Summary
协同药物组合是困难和耗时的鉴定经验。在这里, 我们描述了一种识别和验证协同小分子的方法。
Abstract
虽然抗菌药物大大提高了 20th世纪的寿命和生活质量, 但抗菌素耐药性威胁着我们整个社会治疗全身性感染的能力。仅在美国, 耐药性感染每年会杀死大约2.3万人, 额外的医疗费用约为200亿美元。一种对抗抗菌素耐药性的方法是组合疗法, 在感染性机体及其耐药性剖面确定之前, 这在早期的传染性疾病中特别有用。许多抗菌治疗使用组合疗法。然而, 这些组合的大部分是添加剂, 这意味着联合功效是相同的总和的个别抗生素功效。一些组合疗法是协同作用的: 联合功效远远大于添加剂。协同组合特别有用, 因为它们可以抑制抗菌耐药性菌株的生长。然而, 这些组合是罕见的和难以辨认。这是由于需要以配对的方式测试的分子数量太多: 1000 个分子的库有100万种潜在的组合。因此, 已作出努力预测分子的协同作用。本文介绍了用于预测协同小分子对 (称为重叠2方法 (O2M)) 的高通量方法。O2M 使用化学遗传数据集的模式来识别对协同对中的每个分子都敏感的突变体, 而不是其他分子。布朗实验室通过为抑制突变体而非野型细胞的生长而对分子进行高通量筛查来利用这种生长差异。实验室的工作以前确定的分子, 协同与抗生素甲氧苄啶和抗真菌药物氟康唑使用此策略。在此, 作者提出了一种新的协同组合的筛选方法, 可以改变多种微生物。
Introduction
根据 CDC1, 耐药性细菌每年在美国造成200万多人感染和2.3万例死亡。需要新的治疗方法来克服这些感染。确定这些新治疗方法的策略包括开发新的抗菌药物或为其他条件批准的小分子重新调整用途, 以治疗微生物感染2,3,4。然而, 新药的发现是非常昂贵和耗时的。重新用途药物可能不确定新的药物或药物目标5,6。我们的实验室专注于第三种称为协同组合疗法的策略。当两个小分子在一起的功效大于其个体功效7的附加效果时, 协同组合就会发生。此外, 协同组合可以有效对抗抗性的病原体中的一个小分子, 除了有较少的不必要的离靶效果, 使他们很大的潜力8,9, 10。
协同对是罕见的, 发生在大约4-10% 的药物组合中11,12,13。因此, 传统的技术, 如配对屏幕是挑战和耗时, 数以千计的潜在组合, 从一个小图书馆的100分子。此外, 协同作用通常不能从化合物的活动中预测14。但是, 作者开发了一种高吞吐量的方法来筛选协同对, 称为重叠2方法 (O2M)12。这里描述的这种方法允许更快、更有效地识别这些协同对。O2M 需要使用已知的协同对和化学遗传学数据集。化学遗传学数据集是在许多不同的小分子存在的情况下产生的。如果一个已知的协同配对中的一个分子诱导相同的表型从一个特定的淘汰赛突变体作为第二个协同分子, 任何其他小分子, 诱发表型从同一变种人也应该协同与每个成员的已知协同对。这一基本原理已用于布朗实验室, 以确定协同抗菌对大肠杆菌(大肠杆菌)和协同抗真菌药物对致病性真菌隐球菌(C。隐球菌)11,12。O2M 不仅能适应各种病原体, 而且可以方便快速地筛选大型分子库, 以识别协同对。通过 O2M 识别的基因突变体进行筛选, 我们可以只验证那些预测协同作用的小分子。因此, 测试一个2000分子的图书馆配对将需要几个月, 而如果只有20分子在该库预测协同, 现在的协同测试需要几天时间。O2M 不需要编程技能, 在大多数实验室或核心设施中都可以使用所需的设备。除了对药物组合感兴趣的研究人员之外, O2M 分析对于所有已经完成了药物筛选并希望通过确定重要的药物-药物相互作用来扩大其命中范围的人感兴趣。下面是识别细菌中的协同小分子的协议, 以及验证已知化验中预测的协同作用15,16。
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Protocol
1. 通过重叠的2方法, 从化学遗传学数据集确定协同预测突变体 (O2M)
注意: 这是使用尼科尔斯et发布的数据集来识别协同预测突变体的方法。大肠杆菌中的17 。然而, 这可以在任何化学遗传学数据集和微生物。这些数据集包含一个在100多个小分子存在下的挖空突变体库, 为每个小分子中的每个突变体提供定量的生长评分。必须知道一个协同对, 并且在数据集中包含的两个小分子应该有增长分数。
-
计算每个小分子在单个浓度下生长的所有突变体的平均生长分数和标准偏差。
注意: 这可以使用任何电子表格软件完成。棕色实验室使用 Excel 和函数 = 平均值 (B3: B3981) 和 = STDEV (B3: B3981) 为小分子的每列的计算。- 计算每列小分子的方法和标准偏差, 但如果使用不同的数据集, 这个方向可能会有所不同。
