Summary
שילובים תרופתיים סינרגטי הם וממושכת לזהות את הנתונים באופן אמפירי. כאן נתאר שיטת זיהוי ואימות של מולקולות קטנות סינרגטי.
Abstract
למרות סמים מיקרוביאלית הגדילו בצורה משמעותית את תוחלת החיים ואת איכות החיים בהמאה ה-20 , עמידות מיקרוביאלית מאיימת על יכולתה של החברה כולה שלנו לטיפול בדלקות מערכתית. בארצות הברית לבדה, זיהומים עמידים לאנטיביוטיקה להרוג כ- 23,000 אנשים בשנה ועלות בסביבות 20 מיליארד USD במערכת הבריאות נוספים. גישה אחת כדי להילחם עמידות מיקרוביאלית הוא טיפול משולב, אשר הוא שימושי במיוחד בשלב המוקדם קריטי של זיהום, לפני האורגניזם המזהם ופרופיל ההתנגדות שלה סמים זוהו. טיפולים מיקרוביאלית רבים להשתמש טיפולים משולבים. עם זאת, רוב אלה שילובים הם תוסף, כלומר היעילות המשולב הוא זהה לסכום היעילות לאנטיביוטיקה בודדים. כמה טיפולים משולבים הם סינרגטי: יעילות המשולבת היא הרבה יותר גדולה מאשר מוספים. שילוב סינרגטי שימושיים בעיקר כי הם יכולים לעכב את הצמיחה של זנים עמידים בפני התרופה מיקרוביאלית. עם זאת, אלה שילובים הם נדיר וקשה לזהות. זאת בשל המספר העצום של מולקולות צריך להיבדק באופן pairwise: ספריה של מולקולות 1,000 יש 1 מיליון צירופים אפשריים. לכן, נעשו מאמצים לחזות מולקולות סינרגיה. מאמר זה מתאר שיטת שלנו תפוקה גבוהה לחיזוי זוגות סינרגטי מולקולה קטנה המכונה את החפיפה2 שיטה (O2M). O2M משתמשת דפוסי מ datasets כימית-גנטית כדי לזהות מוטציות שאינן רגישות יתר כל מולקולה בזוג סינרגטי אך לא מולקולות אחרות. המעבדה חום מנצלת את ההבדל הצמיחה הזה על ידי ביצוע מסך תפוקה גבוהה עבור מולקולות כי לעכב את הצמיחה של מוטציה אבל לא פראי-סוג התאים. עבודת המעבדה זוהו בעבר מולקולות שמקושרות עם וטרימטופרים לאנטיביוטיקה את, תהליך הזיקוק של תרופה נגד פטריות באמצעות אסטרטגיה זו. . הנה, המחברים להציג שיטה למסך הרומן שילובים סינרגטי, אשר יכול להשתנות עבור מיקרואורגניזמים מרובים.
Introduction
חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה לגרום זיהומים יותר מ-2 מיליון מקרי מוות 23,000 מדי שנה בארצות הברית על פי ה CDC1. חדש טיפולים נדרשים כדי להתגבר על זיהומים אלה. אסטרטגיות כדי לזהות טיפולים חדשים אלה כוללים הפיתוח של תרופות חדשות מיקרוביאלית או שינוי של מולקולות קטנות אישר תנאים אחרים לטיפול זיהומים חיידקים-2,-3,-4. אולם, גילוי תרופות חדשות הוא מאוד יקר וארוך. שינוי סמים לא יכול להזדהות תרופות חדישות או סמים מטרות5,6. המעבדה שלנו מתמקד אסטרטגיה שלישית המכונה שילוב סינרגיסטי טיפולים. שילוב סינרגטי להתרחש כאשר שתי מולקולות קטנות יש ביחד על יעילות יותר השפעת תוסף שלהם efficacies בודדים7. בנוסף, שילובים סינרגטי יכול להיות יעיל נגד פתוגן עמיד בפני אחד של מולקולות קטנות בזוג בנוסף פחות רצויות תופעות את המטרה, והוציאם נהדר פוטנציאליים8,9, 10.
