Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Høj overførselshastighed identifikation af synergistiske Drug kombinationer af overlapning2 metode

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57241
Automatic Translation
1, 1
1Microbiology and Immunology Division, Department of Pathology, University of Utah

Summary

Synergistisk drug kombinationer er vanskeligt og tidskrævende at identificere empirisk. Her, beskriver vi en metode til at identificere og validere synergistiske små molekyler.

Abstract

Selv om antimikrobielle stoffer steget dramatisk levetid og livskvalitet i det 20. århundrede, truer antimikrobiel resistens vores hele samfundets evne til at behandle systemiske infektioner. I USA alene dræbe antibiotika-resistente infektioner cirka 23.000 personer om året og omkostninger omkring 20 milliarder amerikanske dollars i ekstra sundhedspleje. En metode til bekæmpelse af antimikrobiel resistens er kombinationsbehandling, som er særligt nyttigt i den kritiske tidlige fase af infektion, før de inficerer organisme og dens drug modstand profil er blevet identificeret. Mange antimikrobiel behandlinger bruge Kombinationsbehandlinger. Men de fleste af disse kombinationer er additive, hvilket betyder, at den kombinerede effekt er den samme som summen af de individuelle antibiotisk virkning. Nogle Kombinationsbehandlinger er synergistisk: kombineret effekten er langt større end additiv. Synergistisk kombinationer er især nyttige, fordi de kan hæmme væksten af antimikrobielt resistente stammer. Men disse kombinationer er sjældne og svære at identificere. Dette er på grund af det store antal af molekyler skulle være testet i en parvis måde: et bibliotek af 1.000 molekyler har 1 millioner potentielle kombinationer. Således har gjort en indsats for at forudsige molekyler for synergi. Denne artikel beskriver vores høj overførselshastighed metode til at forudsige synergistiske lille molekyle par kendt som overlapning2 metode (O2M). O2M bruger mønstre fra kemiske-genetiske datasæt til at identificere mutanter, der er overfølsomme for hvert molekyle i en synergistisk par, men ikke til andre molekyler. Den brune lab udnytter denne vækst forskel ved at udføre en høj overførselshastighed skærm for molekyler, der hæmmer væksten af mutant men ikke wild-type celler. Lab's arbejde tidligere identificerede molekyler, der synergieffekter med de antibiotiske trimethoprim og svampedræbende stof fluconazol ved hjælp af denne strategi. Forfatterne præsenterer her, en metode til skærmen for romanen synergistiske kombinationer, der kan ændres til flere mikroorganismer.

Introduction

Antibiotikaresistente bakterier forårsager mere end 2 millioner infektioner og 23.000 dødsfald årligt i USA Ifølge CDC1. Nye behandlinger er nødvendig for at overvinde disse infektioner. Strategier til at identificere disse nye behandlinger omfatter udvikling af nye antimikrobielle stoffer eller nyorientering af små molekyler godkendt til andre betingelser til behandling af mikrobielle infektioner2,3,4. Nye drug discovery er dog meget dyrt og tidskrævende. Nyorientering narkotika kan ikke identificere roman medicin eller narkotika mål5,6. Vores lab fokuserer på en tredje strategi er kendt som synergistisk Kombinationsbehandlinger. Synergistisk kombinationer opstår når to små molekyler sammen har en effekt, der er større end den additive effekt af deres individuelle efficacies7. Derudover kan synergistiske kombinationer være effektiv mod en patogen resistente over for en af de små molekyler i parret ud over at have mindre uønskede off target effekter, gør dem store potentielle8,9, 10.