- 使用来自尼科尔斯et al的相同数据集计算每个小分子浓度的 Z 分数。电子表格程序中的17 。为此, 负 z 分数将是 z (2.5) = 平均-2.5 * 标准偏差, 和正 z 分数将 z (2.5) = 平均值 + 2.5 * 标准偏差。
- 确定哪些基因突变体在组成已知协同对的小分子中含有显著的 Z 分数, 一定要观察这些分子的所有浓度。如果突变体的生长评分小于负 z (2.5) 评分或大于正 z (2.5) 分数的小分子, 它被认为是重要的。
- 确定是否有任何重要的基因突变体属于操纵。
注: 对于大肠杆菌, 作者建议检查 "Ecoli wiki", 以了解有关基因是否转录为 polycistronic RNA 的一部分的信息。 - 在不同浓度的小分子中, 发现基因/操纵突变体 (e. g), 在寻找与抗生素甲氧苄啶协同的分子时, 识别出显着 Z 的突变体。在甲氧苄啶的存在和其已知的协同合作伙伴如 sulfamethizole 或磺胺) 中生长时得分。这些都是假定的协同预测突变体。
2. 通过 O2M 预测化学遗传学数据集内的 Synergizers
- 返回到数据集17, 确定每个小分子的浓度, 从协同预测突变体中引出显著的生长分数。这是通过观察计算每个小分子浓度的 Z 分数来完成的。同样, 一个显著的增长分数小于负 z 分数或大于正 z 分数为该浓度的小分子。
注: 如果一个分子出现在其浓度的一个, 分子被认为是预测的 synergizer。任何不引起显著生长评分的分子都是预测的非 synergizer。
3. 预测的协同相互作用的验证
- 寻找预测 synergizers 的最小抑制浓度 (MIC)。
- 在 M9 最小介质中, 在摄氏37摄氏度处生长一夜之间的大肠杆菌文化。
注意: 任何隔夜文化都可以用适当定义的培养基为感兴趣的有机体生长。布朗实验室不推荐像 LB 或 YPD 这样的富媒体。M9 最小介质包括10.5 克/升 M9 汤, 0.2% casamino 酸, 0.1 米 CaCl2, 0.4% 葡萄糖, 1 m MgSO4, 0.25% 烟酸, 0.33% 硫胺在 H2O。 - 如果在接受小分子时, 在文献中没有发现感兴趣的病菌的 MIC 数据, 则在高浓度 (> 10 毫克/毫升) 中溶解二甲基亚砜 (亚砜)。
- 使用96井板, 添加100µL 的 M9 介质到每个井。在1栏中添加额外的100µL M9 介质, 因此它总共包含200µL。
- 在1栏中添加任意量 (~ 10 µL) 的浓缩小分子溶液。一个小分子每井专栏 1 (8 个小分子每板材)。
注: 这些是感兴趣的小分子, 预测协同。布朗实验室通常增加10µL 的高度集中的小分子溶液, 它低于100% 亚砜的数量, 可以抑制大肠杆菌。 - 一旦添加了小分子, 就会将小分子分散在平板的 x 轴上。采取100µL 的解决方案从1栏, 地方在2栏和混合。从2栏中取100µL, 在3栏中放置并混合。继续此过程, 直到将100µL 放在11列中。混合11列, 然后从该列中取100µL 并丢弃。将12栏与仅介质保持在一起, 使数据正常化。
- 给盘子接种疫苗。从隔夜文化中获取光学密度 (OD600)。用区域性和 M9 介质准备一个解决方案, 使其达到600的 0.002 (或适当的浓度, 表示所需的感兴趣的有机体的500个单元格/µL)。吸管2µL 的培养溶液到每一个井的板块, 所以有1000个细胞每井。
- 轻轻摇动盘子, 获得0小时读数的 OD600 。让板材生长在37°c 为 24 h. 获取 24 h 读数的 OD600 。
注: 对其他感兴趣的生物体使用适当的生长条件。 - 使用电子表格程序计算每个井的净增长。
- 平均12栏净增长, 获得平均无药物增长。使用电子表格软件将其他油井正常化为无药物增长的平均值。寻找任何与少于10% 的增长, 以确定 MIC90 的好。任何低于50% 生长的井表明 MIC50。计算小分子在这些油井中的浓度。
- 在 M9 最小介质中, 在摄氏37摄氏度处生长一夜之间的大肠杆菌文化。
- 协同作用的棋盘测定方法
- 像以前一样, 在 M9 最小的介质中长出一夜之间的大肠杆菌文化。
注: 对其他生物体使用适当的生长条件。 - 将100µL M9 介质添加到96井板的每一个井中, 在1列中增加100µL。
- 将测试小分子 (8 x 麦克风) 添加到1列中的每个井中, 并增加两个浓度 (~ 16 x 麦克风) 到良好的 A1 (每板测试一个小分子)。
