Summary
Synergistic दवा संयोजन मुश्किल और समय लेने के लिए empirically की पहचान कर रहे हैं । यहां, हम synergistic छोटे अणुओं की पहचान और मांयता के लिए एक विधि का वर्णन ।
Abstract
हालांकि रोगाणुरोधी दवाओं नाटकीय रूप से 20वें सदी में जीवन की उम्र और गुणवत्ता में वृद्धि हुई है, रोगाणुरोधी प्रतिरोध हमारे पूरे समाज प्रणालीगत संक्रमण का इलाज करने की क्षमता की धमकी दी. संयुक्त राज्य अमेरिका में अकेले, एंटीबायोटिक प्रतिरोधी संक्रमण लगभग २३,००० लोगों को एक साल और लागत के आसपास की हत्या २०,०००,०००,००० अतिरिक्त हेल्थकेयर में अमरीकी डालर । एक दृष्टिकोण रोगाणुरोधी प्रतिरोध का मुकाबला करने के लिए संयोजन चिकित्सा है, जो संक्रमण के महत्वपूर्ण प्रारंभिक चरण में विशेष रूप से उपयोगी है, संक्रमित जीव और इसकी दवा प्रतिरोध प्रोफ़ाइल की पहचान की गई है पहले । कई रोगाणुरोधी उपचार संयोजन चिकित्सा का उपयोग करें । हालांकि, इन संयोजनों के सबसे additive रहे हैं, जिसका अर्थ है कि संयुक्त प्रभावकारिता व्यक्तिगत एंटीबायोटिक प्रभावकारिता का योग के रूप में ही है । कुछ संयोजन चिकित्सा synergistic हैं: संयुक्त प्रभावकारिता बहुत additive से अधिक है । Synergistic संयोजन विशेष रूप से उपयोगी होते हैं क्योंकि वे रोगाणुरोधी दवा प्रतिरोधी उपभेदों के विकास को बाधित कर सकते हैं. हालांकि, इन संयोजनों दुर्लभ है और पहचान करने के लिए मुश्किल है । यह एक pairwise तरीके से परीक्षण किया जा करने के लिए आवश्यक अणुओं की सरासर संख्या के कारण है: १,००० अणुओं की एक पुस्तकालय १,०००,००० संभावित संयोजन है । इस प्रकार तालमेल के लिए अणुओं की भविष्यवाणी करने के प्रयास किए गए हैं. यह आलेख वर्णन करता है कि हमारे synergistic छोटे अणु अधिव्याप्त2 विधि (O2M) के रूप में जाना जाता जोड़ों के लिए अनुमान लगाने के लिए उच्च-प्रवाह विधि । O2M रासायनिक-आनुवंशिक datasets से पैटर्न का उपयोग करता है म्यूटेंट है कि एक synergistic जोड़ी में प्रत्येक अणु के लिए अनुभुत रहे हैं, लेकिन अन्य अणुओं की पहचान करने के लिए. ब्राउन लैब अणुओं के लिए एक उच्च प्रवाह स्क्रीन है कि उत्परिवर्ती लेकिन नहीं जंगली प्रकार की कोशिकाओं के विकास को बाधित प्रदर्शन से इस विकास के अंतर का दोहन । है लैब काम पहले अणुओं की पहचान की है कि एंटीबायोटिक trimethoprim और रोधी दवा fluconazole इस रणनीति का उपयोग कर के साथ synergize । यहाँ, लेखकों उपन्यास synergistic संयोजन है, जो कई सूक्ष्मजीवों के लिए बदला जा सकता है के लिए स्क्रीन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं ।
Introduction
एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया से अधिक २,०००,००० संक्रमण और २३,००० के अनुसार संयुक्त राज्य अमेरिका में प्रतिवर्ष होने वाली मौतों के कारण1सीडीसी । इन संक्रमणों से उबरने के लिए नए उपचार की जरूरत है । इन नए उपचार की पहचान करने के लिए रणनीति नई रोगाणुरोधी दवाओं के विकास या छोटे अणुओं की repurposing अन्य स्थितियों के लिए अनुमोदित2,3,4के इलाज के लिए शामिल हैं । हालांकि, नई दवा खोज बहुत महंगा है और समय लेने वाली । Repurposing दवाओं उपंयास दवाओं या दवा लक्ष्य5,6की पहचान नहीं कर सकते हैं । हमारी प्रयोगशाला एक तिहाई synergistic संयोजन चिकित्सा के रूप में जाना जाता रणनीति पर केंद्रित है । Synergistic युग्म हो जब दो छोटे अणुओं के साथ एक प्रभावकारिता उनके व्यक्तिगत efficacies के additive प्रभाव से अधिक है7। इसके अतिरिक्त, synergistic संयोजन एक रोगज़नक़ के खिलाफ प्रभावी कम अवांछित दूर होने के अलावा में जोड़ी में छोटे अणुओं में से एक के लिए प्रतिरोधी हो सकता है-लक्ष्य प्रभाव, उंहें महान क्षमता प्रतिपादन8,9, 10.
