Summary
Наркотиков синергических сочетаний, сложным и трудоемким для выявления эмпирически. Здесь мы описываем метод для идентификации и проверки синергетический малых молекул.
Abstract
Хотя антимикробные резко увеличили продолжительность жизни и качество жизни в20 веке , антибиотикорезистентности угрожает способности всего нашего общества для лечения системных инфекций. В одних только Соединенных Штатах антибиотикоустойчивых инфекций убивают около 23 000 человек год и стоимостью около 20 миллиардов долларов США в дополнительных здравоохранения. Один из подходов к борьбе с устойчивостью к противомикробным препаратам является комбинированной терапии, которая является особенно полезным в критической стадии инфекции, прежде чем заражение организма и его сопротивление профиля наркотиков были определены. Многие антимикробного лечения используют комбинированной терапии. Однако, большинство из этих комбинаций являются добавка, означает, что эффективность комбинированных сумма отдельных антибактериальной эффективности. Некоторые комбинированной терапии синергетический: Комбинированные эффективность гораздо больше, чем добавка. Синергетических комбинаций особенно полезны, поскольку они могут подавлять рост антимикробной лекарственной устойчивостью штаммов. Однако эти сочетания, редких и трудно определить. Это связано огромное количество молекул, необходимых для проверки на основе pairwise: Библиотека 1000 молекул имеет 1 миллиона потенциальных комбинаций. Таким образом были предприняты усилия для прогнозирования молекул для взаимодействия. Эта статья описывает наш метод высокой пропускной способностью для прогнозирования пар синергетический малые молекулы, известный как перекрытие2 метод (O2M). O2M использует шаблоны от химико генетические наборов данных для выявления мутантов, которые гиперчувствительности, каждая молекула в паре синергетический, но не других молекул. Коричневый лаборатории эксплуатирует этот рост разница, выполняя экран высокой пропускной способностью для молекул, которые подавляют рост мутант, но не одичал тип клеток. Лабораторная работа ранее выявленных молекулы, которые объединения с антибиотиком триметоприм и флуконазол противогрибковый препарат, используя эту стратегию. Здесь авторы представляют способ экран для Роман синергетических комбинаций, которые могут быть изменены для нескольких микроорганизмов.
Introduction
Устойчивых к антибиотикам бактерий вызывать инфекции более чем 2 миллиона и 23 000 смертей ежегодно в Соединенных Штатах согласно CDC1. Новые методы лечения необходимы для преодоления этих инфекций. Стратегии для выявления этих новых методов лечения включают в себя разработку новых противомикробных препаратов или повторное использование малых молекул, утвержденных для других условий для лечения микробной инфекции2,3,4. Однако новых лекарственных препаратов является очень дорогостоящим и трудоемким. Повторное использование наркотиков не могут идентифицировать Роман лекарств или наркотиков цели5,6. Наша лаборатория фокусируется на третью стратегию, известную как синергических комбинированной терапии. Синергетических комбинаций возникают, когда два малых молекул вместе имеют эффективность более чем аддитивный эффект их индивидуальных узкоспециализированного7. Кроме того синергетических комбинаций может быть эффективен в отношении возбудителя, устойчив к одной из маленьких молекул в паре помимо меньше нежелательных эффектов пробить, делая их большой потенциал8,9, 10.