Synergistisk par er sjælden, forekommer i ca. 4-10% af stoffet kombinationer11,12,13. Således er traditionelle teknikker såsom parvise skærme udfordrende og tidskrævende, med tusindvis af potentielle kombinationer fra et lille bibliotek af hundrede molekyler. Derudover synergistiske interaktioner normalt kan ikke forudsiges fra aktiviteten af forbindelser14. Men forfatterne udviklet en høj overførselshastighed tilgang til at screene for synergistiske par, kaldet overlapning2 metode (O2M)12. Denne metode, beskrevet her, giver mulighed for hurtigere, mere effektiv identifikation af disse synergistiske par. O2M kræver brug af en kendt synergistiske par og et kemikalie-genetik datasæt. Kemikalie-genetik datasæt genereres, når et bibliotek af knockout mutanter er vokset i overværelse af mange forskellige små molekyler. Hvis et molekyle i en kendt synergistiske par inducerer samme fænotype fra en bestemt knockout mutant som den anden synergistiske molekyle, bør andre lille molekyle, der fremkalder fænotype fra den samme mutant også synergieffekter med hvert medlem af kendt synergistisk par. Denne logik har været brugt i brun lab til at identificere synergistiske antibiotika par aktive mod Escherichia coli (E. coli) og synergistiske svampedræbende stof par aktive mod patogene svampen Cryptococcus neoformans (C. neoformans)11,12. O2M er ikke kun kan tilpasses til forskellige patogener, men giver mulighed for screening af store biblioteker af molekyler til at identificere synergistiske par nemt og hurtigt. Screening med den genetiske mutant identificeret ved O2M tillader os at validere kun de små molekyler forudsagt for synergi. Således ville test en 2.000-molekyle bibliotek parvis tage måneder, hvis der var kun 20 molekyler i biblioteket forudsagt for at synergieffekter, test for synergy nu tager et spørgsmål om dage. O2M kræver ingen programmering færdigheder, og det nødvendige udstyr er tilgængelig i de fleste labs eller core faciliteter. Ud over forskere interesseret i stof kombinationer er O2M analyse af interesse for alle, der har gennemført et stof skærmen og ønsker at udvide deres hits ved at identificere vigtige stof-drug interaktioner. Herunder er protokol for at identificere synergistiske små molekyler i bakterier, samt validering af de forudsagte synergistiske interaktioner i velkendte assays15,16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. at identificere synergi forudsigelse mutanter fra kemiske-genetik datasæt ved overlapning2 metode (O2M)

Bemærk: Dette er metoden til at identificere synergi forudsigelse mutanter ved hjælp af den offentliggjorte datasæt fra Nichols mfl. 17 i E. coli. Dette kan dog gøres på enhver kemisk-genetik datasæt og mikroorganisme. Disse datasæt indeholder et bibliotek med knockout mutanter vokset i overværelse af mere end 100 små molekyler, giver en kvantitativ vækst score for hvert mutant i hver enkelt små molekyle. En synergistisk par skal være kendt, og der skal være vækst noder for begge små molekyler, der indgår i datasættet.

  1. Beregn den gennemsnitlige vækst score og standardafvigelse for alle mutanter, dyrkes i overværelse af en enkelt koncentration af hver enkelt små molekyle.
    Bemærk: Dette kan gøres ved hjælp af regneark software. Den brune lab bruger Excel og funktionerne =AVERAGE(B3:B3981) og =STDEV(B3:B3981) for beregninger af hver kolonne i lille molekyle.
    1. Beregne de betyder, og standardafvigelser fra hver kolonne af lille molekyle, selvom denne orientering kan afvige hvis ved hjælp af et andet datasæt.
  2. Beregne Z score for hver koncentration af lille molekyle ved hjælp af de samme datasæt fra Nichols mfl. 17 i et regnearksprogram. For dette, negative z score vil være Z(2.5) = betyder - 2,5 * standardafvigelse og positive z score vil være Z(2.5) = middelværdi + 2,5 * standardafvigelse.
  3. Afgøre, hvilke gen mutanter indeholder betydelige Z score i de små molekyler, som udgør de kendte synergistiske par, Sørg for at kigge på alle koncentrationer af disse molekyler. Hvis væksten score en mutant er mindre end den negative Z (2.5) score eller er større end den positive Z (2.5) score for at lille molekyle, anses det for betydelig.
  4. Bestemme, hvis nogen af betydelig gene mutanter tilhører en operon.
    Bemærk: For E. coli, forfatterne anbefaler kontrol "Ecoli wiki" for oplysninger om hvis gener er transkriberet som del af en polycistronic RNA.
  5. Identificere genet/operon mutanter, der er fælles for fleste af de små molekyler af interesse ved forskellige koncentrationer (fx., når man ser for molekyler, der synergieffekter med de antibiotiske trimethoprim, identificere mutanter, der viser en betydelig Z score når vokset trimethoprim og dets kendte synergistiske partnere såsom sulfamethizole eller sulfamethoxazol). Disse er formodede synergi forudsigelse mutanter.