Synergistic जोड़े दुर्लभ हैं, दवा संयोजनों की लगभग 4-10% में होने वाली11,12,13. इस प्रकार, pairwise स्क्रीन के रूप में पारंपरिक तकनीक को चुनौती दे रहे है और समय लेने वाली, एक सौ अणुओं के एक छोटे पुस्तकालय से संभावित संयोजन के हजारों के साथ । इसके अलावा, synergistic बातचीत आमतौर पर यौगिकों14की गतिविधि से नहीं की भविष्यवाणी की जा सकती है । हालांकि, लेखकों synergistic जोड़े के लिए स्क्रीन करने के लिए एक उच्च प्रवाह दृष्टिकोण विकसित, ओवरलैप2 विधि (O2M)12कहा जाता है । इस विधि, यहां वर्णित है, तेजी से, इन synergistic जोड़े की अधिक कुशल पहचान के लिए अनुमति देता है । O2M एक ज्ञात synergistic जोड़ी और एक रासायनिक आनुवंशिकी डेटासेट के उपयोग की आवश्यकता है । रासायनिक-आनुवंशिकी डेटासेट उत्पन्न होते हैं जब एक पुस्तकालय नॉकआउट म्यूटेंट के कई विभिन्न छोटे अणुओं की उपस्थिति में उगाया जाता है । यदि एक ज्ञात synergistic जोड़ी में एक अणु दूसरा synergistic अणु, किसी भी अंय छोटे अणु है कि एक ही उत्परिवर्ती से phenotype भी synergize के प्रत्येक सदस्य के साथ जाना चाहिए के रूप में एक विशेष नॉकआउट उत्परिवर्ती से ही phenotype लाती है ज्ञात synergistic जोड़ी । इस तर्क भूरे रंग के लैब में इस्तेमाल किया गया है synergistic एंटीबायोटिक ई कोलाई (ई. कोलाई) और synergistic रोधी दवा के खिलाफ सक्रिय जोड़े की पहचान रोगजनक कवक के खिलाफ सक्रिय जोड़े Cryptococcus neoformans (सी । neoformans)11,12. O2M न केवल विभिन्न रोगजनकों के लिए अनुकूलनीय है, लेकिन synergistic जोड़े आसानी से और तेजी से पहचान करने के लिए अणुओं के बड़े पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है । आनुवंशिक O2M द्वारा की पहचान उत्परिवर्ती के साथ स्क्रीनिंग हमें केवल उन छोटे तालमेल के लिए भविष्यवाणी की अणुओं को मांय करने की अनुमति देता है । इस प्रकार, परीक्षण एक २,०००-अणु पुस्तकालय pairwise महीने लगेंगे, जबकि अगर उस पुस्तकालय में केवल 20 अणुओं synergize की भविष्यवाणी की थी, तालमेल के लिए परीक्षण अब दिनों की बात लेता है । O2M प्रोग्रामिंग कौशल की आवश्यकता नहीं है, और आवश्यक उपकरण सबसे प्रयोगशालाओं या मुख्य सुविधाओं में उपलब्ध है । दवा संयोजन में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के अलावा, O2M विश्लेषण किसी को भी, जो एक दवा स्क्रीन पूरी कर ली है के लिए ब्याज की है और महत्वपूर्ण दवा दवा बातचीत की पहचान करके अपनी हिट का विस्तार करना चाहता है । नीचे बैक्टीरिया में synergistic छोटे अणुओं की पहचान करने के लिए प्रोटोकॉल है, साथ ही साथ में भविष्यवाणी की synergistic बातचीत मांय परख15,16जाना जाता है ।
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Protocol
1.2 विधि (O2M) ओवरलैप द्वारा रासायनिक-आनुवंशिकी डेटासेट से सिनर्जी पूर्वानुमान म्यूटेंट की पहचान
नोट: यह सिनर्जी पूर्वानुमान म्यूटेंट Nichols एट अलसे प्रकाशित डेटासेट का उपयोग कर की पहचान करने के लिए विधि है । 17 में ई. कोलाई। हालांकि, यह किसी भी रासायनिक-आनुवंशिकी डेटासेट और सूक्ष्मजीवों पर किया जा सकता है । इन डेटा सेट नॉकआउट म्यूटेंट से अधिक १०० छोटे अणुओं की उपस्थिति में हो, प्रत्येक छोटे अणु में प्रत्येक उत्परिवर्ती के लिए एक मात्रात्मक वृद्धि स्कोर देने के एक पुस्तकालय होते हैं । एक synergistic जोड़ी जाना चाहिए, और वहां दोनों छोटे अणुओं के लिए वृद्धि स्कोर डेटासेट में शामिल होना चाहिए ।
-
प्रत्येक छोटे अणु की एक एकाग्रता की उपस्थिति में बड़े सभी म्यूटेंट के लिए मतलब वृद्धि स्कोर और मानक विचलन की गणना ।
नोट: यह किसी भी स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है । ब्राउन लैब एक्सेल और कार्यों का उपयोग करता है = औसत (b3: B3981) और = STDEV (b3: B3981) छोटे अणु के प्रत्येक स्तंभ की गणना के लिए ।- मतलब है और छोटे अणु के प्रत्येक कॉलम से मानक विचलन की गणना, हालांकि एक अलग डेटासेट का उपयोग कर अगर इस अभिविन्यास अलग हो सकता है.
