- Con el Asistente de abrir los paquetes estériles (un paño de tabla, un paño de papel y 6 toallas) y transferir asépticamente el contenido al cirujano.
- Cubra la mesa de instrumentos. Coloque el paño de papel y toallas estériles en la mesa del instrumento cubierto. Con 4 toallas, cuelgue el conejo, dejando sólo el sitio quirúrgico en el cuello expuesto. Coloque el cobertor de papel sobre el conejo. Más tarde se usará una toalla, y el último es una copia de seguridad.
- Con el asistente abrir el paquete de instrumentos esterilizados y pasar asépticamente la bandeja del instrumento para el cirujano. Organizar los instrumentos en la mesa de instrumentos.
- Tienen el asistente abrir el siguiente equipo y asépticamente pasar al cirujano o colóquela en la mesa de instrumentos: una jeringa de 1 mL, una jeringa de 3 mL, una jeringa de 20 mL, una aguja de 21 G, sutura de ácido (PGA) de poliglicólico 3-0, sutura de PGA de 5-0 , sutura del polipropileno 7-0 y un catéter IV de 24 G.
- Fije el cable de electrocauterio para el paño que cubre al conejo, utilizando una pinza Kantrowitz 7,25". Soltar el extremo del enchufe del cable sobre el borde de la mesa de operaciones para ser conectado a la unidad de electrocirugía y el asistente.
- Llene una jeringa de 20 mL con solución salina estéril de una bolsa de solución salina o vial llevó a cabo por el asistente. Utilice esta solución salina según sea necesario para evitar la deshidratación de los tejidos expuestos durante la operación.
- Preparar 5 mL de solución salina fisiológica heparinizada mediante la adición de 0,1 mL de heparina de 5.000 UI/mL a 5 mL de solución salina, es decir., heparina 100 UI/mL, en un pequeño tazón quirúrgico. Utilice esta solución para eliminar el injerto de arteria y vena carótido regularmente durante el procedimiento de injerto.
- Corte un agujero en la cortina de papel sobre el sitio quirúrgico en el cuello del conejo. Utiliza la toalla abrazaderas para sujetar las esquinas del agujero en el lugar para las toallas subyacentes.
- Disección vascular
Nota: Utilice 2 lupas quirúrgicas x para ayudar con esta parte de la cirugía.- Cortar la piel con electrocauterio a lo largo de la línea media entre la fosa esternal y la mandíbula (aproximadamente 7-9 cm de longitud) y sujete la piel del cuello del conejo a las toallas con las abrazaderas de la toalla. En el extremo caudal, hacer un corte lateral corto a través de la fascia con electrocauterización. Diseccionar sin rodeos bajo la fascia a lo largo de la línea media entera con unas tijeras grandes. Corte a través de la capa fascial diseca a lo largo de la línea media con la electrocauterización.
- Empezar en el lado derecho. Disección entre el músculo esternocleidohioideo sobrepuesto a la tráquea y el músculo sternocephalic en forma de V, para exponer la arteria carótida común.
- Disecar cuidadosamente un segmento de 4-5 cm de la arteria carótida común y sus ramas más grandes (típicamente 1-2 por lado) de los tejidos circundantes. La disección de la base del cuello proximal hasta el cruce del nervio faríngeo se extienden distalmente. Uso silicona quirúrgica lazos para ayudar en la retracción de la arteria carótida durante la disección. Ligar las grandes ramas de la arteria carótida común con suturas de seda 5-0 antes de cortar cada rama distal.
Nota: Tenga cuidado de no molestar el nervio vago que es paralelo a la arteria carótida común, o los pequeños nervios que cruzan sobre la arteria. - Repita la disección en el lado izquierdo (paso 2.2.3).
- Utilice pinzas de retención de tejido para cerrar temporalmente la capa de tejido subcutáneo. Disecar la fascia superficial de la piel en el lado derecho hasta que se expone la vena yugular externa. Diseccionar un segmento de 4-5 cm de la vena yugular externa y gratuita sus ramas desde el tejido circundante, la ligadura de ramas pequeñas con las suturas de seda 5-0 antes de cortar la rama.
- Repita la disección en el lado izquierdo (paso 2.2.5).
- Inyectar heparina (150 UI/kg) en el catéter IV y enjuague con 10 mL de solución salina.
- Medir un segmento de 3 cm de la vena yugular externa en el lado derecho y ligar el extremo caudal del tubo con sutura de seda 5-0. Permita que las venas se llenen de sangre y luego ligar el extremo craneal del segmento de la vena. Divide el extremo craneal del segmento de vena yugular externa, lavar cuidadosamente el recipiente con suero fisiológico heparinizado (100 U/mL) usando una jeringa de 3 mL conectada a un catéter IV de 24 G. Dividir el segmento venoso en su extremo caudal. Coloque el segmento venoso en una posición estandarizada, en la que los extremos craneales y caudales son inequívocamente identificables.
- Injerto de vena
- Deje que el asistente Retire las lupas quirúrgicas del cirujano y mover el microscopio quirúrgico (25 X) en posición.