Синергических пары редки, происходящих в примерно 4-10% препарата комбинации11,12,13. Таким образом традиционные методы, такие как парные экраны, сложным и трудоемким, с тысячи возможных комбинаций сотни молекул из небольшой библиотеки. Кроме того синергетического взаимодействия не может быть предсказано от деятельности соединений14. Однако авторы разработали высок объём подход к экрана для синергетического пар, называется перекрытие2 метод (O2M)12. Этот метод, описанный здесь, позволяет быстрее, более эффективной идентификации этих синергических пар. O2M требует использования пару известных синергических и химико генетика dataset. Химико генетика наборы данных создаются, когда библиотека нокаут мутантов выращивается в присутствии многих различных малых молекул. Если одна молекула в пару известных синергетический индуцирует же фенотипа от конкретного нокаут мутант как второй синергетический молекулы, любые другие малые молекулы, что вызывает фенотипа от этого же мутант следует также объединения с каждым членом известных синергических пара. Это обоснование был использован в коричневый лаборатории для выявления синергических антибиотик пар, активен против Escherichia coli (E. coli) и синергических противогрибковый препарат пар активных против патогенных грибом Cryptococcus neoformans (C. neoformans)11,12. O2M является не только адаптируется для различных патогенных микроорганизмов, но позволяет для скрининга больших библиотек молекул для выявления синергических пар легко и быстро. Скрининг с генетический мутант, выявленные O2M позволяет нам проверить только те малые молекулы, прогнозируемое для взаимодействия. Таким образом тестирования библиотеки 2000 молекула попарно будет занять несколько месяцев, тогда как если были только 20 молекул в этой библиотеке, предсказал объединения, тестирование взаимодействия теперь занимает всего несколько дней. O2M не требует навыков программирования, и необходимое оборудование предоставляется в большинстве лабораторий или основной зал. Помимо исследователей, заинтересованных в комбинации препаратов анализ O2M является интерес к любому, кто завершил на экране наркотиков и хочет расширить свои хиты путем выявления важных наркотиков лекарственных взаимодействий. Ниже это протокол для выявления синергических малых молекул в бактерии, а также проверка предсказал синергического взаимодействия в известных анализов15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. выявление синергизма прогноз мутантов из набора данных химико генетика2 методом наложения (O2M)
Примечание: Это метод для выявления синергизма прогноз мутантов с использованием опубликованных данных от Николс и др. 17 в E. coli. Однако это можно сделать на любой химико генетика dataset и микроорганизмов. Эти наборы данных содержат библиотеку нокаут мутантов, выращенных в присутствии более чем 100 маленьких молекул, давая оценку количественного роста для каждого мутант в каждой маленькой молекулы. Одна пара синергетический, должны быть известны, и должен существовать оценки роста для обеих малых молекул, включенных в набор данных.
-
Рассчитайте средний рост показателя и стандартное отклонение для всех мутантов, выращенных при наличии одного концентрации каждой маленькой молекулы.
Примечание: Это может быть сделано с помощью любого программного обеспечения электронной таблицы. Коричневый лаборатория использует Excel и функции =AVERAGE(B3:B3981) и =STDEV(B3:B3981) для вычисления каждого столбца малые молекулы.- Рассчитайте средства и стандартные отклонения от каждого столбца малые молекулы, хотя эта ориентация может отличаться, если используется другой набор данных.
- Расчет оценки Z для каждой концентрации малых молекул с использованием того же набора данных от Николс и др. 17 в программу электронных таблиц. Для этого, отрицательный z баллов будет Z(2.5) = означает - 2,5 * стандартное отклонение и оценки положительных z будет Z(2.5) = среднее + 2,5 * стандартное отклонение.
- Определите, какой ген мутантов содержат значительные результаты Z в маленьких молекул, которые составляют известных синергетический пара, будучи уверенным, чтобы посмотреть на все концентрации этих молекул. Если роста, который является оценка мутант меньше, чем отрицательный Z (2.5) Оценка или больше, чем положительных Z (2.5) Оценка для этой маленькой молекулы, он считается значительным.
- Определите, если какой-либо значительный Джин мутантов принадлежат оперона.
Примечание: Для е. coli, авторы рекомендуют проверка «Ecoli вики» для получения информации относительно если гены транскрибируется как часть полицистронная РНК. - Идентифицировать ген/Оперон мутантов, которые являются общими для большинства малых молекул интерес в различных концентрациях (например., когда ищет молекулы, которые объединения с антибиотиком триметоприм, определить мутантов, которые показывают значительное Z Оценка при выращивании присутствии триметоприм и его известных синергетический партнеров, таких как sulfamethizole или сульфаметоксазол). Эти мутанты прогноза предполагаемого синергии.