- Nichols एट अलसे एक ही डेटासेट का उपयोग छोटे अणु की प्रत्येक एकाग्रता के लिए जेड स्कोर की गणना । 17 एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम में । इस के लिए, नकारात्मक z स्कोर z (2.5) = मतलब-2.5 * मानक विचलन होगा, और सकारात्मक z स्कोर z (2.5) = मतलब + 2.5 * मानक विचलन होगा ।
- निर्धारित जो जीन म्यूटेंट छोटे अणुओं है कि ज्ञात synergistic जोड़ी बनाने में महत्वपूर्ण Z स्कोर होते हैं, उन अणुओं के सभी सांद्रता देखो यकीन किया जा रहा है । यदि एक उत्परिवर्ती के विकास स्कोर नकारात्मक z (२.५) स्कोर से कम है या कि छोटे अणु के लिए सकारात्मक z (२.५) स्कोर से अधिक है, यह महत्वपूर्ण माना जाता है ।
- निर्धारित अगर महत्वपूर्ण जीन म्यूटेंट के किसी भी एक ऑपरोन से संबंधित हैं ।
नोट: ई. कोलाईके लिए, लेखकों एक polycistronic आरएनए के भाग के रूप में जीन लिखित रहे हैं के बारे में जानकारी के लिए "Ecoli wiki" जाँच की सिफारिश. - जीन/ऑपरोन म्यूटेंट कि विभिंन सांद्रता में ब्याज के छोटे अणुओं के बहुमत के लिए आम है की पहचान (उदा, जब अणुओं है कि एंटीबायोटिक trimethoprim के साथ synergize की तलाश में, म्यूटेंट कि एक महत्वपूर्ण शो की पहचान Z स्कोर जब trimethoprim और इसके sulfamethizole या sulfamethoxazole के रूप में जाना जाता synergistic भागीदारों की उपस्थिति में उगाया) । ये हैं ख्यात जरि भविष्यवाणी म्यूटेंट ।
2. O2M द्वारा रासायनिक-आनुवंशिकी डेटासेट के भीतर Synergizers की भविष्यवाणी
- डेटासेट17के लिए रिटर्निंग, छोटे अणु है कि सिनर्जी भविष्यवाणी उत्परिवर्ती से एक महत्वपूर्ण वृद्धि स्कोर बटोरना के प्रत्येक एकाग्रता की पहचान । यह Z छोटे अणुओं के प्रत्येक एकाग्रता के लिए गणना स्कोर को देखकर किया जाता है । फिर, एक महत्वपूर्ण वृद्धि स्कोर नकारात्मक z स्कोर या छोटे अणु की है कि एकाग्रता के लिए सकारात्मक z स्कोर से अधिक से भी कम है ।
नोट: यदि एक अणु भी अपनी सांद्रता में से एक पर प्रकट होता है, अणु एक भविष्यवाणी synergizer माना जाता है । किसी भी अणु है कि एक महत्वपूर्ण वृद्धि स्कोर नहीं है एक भविष्यवाणी की गैर synergizer है ।
3. अनुमानित Synergistic बातचीत का सत्यापन
- अनुमानित synergizers की न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (MIC) ढूँढना.
- ३७ डिग्री सेल्सियस पर M9 कम से कम मीडिया में ई. कोलाई की एक रात संस्कृति बढ़ने ।
नोट: किसी भी रातोंरात संस्कृति हित के जीव के लिए उचित रूप से परिभाषित माध्यम में उगाया जा सकता है । ब्राउन लैब पौंड या YPD की तरह अमीर मीडिया की सिफारिश नहीं करता है । M9 मिनिमल मीडिया १०.५ g/L M9 शोरबा, ०.२% casamino एसिड, ०.१ मीटर CaCl2, ०.४% ग्लूकोज, 1 एम MgSO4, ०.२५% कोर्टेक्स एसिड, और एच2ओ में ०.३३% thiamine शामिल हैं । - यदि कोई MIC डेटा ब्याज की रोगज़नक़ के लिए छोटे अणुओं प्राप्त करने पर साहित्य में पाया जाता है, एक उच्च एकाग्रता में dimethyl sulfoxide (DMSO) में भंग (> 10 मिलीग्राम/एमएल) ।
- एक ९६ अच्छी तरह से प्लेट का प्रयोग, M9 मीडिया के १०० µ एल जोड़ने के लिए एक अच्छी तरह से । स्तंभ 1 में M9 मीडिया के अतिरिक्त १०० µ l जोड़ें तो इसमें कुल २०० µ l हैं ।
- एक मनमाना राशि (~ 10 µ एल) कॉलम 1 में केंद्रित छोटे अणु समाधान के जोड़ें । 1 कॉलम के प्रति अच्छी तरह से एक छोटा सा अणु (प्लेट प्रति 8 छोटे अणुओं) ।
नोट: ये ब्याज के छोटे अणु हैं, जो synergize की भविष्यवाणी कर रहे हैं । ब्राउन लैब आम तौर पर उच्च केंद्रित छोटे अणु समाधान के 10 µ एल कहते हैं, जो १००% DMSO की राशि है कि ई. कोलाईबाधित कर सकते है नीचे है । - एक बार छोटे अणुओं को जोड़ दिया गया है, एक्स भर में छोटे अणुओं प्लेट की धुरी पतला । ले 1 कॉलम से समाधान के १०० µ एल, कॉलम 2 और मिश्रण में जगह है । कॉलम 2 से १०० µ एल लो, कॉलम 3 और मिश्रण में जगह है । इस प्रक्रिया को तब तक जारी रखें जब तक १०० µ l को स्तंभ 11 में रखा जाए. मिश्रण कॉलम 11, तो उस कॉलम से १०० µ एल ले और त्यागें । डेटा को सामान्य करने के लिए केवल मीडिया के साथ स्तंभ 12 छोड़ें.