Nota: El cirujano debe colgar una toalla estéril el microscopio. Esto permite al cirujano manipular el microscopio manteniendo la esterilidad. - Abrazadera de la arteria carótida común derecha en cada extremo del segmento aislado con mini-mordazas, colocar la pinza craneal primero para permitir el relleno, luego colocar la abrazadera del caudal de la arteria.
- Cortar un 1 × 2 cm de papel rígido (disponible en envases estériles para suturas) y colóquela debajo de la arteria carótida común, para mejorar la exposición.
- Realizar una arteriotomía justo craneal a la abrazadera de caudal (la arteriotomía caudal). La longitud de la arteriotomía debe ser igual al diámetro del extremo craneal del segmento de la vena. Inserte la jeringa con el catéter IV a través de la arteriotomía caudal y lave el lumen de la arteria carótida con suero salino heparinizado.
- Sutura el extremo craneal de la vena a la arteriotomía caudal, utilizando sutura de polipropileno 7-0 con puntadas individuales (figura 1).
- Coloque la primera puntada para suturar el extremo caudal de la arteriotomía caudal al extremo craneal del segmento de la vena. Coloque la segunda puntada 180° desde la primera puntada, suturar el extremo craneal de la arteriotomía caudal al extremo craneal del segmento de la vena.
- Lugar la tercera puntada en un punto equidistante de los dos primeros puntos, en el lado lateral de la anastomosis. Lugar la cuarta puntada en el lado medial de la anastomosis, equidistante de los dos primeros puntos y frente a la tercera puntada. Coloque 4 puntadas adicionales (puntos 5-8) entre cada uno de los puntos 1-4.
- Realizar la arteriotomía craneal en el lado caudal del clip craneal. La distancia entre el extremo craneal de la arteriotomía craneal y el extremo caudal de la arteriotomía caudal debe ser igual a la longitud del segmento de la vena. La longitud de la arteriotomía craneal es igual al diámetro del extremo caudal del segmento de la vena.
- Extender la vena cranially de la anastomosis, en tendido sobre la carótida, sin introducir torceduras. Irrigue la arteria carótida y la vena con solución salina heparinizada a través de la arteriotomía craneal normal. La solución salina fluirá a través de la arteria a la vena a través de la anastomosis caudal y saldrá desde el extremo libre y unsutured de la vena. Flushing la vena también le impide girar.
- Sutura el extremo caudal de la vena a la arteriotomía craneal (figura 1).
- Coloque una primera puntada para suturar el extremo caudal de la arteriotomía craneal al caudal extremo del segmento venoso. Coloque una segunda puntada para suturar el extremo craneal de la arteriotomía craneal al caudal extremo del segmento venoso. Completar la anastomosis como se describe en el paso 2.3.5.2. Justo antes de que el último nudo se ata en la anastomosis craneal, brevemente abierta la pinza en el extremo craneal del segmento disecado de arteria carótida común, para permitir el sangrado de espalda que elimina el aire en la arteria carótida y la vena injertada. Apriete el nudo pasado.
- Suelte la abrazadera craneal para permitir el relleno de injerto de vena con sangre y luego suelte la abrazadera del caudal. Puede considerarse pulsaciones enérgicas en el injerto de vena. Aplicar ligera presión con una gasa seca para detener cualquier sangrado en las anastomosis.
- Ligar ambos extremos del segmento de la arteria carótida común que conecta a las anastomosis con una sutura de seda 3-0 y divide la carótida a medio camino entre las ligaduras (figura 1). Aplique varias gotas de la papaverina (3,5 mg/mL) a la arteria carótida junto a cada anastomosis.
- Inyectar heparina (75 UI/kg) en el catéter de oído IV y enjuague con 10 mL de solución salina. En estos momentos, inyecte buprenorfina (SQ, 0.02 mg/kg) para proporcionar analgesia postoperatoria hasta que el parche de fentanilo ha proporcionado niveles plasmáticos analgésicos de fentanilo.
Nota: Una inyección adicional de buprenorfina (SQ, 0.02 mg/kg) puede ser necesario 6 h después de la primera inyección para mantener la analgesia hasta que fentanilo plasma alcanza una concentración terapéutica. - Repetir el injerto en la parte izquierda (pasos 2.2.8, 2.3.2-2.3.9).
- Cerrar el tejido subcutáneo con sutura de PGA de 5-0 con un patrón continuo. Cierre la piel con la sutura de PGA de 3-0 usando un patrón de Intradérmico. Enterrar los nudos en ambos extremos.
- Deje que el asistente Retire las lupas quirúrgicas del cirujano y mover el microscopio quirúrgico (25 X) en posición.
- Cuidado, limpieza y recuperación postoperatoria
Nota: Deje que el conejo a recuperar de la anestesia en un entorno tranquilo y silencioso. Seguimiento del conejo continuamente para adecuada oxigenación y la temperatura corporal hasta que haya recuperado completamente.- Isoflurano y oxígeno y desconecte la máquina de anestesia del conejo. Desconecte el tubo de fluido IV del conejo, pero salir del puerto de IV en la vena de la oreja de acceso emergente.