זוגות סינרגטי הם נדירים, המתרחשים כ- 4-10% של סמים שילובים11,12,13. כך, טכניקות מסורתיות כגון מסכי pairwise הם מאתגרים וצורך, עם אלפי צירופים אפשריים של ספרייה קטנה של מולקולות מאה. יתר על כן, אינטראקציות סינרגטי בדרך כלל לא ניתן לחזות מן הפעילות של תרכובות14. עם זאת, המחברים פיתח גישה תפוקה גבוהה מסך עבור זוגות סינרגטי, קרא את החפיפה2 שיטה (O2M)12. שיטה זו, המתוארות כאן, מאפשר זיהוי מהיר יותר, יעיל יותר מכל הזוגות סינרגטי. O2M מחייב שימוש זוג סינרגטי ידוע dataset כימית-גנטיקה. כימית-גנטיקה datasets נוצרים כאשר ספרייה של knockout מוטציות גדל בנוכחות רבים מולקולות קטנות שונות. אם מולקולה אחת בזוג סינרגטי ידוע המניע את פנוטיפ זהה של מוטציה נוקאאוט מסוים כמו המולקולה סינרגטי השני, כל שאר מולקולה קטנה ולחושים של פנוטיפ של מוטציה זהה זה צריך גם שמקושרות עם כל חבר ידוע זוג סינרגטי. רציונל זה שימש במעבדה חום כדי לזהות זוגות לאנטיביוטיקה סינרגטי פעיל נגד Escherichia coli (e. coli) וזוגות תרופה נגד פטריות סינרגטי פעיל נגד הפטריה פתוגניים קריפטוקוקוס neoformans (C. neoformans)11,12. O2M הוא לא רק וישימה פתוגנים שונים, אבל מאפשר להקרנה של ספריות גדולות של מולקולות לזהות זוגות סינרגטי במהירות ובקלות. הקרנה עם המוטציה הגנטית המזוהה על-ידי O2M מאפשר לנו לאמת רק אלה מולקולות קטנות חזתה סינרגיה. לכן, בדיקות ספרייה 2,000-מולקולה של pairwise תיקח. חודשים, ואילו אם היו רק מולקולות 20 בספריה זו חזה לצוות, בדיקה של סינרגיה עכשיו לוקח עניין של ימים. O2M אינה דורשת יכולת תיכנות, הציוד הדרוש זמין ברוב מעבדות או מתקנים הליבה. בנוסף, חוקרים המעוניינים שילובים תרופתיים ניתוח O2M הוא עניין לכל אחד השלימה מסך הסמים ורוצה להרחיב את הלהיטים שלהם על-ידי זיהוי סמים חשוב-תרופתיות. להלן הוא פרוטוקול זיהוי מולקולות קטנות סינרגטי של חיידקים, כמו גם מאמת את האינטראקציות סינרגטי החזוי מבחני ידועים15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. זיהוי מוטציות חיזוי סינרגיה מפני כימיה-גנטיקה Dataset בשיטה2 חפיפה (O2M)
הערה: זו השיטה לזיהוי מוטציות חיזוי סינרגיה באמצעות את ערכת הנתונים שפורסמו החל ניקולס ואח. 17 ב e. coli. עם זאת, ניתן לבצע זאת על כל ערכת נתונים כימיים-גנטיקה, מיקרואורגניזם. ערכות נתונים אלה מכילים ספריה של נוקאאוט מוטציות גדל בנוכחות מולקולות קטנות יותר מ-100, נותן ציון כמותי צמיחה עבור כל מוטציה בתוך כל מולקולה קטנה. זוג סינרגטי אחד חייב להיות ידוע, היו הציונים הצמיחה של שתי מולקולות קטנות הכלולים ב- dataset.
-
לחשב את הציון הצמיחה הממוצע וסטיית התקן לכל. המוטנטים גדל בנוכחות ריכוז יחיד של כל מולקולה קטנה.
הערה: ניתן לבצע זאת באמצעות תוכנה כלשהי של גיליון אלקטרוני. המעבדה חום משתמשת ב- Excel ו הפונקציות =AVERAGE(B3:B3981) ו- =STDEV(B3:B3981) עבור החישובים של כל אחת מהעמודות של מולקולה קטנה.- לחשב את האמצעים ואת סטיות תקן של כל אחת מהעמודות של מולקולה קטנה, אך נטייה זו עשוי להיות שונה אם משתמש dataset שונים.
- חישוב ציוני Z עבור כל ריכוז של מולקולה קטנה באמצעות את ערכת הנתונים זהה של ניקולס ואח. 17 בתוכנית גיליון אלקטרוני. בשביל זה, ציוני z שליליים יהיה Z(2.5) = כלומר - 2.5 * סטיית תקן, ציוני z החיובי יהיה Z(2.5) = ממוצע + 2.5 * סטיית תקן.
- לקבוע אילו גנים מוטנטים מכילות ציונים Z משמעותית מולקולות קטנות המרכיבות את זוג סינרגטי ידוע, להיות בטוח להסתכל על כל ריכוזי המולקולות האלו. אם הגידול הציון של מוטציה הוא פחות מז שלילי (2.5) ניקוד או גדול מהניקוד Z (2.5) חיובי עבור מולקולה קטנה זו, הוא נחשב משמעותי.
- לקבוע אם כל המוטציות ג'ין משמעותי שייך אופרון.
הערה: עבור e. coli, המחברים ממליצים לבדוק "Ecoli wiki" לקבלת מידע בנוגע אם הגנים הם עיבד כחלק polycistronic RNA. - לזהות מוטציות גנים/אופרון המשותפות הרוב של מולקולות קטנות עניין בריכוזים שונים (למשל., כאשר מחפשים מולקולות שמקושרות עם וטרימטופרים לאנטיביוטיקה, לזהות מוטציות המציגים Z משמעותית ניקוד כאשר גדל בנוכחות וטרימטופרים ושותפיה סינרגטי ידועים כגון sulfamethizole או sulfamethoxazole). אלה סינרגיה בשם חיזוי מוטציות.
2. חיזוי Synergizers בתוך ערכת הנתונים כימית-גנטיקה על ידי O2M
- שחזר הנתונים (dataset)17, לזהות כל ריכוז של מולקולה קטנה ולחושים ניקוד צמיחה משמעותית מ החשבונאי חיזוי סינרגיה. פעולה זו מתבצעת על ידי הסתכלות על ציוני Z מחושב עבור כל ריכוז של מולקולות קטנות. שוב, ציון צמיחה משמעותית הוא פחות מאשר התוצאה Z שליליים או גבוה יותר הציון Z חיובי עבור הריכוז של מולקולה קטנה.
הערה: אם מולקולה מופיע אפילו באחד הריכוזים שלה, מולקולת נחשב של synergizer החזוי. כל מולקולה אשר לא זכה ניקוד צמיחה משמעותית היא החזוי הלא-synergizer.
3. אימות של אינטראקציות סינרגטי חזויים
- מציאת הריכוז המעכב מינימלי (MIC) של synergizers החזוי.
- לגדול תרבות לילה של e. coli בתקשורת מינימלי M9 ב 37 º C.
הערה: ניתן לגדל כל תרבות לילה במדיום מוגדר כהלכה עבור האורגניזם עניין. המעבדה חום אינה ממליצה על מדיה עשירים כמו ליברות או YPD. M9 תקשורתי מזערי מורכב 10.5 g/L M9 מרק, חומצות casamino 0.2%, 0.1 M CaCl2, 0.4% גלוקוז, 1 מ' MgSO4, 0.25% nicotinic חומצה ו תיאמין 0.33% H2O. - אם אין נתונים מיקרופון הפתוגן עניין זה נמצא בספרות כשקיבלנו את מולקולות קטנות, להמיס דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)-ריכוז גבוה (> 10 מ"ג/מ"ל).
- באמצעות צלחת 96-ובכן, להוסיף 100 µL של התקשורת M9 מכל קידוח. להוסיף על µL תוספת 100 של מדיה M9 בעמודה 1 אז הוא מכיל סכום כולל של 200 µL.
- להוסיף כמות שרירותית (~ 10 µL) של מולקולה קטנה מרוכז פתרון בעמודה 1. מולקולה קטנה אחת לכל טוב של עמודה 1 (8 מולקולות קטנות לכל צלחת).
הערה: אלה מולקולות קטנות של עניין, הם חזו לצוות. המעבדה חום בדרך כלל מוסיף 10 µL של מולקולה קטנה מרוכז פתרון, אשר מתחת כמות דימתיל סולפוקסיד 100% זה יכול לעכב e. coli. - ברגע מולקולות קטנות נוספו, לדלל את מולקולות קטנות לאורך ציר ה-x של הצלחת. קח 100 µL של פתרון מעמודה 1, שמים בטור 2 ומערבבים. קח 100 µL מעמודה 2, מקום בעמודה 3 ומערבבים. המשך בתהליך זה עד 100 µL ממוקמים בעמודה 11. לערבב טור 11, ואז לקחת את µL 100 מ עמודה זו, למחוק. השאר את העמודה 12 עם מדיה רק כדי לנרמל את הנתונים.
- לחסן את הצלחת. להשיג את הצפיפות האופטית (OD600) מתרבות לילה. להכין פתרון עם התרבות, המדיה M9 יתר600 של 0.002 (או מתאים ריכוז המייצג 500 תאים/µL עבור האורגניזם הרצוי עניין). פיפטה 2 µL של תרבות פתרון לבאר כל צלחת אז יש תאים 1,000 לכל טוב.
- בעדינות לנער את הצלחת והשג את יתר600 עבור ה 0 קריאה. תן את הצלחת לגדול ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 ח קבל יתר600 עבור 24 שעות קריאה.
הערה: השימוש המתאים גדל תנאים עבור אורגניזמים אחרים מעניינים. - לחשב את הצמיחה נטו עבור כל טוב באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני.
- ממוצע הצמיחה נטו של עמודה 12 כדי לקבל הממוצע אין גידול סמים. לנרמל את הבארות אחרים לממוצע של אין גידול סמים באמצעות תוכנת הגיליון האלקטרוני. אחפש בכל טוב עם פחות מ- 10% צמיחה כדי לזהות את MIC90. כל טוב עם פחות מ- 50% צמיחה מציין את MIC50. לחשב את הריכוז של מולקולה קטנה בבארות האלה.
- לגדול תרבות לילה של e. coli בתקשורת מינימלי M9 ב 37 º C.
- לוח שחמט מבחני עבור אינטראקציות סינרגטי
- לגדול תרבות לילה של e. coli בתקשורת M9 מינימלית כמו בעבר.
הערה: השימוש המתאים גדל התנאים עבור אורגניזמים אחרים. - להוסיף 100 µL של התקשורת M9 כל טוב של צלחת טוב 96 ו µL תוספת 100 בעמודה 1.
- הוספת מולקולה קטנה את הבדיקה (~ 8 x מיקרופון) לכל אחד טוב בעמודה 1 ולהוסיף להכפיל את הריכוז (~ 16 x מיקרופון) ל A1 טוב (מולקולה קטנה אחת נבדק לכל צלחת).
הערה: סכום זה נקבע מן המנזר הנסוי מיקרופון, שונה עבור כל synergizer פוטנציאליים. - צור לדילול ההדרגתי בציר ה-x על-ידי לקיחת µL 100 מעמודה 1 העברת לעמודה 2. המשך בתהליך זה עד 100 µL להוספת עמודה 11. לערבב, ואז לקחת את µL 100 מעמודה 11, להיפטר. אל תוסיף כל סם כדי עמודה 12 (איור 1 א').
- להגדיר את המילוי ההדרגתי התרופה השנייה לאורך ציר ה-y עבור התרופה קלט. להוסיף 100 µL של המדיה המכילה 2-מיקרופון של המולקולה הקלט בשורה ערבוב א ו- µL 100 שתדללו כמו בעבר, לוקח מן השורה A והצבת ב' המשך עד 100 µL תוצב בשורה ג מיקס, לקחת 100 µL ו השלך, הבטחת לא כדי להוסיף כל סם הקלט בשורה ה דבר זה מאפשר H ועמודה 12 כדי להכיל מיקרופונים בודדים של זוג סמים שנבדקו (איור 1B).
- לחסן את הצלחת. להוסיף 2 µL של תרבות e. coli של יתר600 0.002 מכל קידוח (1,000 תאים לכל טוב).
- למדוד את יתר600 של כל טוב בצלחת בקריאת 0 h.
- דגירה את הצלחת במשך 24 שעות ביממה ב- 37 מעלות צלזיוס.
- למדוד את יתר600 של כל טוב בבית 24 שעות ביממה.
- לגדול תרבות לילה של e. coli בתקשורת M9 מינימלית כמו בעבר.
- חישוב המדד הריכוז המעכב החלקי (FICI) של משבצות
- לחשב את הצמיחה נטו לטוב כל צלחת על-ידי חיסור את יתר600 ב- h 0 מ OD600 ב- 24 שעות בתוכנית גיליון אלקטרוני.
- לנרמל את הצמיחה בתוכנה על ידי חלוקת כל H12 טוב מאת טוב, אשר מכיל אין מולקולה קטנה.
- למצוא את MIC90 של המולקולה קלט בעמודה 12, את MIC90 של synergist פוטנציאליים בשורה ה
- חפשו כל הבארות לעכב 90% של צמיחה.
- לחשב את FICI90 על הבאר או הנמוך מתחת (סינרגיסטי) או הגבוהה מעל (אויבת) בשני ערכים MIC90, באמצעות המשוואה:
- לשקול כל ≤ FICI 0.5 כמו סינרגטי, FICI ≥ 4 כמו אויבת (איור 2).
הערה: ניתן גם לבצע זאת עם MIC50 (50% עיכוב של צמיחה) כדי להגיע FICI50 בהתבסס על ערכים אלה מיקרופון.
- Assay העצמאות בליס
הערה: עצמאות בליס מנוהל עם כל synergist פוטנציאל זה לא היה של מיקרופון בכוחות עצמו.- לגדול תרבות לילה של e. coli בתקשורת M9 ב 37 מעלות צלזיוס, כמו קודם.
הערה: שוב, תנאי גידול מתאימים עבור אורגניזמים אחרים עניין יכול לשמש בשלב זה. - להכין צלחות 96-ובכן בדיקות המולקולה פוטנציאל סינרגטי, מולקולת קלט, השילוב, פקד שאינם מטופלים.
- צור את הצלחת synergist פוטנציאליים על-ידי הוספת µL 50 של מדיה M9 מכל קידוח. להוסיף 50 µL של המדיה המכילה ריכוז קבוע (מיקרומטר 10 או 100 מיקרומטר) של synergist הפוטנציאלי כל טוב של שורה. מבחן מולקולות 8 לכל צלחת.
- צור את הצלחת מולקולה קלט על-ידי הוספת µL 50 של מדיה בכל טוב. להוסיף 50 µL המכיל 4 x מיקרופון של הסם קלט מכל קידוח בעמודה 1. צור לדילול ההדרגתי לאורך ציר ה-x דומים ללוחות מיקרופון, לוקח 50 µL מעמודה 1, פיזור, ערבוב בטור 2. המשך בתהליך זה עד עמודה 12, חיסולו 50 µL מעמודה 12. להוסיף על µL 50 נוספים של מדיה בכל טוב אז סה כ במשך כל סוף הוא 100 µL.
- יצירת את הצלחת השילוב באמצעות צלחת טוב 96, להוסיף 50 µL של מדיה בכל טוב. להוסיף 50 µL המכיל 4 x מיקרופון של הסם קלט מכל קידוח בעמודה 1. לדלל לאורך ציר ה-x דומים ללוחות מיקרופון, לוקח 50 µL מעמודה 1, פיזור, ערבוב בטור 2. להמשיך את זה. כל הדרך כדי עמודה 12, חיסולו 50 µL מעמודה 12 להוסיף 50 µL של המדיה המכילה את synergist פוטנציאליים מיקרומטר 10 או 100 מיקרומטר, כדי כל טוב של שורה. שוב, צריך להיות אחד ריכוז או סמים בכל שורה.
- ליצור את הפקד שאינם מטופלים על-ידי הוספת 100 µL של התקשורת M9 בארות כל צלחת.
- לחסן כל הצלחות על-ידי הוספת 2 µL של התרבות חיידקי עם יתר600 של 0.002 או תאים 1,000 לכל גם לפני.
- למדוד את יתר600 של כל טוב-0 ל- 24 שעות ביממה.
- לגדול תרבות לילה של e. coli בתקשורת M9 ב 37 מעלות צלזיוס, כמו קודם.
- חישוב הציון העצמאות בליס
- לחשב את הצמיחה נטו לטוב כל צלחת על-ידי חיסור את יתר600 ב- h 0 מן הגידול ב 24 שעות ביממה באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני.
- לנרמל את הבארות לצמיחה ממוצעת מהצלחת סמים אין בתוכנית גיליון אלקטרוני.
- שימוש בתכנת, לחשב עיכוב על-ידי חיסור הגידול נטו מ- 1.
- ממוצע העמודות בצלחת הבקרה המכיל רק את ההדרגה קלט בתוכנת הגיליון האלקטרוני.
- לחשב את הציון בליס במשך כל על ידי המשוואה:
בליס ציון = (X טוב + עמודת קלט X) – בשילוב X טוב - חפש תוצאות שליליות בבארות מתחת MIC90 של הקלט.
הערה: ציונים שליליים על פני מספר ריכוזים יצביע על האינטראקציה סינרגטי.
4. תפוקה גבוהה מסך עם מוטציות חיזוי סינרגיה לזהות זוגות סינרגטי הרומן
-
לזהות מוטציות חיזוי סינרגיה
הערה: שלב 1.5 זיהו סינרגיה בשם חיזוי מוטציות. כאן, אנחנו קובעים אשר של המוטנטים האלה יפעלו הטוב ביותר על סמים סינרגטי מסך תפוקה גבוהה. ביצענו assay הזה במכונת Bioscreen, אך הקוראים צלחת טוב 96 גם אמור להיות מקובל.- לגדול כל המוטציות חיזוי סינרגיה בשם ותאים פראי-סוג בתקשורת מינימלי M9.
- הגדרת ה-100 הכוורת. ובכן צלחת (או צלחת טוב 96) עם מדיום הגידול המתאים, מדיום הגידול + סמים קלט, מדיום הגידול + שותף סינרגטי מוכרים סמים קלט, ואת מדיום הגידול + סמים שאינם סינרגטי ידוע. להבטיח כוללים פקדים הרכב.
הערה: מומלץ שלשכפל ארבע בארות עבור כל זן/סמים/ריכוז. - לחסן 1,000 תאים לכל טוב, כולל בקרה הריק בארות.
- לגדול h 48-37 מעלות צלזיוס, עם טלטולים, וקרא OD600 כל 20 דקות.
- לקבוע סמים ריכוז וזמן הנקודה המציגה את ההפרש הצמיחה הגדול ביותר בין פראי-סוג סינרגיה חיזוי תאים מוטציה בנוכחות הסם קלט ושותפיה סינרגטי ידוע. נקודת הזמן האופטימלי, ריכוז, שם לא צריך להיות רב לבין גדילה פראי-סוג תאים וסינרגיה חיזוי מוטציה כאשר גדל בנוכחות סמים ידוע לא לפעול בסינרגיה עם התרופה קלט (איור 3).
-
תפוקה גבוהה מסך לסמים סינרגטי
- לצמוח פראי-סוג תאים ותאים סינרגיה חיזוי מוטציה בתקשורת מינימלי M9.
הערה: השתמש מדיום הגידול המתאים עבור אורגניזם בעל עניין. - להוסיף תרופות מספריית המדיה אז כל טוב אשר מכיל 100 µL מדיה עם מולקולות קטנות על ריכוז קבוע אשר נקבע בשלב הקודם. נמנים בארות ריקים (ללא תאים) ווולס עם הרכב פקדים (e.g., דימתיל סולפוקסיד) להביא בחשבון כל עיכוב גדילה על ידי הרכב דילול סמים.
- להכין לפחות ארבע בארות בקרת רכב לכל צלחת, אידיאלי מפוזרים על פני הצלחת להסביר תופעות מיקום טוב. אם מבחני משתנה, ואז כוללים בקרת רכב אחד לפחות טוב לכל שורה/עמודה, השימוש בכל פקד שורה/עמודה וכן הפקד כדי לחשב ציוני Z עבור כל שורה/עמודה במקום על צלחת שלמה (שלב 4.2.5).
- להוסיף 2 µL של תרבות כל גם לפני. (לוח אחד לכל פראי סוג חיידקים וצלחת אחת עבור חיידקים מוטנטים החזוי סינרגיה).
- להעריך את יתר600 ב- 0 ו- 18 h e. coli או 48 שעות עבור neoformans ג.
- שימוש בתכנת, לחשב את הצמיחה נטו על-ידי חיסור ה OD600 של ריק בארות בארות שליטה הרכב. לזהות וולס עם Z-ציון של -2.5 (ציון Z = רשע - 2.5 * סטיית תקן). הבארות הללו מכילים מולקולה קטנה פוטנציאלי synergist.
- אמת מסך כניסות באמצעות השיטות המתוארות בשלב 3.
- לצמוח פראי-סוג תאים ותאים סינרגיה חיזוי מוטציה בתקשורת מינימלי M9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מבחני לוח שחמט הם שיטה כמותית למחצה למדידת אינטראקציות סינרגטי. הציון הסופי פלט, FICI, קובע אם שילוב סמים נחשבת סינרגטי (FICI ≤0.5), שאינו-אינטראקציה (0.5 < FICI < 4), או עוינת (FICI ≥4.0). איור 1 מדגימה כיצד להגדיר את מעברי צבע סמים ב וזמינותו לוח שחמט. איור 2 מדגים תוצאות נפוצות. שקול צמיחה (סגול בארות) המציגים פחות מ- 90% הצמיחה עיכוב. לאחר מדידת ה OD600 של כל טוב בצלחת, אנחנו לנרמל הכל אל הפקד סמים לא טוב. משהו עם ערך מנורמל > 0.1 (10% ה OD600 של הפקד טוב) הוא הבקיע כמו "גידול". ציונים FICI יכול להשתנות בהתאם אשר טוב נבחר; אנו בוחרים את הבאר שנותן את FICI הנמוך ביותר עבור כל אחד מהלוחות. ב- איור 2A, זה יהיה טוב F9 (עמודים ממוספרים, שורות הצטיין), עם FICI = 0.07. ב. איור 2B, FICI מחושבת על פי C3 טוב (FICI = 1.0). עבור אינטראקציות אויבת, חפשו הציון FICI הגבוה ביותר האפשרי. ב- 2C איור, FICI מחושב מ A1 היטב, אשר נותן את FICI של 8.0.
תנאי הקרנה אופטימלית תמנע מספר גבוה של תוצאות חיוביות שגויות במסך, אשר חוסך זמן וכסף. כאשר אנחנו אופטימיזציה המוטציות חיזוי סינרגיה הפטרייה קריפטוקוקוס neoformans, בדקנו את הסם קלט (תהליך הזיקוק), ארבע תרופות שאינן סינרגטי ידוע (קפאין, climbazole, וטרימטופרים ו brefeldin א), ו-5 של פלוקונאזול שותפים סינרגטי (rifamycin, myriocin, nigericin, rapamycin ו FK506, כל שעלון Chandrasekaran, ס. et al. 18). מאז שגילינו את מולקולות אלה באמצעות ניתוח O2M (סעיפים 1 ו-2), ציפינו את synergizers ידוע באופן סלקטיבי לעכב את הצמיחה של תאים מוטציה של חיזוי סינרגיה אך לא פראי-סוג התאים. כדי להגדיל את ההפרש הצמיחה הצפויה, בדקנו טווח ריכוזים עבור כל מולקולה קטנה, אשר רובם היו משנה המעכבת.
דוגמה התוצאות מוצגות באיור3. מולקולה שאינה לפעול בסינרגיה עם תהליך הזיקוק, brefeldin A, עכבות פראי-סוג של סינרגיה חיזוי מוטציה צמיחה רק במעט, בערך אותה כמות. Rifamycin (דמות 3B), הגידול של המוטציה חיזוי סינרגיה (cnag_03917Δ) היה עכבות, אבל גדילה פראי-סוג התא לא היה. ההבדל הצמיחה הגדול ביותר היה בין 32 ו 49 h לאחר חיסון, אז timepoint להקרנה היה בטווח זה. עקומות גדילה של מולקולות אחרות סינרגטי, שאינם סינרגטי ואורח של rifamycin ו- brefeldin A, בהתאמה.
איור 1 : תיאור של לוח שחמט Assay משלב 3. בדיקת סמים והזנת סמים מעברי הצבע מומחשים A ו- B, בהתאמה. הצלחת הסופית assay אמור להופיע כמו ג אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : התוצאות גרפי של לוח שחמט Assay. איורים של סינרגטי, ללא, ומצוירים אינטראקציות אויבת A, B ו- C, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : נתוני לדוגמה לזיהוי זמן ההקרנה. (א) פראי-סוג (ירוק), סינרגיה חיזוי מוטציה (כחול) של neoformans ג גדל בנוכחות brefeldin A, מולקולה קטנה ידועים לצוות לא עם תהליך הזיקוק. פראי-סוג בקרה (ירוק כהה), סמים מטופלים (ירוק בהיר) יש הבדל דומה צמיחה סינרגיה חיזוי מוטציה שליטה (כחול כהה), סמים מטופלים (תכלת). (B) פראי-סוג של סינרגיה חיזוי מוטציה גדל בנוכחות rifamycin, מולקולה קטנה ידועים לצוות עם תהליך הזיקוק. פראי-סוג בקרה (ירוק כהה), סמים מטופלים (ירוק בהיר) יש הבדל גידול קטן יותר מאשר סינרגיה חיזוי מוטציה (כחול כהה) ובקרה סמים מטופלים (תכלת). ההבדל הגדול ביותר הוא ציין ב 48 שעות עבור מולקולת סינרגטי ידועה והיא ההבדל דומה בשלב זה הזמן עבור מולקולת שאינם סינרגטי ידוע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מולקולה קטנה סינרגטי זוגות יכולים להיות כלי רב עוצמה לטיפול זיהומים חיידקים, אך הם לא הגיעו שלהם פוטנציאל קליני מלא כי זוגות סינרגטי מאתגרות לזיהוי. מאמר זה מתאר שיטה לזיהוי מהיר הרבה יותר פשוטה שילובים pairwise סינרגטי זוגות. באמצעות datasets כימית-גנטיקה, O2M מזהה מוטציות עם הסתרה ג'ין זה יוכל לשמש לאחר מכן כמו הבדיקה לספריות גדול מסך של מולקולות קטנות על מנת לחזות זוגות סינרגטי. היכולת לחזות מולקולות קטנות מאפשר המדרגיות גבוהה של המסכים, אשר בתורו גורם וגדולים זיהוי שותפים סינרגטי. לאחר זיהוי זוגות סינרגטי, יכול להבהיר את המנגנון המולקולרי שבבסיס האינטראקציות סינרגטי, אם באופן רציונלי עיצוב בזוגות סינרגטיים נוספים11.