- थाली Inoculate । एक रात संस्कृति से ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो६००) प्राप्त करें । संस्कृति और M9 मीडिया के साथ एक समाधान तैयार ०.००२ के एक आयुध डिपो६०० (या उचित एकाग्रता है कि ५०० कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है/µ एल ब्याज की वांछित जीव के लिए) । पिपेट 2 µ एल के प्रत्येक कुआं में संस्कृति समाधान की थाली तो वहां प्रति अच्छी तरह से १,००० कोशिकाओं रहे हैं ।
- धीरे प्लेट हिला और 0 एच पढ़ने के लिए६०० आयुध डिपो प्राप्त करते हैं । प्लेट 24 घंटे के लिए ३७ ° c पर बढ़ने दो एच के लिए 24 ज पढ़ने के लिए आयुध डिपो६०० प्राप्त करते हैं ।
नोट: ब्याज के अन्य जीवों के लिए उचित बढ़ती स्थितियों का उपयोग करें । - एक अच्छी तरह से एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग कर के लिए शुद्ध विकास की गणना ।
- औसत कोई दवा की वृद्धि प्राप्त करने के लिए कॉलम 12 की शुद्ध वृद्धि औसतन । एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कोई दवा विकास के औसत के लिए अन्य कुओं को सामान्य. MIC90 की पहचान करने के लिए 10% से कम वृद्धि के साथ किसी भी अच्छी तरह से देखें । ५०% से कम वृद्धि के साथ कोई भी अच्छी तरह से MIC50 इंगित करता है । उन कुओं में छोटे अणु की एकाग्रता की गणना.
- ३७ डिग्री सेल्सियस पर M9 कम से कम मीडिया में ई. कोलाई की एक रात संस्कृति बढ़ने ।
- synergistic बातचीत के लिए चेकरबोर्ड परख
- पहले की तरह M9 ंयूनतम मीडिया में ई. कोलाई की एक रात संस्कृति बढ़ने ।
नोट: अन्य जीवों के लिए उचित बढ़ती स्थितियों का उपयोग करें । - जोड़ें १०० µ M9 मीडिया के एल एक अच्छी तरह से एक ९६ प्लेट और 1 कॉलम में एक अतिरिक्त १०० µ एल के प्रत्येक कुआं के लिए ।
- 1 कॉलम में प्रत्येक अच्छी तरह से (~ 7 x mic पर) परीक्षण छोटे अणु जोड़ें और डबल एकाग्रता (~ 16x MIC) अच्छी तरह से A1 (प्लेट प्रति एक छोटे से अणु परीक्षण) को जोड़ें ।
नोट: यह राशि पहले पूरा MIC परीक्षण से निर्धारित किया जाता है और प्रत्येक संभावित synergizer के लिए अलग है. - 1 कॉलम से १०० µ एल लेने और कॉलम 2 में स्थानांतरित करके एक्स अक्ष पर एक ढाल कमजोर पड़ने बनाएं । १०० µ l स्तंभ 11 में जोड़ा गया है जब तक यह प्रक्रिया जारी रखें । मिश्रण है, तो कॉलम 11 और निपटान से १०० µ एल ले लो । 12 कॉलम (चित्रा 1a) के लिए किसी भी दवा मत जोड़ें ।
- इनपुट दवा के लिए y-अक्ष के पार दूसरी दवा ढाल सेट करें । एक पंक्ति में इनपुट अणु के 2x MIC युक्त मीडिया के १०० µ एल जोड़ें मिश्रण और पहले के रूप में पतला, एक पंक्ति से १०० µ एल ले रही है और बी में रखने से १०० µ एल पंक्ति जी मिश्रण में रखा गया है, १०० µ एल ले और निपटाने, पंक्ति में किसी भी इनपुट दवा नहीं जोड़ सुनिश्चित करने के एच । यह पंक्ति H और कॉलम 12 दवा जोड़ी परीक्षण के व्यक्तिगत MICs शामिल करने की अनुमति देता है (चित्र 1b) ।
- थाली Inoculate । आयुध डिपो की एक ई. कोलाई संस्कृति के 2 µ एल जोड़ें६०० ०.००२ प्रत्येक अच्छी तरह से (१,००० कोशिकाओं के अनुसार) ।
- 0 एच पढ़ने के लिए प्लेट में प्रत्येक अच्छी तरह के आयुध डिपो६०० उपाय ।
- ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए थाली मशीन ।
- मापने के आयुध डिपो६०० प्रत्येक कुआं पर 24 एच ।
- पहले की तरह M9 ंयूनतम मीडिया में ई. कोलाई की एक रात संस्कृति बढ़ने ।
- Checkerboards से भिन्नात्मक निरोधात्मक एकाग्रता सूचकांक (FICI) की गणना
- एक अच्छी तरह से प्लेट के लिए शुद्ध विकास की गणना के आयुध डिपो६०० में 0 एच से६०० पर 24 एच में एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम में ।
- एक अच्छी तरह से H12 है, जो कोई छोटे अणु शामिल द्वारा विभाजित द्वारा सॉफ्टवेयर में वृद्धि को सामान्य ।
- स्तंभ 12 में इनपुट अणु की MIC90 और पंक्ति H में संभावित तालमेल के MIC90 का पता लगाएं ।
- सभी कुओं है कि विकास के ९०% बाधित के लिए देखो ।
- अच्छी तरह से है कि या तो नीचे (synergistic) सबसे नीचे या उच्चतम (विरोधी) दोनों MIC90 मूल्यों, समीकरण का उपयोग कर के लिए FICI90 की गणना:
- किसी भी FICI ≤ ०.५ synergistic और FICI ≥ 4 के रूप में विरोधी के रूप में (चित्रा 2) पर विचार करें ।
नोट: यह भी MIC50 के साथ किया जा सकता है (वृद्धि की ५०% निषेध) उन MIC मूल्यों पर आधारित एक FICI50 पाने के लिए.