2. at forudsige Synergizers inden for den kemiske-genetik datasæt af O2M

  1. Vender tilbage til dataset17, identificere hver koncentration af lille molekyle, der fremkalder en betydelig vækst score fra synergi forudsigelse mutant. Dette gøres ved at kigge på Z score beregnes for hver koncentration af små molekyler. Igen, en betydelig vækst score er mindre end den negative Z-score eller større end den positive Z score for at koncentrationen af lille molekyle.
    Bemærk: Hvis et molekyle vises på endnu en af sine koncentrationer, molekylet anses for en forudsagt synergizer. Ethvert molekyle, der ikke fremkalde en væsentlig vækst score er en forudsagt ikke-synergizer.

3. validering af forudsagte synergistiske interaktioner

  1. At finde minimal hæmmende koncentration (MIC) af forventede synergizers.
    1. Vokse en overnight kultur af E. coli i M9 minimal medier ved 37 ° C.
      Bemærk: Enhver overnight kultur kan dyrkes i korrekt definerede medium for organisme af interesse. Den brune lab anbefaler ikke rig medier som LB eller YPD. M9 minimal media består af 10,5 g/L M9 bouillon, 0,2% casamino syrer, 0,1 M CaCl2, 0,4% glucose, 1 M MgSO4, 0,25% nikotinsyre og 0,33% thiamin i H2O.
    2. Hvis ingen MIC data for patogenet af interesse er fundet i litteratur ved modtagelse af små molekyler, opløses i dimethylsulfoxid (DMSO) på en høj koncentration (> 10 mg/mL).
    3. Bruger en 96-brønd plade, Tilsæt 100 µL af M9 medier til hver brønd. Tilføje en ekstra 100 µL af M9 medier i kolonne 1, så det indeholder i alt 200 µL.
    4. Tilføje en vilkårlig mængde (~ 10 µL) koncentreret lille molekyle løsning i kolonne 1. Et lille molekyle pr. brønd af kolonne 1 (8 små molekyler pr. plade).
      Bemærk: Disse er små molekyler af interesse, der er forudsagt for synergieffekter. Den brune lab generelt tilføjer 10 µL af stærkt koncentreret lille molekyle løsning, der er lavere end mængden af 100% DMSO, der kan hæmme E. coli.
    5. Når de små molekyler er blevet tilføjet, fortyndes de små molekyler på tværs af x-aksen af pladen. Tag 100 µL af løsning fra kolonne 1, placere i kolonne 2 og bland. Tag 100 µL fra kolonne 2, sted i kolonne 3 og bland. Fortsæt denne proces indtil 100 µL placeres i kolonne 11. Bland kolonne 11, derefter tage 100 µL fra kolonnen og kassér. Forlade kolonne 12 med bare medierne til at normalisere dataene.
    6. Podes pladen. Opnå det optisk densitet (OD600) fra en overnight kultur. Der fremstilles en opløsning med kultur og M9 medier til en OD600 af 0,002 (eller passende koncentration, der repræsenterer 500 celler/mikroliter for den ønskede organisme af interesse). Der afpipetteres 2 µL af kultur løsning i hvert hul i pladen så der er 1.000 celler pr. brønd.
    7. Forsigtigt ryste pladen og få OD600 for 0 h læsning. Lad pladen vokse ved 37 ° C i 24 h. Hent OD600 for 24 h læsning.