注: 这笔金额是从麦克风测试完成之前, 并不同的每一个潜在的 synergizer。 - 通过从1列中取100µL 并转移到2列, 在 x 轴上创建渐变稀释。继续此过程, 直到将100µL 添加到11列。混合, 然后采取100µL 从11栏和处置。不要将任何药物添加到12栏 (图 1A)。
- 为输入药物在 y 轴上设置第二个药物梯度。添加100µL, 其中包含输入分子的2x 麦克风在 a 行混合和稀释为以前, 采取100µL 从 a 行和放置在 b. 继续直到100µL 放在列 g 混合, 采取100µL 和处置, 确保不添加任何输入药物在行 H。这允许行 H 和12列包含测试的药物对的单个麦克风 (图 1B)。
- 给盘子接种疫苗。将 OD 600 0.002 的大肠杆菌区域性的2µL 添加到每个井 (每井1000个单元格)。
- 测量0小时读数板中每个井的 OD600 。
- 在37摄氏度孵育24小时的盘子。
- 在24小时测量每个井的 OD600 。
- 像以前一样, 在 M9 最小的介质中长出一夜之间的大肠杆菌文化。
- 棋盘中分数抑制浓度指数 (五指) 的计算
- 通过在电子表格程序中, 从外径600的 od600减去0小时, 计算板中每个井的净增长。
- 通过 H12, 不包含小分子的井分, 使软件的增长正常化。
- 找出12栏中输入分子的 MIC90 和 MIC90 中潜在增效剂的产生。
- 寻找所有能抑制90% 增长的水井。
- 计算 FICI90 的井, 这是最低以下 (协同) 或最高以上 (对抗性) 两个 MIC90 值, 使用等式:
- 考虑任何五指≤0.5 作为协同作用和五指≥4作为对抗性 (图 2)。
注: 这也可以做与 MIC50 (50% 抑制增长) 得到一个 FICI50 基于这些麦克风的价值。
- 极乐独立化验
注: 极乐独立是运行与任何潜在的增效剂, 没有麦克风本身。- 像以前一样, 在 M9 介质中, 在37摄氏度的环境中生长出一夜之间的大肠杆菌文化。
注意: 再一次, 在这个步骤中可以使用适合其他感兴趣有机体的适当生长条件。 - 准备96井板, 用于测试潜在的协同分子、输入分子、组合和未处理的控制。
- 通过增加50µL 的 M9 介质, 创造潜在的增效剂板块。添加50µL 的介质, 其中包含集浓度 (10 µM 或100µM) 的潜在增效剂的每一个井。每板测试8个分子。
- 通过将50µL 的介质添加到每个井中, 创建输入分子板。在1栏中添加50µL 包含输入药物的4x 麦克风。沿 x 轴创建渐变稀释, 类似于 MIC 板, 从1列中取50µL, 在2列中分散和混合。继续此过程直到12栏, 从12列中处理50µL。增加一个额外的50µL 的介质, 每一个井, 所以每个井的结束总数是100µL。
- 使用96井板创建组合板, 每井添加50µL 介质。在1栏中添加50µL 包含输入药物的4x 麦克风。沿 x 轴稀释类似于 MIC 板, 从1列中取50µL, 在2列中分散和混合。继续这整个方式到专栏 12, 处理50µL 从专栏12。添加50µL 的介质, 其中含有10µM 或100µM 的潜在增效剂。同样, 每排应该有一个浓度或药物。
- 通过将100µL M9 介质添加到板的所有井中, 创建未处理的控制。
- 通过添加2µL 的细菌培养, 将所有的盘子接种到0.002 或1000细胞的 OD600 , 并与以前一样。
- 在0和 24 h 测量每个井的 OD600 。
- 像以前一样, 在 M9 介质中, 在37摄氏度的环境中生长出一夜之间的大肠杆菌文化。
- 计算极乐独立评分
- 通过使用电子表格程序, 从 24 h 的增长中减去0小时的 OD600 , 计算板中每个井的净增长。
- 将油井正常化为电子表格程序中没有药物板块的平均生长。
- 使用电子表格软件, 通过减去1的净增长来计算抑制。
- 平均控制板中仅包含电子表格软件中的输入渐变的列。
- 用等式计算每个井的极乐分数:
极乐评分= (井 x + 输入列 x) -组合井 x - 在输入的 MIC90 下面寻找井下的负分数。
注意: 跨多个浓度的负分数将表明协同作用。
4. 具有协同预测突变体的高通量屏幕, 以识别新的协同对
-
识别协同预测突变体
注: 步骤1.5 确定了假定的协同预测突变体。在这里, 我们确定哪些突变体将在高通量屏幕中发挥最佳作用, 用于协同用药。我们在 Bioscreen 机上进行了这种检测, 但是96台平板阅读器也应该是可以接受的。- 在 M9 极小的培养基中生长每个假定的协同预测突变体和野生型细胞。
- 建立100井蜂窝板 (或96井板) 与适当的生长培养基, 生长培养基 + 输入药物, 生长培养基 + 已知的协同合作伙伴的输入药物, 和生长培养基 + 已知的非协同用药。确保包括车辆控制。