2. Прогнозирование Synergizers в наборе данных Dataset химико генетика, O2M
- Возвращаясь к dataset17, идентифицировать каждый концентрации малых молекул, что вызывает значительный рост Оценка от синергии предсказание мутант. Это делается путем глядя на Z баллы, рассчитанные для каждой концентрации малых молекул. Опять же значительный рост Оценка меньше негативных Z счёт или больше, чем положительных Z счёт для этого концентрация малых молекул.
Примечание: Если молекулы появляется даже одного из его концентрации, молекулы считается предсказал synergizer. Любая молекула, которая не вызывает значительный рост Оценка является прогнозируемое non-synergizer.
3. Проверка предсказал синергического взаимодействия
- Нахождение минимальный тормозной концентрации (MIC) предсказал synergizers.
- Растут на ночь культуры E. coli в M9 минимальной СМИ при 37 ° C.
Примечание: Любой ночи культуры можно выращивать в надлежащим образом определенных средой для организма интерес. Коричневый лаборатории не рекомендуем богатых СМИ как LB или YPD. M9 минимальные средства массовой информации состоит из 10,5 г/Л бульона M9, 0,2% casamino кислот, 0,1 М CaCl2, 0,4% глюкозы, 1М MgSO4, 0,25% никотиновой кислоты и 0,33% тиамина в H2O. - Если данные не микрофон для возбудитель интереса встречается в литературе по получении малых молекул, растворяются в диметилсульфоксида (ДМСО) в высокой концентрации (> 10 мг/мл).
- С помощью 96-луночных плиты, добавьте 100 мкл M9 СМИ каждой скважины. Добавьте дополнительные 100 мкл M9 СМИ в колонке 1, поэтому он содержит в общей сложности 200 мкл.
- Добавление произвольного количества концентрированной малые молекулы решения (~ 10 мкл) в колонке 1. Одна небольшая молекула за хорошо столбец 1 (8 малых молекул на пластину).
Примечание: Это малых молекул интерес, которые прогнозируются для обеспечения согласованности. Коричневый лаборатории обычно добавляет 10 мкл высококонцентрированных малые молекулы решения, которое находится ниже количество 100% ДМСО, который может сдерживать E. coli. - После того, как были добавлены маленькие молекулы, разбавляют малых молекул через оси пластины. Взять 100 мкл раствора из столбца 1, место в колонке 2 и перемешать. Взять 100 µL из столбца 2, место в колонке 3 и перемешать. Продолжайте этот процесс до тех пор, пока 100 мкл, помещаются в колонке 11. Смешать колонке 11, затем взять 100 µL из этого столбца и отбросить. Оставьте столбец 12 с просто СМИ для нормализации данных.
- Прививать пластину. Получите оптической плотности (600OD) ночь культуры. Приготовляют раствор с культурой и M9 СМИ к ОД600 0,002 (или соответствующих концентрации, представляющий 500 клеток/мкл для желаемого организма интерес). Пипетка 2 мкл раствора культуры в каждой скважине пластины, так есть 1000 ячеек на хорошо.
- Осторожно встряхнуть пластину и получить ОД600 для 0 h чтения. Пусть расти при 37 ° C в течение 24 ч. получение ОД600 для чтения 24 h пластины.
Примечание: Используйте соответствующий рост условия для других организмов, представляющих интерес. - Рассчитайте чистый рост для каждой хорошо при помощи таблицы программы.
- Средний чистый рост в колонке 12 для получения среднего роста не наркотиков. Нормализовать других скважин в среднем рост не наркотиков, используя программное обеспечение электронной таблицы. Ищите любые хорошо, с менее чем 10% роста для идентификации MIC90. Все хорошо с менее чем 50% рост указывает MIC50. Рассчитайте концентрацию малые молекулы в этих скважинах.
- Растут на ночь культуры E. coli в M9 минимальной СМИ при 37 ° C.
- Клетчатый анализов для синергического взаимодействия
- Растут ночь культуры E. coli в M9 минимальной СМИ, как раньше.