      Bemærk: Brug passende vækstbetingelser for andre organismer af interesse.
    8. Beregne nettotilvæksten til hver brønd med et regnearksprogram.
    9. Gennemsnitlig nettotilvæksten af kolonne 12 at få gennemsnitlige ingen narkotika vækst. Normalisere de andre brønde til gennemsnittet af ingen narkotika vækst ved hjælp af et regneark software. Kigge efter hvilken som helst godt med mindre end 10% vækst til at identificere MIC90. Enhver godt med mindre end 50% vækst angiver MIC50. Beregne koncentrationen af lille molekyle i disse brønde.
  2. Skakternet Assays til synergistiske interaktioner
    1. Vokse en overnight kultur af E. coli i M9 minimal medier som før.
      Bemærk: Brug passende vækstbetingelser for andre organismer.
    2. Tilsæt 100 µL af M9 medier til hver brønd med en 96 godt plade og en ekstra 100 µL i kolonne 1.
    3. Tilføje test lille molekyle (på ~ 8 x MIC) til hver godt i kolonne 1 og tilføje dobbelt koncentration (~ 16 x MIC) til godt A1 (et lille molekyle testet pr. plade).
      Bemærk: Dette beløb bestemmes fra MIC test afsluttet forudgående og er forskellig for hver enkelt potentiel synergizer.
    4. Oprette en gradient fortynding på x-aksen ved at tage 100 µL fra kolonne 1 og overførsel til kolonne 2. Fortsæt denne proces indtil 100 µL føjes til kolonne 11. Bland, derefter tage 100 µL fra kolonne 11 og afhænde. Tilføj ikke noget stof til kolonne 12 (figur 1A).
    5. Oprette den anden narkotika forløb på tværs af y-aksen for input stoffet. Tilsæt 100 µL af medier indeholdende 2 x MIC input molekyle i rækken A. Mix og fortyndet som før, tager 100 µL fra række A og markedsføring i B. Fortsæt indtil 100 µL er placeret i rækken G. Mix, tage 100 µL og bortskaffer, sikre ikke hen til sammenlægge noget input stof i række H. Dette giver mulighed for række H, og kolonne 12 skal indeholde individuelle mikrofoner af stoffet parret testet (figur 1B).
    6. Podes pladen. Tilsæt 2 µL af en E. coli kultur OD600 0,002 til hver brønd (1.000 celler pr. brønd).
    7. Måle OD600 i hver brønd i plade for 0 h læsning.
    8. Inkuber plade i 24 timer ved 37 ° C.
    9. Måle OD600 i hver brønd på 24 h.
  3. Beregning af fraktioneret hæmmende koncentration indeks (FICI) fra Checkerboards
    1. Beregne nettotilvæksten for hver brønd af pladen ved at fratrække OD600 på 0 h fra OD600 på 24 h i et regnearksprogram.
    2. Normalisere vækst i softwaren ved at dividere hver brønd ved godt H12, som indeholder ingen lille molekyle.
    3. Find MIC90 af input-molekylet i kolonne 12 og MIC90 af den potentielle synergist i række H.
    4. Kigge efter alle brønde, der hæmmer 90% af vækst.
    5. Beregn FICI90 for de godt, det er enten den laveste nedenfor (synergistiske) eller højeste ovenfor (antagonistiske) begge MIC90 værdierne, ved hjælp af ligningen:
      Equation 1
    6. Overveje enhver FICI ≤ 0,5 så synergistiske og FICI ≥ 4 som antagonistiske (figur 2).