O2M דורש dataset כימית-גנטית וזוג סינרגטי ידוע. למרבה המזל, כימית-גנטיקה datasets נפוצים עבור מגוון רחב של חיידקים19,20,21. המעבדה חום הפגינו בעבר כי O2M יכול בהצלחה למצוא זוגות סינרגטי11, neoformans ג ו- e. coli12. זה מדגים כי ההשפעה רחב O2M יש כשיטה מדרגי בהרחבה הרלוונטיים מגוון רחב של אורגניזמים. כל השלבים המפורטים להלן יכולים להשתנות לצמיחה של מיקרואורגניזם שונים עם תוצאות דומות יחסית, ובכך O2M כלי רב ערך עבור זיהוי כללי של זוגות סינרגטי. כמה ארגונים אחרים הם מזהים השילובים סינרגטי כימית-גנטיקה datasets באמצעות שיטות אנליטיות שונות, למרות O2M דורש את הידע לפחות תכנות של כל אחת מהשיטות הללו. כל שיטת זיהוי סטים שונים של אנטיביוטיקה סינרגטי או פטרייתי 18,22,23,24, רומז כי מספר רב של זוגות סינרגטי יישארו להתגלות. O2M ושיטות אחרות של חיזוי סינרגיה חלים גם פוטנציאל בתרבית של מערכות, כולל זיהוי סרטן שילובים תרופתיים.
לסיכום, מתאר שיטה זו דרך מהירה עבור זוגות סינרגטי מסך מ- dataset כימית-גנטיקה. שיטה זו ואחרים לסייע זוגות סינרגטי להפוך אפשרות לטיפול יותר ריאלי במרפאות. בנוסף, שיטה כללית ומהירה של O2M מוכיח את זה כלי רב ערך כאשר מחפש זוגות סינרגטי מולקולה קטנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק הפעלה של המחלקה של פתולוגיה, אוניברסיטת יוטה כדי J.C.S.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioscreen C | instrument | Growth Curves USA | |
| Synergy H1 | instrument | BioTek | |
| M9 broth | reagent | Amresco | J863-500G |
| Casamino Acids | reagent | Fisher Scientific | BP1424-500 |
| Glucose | reagent | Sigma | G7021-10KG |
| Nicotinic Acid | reagent | Alfa Aesar | A12683 |
| Thiamine | reagent | Acros Organics | 148991000 |
| CaCl2 Dihydrate | reagent | Fisher | C79-500 |
| MgSO4 Heptahydrate | reagent | Fisher | M63-500 |
| chemical-genetics dataset | dataset | examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text. | |
| trimethoprim (example input drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN19552701 |
| sulfamethoxazole (example test drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN15671125 |
References
- Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management. Front Public Health. 2, 145 (2014).
- Butts, A., Krysan, D. J. Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New. PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870 (2012).
- Roemer, T., Krysan, D. J. Antifungal Drug Development: Challenges, Unmet Clinical Needs, and New Approaches. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (5), a019703 (2014).
- Oprea, T. I., Mestres, J. Drug Repurposing: Far Beyond New Targets for Old Drugs. AAPS J. 14 (4), 759-763 (2012).
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nat Rev Drug Discov. 11 (3), 191-200 (2012).
- Rangel-Vega, A., Bernstein, L. R., Mandujano-Tinoco, E. A., García-Contreras, S. J., García-Contreras, R. Drug repurposing as an alternative for the treatment of recalcitrant bacterial infections. Front Microbiol. 6, 282 (2015).
- Torella, J. P., Chait, R., Kishony, R. Optimal Drug Synergy in Antimicrobial Treatments. PLoS Comput Biol. 6 (6), e1000796 (2010).
- Cowen, L. E., et al. Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease. P Natl Acad Sci. 106 (8), 2818-2823 (2009).
- Zuo, G. -Y., et al. Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). Molecules. 16 (12), 9819 (2011).
- Jia, J., et al. Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).
- Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. S. High-throughput identification and rational design of synergistic small-molecule pairs for combating and bypassing antibiotic resistance. PLOS Biol. 15 (6), e2001644 (2017).
- Brown, J. C. S., et al. Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics. Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).
- Cokol, M., et al. Systematic exploration of synergistic drug pairs. Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).
- Borisy, A. A., et al.
- Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. What is synergy? The Saariselkä agreement revisited. Front Pharmacol. 6, 181 (2015).
- Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis. Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell. Cell. 144 (1), 143-156 (2011).
- Chandrasekaran, S., et al. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).
- Pradhan, A., et al. Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery. Sci Rep. 5, 15930 (2015).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).
- Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. E. Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry. PLoS Genetics. 8 (3), e1002562 (2012).
- Robbins, N., et al. An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens. Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).
- Wildenhain, J., et al. Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning. Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).
- Spitzer, M., et al. Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole. Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).