- आनंद स्वतंत्रता परख
नोट: आनंद स्वतंत्रता किसी भी संभावित तालमेल है कि अपने आप पर एक MIC नहीं था के साथ चला जाता है ।- ३७ डिग्री सेल्सियस पर M9 मीडिया में ई. कोलाई की एक रात संस्कृति बढ़ती है, पहले के रूप में ।
नोट: फिर से, ब्याज की अन्य जीवों के लिए उचित बढ़ती शर्तों इस कदम में इस्तेमाल किया जा सकता है । - तैयार ९६-अच्छी तरह से क्षमता synergistic अणु, इनपुट अणु, संयोजन, और एक गैर इलाज नियंत्रण परीक्षण के लिए प्लेटें ।
- एक अच्छी तरह से M9 मीडिया के ५० µ एल जोड़कर संभावित सिनर्जी प्लेट बनाएं । एक सेट एकाग्रता युक्त मीडिया के ५० µ एल जोड़ें (10 µ एम या १०० µ एम) एक पंक्ति के एक अच्छी तरह से करने के लिए संभावित सिनर्जी के । टेस्ट प्लेट प्रति 8 अणुओं ।
- एक अच्छी तरह से मीडिया के ५० µ एल जोड़कर इनपुट अणु प्लेट बनाएं । 1 कॉलम में प्रत्येक अच्छी तरह से इनपुट दवा के 4x MIC युक्त ५० µ एल जोड़ें । एक्स के साथ एक ढाल कमजोर पड़ने बनाने के लिए MIC प्लेटों के समान अक्ष, 1 कॉलम से ५० µ एल ले, फैलाने और 2 कॉलम में मिश्रण । स्तंभ 12, ५० µ l को स्तंभ 12 से निपटाने तक इस प्रक्रिया को जारी रखें । एक अतिरिक्त ५० मीडिया के µ एल जोड़ने के लिए एक अच्छी तरह से तो एक अच्छी तरह के लिए अंत कुल १०० µ एल है
- एक ९६ अच्छी तरह से थाली का उपयोग करके संयोजन प्लेट बनाने, एक अच्छी तरह से मीडिया के ५० µ एल जोड़ें. 1 कॉलम में प्रत्येक अच्छी तरह से इनपुट दवा के 4x MIC युक्त ५० µ एल जोड़ें । MIC प्लेटों के समान x-अक्ष के साथ पतला, 1 कॉलम से ५० µ एल ले रही है, फैलाने और 2 कॉलम में मिश्रण । 12 कॉलम से इस पूरे रास्ते जारी रखें, 12 कॉलम से ५० µ एल निपटान । 10 µ m या १०० µ m पर संभावित सिनर्जी युक्त मीडिया के ५० µ एल जोड़ें एक पंक्ति के एक अच्छी तरह से । फिर, वहां एक एकाग्रता या प्रति पंक्ति दवा होना चाहिए ।
- प्लेट के सभी कुओं के लिए M9 मीडिया के १०० µ एल जोड़कर गैर स्वास्थ्यकर्मी नियंत्रण बनाएँ.
- से पहले के रूप में प्रत्येक अच्छी तरह से ०.००२ या १,००० कोशिकाओं के एक आयुध डिपो के६०० के साथ बैक्टीरियल संस्कृति के 2 µ एल जोड़कर सभी प्लेटें Inoculate ।
- 0 और 24 एच में प्रत्येक अच्छी तरह से६०० के आयुध डिपो को मापने ।
- ३७ डिग्री सेल्सियस पर M9 मीडिया में ई. कोलाई की एक रात संस्कृति बढ़ती है, पहले के रूप में ।
- आनंद स्वतंत्रता स्कोर की गणना
- एक अच्छी तरह से प्लेट के लिए शुद्ध विकास की गणना 0 एच में 24 एच में वृद्धि से एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग कर६०० आयुध डिपो ।
- एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम में कोई दवा थाली से औसत वृद्धि करने के लिए कुओं को सामान्य.
- स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, 1 से शुद्ध विकास को घटाकर निषेध की गणना ।
- स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर में केवल इनपुट ग्रैडिएंट वाले नियंत्रण प्लेट में स्तंभों का औसत ।
- समीकरण द्वारा एक अच्छी तरह के लिए आनंद स्कोर की गणना:
आनंद स्कोर = (अच्छी तरह से एक्स + इनपुट कॉलम एक्स) -संयुक्त अच्छी तरह से एक्स - इनपुट के MIC90 नीचे कुओं में नकारात्मक स्कोर के लिए देखो ।
नोट: कई सांद्रता भर में नकारात्मक स्कोर एक synergistic बातचीत का संकेत होगा.
4. सिनर्जी भविष्यवाणी म्यूटेंट के साथ उच्च प्रवाह स्क्रीन उपंयास Synergistic जोड़े की पहचान करने के लिए
-
तालमेल से पहचानें भविष्यवाणी म्यूटेंट
नोट: चरण १.५ की पहचान ख्यात सिनर्जी भविष्यवाणी म्यूटेंट । यहां, हम जो इन म्यूटेंट के synergistic दवाओं के लिए एक उच्च प्रवाह स्क्रीन में सबसे अच्छा कार्य करेंगे निर्धारित करते हैं । हम एक स्क्रीन मशीन में इस परख प्रदर्शन किया, लेकिन ९६ अच्छी तरह से थाली पाठकों को भी स्वीकार्य होना चाहिए ।- M9 ंयूनतम मीडिया में प्रत्येक ख्यात सिनर्जी पूर्वानुमान म्यूटेंट और वंय-प्रकार की कोशिकाओं हो जाना ।
- उचित विकास मध्यम, विकास मध्यम + इनपुट दवा, विकास मध्यम + ज्ञात synergistic भागीदार के साथ १०० अच्छी तरह से छत्ते की थाली (या ९६ अच्छी तरह से थाली) सेट इनपुट दवा, और विकास मध्यम + ज्ञात गैर synergistic दवा । वाहन नियंत्रण शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें ।
नोट: हम अनुशंसा करते है चार प्रत्येक तनाव के लिए कुओं को दोहराने/ - Inoculate १,००० कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से, खाली नियंत्रण कुओं सहित ।
- झटकों के साथ ३७ ° c, में ४८ ज हो जाना, और पढ़ने के आयुध डिपो६०० हर 20 मिनट ।
- दवा एकाग्रता और समय बिंदु है कि जंगली प्रकार और सिनर्जी पूर्वानुमान उत्परिवर्ती कोशिकाओं के बीच सबसे बड़ी वृद्धि इनपुट दवा और उसके ज्ञात synergistic भागीदारों की उपस्थिति में अंतर से पता चलता है निर्धारित करते हैं । इष्टतम समय बिंदु और एकाग्रता में, वहाँ नहीं होना चाहिए ज्यादा विकास के बीच अंतर जंगली प्रकार और सिनर्जी पूर्वानुमान उत्परिवर्ती कोशिकाओं जब इनपुट दवा के साथ synergistically अधिनियम नहीं करने के लिए जाना जाता दवाओं की उपस्थिति में उगाया (चित्रा 3).
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synergistic दवाओं के लिए उच्च प्रवाह स्क्रीन
- बढ़ती जंगली-प्रकार कोशिकाओं और सिनर्जी पूर्वानुमान उत्परिवर्ती कोशिकाओं M9 ंयूनतम मीडिया में ।
नोट: ब्याज के जीव के लिए उचित विकास माध्यम का उपयोग करें । - पुस्तकालय से मीडिया के लिए ड्रग्स जोड़ें तो एक अच्छी तरह से जो सेट एकाग्रता है जो पिछले चरण में निर्धारित किया गया था पर छोटे अणुओं के साथ १०० µ एल मीडिया शामिल हैं । खाली कुओं (कोशिकाओं के बिना) और वाहन नियंत्रण (ई. जी., DMSO) के साथ कुओं को शामिल करने के लिए दवा कमजोर पड़ने वाहन द्वारा किसी भी विकास निषेध के लिए खाते ।
- थाली के अनुसार, आदर्श रूप में अच्छी तरह से स्थिति प्रभाव के लिए खाता करने के लिए थाली भर में बिखरे हुए कम चार वाहन नियंत्रण कुओं तैयार करते हैं । यदि परख चर रहे हैं, तो पंक्ति/कॉलम और प्रत्येक पंक्ति/स्तंभ नियंत्रण के रूप में अच्छी तरह से प्रत्येक पंक्ति/कॉलम के बजाय एक पूरी थाली के लिए Z स्कोर की गणना करने के लिए नियंत्रण के रूप में एक वाहन नियंत्रण अच्छी तरह से शामिल करें (step 4.2.5) ।
- एक अच्छी तरह से पहले के रूप में संस्कृति के 2 µ एल जोड़ें । (एक प्लेट जंगली प्रकार के बैक्टीरिया और अनुमानित सिनर्जी उत्परिवर्ती बैक्टीरिया के लिए एक थाली के लिए) ।
- ई. कोलाई या ४८ एच के लिए सी. neoformansके लिए६०० 0 और 18 एच में आयुध डिपो का आकलन करें ।
- स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का प्रयोग, वाहन नियंत्रण कुओं से खाली कुओं के आयुध डिपो६०० को घटाकर शुद्ध वृद्धि की गणना. एक जेड के साथ कुओं की पहचान-२.५ (जेड स्कोर = मतलब है-2.5 * मानक विचलन) का स्कोर । इन कुओं में एक संभावित तालमेल छोटे अणु होते हैं.