      Bemærk: Dette kan også gøres med MIC50 (50% hæmning af vækst) at få et FICI50 baseret på disse MIC værdier.
  4. Bliss uafhængighed Assay
    Bemærk: Bliss uafhængighed er køre med enhver potentiel synergist, der ikke har en mikrofon på egen hånd.
    1. Vokse en overnight kultur af E. coli i M9 medier ved 37 ° C, som før.
      Bemærk: Igen, passende vækstbetingelser for andre organismer af interesse kan bruges i dette trin.
    2. Forberede 96-brønd plader til afprøvning af potentielle synergistiske molekylet, input molekylet, kombinationen og en ikke-behandlet kontrol.
    3. Skabe potentiel synergist pladen ved at tilføje 50 µL af M9 medier til hver brønd. Tilsæt 50 µL af medier indeholdende et sæt koncentration (10 µM eller 100 µM) af den potentielle synergist til hver brønd i en række. Teste 8 molekyler pr. plade.
    4. Oprette input molekyle pladen ved at tilføje 50 µL af medier til hver brønd. Tilsæt 50 µL indeholdende 4 x MIC af input stoffet til hver brønd i kolonne 1. Oprette en gradient fortynding langs x-aksen svarer til MIC plader, tager 50 µL fra kolonne 1, sprede og blande i kolonne 2. Fortsæt denne proces indtil kolonne 12, bortskaffelse 50 µL fra kolonne 12. Tilføje en yderligere 50 µL af medier til hver brønd, så sum for hver brønd er 100 µL.
    5. Oprettelse kombination plade ved hjælp af en 96 godt plade, tilsæt 50 µL af medier til hver brønd. Tilsæt 50 µL indeholdende 4 x MIC af input stoffet til hver brønd i kolonne 1. Fortynd langs x-aksen svarer til MIC plader, tager 50 µL fra kolonne 1, sprede og blande i kolonne 2. Fortsæt det hele vejen til kolonne 12, bortskaffelse 50 µL fra kolonne 12. Tilsæt 50 µL af medier indeholdende den potentielle synergisten på 10 µM eller 100 µM til hver brønd i rækken. Igen, bør der være en koncentration eller stof pr. række.
    6. Oprette den ubehandlede kontrol ved at tilføje 100 µL af M9 medier til alle pladens huller.
    7. Podes alle plader ved at tilføje 2 µL af bakteriekultur med en OD600 0,002 eller 1.000 celler til hver brønd som før.
    8. Måle OD600 i hver brønd på 0 og 24 h.
  5. Beregning af Bliss uafhængighed Score
    1. Beregne nettotilvæksten for hver brønd af pladen ved at fratrække OD600 på 0 h fra vækst på 24 timer ved hjælp af et regnearksprogram.
    2. Normalisere brøndene til den gennemsnitlige vækst fra ingen narkotika pladen i et regnearksprogram.
    3. Brug af regneark software, beregne hæmning ved at fratrække nettotilvæksten fra 1.
    4. Gennemsnitlig kolonner i kontrol pladen som indeholder kun input farveforløbet i programmet regneark.
    5. Beregne bliss scoren for hver brønd ved ligningen:
      Bliss Score = (godt X + input kolonne X) – kombineret godt X
    6. Kigge efter negative scores i brønde under MIC90 af input.
      Bemærk: Negative noder på tværs af flere koncentrationer tyder på en synergistisk interaktion.