注: 我们建议每种应变/药物/浓度的四个复制井。 - 每井接种1000个细胞, 包括空白控制井。
- 增长48小时在37°c, 与震动, 并且读 OD600每20分钟。
- 确定药物浓度和时间点, 表明在输入药物及其已知的协同伙伴存在下, 野生型和协同预测突变细胞之间最大的生长差异。在最佳的时间点和浓度, 野生类型和协同预测突变细胞之间不应该有太大的增长差异, 在已知的药物存在不与输入药物协同作用 (图 3)。
-
用于协同用药的高通量屏幕
- 在 M9 最小介质中生长野生型细胞和协同预测突变细胞。
注: 为感兴趣的生物体使用适当的生长培养基。 - 将药物从库中添加到介质中, 每一个井中都含有100µL 介质, 在设定浓度上有小分子, 在上一步中确定。包括空白井 (无单元格) 和与车辆控制 (e. g, 亚砜) 的水井, 以说明药物稀释车的任何生长抑制。
- 每板至少准备四辆车辆控制井, 理想情况下分散在板上, 以说明井位效应。如果检测是可变的, 那么每行/列至少包含一个车辆控制井, 并使用每行/列控件以及控件来计算每行/列的 Z 分数, 而不是整个板块 (步骤 4.2.5)。
- 将2µL 的文化添加到以前的井中。(一盘为野生类型细菌和一个板材为预测的协同突变细菌)。
- 评估大肠杆菌或 48 h 用于C. 隐球菌的 OD600为0和 18 h。
- 使用电子表格软件, 通过从车辆控制井中减去空白井的 OD600计算净增长。识别与 z 评分为-2.5 的井 (z 分数 = 平均 2.5 * 标准偏差)。这些井含有一个潜在的增效剂小分子。
- 使用步骤3中概述的方法验证屏幕命中。
- 在 M9 最小介质中生长野生型细胞和协同预测突变细胞。
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Representative Results
棋盘检测是一种测量协同相互作用的半定量方法。最后的分数输出, 五指, 确定药物组合是否被认为是协同的 (五指≤0.5), 不相互作用 (0.5 < 五指 < 4), 或拮抗 (五指≥4.0)。图 1阐释了如何在棋盘分析中设置药物渐变。图 2说明了常见的结果。考虑生长不到90% 的生长抑制 (紫色井)。在测量每一个盘子中每个井的 OD600后, 我们将一切标准化到没有药物控制好。任何具有规范化值 > 0.1 (控件的 OD600的 10%) 的任何内容都被作为 "增长" 评分。五指分数可以根据挑选的好而不同;我们选择的井, 给每个板块的最低五指。在图 2A中, 这将是很好的 F9 (列编号, 行字母), 五指 = 0.07。在图 2B中, 五指是从 C3 井 (五指 = 1.0) 计算出来的。对于对立的互动, 寻找最高的五指得分可能。在图 2C中, 五指是从 A1 井中计算出来的, 它给出了一个五指8.0。
最佳筛选条件将防止屏幕上出现大量的误报, 从而节省了时间和金钱。当我们优化了真菌的协同预测突变体新生隐球菌, 我们测试了输入药物 (氟康唑), 四已知的非协同药物 (咖啡因, 甘宝素, 甲氧苄啶, 和 brefeldin A), 和五氟康唑的协同合作伙伴 (利福平、myriocin、尼日利亚菌素、雷帕霉素和 FK506, 都在钱德拉塞克兰、S . et 中讨论过。18). 由于我们发现这些分子通过 O2M 分析 (1 和2节), 我们期望已知的 synergizers 有选择地抑制协同预测突变细胞的生长, 而不是野生型细胞。为了最大化预期的生长差异, 我们测试了每个小分子的浓度范围, 其中大部分是亚抑制。
示例结果显示在图 3中。一个不与氟康唑, brefeldin, 抑制野生类型和协同预测突变体生长的分子, 只有轻微的, 大约相同的数量。利福平 (图 3B), 协同预测突变体 (cnag_03917Δ) 的生长受到抑制, 但野生型细胞生长不明显。最大的生长区别在32和 49 h 以后接种, 因此 timepoint 为筛查是在这个范围内。其他协同和非协同分子的生长曲线分别类似于利福平和 brefeldin。