- El conejo en una jaula de recuperación del transporte y coloque a su lado. Proporcionar apoyo térmico con agua tibia manta (o calentamiento de aire forzado). Dar O2 espiga hasta que la SpO2 es estable.
- Hasta que el conejo pueda sentarse y andar en su jaula, voltear el conejo a su otro lado cada 15 minutos. Luego retire la cánula IV de oído y regresar el conejo a su jaula. Devuelva el conejo a la compañía de otros animales sólo después de recuperado de la anestesia.
- Deseche cualquier residuos siguientes protocolos adecuados para eliminación de residuos biopeligrosos y sostenidos.
- Postoperatoriamente, compruebe el conejo salud y herida quirúrgica diariamente. Administrar la buprenorfina como necesario para el dolor no gestionado por el parche de fentanilo. Retire el parche de fentanilo en día postoperatorio 3.
3. ultrasonido transcutáneo
- Para evaluar la permeabilidad del injerto, realizar ecografía en conejos anestesiados no 5-7 días después de la cirugía de injerto de la vena y la cirugía de transferencia de genes.
- Envuelva firmemente el conejo no anestesiados en una manta y colocar el conejo supina en una V-a través de veterinaria con su cuello extendido. Afeite el cuello, o si es necesario, eliminar el vello con un agente depilatorio. Aplique el gel de ultrasonido al cuello y realizar una ecografía.
Nota: Un examen de ultrasonido se realiza también en conejos anestesiados en el momento de la cirugía de transferencia de genes y la cirugía del injerto terminal de cosecha para examinar la permeabilidad del injerto y para medir diámetro de lumen del injerto. El examen se realiza justo antes de la limpieza del cuello y se realiza de manera similar en cuanto a los conejos no anestesiados.
- Envuelva firmemente el conejo no anestesiados en una manta y colocar el conejo supina en una V-a través de veterinaria con su cuello extendido. Afeite el cuello, o si es necesario, eliminar el vello con un agente depilatorio. Aplique el gel de ultrasonido al cuello y realizar una ecografía.
4. Gene transferencia cirugía realizada ~ 28 días después de la colocación de un injerto (cirugía de supervivencia)
- Preparar los instrumentos y el campo estéril.
- Siga los pasos 2.1.1-2.1.3. en la cirugía de injerto de vena.
- Que el ayudante Abra los siguientes equipos y cualquiera asépticamente pase al cirujano o colóquela en la mesa de instrumentos: seis jeringas de 1 mL (con aguja), una jeringa de 3 mL, una jeringa de 20 mL, una aguja de 21 G, una aguja de 19 G, sutura de PGA de 3-0 , Sutura de PGA de 5-0, sutura del polipropileno 7-0, dos catéteres IV de 24 G y una sonda de flujo de sangre estéril.
- Siga los pasos 2.1.5-2.1.6. en la cirugía de injerto de vena.
- Preparar una jeringa de 1 mL con 1 mL DMEM para el injerto de la arteria y la vena se lavan y preparan dos jeringas de 1 mL con solución de antivirus (~ 0.5-0.7 injerto de vena solución mL virus). Deje que el Asistente de descongelar el virus y diluirlo en DMEM. Preparar una jeringa de 3 mL con 0,5 mL de lidocaína/bupivacaína (mezcla 50/50, paso 1.2.4).
- Siga el paso 2.1.8 en la cirugía de injerto de vena.
- Aislamiento de injertos de la vena y arterias carótidas adyacentes
Nota: 2 x lupas quirúrgicas debe utilizarse para esta parte.- Cortar la piel con electrocauterio a lo largo de la línea media entre la fosa esternal y la mandíbula (aproximadamente 7-9 cm de longitud) y sujete la piel abierta con abrazaderas de toalla. Aplicar 0,5 mL de lidocaína/bupivacaína (mezcla 50/50, paso 1.2.4) al tejido subcutáneo.
- En el extremo caudal, hacer un corte lateral corto a través de la fascia con electrocauterización. Diseccionar sin rodeos bajo la fascia a lo largo de la línea media entera. Con electrocauterización, corte a través de la fascia diseca a lo largo de la línea media.
- Empezar en el lado derecho. Disección entre el músculo esternocleidohioideo superponer la tráquea y el músculo sternocephalic en forma de V, para exponer el injerto de vena. Aislar cuidadosamente el injerto de la vena y 1.5-2.0 cm de la arteria carótida adyacente al injerto en el lado craneal y caudal.
- Repita la disección a la izquierda siguiente paso 4.2.3.
- Medir el flujo sanguíneo en los injertos de vena.
- Rellenar la cavidad de la herida quirúrgica en el lado derecho con solución salina normal para permitir la transmisión de las ondas sonoras. Introducir una sonda de flujo de 2 mm perivascular (conectada a un medidor de caudal) en la solución salina en la cavidad de la herida y fijar el caudal a cero.
- Coloque la sonda de flujo alrededor de la arteria carótida caudal o craneal al injerto de vena. Registrar datos de la sonda de flujo con un sistema de adquisición de datos electrónicos.
- Repita la medición de flujo en el lado izquierdo tras paso 4.3.2.