4. høj overførselshastighed skærmen med Synergy forudsigelse mutanter at identificere roman synergistiske par

  1. Identificere synergi forudsigelse mutanter
    Bemærk: Trin 1,5 identificeret formodede synergi forudsigelse mutanter. Her, afgøre vi, hvilken af disse mutanter vil fungere bedst i en høj overførselshastighed skærm for synergistiske narkotika. Vi udførte denne analyse i en Bioscreen maskine, men 96 godt plade læsere bør også være acceptabelt.
    1. Vokse hver formodede synergi forudsigelse mutanter og wild-type celler i M9 minimal medier.
    2. Oprettet af 100 honeycomb godt plade (eller 96 godt plade) med passende vækstmediet, vækstmediet + input stof, vækstmediet + kendte synergistiske partner input stof, og vækstmediet + kendte ikke-synergistiske stof. Sørge for at medtage betjeningsanordninger.
      Bemærk: Vi anbefaler fire replikere brønde for hver stamme/drug/koncentration.
    3. Podes 1.000 celler pr. brønd, herunder tomme kontrolhullerne.
    4. Vokse 48 timer ved 37 ° C, med rysten, og læser OD600 hver 20 min.
    5. Bestemme drug koncentration og tid punkt, der viser den største vækst forskellen mellem wild-type og synergi forudsigelse muterede celler input stoffet og dets kendte synergistiske partnere. På det optimale tidspunkt og koncentration, bør der ikke være megen vækst forskellen mellem wild-type og synergi forudsigelse muterede celler når der dyrkes i overværelse af lægemidler kendt ikke handle synergistisk med input stoffet (figur 3).
  2. Høj overførselshastighed skærmen for synergistiske narkotika
    1. Vokse wild-type celler og synergi forudsigelse muterede celler i M9 minimal medier.
      Bemærk: Brug passende vækstmedium for organisme af interesse.
    2. Tilføje narkotika fra biblioteket til medier, så hver godt som indeholder 100 µL medier med små molekyler på sæt koncentration, som blev fastsat i det forrige trin. Blanke brønde (uden celler) og brønde med køretøjets forskellige betjeningsapparater (e.g., DMSO) for at tage højde for enhver væksthæmning af narkotika fortynding køretøj.
      1. Forbered mindst fire køretøj kontrolhullerne pr. plade, ideelt spredt ud over hele pladen for at tage højde for godt holdning effekter. Hvis assays er variabel, derefter omfatter mindst ét køretøj kontrol godt pr. række/kolonne og bruge hver række/kolonne kontrol samt kontrol til at beregne Z score for hver række/kolonne i stedet for for en hel plade (trin 4.2.5).
    3. Tilsæt 2 µL af kultur til hver brønd som før. (Én plade for vildtype bakterier og en plade for forventede synergi mutant bakterier).
    4. Vurdere OD600 på 0 og 18 h for E. coli eller 48 timer for C. neoformans.
    5. Brug af regneark software, beregne nettotilvæksten ved at fratrække OD600 af Tom brønde fra køretøjet-kontrolhullerne. Identificere brønde med en Z-score på-2.5 (Z score = middelværdi - 2,5 * standardafvigelse). Disse brønde indeholder en potentiel synergist lille molekyle.
    6. Validere skærmen hits ved hjælp af de metoder, der er beskrevet i trin 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Skakternet assays er en semi-kvantitative metode til måling af synergistiske interaktioner. Den endelige score output, FICI, bestemmer en drug kombination anses synergistiske (FICI ≤0.5), ikke-interagere (0,5 < FICI < 4), eller antagonistisk (FICI ≥4.0). Figur 1 illustrerer hvordan man opsætter drug forløb i et skakternet assay. Figur 2 illustrerer fælles resultater. Overveje vækst (lilla wells) som viser mindre end 90% væksthæmning. Efter måling af OD600 i hver brønd i en plade, normalisere vi alt til kontrolelementet ingen narkotika godt. Noget med en normaliseret værdi > 0,1 (10% af OD600 i kontrolelementet godt) er scoret som "vækst". FICI score kan variere afhængigt af hvor godt er plukket; Vi vælger den brønd, der giver den laveste FICI for hver plade. I figur 2A, der ville være godt F9 (kolonner er nummererede, rækker bogstaverne), = med en FICI 0,07. I figur 2B, FICI er beregnet ud fra godt C3 (FICI = 1,0). For antagonistiske interaktioner, kigge efter den højeste FICI score muligt. I figur 2 cberegnes FICI fra godt A1, som giver en FICI af 8.0.

Optimal screening betingelser vil forhindre, at et stort antal falske positiver fra skærmen, hvilket sparer tid og penge. Når vi optimeret synergi forudsigelse mutanter for svampen Cryptococcus neoformans, testede vi de input stof (fluconazol), fire kendte ikke-synergistiske lægemidler (koffein, climbazole, trimethoprim og brefeldin A), og fem af fluconazols synergistisk partnere (rifamycin, myriocin, nigericin, rapamycin og FK506, alle drøftet i Casper, S. et al. 18). da vi opdagede disse molekyler gennem O2M analyse (afsnit 1 og 2), forventede vi de kendte synergizers til selektivt at hæmme væksten af synergy forudsigelse muterede celler men ikke wild-type celler. For at maksimere den forventede vækst forskel, vi har testet en række koncentrationer for hver enkelt små molekyle, hvoraf de fleste var sub-hæmmende.