Примечание: Используйте соответствующий рост условия для других организмов. - Добавьте 100 мкл M9 СМИ в каждой скважине 96 хорошо плиты и дополнительные 100 мкл в колонке 1.
- Добавьте тестирования малые молекулы (~ 8 x MIC) каждому хорошо в колонке 1 и добавить двойной концентрации (~ 16 x MIC) хорошо А1 (одна небольшая молекула тестировался на пластину).
Примечание: Эта сумма определяется на основе предварительного тест завершен MIC и отличается для каждого потенциального synergizer. - Создание градиента разрежения на оси x, принимая 100 µL из столбца 1 и передачи в колонке 2. Продолжайте этот процесс до тех пор, пока 100 мкл добавляется столбец 11. Перемешать, затем взять 100 µL из колонки 11 и распоряжаться. Не добавляйте любой препарат в колонке 12 (рис. 1A).
- Настройка второго препарата градиент по оси y для ввода наркотиков. 100 мкл СМИ, содержащий 2 x MIC ввода молекулы в строке A. Mix и разбавить как раньше, принимая 100 мкл от строки A и размещение в B. продолжить до 100 мкл помещается в строке G. Mix, 100 мкл и метод dispose, обеспечение того, чтобы не добавлять любые входные наркотиков в строке H. Это позволяет ряду H и колонка 12 содержат отдельных ОПГВ пары наркотиков испытания (Рисунок 1B).
- Прививать пластину. 2 мкл культуры е. coli ОД600 0,002, для каждой скважины (1000 ячеек на хорошо).
- Измерьте ОД600 каждой скважины в пластину для чтения 0 h.
- Инкубировать пластину для 24 ч при 37 ° C.
- Измерьте ОД600 каждой скважины в 24 ч.
- Растут ночь культуры E. coli в M9 минимальной СМИ, как раньше.
- Расчет индекса дробных ингибирующее концентрации (FICI) от загорождений
- Рассчитайте чистый рост для каждой скважины пластины путем вычитания ОД600 в 0 ч от ОД600 на 24 ч в программу электронных таблиц.
- Нормализовать рост программного обеспечения путем деления каждой скважины по H12, который содержит не малые молекулы.
- Найти MIC90 ввода молекулы в колонке 12 и MIC90 потенциальных синергист в строке H.
- Посмотрите для всех скважин, которые тормозят 90% роста.
- Рассчитать FICI90 хорошо, что либо низкие ниже (синергический) или высоких выше (антагонистических) оба MIC90 значения, используя уравнение:
- Рассмотрим любые FICI ≤ 0,5 как синергических и FICI ≥ 4 как антагонистические (рис. 2).
Примечание: Это также может быть сделано с MIC50 (50% ингибирования роста) для получения FICI50 на основе этих ценностей MIC.
- Блисс независимости Assay
Примечание: Блаженство независимости запускается с любых потенциальных синергист, которые не имеют микрофон на свой собственный.- Растут в ночь культуры е. coli в M9 СМИ при 37 ° C, как раньше.
Примечание: Опять же, соответствующие условия для роста других организмов, представляющих интерес может использоваться на этом шаге. - Подготовка 96-луночных пластины к тестированию потенциальных синергических молекулы входные молекуле, сочетание, управления и не лечить.
- Создайте потенциальных синергист пластины, добавляя 50 мкл M9 СМИ для каждой скважины. 50 мкл носитель, содержащий набор концентрации (10 мкм или 100 мкм) из потенциальных синергист для каждой скважины строки. Тест 8 молекул за тарелку.
- Создайте пластину входные молекуле, добавляя 50 мкл СМИ для каждой скважины. Добавьте 50 мкл, содержащий 4 x MIC ввода препарата для каждой скважины в колонке 1. Создание градиента разрежения вдоль оси x похож на MIC пластины, принимая 50 мкл из столбца 1, диспергирования и смешивания в колонке 2. Продолжайте этот процесс до колонка 12, утилизация 50 мкл из столбца 12. Дополнительные 50 мкл СМИ в каждой скважине таким образом в конце общей для каждой скважины — 100 мкл.
- Создание сочетание пластину с помощью 96 хорошо пластины, 50 мкл СМИ в каждой скважине. Добавьте 50 мкл, содержащий 4 x MIC ввода препарата для каждой скважины в колонке 1. Развести вдоль оси x, похож на MIC пластины, принимая 50 мкл из столбца 1, диспергирования и смешивания в колонке 2. Продолжайте этот весь путь к колонке 12, утилизация 50 мкл из столбца 12. Добавьте 50 мкл средств массовой информации, содержащие потенциальные синергист на 10 мкм или 100 мкм для каждой скважины строки. Опять же должно быть одно концентрации или наркотиков в строке.
- Создайте элемент управления, не лечить, добавив 100 мкл M9 СМИ для всех скважин пластины.
- Прививать все пластины, добавив 2 мкл бактериальной культуры с ОД600 0,002 или 1000 ячеек для каждой скважины, как раньше.
- Измерьте ОД600 каждой скважины на 0 и 24 ч.
- Растут в ночь культуры е. coli в M9 СМИ при 37 ° C, как раньше.
- Расчет Оценка независимости Блисс
- Рассчитайте чистый рост для каждой скважины пластины путем вычитания ОД600 в 0 ч от роста на 24 ч, при помощи таблицы программы.
- Нормализовать скважин на средний рост от пластины не наркотиков в программу электронных таблиц.
- С помощью таблицы программного обеспечения, вычислить ингибирование путем вычитания чистый рост от 1.
- Средняя столбцы в пластину управления, содержащие только ввода градиента в программном обеспечении электронной таблицы.
- Рассчитайте показатель блаженство для каждой скважины уравнением:
Блисс Оценка = (хорошо X + входной столбец X) – комбинированный хорошо X - Посмотрите на негативные оценки в скважинах ниже MIC90 входных данных.
Примечание: Отрицательные результаты через несколько концентрации будет означать синергического взаимодействия.
4. высок объём экран с мутантами предсказание синергии для выявления роман синергетический пар
-
Выявления синергизма прогноз мутантов
Примечание: Шаг 1,5 определены предполагаемый синергии прогноз мутантов. Здесь мы определить, какие из этих мутантов будет работать лучше на экране высокой пропускной способности синергетический наркотиков. Мы провели этот assay в Bioscreen машине, но 96 хорошо пластины читатели также должен быть приемлемым.- Растут каждый предполагаемый Синергия прогноз мутантов и одичал тип ячейки M9 минимальные средства массовой информации.
- Настройка 100 хорошо соты пластину (или 96 хорошо пластины) с соответствующим рост среднего, среднего роста + ввода наркотиков, среднего роста + известных синергетический партнера ввода наркотиков и рост среднего + известные номера синергетический наркотиков. Обеспечить, чтобы включить элементы управления транспортного средства.
Примечание: Мы рекомендуем, что четыре реплицировать скважин для каждого штамма/наркотиков/концентрации. - Прививать 1000 ячеек на колодец, включая колодцы пустой элемент управления.
- Растут 48 ч при 37 ° C, при встряхивании и читать ОД600 каждые 20 мин.
- Определите точку концентрации и времени наркотиков, который показывает крупнейших роста разница между одичал тип и синергии предсказание мутант клетки при наличии входного наркотиков и его известных синергетический партнеров. В точке, оптимальное время и концентрации не должно быть много роста разницы между одичал тип и синергии предсказание мутантные клетки при выращивании наркотиков в присутствии известных не действовать синергически с ввода наркотиков (рис. 3).
-
Высок объём экран для синергетического наркотиков
- Растут одичал тип клетки и Синергия прогноз мутантов клетки в M9 минимальные средства массовой информации.
Примечание: Используйте соответствующий рост среднего для организма интерес. - Добавьте наркотиков из библиотеки в СМИ так что каждый хорошо, которая содержит 100 мкл СМИ с малых молекул в набор концентрации, который был определен на предыдущем шаге. Включать пустые скважин (без клетки) и скважин с контроля автотранспортных средств (e.g., ДМСО) для учета любых замедление роста в автомобиле разбавления наркотиков.
- Подготовка по меньшей мере четыре автомобиля контроля скважин каждой пластины, идеально разбросаны пластину для учета также позицию эффекты. Если анализы переменную, затем включают по крайней мере одного транспортного средства управления также в строке или столбце и использовать каждую строку/столбец элемента управления как элемента управления для вычисления Z оценки для каждой строки/столбца вместо всего пластины (шаг 4.2.5).
- 2 мкл культуры, для каждой скважины, как раньше. (Одна пластина для дикого типа бактерии и одна пластина для прогнозируемого взаимодействия мутант бактерий).
- Оценить ОД600 на 0 и 18 h для е. coli или 48 h для C. neoformans.
- С помощью таблицы программного обеспечения, рассчитайте чистый рост путем вычитания ОД600 пустых скважин из скважин управления транспортного средства. Выявление скважин с Z-счет-2,5 (Z счёт = среднее - 2,5 * стандартное отклонение). Эти скважины содержат потенциал синергист малые молекулы.
- Проверка экрана хитов, используя методы, описанные в шаге 3.
- Растут одичал тип клетки и Синергия прогноз мутантов клетки в M9 минимальные средства массовой информации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Клетчатый анализов являются полуколичественного метода для измерения синергического взаимодействия. Окончательный счет выход, FICI, определяет если сочетание наркотиков считается синергетический (FICI норме), не взаимодействие (0,5 < FICI < 4), или антагонистических (FICI ≥4.0). Рисунок 1 показывает, как настроить градиентов наркотиков в шахматном порядке assay. Рисунок 2 иллюстрирует общих результатов. Рассмотрим рост (фиолетовый скважин) который отображения менее чем 90% роста. После измерения ОД600 каждой скважины в тарелку, мы хорошо нормализовать все без контроля над наркотиками. Что-нибудь с нормализованное значение > 0,1 (10% од600 управления хорошо) оценивается как «рост». FICI оценки может варьироваться в зависимости от которых хорошо подобран; Мы выбираем хорошо, что дает самые низкие FICI для каждой пластины. В рисунке 2A, что было бы хорошо F9 (столбцы нумеруются, буквами строки), с FICI = 0,07. Рисунок 2B, FICI вычисляется из хорошо C3 (FICI = 1.0). Для антагонистических взаимодействий посмотрите на высокий балл FICI возможно. В рисунке 2 cFICI вычисляется из хорошо A1, которые дают FICI 8.0.
Условия оптимального отбора будет предотвратить большое количество ложных срабатываний от экрана, который экономит время и деньги. Когда мы оптимизировали прогноз мутантов синергии для грибом Cryptococcus neoformans, мы протестировали ввода наркотиков (Флуконазол), четыре известные номера синергетический препараты (кофеин, climbazole, триметоприм и brefeldin A) и пять флуконазола в синергических партнеры (рифамицина, myriocin, nigericin, rapamycin и FK506, все подробно Chandrasekaran, S. et al. 18). Поскольку мы обнаружили эти молекулы через O2M анализа (разделы 1 и 2), мы ожидали известных synergizers чтобы избирательно подавляют рост синергии предсказание мутантные клетки, но не одичал тип клеток. Чтобы максимизировать ожидаемый рост разница, мы протестировали диапазон концентраций для каждой маленькой молекулы, большинство из которых были sub-inhibitory.
Результаты примера показаны на рисунке 3. Молекула, которая не действуют синергически с флуконазол, brefeldin A, ингибированная одичал тип и Синергия предсказание мутант рост лишь незначительно и примерно такую же сумму. Тормозится рифамицина (рис. 3B), росту синергии предсказание мутант (cnag_03917Δ), но рост одичал типа клеток не было. Наибольший рост разница была между 32 и 49 h после прививки, поэтому timepoint для скрининга был в этом диапазоне. Кривые роста других молекул синергических и не синергетический напоминала рифамицина brefeldin A, соответственно.
Рисунок 1 : Изображением шахматной Assay из шага 3. Градиенты наркотиков испытания наркотиков и ввода проиллюстрированы в A и B, соответственно. Пластину окончательный анализ должен появиться как C. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Графические результаты клетчатый Assay. Иллюстрации синергетический, нет, и антагонистических взаимодействий изображены в A, B и C, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Пример данных для выявления время скрининг. (A) одичал тип (зеленый) и Синергия прогноз мутантов (синий) C. neoformans вырос в присутствии brefeldin A, малые молекулы известных не объединения с флуконазолом. Одичал тип управления (тёмно-зеленый) и лечение наркомании (светло-зелёный) имеют аналогичное различие в росте синергии прогноз мутантов управления (синий) и наркотиками лечение (светло-голубой). (B) одичал тип и Синергия предсказание мутант вырос в присутствии рифамицина, малые молекулы известных для обеспечения согласованности с флуконазолом. Одичал тип управления (тёмно-зеленый) и лечение наркомании (светло-зелёный) имеют меньше роста разницы чем синергии прогноз мутантов управления (синий) и наркотиками лечение (светло-голубой). Наибольшее различие наблюдается в 48 h для известных синергетический молекулы и разница похожа на то время точкой для известных не синергетический молекулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Синергических малые молекулы пар может быть мощным инструментом в лечении микробных инфекций, пока они не достигли их полная клиническая потенциал потому что синергетический пары сложно определить. Этот документ описывает метод для выявления синергических пар намного быстрее, чем простой парного сочетаний. С помощью наборов данных химико генетика, O2M идентифицирует мутантов с Джин нокауты, которые затем могут использоваться как индикация на экране крупных библиотек малых молекул для того, чтобы предсказать синергетический пар. Способность предсказывать малых молекул позволяет высокая масштабируемость экранов, который в свою очередь делает для масштабных выявления синергических партнеров. После выявления синергических пар, можно выяснить основные синергетического взаимодействия молекулярный механизм, то рационально дизайн дополнительных синергетических пар11.
O2M требует химико генетический набор данных и известный синергетический пара. К счастью химико генетика наборы данных являются общими для различных микробов19,,2021. Коричневый лаборатории ранее продемонстрировал, что O2M успешно можно найти синергетический пары в C. neoformans и E. coli11,12. Это показывает, что широкое влияние O2M имеет как масштабируемый метод, который широко применяется для различных организмов. Все шаги, перечисленные здесь могут быть изменены для роста различных микроорганизмов с относительно аналогичные результаты, таким образом делая O2M ценным инструментом для общего выявления синергических пар. Некоторые другие группы выявление синергических сочетаний от химико генетика наборов данных различных аналитических методов, хотя O2M требует знания наименее программирования любого из этих методов. Каждый метод определяет различные наборы синергетический антибиотики или противогрибковые препараты 18,,2223,24, предполагая, что большое количество синергетический пар по-прежнему быть обнаружены. O2M и другие методы прогнозирования синергии, также потенциально применимы к млекопитающих систем, включая выявление рака наркотиков комбинаций.
В целом этот метод описывает это быстрый способ экран для синергетического пар из набора химико генетика. Этот метод и другие помочь синергетический пар становится более осуществимым вариантом лечения в клиниках. Кроме того O2M в быстрый и обобщенный метод доказывает это ценным инструментом при поиске синергетический малые молекулы пар.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана запуска грант от Департамента патологии, Университет штата Юта в J.C.S.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioscreen C | instrument | Growth Curves USA | |
| Synergy H1 | instrument | BioTek | |
| M9 broth | reagent | Amresco | J863-500G |
| Casamino Acids | reagent | Fisher Scientific | BP1424-500 |
| Glucose | reagent | Sigma | G7021-10KG |
| Nicotinic Acid | reagent | Alfa Aesar | A12683 |
| Thiamine | reagent | Acros Organics | 148991000 |
| CaCl2 Dihydrate | reagent | Fisher | C79-500 |
| MgSO4 Heptahydrate | reagent | Fisher | M63-500 |
| chemical-genetics dataset | dataset | examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text. | |
| trimethoprim (example input drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN19552701 |
| sulfamethoxazole (example test drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN15671125 |
References
- Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management. Front Public Health. 2, 145 (2014).
- Butts, A., Krysan, D. J. Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New. PLOS Pathogens. 8 (9), e1002870 (2012).
- Roemer, T., Krysan, D. J. Antifungal Drug Development: Challenges, Unmet Clinical Needs, and New Approaches. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (5), a019703 (2014).
- Oprea, T. I., Mestres, J. Drug Repurposing: Far Beyond New Targets for Old Drugs. AAPS J. 14 (4), 759-763 (2012).
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nat Rev Drug Discov. 11 (3), 191-200 (2012).
- Rangel-Vega, A., Bernstein, L. R., Mandujano-Tinoco, E. A., García-Contreras, S. J., García-Contreras, R. Drug repurposing as an alternative for the treatment of recalcitrant bacterial infections. Front Microbiol. 6, 282 (2015).
- Torella, J. P., Chait, R., Kishony, R. Optimal Drug Synergy in Antimicrobial Treatments. PLoS Comput Biol. 6 (6), e1000796 (2010).
- Cowen, L. E., et al. Harnessing Hsp90 function as a powerful, broadly effective therapeutic strategy for fungal infectious disease. P Natl Acad Sci. 106 (8), 2818-2823 (2009).
- Zuo, G. -Y., et al. Synergistic Antibacterial and Antibiotic Effects of Bisbenzylisoquinoline Alkaloids on Clinical Isolates of Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). Molecules. 16 (12), 9819 (2011).
- Jia, J., et al. Mechanisms of drug combinations: interaction and network perspectives. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 111-128 (2009).
- Wambaugh, M. A., Shakya, V. P. S., Lewis, A. J., Mulvey, M. A., Brown, J. C. S. High-throughput identification and rational design of synergistic small-molecule pairs for combating and bypassing antibiotic resistance. PLOS Biol. 15 (6), e2001644 (2017).
- Brown, J. C. S., et al. Unraveling the biology of a fungal meningitis pathogen using chemical genetics. Cell. 159 (5), 1168-1187 (2014).
- Cokol, M., et al. Systematic exploration of synergistic drug pairs. Mol Syst Biol. 7, 544-544 (2011).
- Borisy, A. A., et al.
- Tang, J., Wennerberg, K., Aittokallio, T. What is synergy? The Saariselkä agreement revisited. Front Pharmacol. 6, 181 (2015).
- Hsieh, M. H., Yu, C. M., Yu, V. L., Chow, J. W. Synergy assessed by checkerboard. A critical analysis. Diagn Microbiol Infect Dis. 16 (4), 343-349 (1993).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic Landscape of a Bacterial Cell. Cell. 144 (1), 143-156 (2011).
- Chandrasekaran, S., et al. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Mol Syst Biol. 12 (5), (2016).
- Pradhan, A., et al. Chemogenomic profiling of Plasmodium falciparum as a tool to aid antimalarial drug discovery. Sci Rep. 5, 15930 (2015).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1 (5), 1-8 (2010).
- Diezmann, S., Michaut, M., Shapiro, R. S., Bader, G. D., Cowen, L. E. Mapping the Hsp90 Genetic Interaction Network in Candida albicans Reveals Environmental Contingency and Rewired Circuitry. PLoS Genetics. 8 (3), e1002562 (2012).
- Robbins, N., et al. An Antifungal Combination Matrix Identifies a Rich Pool of Adjuvant Molecules that Enhance Drug Activity Against Diverse Fungal Pathogens. Cell reports. 13 (7), 1481-1492 (2015).
- Wildenhain, J., et al. Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning. Cell Syst. 1 (6), 383-395 (2015).
- Spitzer, M., et al. Cross-species discovery of syncretic drug combinations that potentiate the antifungal fluconazole. Mol Syst Biol. 7, 499-499 (2011).