图 1: 从步骤3描述棋盘检测.实验药物和输入药物梯度分别在 A 和 B 中说明。最后的化验盘应显示为 C.请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 棋盘检测的图形结果.在 A、B 和 C 中分别描述了协同、无和拮抗相互作用的插图。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 用于标识筛选时间的示例数据.(A) 野生类型 (绿色) 和协同预测突变体 (蓝色) 的C. 隐球菌生长在一个 brefeldin 的存在, 一个小分子已知不协同与氟康唑。野生型控制 (深绿色) 和药物治疗 (浅绿色) 有类似的增长差异的协同预测突变控制 (深蓝色) 和药物治疗 (浅蓝色)。(B) 野生类型和协同预测突变体, 在利福平的存在下生长, 这是已知与氟康唑协同的一个小分子。野生型控制 (深绿色) 和药物治疗 (浅绿色) 的生长差异比预测突变控制 (深蓝色) 和药物治疗 (浅蓝色) 小。已知的协同分子在 48 h 上观察到最大的差异, 在那个时间点上, 已知的非协同分子的差异是相似的。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
协同小分子对是治疗微生物感染的有力工具, 但由于协同对识别的挑战, 它们尚未达到充分的临床潜力。本文介绍了一种比简单配对组合更快地识别协同副的方法。通过使用化学遗传学数据集, O2M 识别突变体的基因敲除, 然后可以用来作为一个读数, 以筛选大型图书馆的小分子, 以预测协同对。预测小分子的能力允许屏幕的高可伸缩性, 这反过来又使得对协同合作伙伴的大规模识别。在确定协同对的基础上, 可以阐明协同作用的分子机制, 然后合理设计附加的协同对11。
O2M 需要一个化学遗传数据集和一个已知的协同对。幸运的是, 化学遗传学数据集是常见的各种微生物19,20,21。布朗实验室以前证明, O2M 可以成功地在C. 隐球菌和大肠杆菌11,12中找到协同对。这表明, 广泛的影响 O2M 具有可伸缩的方法, 广泛适用于各种有机体。这里列出的所有步骤都可以改变为不同的微生物的生长, 具有相对相似的结果, 从而使 O2M 成为一个有价值的工具, 一般识别的协同对。其他几个小组通过不同的分析方法来确定化学遗传学数据集的协同组合, 尽管 O2M 需要对这些方法中的任何一种进行最少的编程知识。每个方法都标识不同的协同抗生素组或抗真菌药物18、22、23、24, 这表明仍有待发现大量的协同对.O2M 和其他协同预测方法也可能适用于哺乳动物系统, 包括识别癌症药物组合。
总之, 此方法描述了一种从化学遗传学数据集中筛选协同对的快速方法。这种方法和其他帮助协同对成为一个更可行的治疗方案在诊所。此外, O2M's 快速和广义的方法证明它是一个宝贵的工具, 当寻找协同小分子对。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了来自犹他州大学病理学系 j.c.s. B 的启动补助金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioscreen C | instrument | Growth Curves USA | |
| Synergy H1 | instrument | BioTek | |
| M9 broth | reagent | Amresco | J863-500G |
| Casamino Acids | reagent | Fisher Scientific | BP1424-500 |
| Glucose | reagent | Sigma | G7021-10KG |
| Nicotinic Acid | reagent | Alfa Aesar | A12683 |
| Thiamine | reagent | Acros Organics | 148991000 |
| CaCl2 Dihydrate | reagent | Fisher | C79-500 |
| MgSO4 Heptahydrate | reagent | Fisher | M63-500 |
| chemical-genetics dataset | dataset | examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text. | |
| trimethoprim (example input drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN19552701 |
| sulfamethoxazole (example test drug; any can be used) | reagent | Fisher Scientific | ICN15671125 |
References
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