Eksempel resultater er vist i figur 3. Et molekyle, der ikke handler synergistisk med fluconazol, brefeldin A, hæmmet vildtype og synergi forudsigelse mutant vækst kun lidt, og omtrent den samme mængde. Rifamycin (figur 3B), væksten af synergy forudsigelse mutant (cnag_03917Δ) blev hæmmet, men wild-type cellevækst var ikke. Den største vækst forskel var mellem 32 og 49 h efter podning, så tidspunkt for screening var i dette område. Vækstkurver i andre synergistiske og ikke-synergistiske molekyler lignede de rifamycin og brefeldin A, henholdsvis.

Figure 1
Figur 1 : Skildring af skakternet analyse fra trin 3. Test narkotika og input drug gradienter er illustreret i A og B, henholdsvis. Den endelige assay plade skal vises som C. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Grafisk resultaterne af skakternet Assay. Illustrationer af synergistiske, ingen, og antagonistiske interaktioner er afbildet i A, B og C, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Eksempeldata til identifikation af screening tid. (A) Wild-type (grøn) og synergi forudsigelse mutant (blå) af C. neoformans vokset i tilstedeværelse af en brefeldin A, et lille molekyle kendte til ikke synergieffekter med fluconazol. Wild-type kontrol (mørk grøn) og narkotika behandles (lysegrøn) har en lignende forskel i væksten for synergy forudsigelse mutant kontrol (mørkeblå) og narkotika behandles (lyseblå). (B) Wild-type og synergi forudsigelse mutant vokset i overværelse af rifamycin, et lille molekyle kendte til synergieffekter med fluconazol. Wild-type kontrol (mørk grøn) og narkotika behandles (lysegrøn) har en mindre vækst forskel end synergy forudsigelse mutant kontrol (mørkeblå) og narkotika behandles (lyseblå). Den største forskel er observeret på 48 timer for den kendte synergistiske molekyle og forskellen er ens på dette tidspunkt for de kendte ikke-synergistiske molekyle. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Synergistisk lille molekyle par kan være et effektivt redskab til behandling af mikrobielle infektioner, men de har ikke nået deres fulde kliniske potentiale fordi synergistiske par er udfordrende at identificere. Dette papir beskriver en metode til at identificere synergistiske par meget hurtigere end simpel parvise kombinationer. Ved hjælp af kemisk-genetik datasæt, identificerer O2M mutanter med gen knockouts, som derefter kan bruges som en udlæsning på skærmen store biblioteker af små molekyler for at forudsige synergistiske par. Evnen til at forudsige små molekyler giver mulighed for høj skalerbarhed af skærme, hvilket igen gør for stor identifikation af synergistiske partnere. Efter at identificere synergistiske par, kan en belyse molekylære mekanisme underliggende synergistiske interaktioner, så rationelt designe ekstra synergistiske par11.

O2M kræver et kemikalie-genetiske datasæt og en kendt synergistiske par. Heldigvis, kemikalie-genetik datasæt er fælles for en række forskellige mikrober19,20,21. Den brune lab tidligere demonstreret, at O2M med succes kan finde synergistiske par i både C. neoformans og E. coli11,12. Dette viser, at den brede virkning O2M er som en skalerbar metode, der er stort set gælder for en række forskellige organismer. Alle trinnene her kan ændres for væksten i en anden mikroorganisme med forholdsvis ensartede resultater, hvorved O2M et værdifuldt redskab til generel identifikation af synergistiske par. Flere andre grupper er at identificere synergistiske kombinationer fra kemiske-genetik datasæt ved forskellige analysemetoder, selvom O2M kræver den mindste programmering viden om nogen af disse metoder. Hver metode identificerer forskellige sæt af synergistiske antibiotika eller svampemidler 18,22,23,24, tyder på, at et stort antal synergistiske par fortsat at blive opdaget. O2M og andre synergi forudsigelse metoder kan også potentielt anvendes til pattedyr systemer, herunder at identificere kræft narkotika kombinationer.