- Calcular la pulsatilidad basada en tasa de flujo sistólico máximo, flujo diastólico mínimo y tasa de flujo promedio. También calcular tensión de esquileo laminar, basado en la tasa de flujo y diámetro de lumen (medido con ultrasonido transcutáneo).
- Infundir solución de vector en los injertos de vena
Nota: Se utiliza un microscopio quirúrgico (16 X) según sea necesario para la punción, infusión y reparación de la arteria carótida.- Con el Asistente de quitar lupas quirúrgicas del cirujano y mover el microscopio quirúrgico en posición. Tienen el cirujano cubra el microscopio con una toalla estéril. La toalla estéril permite al cirujano manipular el microscopio manteniendo la esterilidad.
- El Asistente de inyectar heparina (150 UI/kg) en el catéter IV y enjuague con solución salina.
- Utilizar un controlador de aguja grande para doblar la aguja de 21 G a aprox. 80° por encima del bisel (no doble el bisel; Figura 2A).
- Abrazadera de la arteria carótida común en cada extremo del injerto de la vena con mini-mordazas, colocar la pinza craneal primero para permitir el relleno, luego colocar el clip de caudal de la arteria. Lugar el clip caudal aproximadamente 10 mm de caudal a la anastomosis, para dejar cierto margen para la arteriotomía.
- Poner dos lazos de seda alrededor de la arteria justo caudal al injerto y ate un nudo simple en cada uno - sin apretarlos.
- La carótida caudal al injerto de punción con la aguja de 21 G doblada justo craneal del clip vascular caudal. Tenga cuidado de no perforar las paredes posterior o laterales. Avanzar la aguja en el lumen y atrás dos veces para asegurarse de que la luz es clara y cuidadosamente retire la aguja.
Notas: Punción de carótida común puede ser ayudada por tomando la adventicia arterial con pinzas finas y levantando suavemente la pared frontal al insertar la punta de la aguja justo caudal al punto de elevación (figura 2A). Esto reduce el riesgo de golpear la pared posterior con la aguja. - Con varias gasas desdobladas, crear un nido para colocar la jeringa utilizada para infusiones. Lugar este nido de Gasa caudal al sitio quirúrgico.
- Poner catéter IV de 24 G en la jeringa con sólo DMEM y apriete el catéter de la jeringa lo suficiente como para evitar fugas (la jeringa se eliminarán después de esta cirugía) y doblar el catéter ~ 4 mm de la punta para que la curva tiene a unos 75° después se libera.
- Inserte el catéter IV en la arteriotomía carótida común hasta el punto de la curva y lavar el lumen del injerto de la vena dos veces con 0,5 mL de DMEM. Para cada repetición, llene el injerto de la vena con DMEM. Continuación, extraiga el DMEM injerto presionando ligeramente con un dedo enguantado en el extremo craneal de la prótesis. Cuidadosamente Deslice el dedo hacia el extremo caudal del injerto para eliminar el contenido luminal a través de la arteriotomía.
- Retire la jeringa DMEM el catéter, dejando el catéter en el vaso. Conectar la jeringa que contiene la solución antivirus, asegurándose de que no el aire entra en el catéter. Mueva que la seda flojamente anudada lazos abajo de la arteria hasta que estén alrededor de la punta del catéter, pero no los apriete.
- Infunda 0,03 mL de la solución antivirus para empujar el DMEM restantes por el catéter. Retire todo el líquido del lumen del injerto de vena con el dedo, presionar suavemente desde craneal a caudal.
- Apriete los dos lazos alrededor de la punta de la arteria y el catéter a la luz del sello. Infundir la solución de virus hasta que la vena se dilata. Suavemente Coloque la jeringa sobre el nido de Gasa.
Nota: Es vital que el injerto de la vena se expande a su calibre de la transducción de señales y se mantiene inflado durante la infusión de virus. Si no es así, se reducirá significativamente la cantidad de transferencia de genes. - Dejar la solución que contiene el virus en el lumen del injerto de vena por 20 min y vuelva a colocar la jeringa que contiene el virus unida al catéter con una jeringa vacía. Aspire suavemente la solución que contiene el virus del injerto hasta que el vaso se colapsa. Retire la jeringa, dejando el catéter en su lugar. Corte y desatar las suturas seda y retirar el catéter de la nave. Retire el catéter de la arteria carótida con cuidado para evitar dañar el endotelio.
- Con la ayuda del microscopio quirúrgico, cerrar la arteriotomía con sutura de polipropileno 7-0 usando un patrón de X (figura 2B).
- Sujete la sutura con un sostenedor de la aguja, introduzca el recipiente en la parte inferior derecha de la arteriotomía y salir de la nave en la parte inferior izquierda. Cruzar la apertura fuera de la nave y hacer el segundo paso de la parte superior derecha de arriba a la izquierda.
- Antes de apretar la sutura, brevemente suelte el clip vascular craneal para purgar el aire y virus residuales del injerto de la vena y arteria. Sangre fluirá de la arteriotomía cuando se suelta la pinza.
- Cerrar la arteriotomía tirando suavemente de la sutura termina y atar junto con 2 nudos cuadrados.
Nota: Tirar de la sutura muy apretada hará que agrupar de los tejidos que perturban el flujo, aumentan riesgo de trombosis y potencialmente introducir variables incontroladas.
- Suelte el clip vascular craneal, después el clip de caudal. Detener el sangrado utilizando gasa para aplicar presión ligera.
- Alrededor de este tiempo, inyectar buprenorfina (SQ, 0.02 mg/kg) para proporcionar analgesia postoperatoria hasta que el parche de fentanilo ha proporcionado analgesia fentanilo niveles plasmáticos.
Nota: Una inyección adicional de buprenorfina (SQ, 0.02 mg/kg) puede ser necesario 6 h después de la primera inyección para mantener la analgesia hasta que fentanilo plasma alcanza una concentración terapéutica. - Repita el protocolo de infusión de virus en el lado izquierdo, siguientes pasos 4.4.5-4.4.15.
- Encierro de la herida
- Cerrar el tejido subcutáneo con sutura de PGA de 5-0, con un patrón continuo. Cierre la piel con la sutura de PGA de 3-0 usando un patrón de Intradérmico. Enterrar los nudos en ambos extremos.
- Cuidado, limpieza y recuperación postoperatoria
- Siga el paso 2.4.
5. cosecha cirugía (Terminal)
- Preparar los instrumentos y el sitio quirúrgico.
- Siga los pasos 2.1.1-2.1.3 en la cirugía de injerto de vena.
- Deje que el asistente abierto y asépticamente coloque sobre la mesa del instrumento (o pasar al cirujano): una jeringa de 20 mL, una aguja de 21G, sutura de seda 3-0 y una punta de prueba de flujo de sangre estéril.
- Siga los pasos 2.1.5-2.1.6 y 2.1.8 cirugía del injerto de la vena.
- Aislamiento de injertos de vena y arterias carótidas comunes
- Cortar la piel con electrocauterio a lo largo de la línea media entre la fosa esternal y la mandíbula (aproximadamente 7-9 cm de longitud) y sujete la piel del cuello del conejo a las toallas con las abrazaderas de la toalla.
- En el extremo caudal, hacer un corte lateral corto a través de la fascia con electrocauterización. Diseccionar sin rodeos bajo la fascia a lo largo de la línea media entera. Cortar la fascia diseca a lo largo de la línea media con la electrocauterización.
- Empezar en el lado derecho. Disección entre el músculo esternocleidohioideo sobrepuesto a la tráquea y los músculos en forma de V sternocephalic a exponer el injerto común carótida y la vena.
- Diseccionar el injerto de la vena derecha y arteria carótida común libre de los tejidos circundantes. Utilizar bucles de silicona quirúrgica de la retracción de la arteria y el injerto de la vena durante la disección.
- Repita la disección en el lado izquierdo siguiendo pasos 5.2.3-5.2.4.
- Realizar mediciones de flujo siguiendo pasos 4.3.1-4.3.3 en la cirugía de transferencia génica.
- Cosecha de los injertos de vena
- Con sutura de seda 3-0, ligar la arteria carótida común derecha craneal al injerto. Entonces ligar la carótida caudal al injerto.
- Suprimir el injerto de la vena derecha dividiendo la arteria carótida adyacente entre cada una de las trompas y la anastomosis adyacente. Retirar el injerto de la vena del conejo e Irrigue el lumen con la solución salina.
- Cortar la arteria carótida y la anastomosis de ambos extremos del injerto de la vena. Recortar tejido adventitial exceso lejos del injerto de vena y cortar el injerto en segmentos según sea necesario para el análisis de punto final diferente.
- La cosecha del injerto de la vena izquierda repitiendo los pasos 5.4.1-5.4.3.
- Inyecte 1 mL de fenitoína/pentobarbital IV de eutanasia el conejo.
- Deseche cualquier residuos siguientes protocolos adecuados para eliminación de residuos biopeligrosos y sostenidos.
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Representative Results
La competencia técnica de un nuevo operador debe ser validada antes de que el operador puede utilizar este método para generar datos experimentales. El primer hito que un nuevo operador debe lograr es la permeabilidad del injerto de vena consistente después de la cirugía de injerto de vena inicial y la posterior cirugía retrasada-transducción. 90% sobre la permeabilidad después de cada una de las cirugías es deseable y alcanzable. La permeabilidad puede ser evaluada de forma no invasiva mediante ultrasonido transcutáneo, que normalmente realizamos en el día postoperatorio 5-7. En los conejos con las venas de patentes, el examen de ultrasonido revelará un vaso sanguíneo grande con flujo de sangre de craneal a caudal enérgico en ambos lados del cuello anterior (figura 3A). Si cualquiera de los injertos de la vena se ocluye, habrá no hay flujo de sangre de craneal a caudal detectable en los lados con el injerto ocluido. Sin embargo, el flujo sanguíneo de craneal a caudal todavía será detectado en la vena yugular interna (figura 3B).
El segundo hito que tiene que conseguir un nuevo operador es eficiente transducción de las células endoteliales del injerto de la vena. Aquí, un vector adenoviral que expresa la β-galactosidasa se utiliza para evaluar la eficiencia de la transferencia de genes endoteliales. Un nuevo operador en nuestro laboratorio transduced injertos de la vena con un adenovirus que expresan β-galactosidasa (AdnLacZ) mediante los métodos descritos. Los injertos fueron cosechadas 3 días después de la transducción y cortan en segmentos. Algunos segmentos fueron teñidos con 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal). Cara en las imágenes de las superficies luminales demostraron injertos de la vena con transducción eficiente (figura 4A) y transduction pobre (figura 4B). Para evaluar la competencia de un nuevo operador, mRNA de la ß-galactosidasa en los extractos del injerto de vena transduced se mide también mediante PCR cuantitativa mediada por la transcriptasa inversa y la normalización de la señal hasta el nivel de fosfato de gliceraldehído deshidrogenasa (GAPDH) mRNA medido en los injertos de la vena misma.
Los niveles de ARNm de β-galactosidasa en injertos de vena transduced por el nuevo operador no fueron significativamente diferentes de los niveles de ARNm de β-galactosidasa en injertos de vena transduced por un operador experimentado (figura 5). Si no hay muestras de mRNA de los injertos de vena transduced por un operador experimentado para la comparación, injertos de mRNA puede ser generada por transducing de la vena del injerto de la vena del control negativo con un vector de control de no expresar (AdNull). Hemos encontrado que los niveles promedios de ARNm de β-galactosidasa en vena injertos transduced por un operador experimentado son aproximadamente 1,000-fold más altos que la señal de PCR fondo de ARNm de β-galactosidasa en injertos AdNull-transduced (figura 5) .
Figura 1 . La colocación de un invertida derecha externa vena yugular a la derecha común de la arteria carótida injerto con anastomosis extremo a otro. El injerto de vena (azul) se sutura a la arteria carótida común (rojo) en dos anastomosis. En cada anastomosis, puntadas (blanco x) están numerados en el orden en que se colocan. Para ambos de las anastomosis, puntada 1 suturas el extremo caudal de la arteriotomía de la vena yugular externa. Puntada de 2 suturas el extremo craneal de la arteriotomía de la vena yugular externa. Punto 3 se coloca en el lado lateral de la anastomosis en un punto equidistante de los dos primeros puntos de sutura. Punto 4 se coloca en el lado medial de la anastomosis, equidistante de los dos primeros puntos y enfrente de la puntada 3. Cuatro puntadas adicionales (puntos 5-8) se sitúan a medio camino entre los cuatro puntos existentes. El segmento de la arteria carótida entre las anastomosis está ligado en ambos extremos con sutura de seda 3-0 (flechas) y dividido (línea discontinua) a medio camino entre las ligaduras. Lado izquierdo los injertos se realizan de manera similar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . La creación y cierre de una arteriotomía carótida. (A) la adventicia de la arteria carótida común es captado cerca del injerto de la vena con pinzas finas y tracción hacia arriba se aplica a la pared arterial. Esto crea una superficie vertical, permitiendo que la aguja de 21 G doblada a insertarse aproximadamente paralelo a la luz de los vasos, disminuyendo el riesgo de perforar la pared posterior de la arteria. (B) la arteriotomía se sutura con polipropileno 7-0 en un patrón de X. El primer paso de la sutura entra la luz de la arteria en la parte inferior derecha de la arteriotomía (sitio 1) y sale la luz en la parte inferior izquierda (sitio 2). La sutura entonces cruza la arteriotomía. El paso siguiente vuelve a entra la luz en la parte superior derecha (sitio 3) y sale la luz en la parte superior izquierda (sitio 4). Suave tracción sobre los extremos de la sutura (los extremos salen del sitio 1 y 4) cierra la arteriotomía. Los extremos de la sutura se atan con nudos cuadrados 2. El sólido círculos azules indican los lugares donde la sutura penetra en la pared arterial. Las sólidas líneas azules indican donde la sutura se pasa fuera de la pared arterial; líneas azules punteadas indican que la sutura se encuentra dentro del lumen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Imágenes de ultrasonido transcutáneo de cuello de conejo, evaluar permeabilidad del injerto de la vena 5-7 días después de injertar. (A) patente injerto de la vena (rojo) con el flujo sanguíneo en dirección craneal a caudal está indicado (flecha). Occluded (B) injerto de la vena. No hay flujo de sangre de craneal a caudal (que aparecería roja) se detecta. La vena yugular interna (azul) con el flujo sanguíneo en dirección craneal a caudal se indica (asterisco). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Expresión del transgén de beta-galactosidasa en injertos de vena. 28 días después del injerto, injertos de la vena de conejo fueron transduced por una incubación de 20 min de adenoviral vectores expresar β-galactosidasa dentro de los lúmenes de los injertos de vena quirúrgico aislado. Injertos venosos fueron cosechadas 3 días después de transducción y teñidas con 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside. (A) cara En imagen de la superficie luminal de un segmento de vena mostrando transducción eficiente. (B) cara En imagen de la superficie luminal de un segmento de vena mostrando pobres transducción. Barra de escala = 1,0 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Expresión del transgén de beta-galactosidasa (β-gal) mRNA en segmentos de injerto de vena. 28 días después de la colocación de injertos de interposición de la vena yugular en carótidas del conejo, los injertos fueron transduced con un vector adenoviral beta-galactosidasa (AdnLacZ) o con un vector adenoviral de control que no expresan un transgen (AdNull ). Cirugías fueron completadas por un operador experimentado (cirujano 1) o un nuevo operador (cirujano 2). Injertos de vena transduced con AdnLacZ eran todas cosechados 3 días después de transducción de señales. RNA extraído de injertos transduced con AdNull y cosechó 14 días después de transducción de señales también se analizó, como control negativo. La expresión de mRNA de beta-galactosidasa se cuantificó por PCR cuantitativa mediada por la transcriptasa inversa, con valores normalizados a la deshidrogenasa de fosfato de gliceraldehído mRNA medido en los extractos de la misma y expresado en unidades arbitrarias (UA). Las barras indican valores promedio; valores de p son de suma de rango de pruebas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Pasos críticos en este protocolo incluyen la administración de la anestesia, manipulación de anticoagulación, cirugía de la vena arteria/injertado y medidas hemodinámicas de la vena injertada. Adecuado manejo de la anestesia es fundamental en este modelo de cirugía supervivencia múltiple que incluye dos operaciones relativamente largo (típicamente 3-3.5 h para injerto bilateral de la vena y 1.5-2.5 h para la transducción de injerto bilateral). Hemos administrado anestesia mediante una ojiva y por intubación endotraqueal y encontró que la intubación mejoró la supervivencia después de la cirugía del injerto de la transducción de señales, posiblemente debido a ventilación con presión positiva previene la atelectasia y asociados insuficiencia respiratoria. Conejos son difíciles de intubar, y trauma relacionado con la intubación de la vía aérea puede causar estridor postoperatoria. Sin embargo, los retos y complicaciones de la intubación son un precio pequeño a pagar para el beneficio de eliminación de la mayoría de la morbilidad perioperatoria y la mortalidad asociadas con la cirugía de injerto de vena.
Anticoagulación es esencial para prevenir la trombosis de las venas injertadas, que puede ocurrir después de las cirugías de sobrevivencia. La trombosis parece ser un evento temprano postoperatorio, ya que los injertos de vena que son patentes en la ecografía transcutánea 5-7 días después de la operación son casi siempre patentes en la cosecha. Para prevenir la trombosis después de la primera cirugía (es decir., el injerto de la vena), se administra heparina IV antes de la cosecha la primera vena yugular externa. Basado en el período del plasma de la heparina en conejos (1-2 h), una dosis media adicional de heparina IV se administra antes de la cosecha de la vena yugular externa contralateral. Además, hasta completas ambas anastomosis arteriovenosas de un injerto de vena individual, nos Lave el lumen de la arteria carótida y el injerto de la vena aproximadamente cada 8 minutos con suero fisiológico heparinizado. Para evitar la trombosis del injerto, debe procurar no dañar la vena del injerto, especialmente el endotelio-durante la cosecha y el injerto. Esto incluye la manipulación de la vena con instrumental quirúrgico suave y dejando una fina capa de tejido de adiposo adventicial conectado a la vena. También administramos una sola dosis de papaverina tópica para los injertos de la arteria carótida para prevenir o vasoespasmo inversa, que podría contribuir a la trombosis.
Durante la cirugía de injerto de la vena es necesaria una atención meticulosa a la técnica quirúrgica. Para evitar sangrado en las anastomosis, la trombosis del injerto y la introducción de variables hemodinámicas incontroladas, las dos arteriotomies debe ser de la longitud adecuada. Si una arteriotomía es demasiado corta, la pared ostiaria del injerto de vena será redundante en el sitio de la anastomosis, creando huecos que permiten la sangría. Si la arteriotomía es demasiado larga, que se extiende la vena para cubrir la arteriotomía traerá la vena injerto paredes cerca, haciendo difícil para el cirujano evitar suturar la vena de la opuestas injerto paredes juntos (esencialmente garantizando postoperatorio trombosis). Por otra parte, si se estrecha el lumen del injerto de la vena porque la vena fue estirada para cubrir una arteriotomía excesivamente largo, una estenosis se creará que aumenta la tensión de esquileo, predispone a la trombosis33y potencialmente altera las variables de resultado tales como el crecimiento neointimal y remodelación vascular del34,35. Además, es importante evitar la introducción de giros en el injerto de la vena, que podría resultar en lumen el enangostar o flujo anormal. Para ayudar a evitar la torsión de la prótesis, siempre alinear el segmento venoso a lo largo de la superficie ventral de la arteria carótida común y asegúrese de que hay no hay giros en la vena. Debido al potencial de la técnica quirúrgica variable alterar la vena del injerto hemodinámica y porque hemodinámica alterada puede afectar las variables de resultado independientemente de tratamiento, habitualmente medimos sangre flujo e injerto de diámetro antes de la infusión del vector y en el el tiempo de la cosecha. Utilizamos estos valores para calcular la tensión de esquileo y pulsatilidad. Injertos de la vena con mediciones hemodinámicas fuera de rangos predeterminados pueden excluirse objetivamente de más análisis, disminuyendo la variabilidad experimental y aumentar el poder estadístico.
Como se desarrolló este método, hicimos varias modificaciones. Inicialmente, se intentó la transferencia de genes de la vena del injerto durante la operación de injertaba. Sin embargo, en estas circunstancias, expresión del transgen se perdió casi totalmente por 3 días después de la transferencia de gen22. Expresión del transgén se perdió rápidamente si el segmento venoso transduced en situ y luego injertadas o si la vena injertada primero y luego transduced. Sólo retrasando transducción hasta después de que el injerto de la vena se había adaptado a la circulación arterial (esperamos hasta 28 días después del injerto para realizar a la transferencia de genes, aunque un retraso más corto posible), fue la rápida pérdida de expresión del transgen que se evita22 . También convertimos de ojiva entregado anestesia anestesia entregada por el tubo endotraqueal para la segunda cirugía (transferencia del gene) después de experimentar mortalidad intraoperatoria y postoperatoria. Además, después de encontrar neumonía por aspiración evidente en un postoperatorio de conejo, comenzamos a colocar una pequeña mesa de plástico sobre el abdomen del conejo (bajo las gasas estériles). La tabla fue colocada para impedir que el cirujano inadvertidamente, apoyado en el abdomen del conejo, potencialmente estimulante de aspiración y reflujo gastroesofágico. No teníamos más eventos de aspiración después de la colocación de la tabla. Sin embargo, debido a esta colocación coincidió con el cambio a intubación endotraqueal, nosotros no podemos estar seguros que la intervención es responsable de eliminar eventos de aspiración.
Este método también tiene limitaciones. En los Estados Unidos, el uso de conejos en lugar de roedores requiere conformidad con los requisitos de la ley de bienestar de animales de laboratorio, de 1966. En consecuencia, los investigadores usando conejos (u otros animales cubiertos por esta ley) deben tener bien equipados quirófanos y anestesistas expertos y proporcionar un alto nivel de monitoreo postoperatorio y cuidados. La segunda limitación es que 2 cirugías son necesarias para garantizar la expresión de transgenes persistentes22. La segunda cirugía incrementa el costo de los experimentos y expone cada conejo a un conjunto de posibilidades operativas y de complicaciones perioperatorias. Sin embargo, no somos conscientes de cualquier otro método de transferencia de gene que alcanza expresión transgen durable en injertos de vena. La tercera limitación de este método es que requiere de conocimientos en la construcción de vectores de la HDAd y preparación de stocks de alto-título HDAd. Muchos laboratorios tienen experiencia con primera generación adenoviral, lentivirales y vectores (AAV) virales adeno-asociado, pero relativamente pocos grupos tienen experiencia con HDAd y normalmente tendría que establecer una colaboración para obtener de esta experiencia. La aplicabilidad clínica del método también puede ser limitada. Para los seres humanos, una segunda cirugía aumentaría riesgo de complicación y costo. Además, en comparación con las venas safenas humanas (utilizadas para cirugías de bypass coronario y periférico), venas yugulares externas de conejo tienen paredes muy delgadas. Es posible que la pared engrosamiento y remodelado se produce después de injerto de una vena yugular externa de conejo en la circulación arterial se atenúa si el injerto de la vena ya tiene una pared más gruesa. Finalmente, en los experimentos en este modelo hasta 6 meses de duración, ninguna de las venas injertadas desarrollado una estenosis22. Por lo tanto, este método no parece modelo todos los procesos biológicos que contribuyen a la falta del injerto de la vena.
En conclusión, el método utiliza un robusto modelo animal de la humana enfermedad vascular (conejos) para generar las venas injertadas en el que los transgenes se expresan estable durante períodos prolongados de tiempo (por lo menos 6 meses)22. La expresión estable de transgenes en injertos de vena revelará sus papeles en vena normal homeostasis de injerto y clarificarán su potencial para la terapia del gene de la vena del injerto. El método podría mejorado y hecho más clínicamente aplicable por el desarrollo de técnicas que permiten la entrega percutánea de vectores para el injerto de la vena, evitando así la segunda cirugía. Estas técnicas pueden ser basadas en catéter36,37, o podría incorporan vectores especialmente preparados que se inyecta en una vena periférica y luego dirigidas a la pared de la vena del injerto, por ejemplo por campos magnéticos38. El método también permitiría pruebas de vectores que no sean de la HDAd para terapia del gene del injerto de la vena, incluyendo lentivirales vectores AAV como vectores no virales. 39 , 40 , 41 , 42
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer surgery |
| 1 mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery |
| 20 mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24Ga x 3/4” | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4” x 4” | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8703P | Vein graft surgery |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For the placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 5098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine, 20 mg/mL | Pfizer | 409427702 | |
| Marcaine 0.5% | Pfizer | 409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | |
| Papaverine (3.5 mg/ml) | American Reagent Inc. | NDC 0517-4002-25 | Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum |
| Fentanyl patch, 25 mcg/h | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Viral vector | Gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | ||
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3 mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Bair hugger warming unit | 3M | Model 505 | |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery |
References
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