- चरण 3 में उल्लिखित विधियों का उपयोग कर स्क्रीन हिट्स मान्य करें ।
- बढ़ती जंगली-प्रकार कोशिकाओं और सिनर्जी पूर्वानुमान उत्परिवर्ती कोशिकाओं M9 ंयूनतम मीडिया में ।
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Representative Results
चेकरबोर्ड परख एक अर्द्ध synergistic बातचीत को मापने के लिए मात्रात्मक विधि रहे हैं । अंतिम स्कोर आउटपुट, FICI, निर्धारित करता है यदि कोई दवा संयोजन synergistic (FICI ≤ ०.५), गैर-सहभागिता (०.५ < FICI < 4), या विरोधी (FICI ≥ ४.०) माना जाता है । चित्र 1 दिखाता है कि कैसे एक चेकरबोर्ड परख में दवा ढाल स्थापित करने के लिए । चित्र 2 सामांय परिणामों को दिखाता है । विकास पर विचार (बैंगनी कुओं) जो कम प्रदर्शन से ९०% विकास निषेध । एक प्लेट में एक अच्छी तरह से६०० के आयुध डिपो को मापने के बाद, हम अच्छी तरह से कोई दवा नियंत्रण के लिए सब कुछ सामान्य. एक सामान्यीकृत मूल्य के साथ कुछ भी > 0.1 (नियंत्रण अच्छी तरह से के आयुध डिपो६०० का 10%) "वृद्धि" के रूप में बनाए गए है. FICI स्कोर जो अच्छी तरह से उठाया है के आधार पर भिन्न हो सकते हैं; हम अच्छी तरह से है कि प्रत्येक थाली के लिए सबसे कम FICI देता है का चयन करें । चित्र 2aमें, जो कि अच्छी तरह से F9 होगा (स्तंभ क्रमांकित हैं, पंक्तियों को लिखे गए हैं), एक FICI = ०.०७ के साथ । चित्र bमें, FICI को अच्छी तरह C3 (FICI = १.०) से परिकलित की जाती है । विरोधी बातचीत के लिए, संभव उच्चतम FICI स्कोर के लिए देखो । चित्र 2cमें, FICI की गणना अच्छी तरह से A1 से की जाती है, जो ८.० का FICI देता है ।
इष्टतम स्क्रीनिंग शर्तों स्क्रीन है, जो समय और पैसे बचाता से झूठी सकारात्मक की एक उच्च संख्या को रोकने जाएगा । जब हम कवक Cryptococcus neoformansके लिए सिनर्जी भविष्यवाणी म्यूटेंट अनुकूलित, हम इनपुट दवा का परीक्षण किया (fluconazole), चार ज्ञात गैर synergistic दवाओं (कैफीन, climbazole, trimethoprim, और brefeldin एक), और fluconazole के पांच synergistic पार्टनर्स (rifamycin, myriocin, nigericin, rapamycin, और FK506, सभी Chandrasekaran, एस एट अल में चर्चा की । 18). जब से हम O2M विश्लेषण के माध्यम से इन अणुओं की खोज की (1 वर्गों और 2), हम जाने की उंमीद synergizers चुनिंदा सिनर्जी पूर्वानुमान उत्परिवर्ती कोशिकाओं के विकास को बाधित नहीं बल्कि जंगली प्रकार की कोशिकाओं । अपेक्षित वृद्धि अंतर को अधिकतम करने के लिए, हम प्रत्येक छोटे अणु के लिए सांद्रता की एक सीमा का परीक्षण किया, जिनमें से अधिकांश उप निरोधात्मक थे.
उदाहरण परिणाम आरेख 3में दिखाए जाते हैं । एक अणु है कि fluconazole के साथ synergistically अधिनियम नहीं है, brefeldin एक, बाधा जंगली प्रकार और सिनर्जी पूर्वानुमान उत्परिवर्ती विकास केवल थोड़ा, और लगभग एक ही राशि । Rifamycin (चित्र बी), सिनर्जी पूर्वानुमान उत्परिवर्ती (cnag_03917Δ) के विकास को बाधित किया गया था, लेकिन जंगली प्रकार के सेल विकास नहीं था । सबसे बड़ी वृद्धि अंतर ३२ और ४९ एच पोस्ट-टीका के बीच था, इसलिए स्क्रीनिंग के लिए timepoint इस रेंज में था । अंय synergistic और गैर synergistic अणुओं के विकास घटता rifamycin और brefeldin ए, क्रमशः के उन मची ।
चित्र 1 : चरण 3 से चेकरबोर्ड परख का चित्रण । परीक्षण दवा और इनपुट दवा ढाल क्रमशः ए और बी में सचित्र हैं । अंतिम परख प्लेट सी के रूप में प्रकट करना चाहिए. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 2 : चेकरबोर्ड परख के ग्राफिकल परिणाम । synergistic, कोई नहीं, और विरोधी बातचीत के चित्र क्रमशः ए, बी, और सी में चित्रित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 : स्क्रीनिंग समय की पहचान करने के लिए डेटा उदाहरण. (क) जंगली-प्रकार (हरा) और सिनर्जी पूर्वानुमान उत्परिवर्ती (ब्लू) के सी. neoformans एक brefeldin एक, एक छोटे fluconazole के साथ synergize नहीं करने के लिए जाना जाता अणु की उपस्थिति में हो । जंगली प्रकार के नियंत्रण (डार्क ग्रीन) और दवा इलाज (हल्के हरे रंग) सिनर्जी पूर्वानुमान उत्परिवर्ती नियंत्रण (डार्क ब्लू) और दवा इलाज (हल्का नीला) के विकास में एक समान अंतर है । (ख) वंय-प्रकार और सिनर्जी पूर्वानुमान उत्परिवर्ती rifamycin, एक छोटे fluconazole के साथ synergize के लिए जाना जाता अणु की उपस्थिति में हो गया । जंगली प्रकार के नियंत्रण (डार्क ग्रीन) और दवा इलाज (हल्के हरे रंग) सिनर्जी पूर्वानुमान उत्परिवर्ती नियंत्रण (डार्क ब्लू) और दवा (हल्का नीला) इलाज से एक छोटे विकास अंतर है । सबसे बड़ा अंतर ज्ञात synergistic अणु के लिए ४८ ज में मनाया जाता है और अंतर ज्ञात गैर synergistic अणु के लिए उस समय बिंदु पर समान है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
Synergistic छोटे अणु जोड़े माइक्रोबियल संक्रमण के उपचार में एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है, अभी तक वे अपने पूर्ण नैदानिक क्षमता तक पहुंच नहीं है क्योंकि Synergistic जोड़े की पहचान करने के लिए चुनौती दे रहे हैं । इस कागज synergistic जोड़े की पहचान करने के लिए एक विधि का वर्णन बहुत तेजी से सरल pairwise संयोजन से । रासायनिक आनुवंशिकी डेटासेट का उपयोग करके, O2M जीन नॉकआउट के साथ म्यूटेंट की पहचान करता है जो तब synergistic जोड़े की भविष्यवाणी करने के लिए छोटे अणुओं के बड़े पुस्तकालयों को स्क्रीन करने के लिए एक readout के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । छोटे अणुओं की भविष्यवाणी करने की क्षमता स्क्रीन है, जो बारी में synergistic भागीदारों की largescale पहचान के लिए बनाता है की उच्च दरिद्रता के लिए अनुमति देता है । synergistic जोड़े की पहचान करने के बाद, एक आणविक synergistic बातचीत अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट कर सकते हैं, तो तर्क से अतिरिक्त synergistic जोड़े11डिजाइन ।
O2M एक रासायनिक आनुवंशिक डेटासेट और एक ज्ञात synergistic जोड़ी की आवश्यकता है । सौभाग्य से, रासायनिक आनुवंशिकी डेटासेट रोगाणुओं की एक किस्म के लिए आम है19,20,21। ब्राउन लैब पहले से प्रदर्शित किया है कि O2M सफलतापूर्वक दोनों सी. neoformans और ई. कोलाई11,12में synergistic जोड़े पा सकते हैं । यह दर्शाता है कि व्यापक प्रभाव O2M एक स्केलेबल विधि है कि व्यापक रूप से जीवों की एक किस्म के लिए लागू है के रूप में है । सभी कदम यहां सूचीबद्ध अपेक्षाकृत समान परिणामों के साथ एक अलग सूक्ष्मजीव के विकास के लिए बदला जा सकता है, इस प्रकार O2M synergistic जोड़े की सामांय पहचान के लिए एक मूल्यवान उपकरण बनाने । कई अंय समूहों के विभिंन विश्लेषणात्मक तरीकों से रासायनिक आनुवंशिकी डेटासेट से synergistic संयोजन की पहचान कर रहे हैं, हालांकि O2M इन तरीकों में से किसी के कम से प्रोग्रामिंग ज्ञान की आवश्यकता है । प्रत्येक विधि synergistic एंटीबायोटिक दवाओं या रोधी 18,22,23,24के विभिंन सेट की पहचान करता है, सुझाव है कि synergistic जोड़े की एक बड़ी संख्या में रहने की खोज की है । O2M और अंय तालमेल भविष्यवाणी तरीकों को भी संभावित स्तनधारी प्रणालियों के लिए लागू होते हैं, कैंसर दवा संयोजन की पहचान सहित ।
संक्षेप में, इस विधि एक तेजी से एक रासायनिक-आनुवंशिकी डेटासेट से synergistic जोड़े के लिए स्क्रीन करने के लिए तरीका का वर्णन । इस विधि और दूसरों की मदद synergistic जोड़े क्लीनिक में एक अधिक व्यावहारिक उपचार के विकल्प बन जाते हैं । इसके अतिरिक्त, O2M's तेजी से और सामान्यीकृत विधि यह एक मूल्यवान उपकरण जब बाहर synergistic छोटे अणु जोड़े की मांग साबित होता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम पैथोलॉजी विभाग, यूटा के विश्वविद्यालय से एक स्टार्टअप अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था J.C.S.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioscreen C | instrument | Growth Curves USA | |
| Synergy H1 | instrument | BioTek | |
| M9 broth | reagent | Amresco | J863-500G |
| Casamino Acids | reagent | Fisher Scientific | BP1424-500 |
| Glucose | reagent | Sigma | G7021-10KG |
| Nicotinic Acid | reagent | Alfa Aesar | A12683 |
| Thiamine | reagent | Acros Organics | 148991000 |
| CaCl2 Dihydrate | reagent | Fisher | C79-500 |
| MgSO4 Heptahydrate | reagent | Fisher | M63-500 |
| chemical-genetics dataset | dataset | examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text. | |
| trimethoprim (example input drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN19552701 |
| sulfamethoxazole (example test drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN15671125 |
References
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