I sum beskrives i denne metode en hurtig måde at screene for synergistiske par fra et kemikalie-genetik datasæt. Denne metode og andre hjælpe synergistiske par blive en mere realistisk behandlingsmulighed i klinikker. Derudover beviser O2M's hurtige og generaliserede metode det til et værdifuldt redskab, når de søger ud synergistiske lille molekyle par.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en start tilskud fra Institut patologi, University of Utah til J.C.S.B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioscreen C instrument Growth Curves USA
Synergy H1 instrument BioTek
M9 broth reagent Amresco J863-500G
Casamino Acids reagent Fisher Scientific BP1424-500
Glucose reagent Sigma G7021-10KG
Nicotinic Acid reagent Alfa Aesar A12683
Thiamine reagent Acros Organics 148991000
CaCl2 Dihydrate reagent Fisher C79-500
MgSO4 Heptahydrate reagent Fisher M63-500
chemical-genetics dataset dataset examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text.
trimethoprim (example input drug; any can be used) reagent Fisher Scientific ICN19552701
sulfamethoxazole (example test drug; any can be used) reagent Fisher Scientific ICN15671125

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management. Front Public Health. 2, 145 (2014).
  2. Butts, A., Krysan, D. J. Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New. PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870 (2012).
  3. Roemer, T., Krysan, D. J. Antifungal Drug Development: Challenges, Unmet Clinical Needs, and New Approaches. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (5), a019703 (2014).
  4. Oprea, T. I., Mestres, J. Drug Repurposing: Far Beyond New Targets for Old Drugs. AAPS J. 14 (4), 759-763 (2012).
  5. Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nat Rev Drug Discov. 11 (3), 191-200 (2012).
  6. Rangel-Vega, A., Bernstein, L. R., Mandujano-Tinoco, E. A., García-Contreras, S. J., García-Contreras, R. Drug repurposing as an alternative for the treatment of recalcitrant bacterial infections. Front Microbiol. 6, 282 (2015).
  7. Torella, J. P., Chait, R., Kishony, R. Optimal Drug Synergy in Antimicrobial Treatments. PLoS Comput Biol. 6 (6), e1000796 (2010).
  8. Cowen, L. E., et al. Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease. P Natl Acad Sci. 106 (8), 2818-2823 (2009).
  9. Zuo, G. -Y., et al. Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). Molecules. 16 (12), 9819 (2011).
  10. Jia, J., et al. Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).
  11. Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. S. High-throughput identification and rational design of synergistic small-molecule pairs for combating and bypassing antibiotic resistance. PLOS Biol. 15 (6), e2001644 (2017).
  12. Brown, J. C. S., et al. Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics. Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).
  13. Cokol, M., et al. Systematic exploration of synergistic drug pairs. Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).
  14. Borisy, A. A., et al. Systematic discovery of multicomponent therapeutics. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (13), 7977-7982 (2003).
  15. Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. What is synergy? The Saariselkä agreement revisited. Front Pharmacol. 6, 181 (2015).
  16. Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis. Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).
  17. Nichols, R. J., et al. Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell. Cell. 144 (1), 143-156 (2011).
  18. Chandrasekaran, S., et al. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).
  19. Pradhan, A., et al. Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery. Sci Rep. 5, 15930 (2015).
  20. Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).
  21. Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. E. Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry. PLoS Genetics. 8 (3), e1002562 (2012).
  22. Robbins, N., et al. An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens. Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).
  23. Wildenhain, J., et al. Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning. Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).
  24. Spitzer, M., et al. Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole. Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).

Tags

Genetik spørgsmålet 135 antibiotikaresistens antimikrobiel resistens drug kombinationer drug synergi høj overførselshastighed skærm overlapning2 metode
Høj overførselshastighed identifikation af synergistiske Drug kombinationer af overlapning<sup>2</sup> metode
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wambaugh, M. A., Brown, J. C. S.… More

Wambaugh, M. A., Brown, J. C. S. High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method. J. Vis. Exp. (135), e57241, doi:10.3791/57241 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter