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Genetics

Hochdurchsatz-Identifizierung von synergistischen Wirkstoffkombinationen durch die Überlappung2 Methode

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57241
Automatic Translation
1, 1
1Microbiology and Immunology Division, Department of Pathology, University of Utah

Summary

Synergistische Wirkstoffkombinationen sind schwierig und zeitaufwändig, empirisch zu identifizieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung und Validierung von synergistischen kleine Moleküle.

Abstract

Obwohl antimikrobielle Medikamente erheblich die Lebensdauer und die Qualität des Lebens im20. Jahrhundert zugenommen haben, droht Antibiotikaresistenz unsere gesamte Gesellschaft Fähigkeit, systemische Infektionen zu behandeln. In den Vereinigten Staaten allein töten Antibiotika-resistente Infektionen etwa 23.000 Menschen pro Jahr und rund 20 Milliarden US-Dollar im Gesundheitswesen zusätzliche Kosten. Ein Ansatz zur Bekämpfung der Antibiotikaresistenz ist die Kombinationstherapie, die in der kritischen frühen Phase der Infektion, besonders nützlich ist, bevor der infizierenden Organismus und seine Droge-Widerstand-Profil identifiziert wurden. Viele antimikrobielle Behandlungen verwenden Kombinationstherapien. Jedoch die meisten dieser Kombinationen sind additiv, d. h., dass die kombinierte Wirkung die gleiche wie die Summe der einzelnen antibiotische Wirksamkeit ist. Einige Kombinationstherapien sind synergistische: die kombinierte Wirkung ist viel größer als Additiv. Synergistische Kombinationen sind besonders nützlich, weil sie das Wachstum von Antibiotika resistente Stämme hemmen können. Diese Kombinationen sind jedoch selten und schwer zu identifizieren. Dies ist aufgrund der schieren Anzahl der Moleküle, die in gewissem Sinne paarweise getestet werden: eine Bibliothek mit 1.000 Moleküle hat 1 Million Kombinationsmöglichkeiten. So wurden Anstrengungen unternommen, Moleküle für Synergie vorherzusagen. Dieser Artikel beschreibt unsere Hochdurchsatz-Methode für die Vorhersage synergistische niedermolekularer Paare als Überlappung2 Methode (O2M) bekannt. O2M verwendet Muster aus chemisch-genetische Datasets Mutanten zu identifizieren, die überempfindlich auf jedes Molekül in einem synergistischen paar aber nicht auf andere Moleküle. Die braunen Lab nutzt dieses Wachstum Unterschied durch Ausführen eines Hochdurchsatz-Bildschirms für Moleküle, die das Wachstum von Mutant aber nicht Wildtyp-Zellen hemmen. Das Labor Arbeit zuvor identifizierten Moleküle, die mit dem Antibiotikum Trimethoprim und der antimykotische Wirkstoff Fluconazol mit dieser Strategie synergize. Hier präsentieren die Autoren eine Methode, um Bildschirm für neuartige synergistische Kombinationen, die für mehrere Mikroorganismen verändert werden kann.

Introduction

Antibiotika-resistente Bakterien dazu führen, dass mehr als 2 Millionen Infektionen und 23.000 Todesfälle jährlich in den Vereinigten Staaten nach der CDC-1. Neue Behandlungen sind erforderlich, um diese Infektionen zu überwinden. Strategien zu identifizieren, diese neuen Behandlungen umfassen die Entwicklung neuer antimikrobielle Medikamente oder die Wiederverwendung von kleinen Molekülen, die für andere Bedingungen zur Behandlung von mikrobiellen Infektionen2,3,4zugelassen. Neue Drogeentdeckung ist jedoch sehr kostspielig und zeitaufwendig. Wiederverwendung von Drogen kann nicht identifizieren neuartiger Medikamente oder Drogen richtet sich an5,6. Unser Labor konzentriert sich auf eine dritte Strategie als synergistische Kombinationstherapien bekannt. Synergistische Kombinationen auftreten, wenn zwei kleine Moleküle zusammen eine Wirksamkeit größer als die additive Wirkung von ihrer individuellen Wirksamkeiten7haben. Darüber hinaus können synergistische Kombinationen gegen einen Erreger resistent gegen eines der kleinen Moleküle des Paares neben mit weniger unerwünschten Wirkungen Ziel, wodurch sie große potenzielle8,9wirksam, 10.

Synergistische Paare sind selten, auftreten bei etwa 4-10 % der Droge Kombinationen11,12,13. So sind traditionelle Techniken wie paarweisen Bildschirmen schwieriger und zeitaufwendiger, mit Tausenden von möglichen Kombinationen aus einer kleinen Bibliothek von hundert Moleküle. Synergistische Wechselwirkungen können darüber hinaus in der Regel von der Aktivität der Verbindungen14vorhergesagt werden. Jedoch entwickelten die Autoren einen Hochdurchsatz-Ansatz für Bildschirm für synergistische Paare, genannt die Überlappung2 Methode (O2M)12. Diese hier beschriebene Methode ermöglicht schnellere, effizientere Identifikation dieser synergistischen Paare. O2M erfordert den Einsatz eines bekannten synergistische Paares und ein Chemie-Genetik-Dataset. Chemie-Genetik-Datasets werden generiert, wenn eine Bibliothek von Knockout-Mutanten in Anwesenheit von vielen verschiedenen kleinen Molekülen angebaut wird. Wenn ein Molekül in einem bekannten synergistische paar den gleichen Phänotyp aus einer bestimmten ko-Mutante als das zweite synergistische Molekül induziert, sollten alle anderen kleines Molekül, das den Phänotyp aus diesem gleichen Mutant entlockt auch mit jedem Mitglied der bekannten synergize. synergistische Paar. Diese Begründung wurde in der braunen Lab verwendet, um synergistische Antibiotika wirksam gegen Escherichia coli (E. Coli) und synergistische pilzbefallverhütende Droge Paare aktiv gegen die pathogenen Pilzes Cryptococcus Neoformans (C. identifizieren Neoformans)11,12. O2M ist nicht nur anpassungsfähig für verschiedene Krankheitserreger, sondern ermöglicht für das Screening der großen Bibliotheken der Moleküle, synergistische Paare einfach und schnell zu identifizieren. Screening mit der genetischen Mutant bezeichneten O2M ermöglicht es uns, nur diesen kleinen Molekülen vorhergesagt für Synergie zu validieren. So würde eine 2.000-Molekül-Bibliothek paarweise testen Monate dauern, während gäbe es nur 20 Moleküle in dieser Bibliothek synergize voraussichtlich, Test für Synergie jetzt eine Frage von Tagen dauert. O2M erfordert keine Programmierkenntnisse und das benötigte Equipment gibt es in den meisten Labors oder zentrale Einrichtungen. Neben der Forscher Wirkstoffkombinationen interessieren ist O2M Analyse für jeden von Interesse, die hat einen Drogentest absolviert und will ihre Hits zu erweitern, indem Sie wichtige Wechselwirkungen zu identifizieren. Unten ist das Protokoll für synergistische kleine Moleküle in Bakterien zu identifizieren, sowie die Validierung der vorhergesagten synergistischen Interaktionen in bekannten Assays15,16.

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Protocol

1. Identifizierung Synergie Vorhersage Mutanten aus chemisch-Genetik Dataset durch die Überlappung2 Methode (O2M)

Hinweis: Dies ist die Methode zur Identifizierung von Synergie Vorhersage Mutanten mit der veröffentlichten Dataset von Nichols Et Al. 17 in E. Coli. Allerdings kann dies auf alle chemisch-Genetik-Dataset und Mikroorganismus erfolgen. Diese Datensätze enthalten eine Bibliothek von Ko-Mutanten gewachsen in Anwesenheit von mehr als 100 kleine Moleküle geben ein quantitatives Wachstum Punktzahl für jede Mutante in jedem kleinen Molekül. Eine synergistische Paar muss bekannt sein sollte, und es Wachstum Noten für beide kleine Moleküle, die in dem Dataset enthalten.

  1. Berechnen Sie die mittlere Wachstum Partitur und Standardabweichung für alle Mutanten in Anwesenheit einer einzigen Konzentration jedes kleine Molekül gewachsen.
    Hinweis: Dies kann mit jedem Tabellenkalkulations-Software. Die braunen Lab verwendet Excel und die Funktionen =AVERAGE(B3:B3981) und =STDEV(B3:B3981) für die Berechnungen der einzelnen Spalten kleiner Moleküle.
    1. Berechnen Sie die Mittel und die Standardabweichungen aus jeder Spalte kleiner Moleküle, obwohl diese Ausrichtung unterschiedlich sein kann, wenn ein anderes Dataset verwenden.
  2. Z-Scores für jede Konzentration kleiner Moleküle mit der gleichen Dataset von Nichols Et al.zu berechnen. 17 in einem Tabellenkalkulationsprogramm. Hierzu werden negative Z-Scores Z(2.5) = bedeuten - 2,5 * Standardabweichung und positive Z-Scores werden Z(2.5) = Mittelwert + 2,5 * Standardabweichung.
  3. Bestimmen Sie, welche gen Mutanten enthalten bedeutende Z-Scores in den kleinen Molekülen, aus denen das bekannte synergistische Paar, als sicher zu betrachten alle Konzentrationen von diesen Molekülen besteht. Wenn das Wachstum, das Ergebnis einer Mutante ist weniger als die negative Z (2.5) Punkten oder größer als die positive Z (2.5) Punktzahl für dieses kleine Molekül ist, ist es als signifikant betrachtet.
  4. Festzustellen Sie, ob eines der bedeutenden gen Mutanten zu einem Operon gehören.
    Hinweis: Für E. Coli, die Autoren empfehlen "Ecoli Wiki" für Informationen bezüglich wenn Gene als Bestandteil einer Polycistronic RNA transkribiert werden.
  5. Gen/Operon Mutanten, die für die Mehrzahl der kleinen Moleküle von Interesse bei verschiedenen Konzentrationen sind zu identifizieren (z. B.., bei der Suche nach Molekülen, die mit dem Antibiotikum Trimethoprim synergize identifizieren Mutanten, die eine signifikante Z zeigen Ergebnis, wenn in Gegenwart von Trimethoprim und ihren bekannten synergistischen Partnern wie Sulfamethizole oder Sulfamethoxazole gewachsen). Dies sind vermeintliche Synergie Vorhersage Mutanten.

(2) Vorhersage von Synergizers innerhalb der Chemie-Genetik-Dataset von O2M

  1. Rückkehr in das Dataset17, identifizieren Sie jede Konzentration von kleines Molekül, das eine deutliche Zuwächse Punktzahl aus der Synergie Vorhersage Mutante entlockt. Dies geschieht anhand der Z-Scores berechnet für jede Konzentration von kleinen Molekülen. Wiederum ist ein signifikantes Wachstum Ergebnis kleiner als der negativen Z-Score oder größer als die positive Z-Score für diese Konzentration kleiner Moleküle.
    Hinweis: Wenn ein Molekül auch nur eines ihrer Konzentrationen angezeigt wird, wird das Molekül eine prognostizierte Synergizer betrachtet. Jedes Molekül, das kein deutliches Wachstum Partitur entlocken ist eine vorhergesagte nicht Synergizer.

3. Überprüfung der vorhergesagten synergistische Wechselwirkungen

  1. Suche nach minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) der prognostizierten Synergizers.
    1. Wachsen einer Übernachtung Kultur von E. Coli in M9 minimal Media bei 37 ° C.
      Hinweis: Jede Nacht Kultur kann in angemessen definierte Medium für den Organismus von Interesse gewachsen. Die braunen Lab empfiehlt nicht rich-Media wie LB oder YPD. M9 minimalste Medien besteht aus 10,5 g/L M9 Brühe, 0,2 % Casamino Säuren, 0,1 M CaCl2, 0,4 % Glukose, 1 M MgSO4, Nikotinsäure 0,25 % und 0,33 % Thiamin in H2O.
    2. Wenn keine MHK-Daten für Erreger von Interesse in der Literatur nach Erhalt die kleinen Moleküle gefunden wird in Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in einer hohen Konzentration auflöst (> 10 mg/mL).
    3. Fügen Sie mithilfe einer 96-Well-Platte 100 µL der M9 Medien in jede Vertiefung. Fügen Sie eine zusätzliche 100 µL der M9 Medien in Spalte 1, so es eine Gesamtmenge von 200 µL enthält.
    4. Fügen Sie eine beliebige Anzahl (~ 10 µL) konzentrierte niedermolekularer Lösung in Spalte 1. Ein kleines Molekül pro Bohrloch von Spalte 1 (8 kleine Moleküle pro Platte).
      Hinweis: Dies sind die kleinen Moleküle des Interesses, die voraussichtlich synergize. Das braune Labor fügt in der Regel 10 µL der hochkonzentrierten niedermolekularer Lösung, die unter dem Betrag von 100 % DMSO ist, die E. Colihemmen können.
    5. Sobald die kleinen Moleküle hinzugekommen sind, verdünnen Sie die kleinen Moleküle auf der x-Achse der Platte. Nehmen Sie 100 µL Lösung von Spalte 1, in Spalte 2 und vermischen. Nehmen Sie 100 µL aus Spalte 2, Spalte 3 und vermischen. Fortfahren Sie, bis 100 µL in Spalte 11 platziert sind. Spalte 11 mischen, dann nehmen Sie 100 µL aus der Spalte und verwerfen. Lassen Sie die Spalte 12 mit nur Medien, die Daten zu normieren.
    6. Die Platte zu impfen. Erhalten Sie die optische Dichte (OD600) von einer Übernacht-Kultur. Bereiten Sie eine Lösung mit der Kultur und M9-Medien auf einem OD-600 von 0,002 (oder entsprechende Konzentration, die 500 Zellen/µL für den gewünschten Organismus von Interesse darstellt). Pipette 2 µL Kulturlösung in jede Vertiefung der Platte, so gibt es 1.000 Zellen pro Bohrloch.
    7. Schütteln Sie die Platte und erhalten Sie die OD600 für die 0 h lesen. Lassen Sie die Platte bei 37 ° C für 24 Std. erhalten die OD600 für die 24 h lesen wachsen.
      Hinweis: Verwendung geeigneten Anbaubedingungen für andere Organismen von Interesse.
    8. Berechnen Sie die Netto-Wachstum für jeden gut mit einem Tabellenkalkulationsprogramm.
    9. Durchschnitt der Nettozuwachs der Spalte 12 im Durchschnitt keine Droge Wachstum zu erhalten. Die weiteren Bohrungen auf den Durchschnitt der kein Medikament Wachstum mit einem Tabellenkalkulationsprogramm zu normalisieren. Suchen Sie nach jeder gut mit weniger als 10 % Wachstum, die MIC90 zu identifizieren. Alle gut mit weniger als 50 % Wachstum zeigt die MIC50. Berechnen Sie die Konzentration der kleinen Molekül in den Brunnen.
  2. Schachbrett-Assays für die synergistische Wechselwirkungen
    1. Wachsen Sie eine Übernachtung Kultur von E. Coli in M9 minimal Medien wie vor.
      Hinweis: Verwendung geeigneten Anbaubedingungen für andere Organismen.
    2. Jede Vertiefung einer 96-well-Platte und eine zusätzliche 100 µL in Spalte 1 100 µL der M9 Medien hinzufügen.
    3. Fügen Sie das Test kleines Molekül (~ 8 x MIC) zueinander auch in Spalte 1 und fügen Sie verdoppeln die Konzentration (~ 16 x MIC) gut a1 (ein kleines Molekül getestet pro Platte).
      Hinweis: Dieser Betrag ergibt sich aus der MIC Test abgeschlossen vor und unterscheidet sich für jede mögliche Synergizer.
    4. Erstellen Sie eine Farbverlauf Verdünnung auf der x-Achse von 100 µL aus Spalte 1 und Spalte 2. Fortfahren Sie, bis 100 µL, Spalte 11 hinzugefügt wird. Mischen, dann 100 µL aus Spalte 11 nehmen und entsorgen. Spalte 12 (Abbildung 1A) keines Medikament hinzufügen.
    5. Das zweite Medikament Gefälle über die y-Achse für die Eingabe Droge eingerichtet. Fügen Sie 100 µL Medium mit 2 x MIC input Moleküls in Zeile A. Mix und als vor dem verdünnen, wobei 100 µL aus Zeile A und Platzierung in B. weiter bis 100 µL in Zeile G. Mix platziert wird, nehmen Sie 100 µL und entsorgen, Gewährleistung nicht fügen Sie jede Eingabe Droge in Reihe H. Dadurch können Zeilen-H und 12 einzelne Mikrofone der Droge paar getestet (Abbildung 1 b) enthalten.
    6. Die Platte zu impfen. Fügen Sie 2 µL einer E. Coli -Kultur von OD600 0,002 in jede Vertiefung (1.000 Zellen pro Well).
    7. Messen Sie die OD600 von jedem Bohrloch in der Platte für die 0 h Lesung.
    8. Inkubieren Sie die Platte für 24 h bei 37 ° c
    9. Messen Sie die OD600 von jedem Bohrloch um 24 Uhr.
  3. Berechnung des fraktionierten hemmende Konzentration Index (FICI) von Schachbretter
    1. Berechnen Sie die Netto-Wachstum für jede Vertiefung der Platte durch Subtraktion der OD600 um 0 Uhr die OD600 bei 24 h in einem Tabellenkalkulationsprogramm.
    2. Das Wachstum in der Software durch Teilung jedes gut durch gut H12, enthält kein kleines Molekül zu normalisieren.
    3. Finden Sie die MIC90 des Eingabe-Moleküls in Spalte 12 und die MIC90 von potenziellen Synergist in Reihe H.
    4. Suchen Sie nach alle Brunnen, die 90 % Wachstum zu hemmen.
    5. Berechnen Sie die FICI90 für die gut, die entweder die niedrigste unten (synergistische) oder oben (antagonistisch) höchste beide MIC90 Werte, unter Verwendung der Gleichung:
      Equation 1
    6. Betrachten alle FICI ≤ 0,5 als synergistische und FICI ≥ 4 als antagonistisch (Abbildung 2).
      Hinweis: Dies geht auch mit MIC50 (50 % Hemmung des Wachstums), ein FICI50, basierend auf diesen Werten MIC zu bekommen.
  4. Bliss-Unabhängigkeit-Assay
    Hinweis: Bliss Unabhängigkeit wird mit jeder möglichen Synergist geführt, die nicht über ein Mikrofon auf eigene.
    1. Wie zuvor wachsen Sie eine Nacht Kultur von E. Coli in M9 Medien bei 37 ° C.
      Hinweis: Können geeignete Wachstumsbedingungen für andere Organismen von Interesse in diesem Schritt wiederverwendet werden.
    2. Bereiten Sie 96-Well Platten für die Prüfung der potentiellen synergistischen Molekül, das Eingabe-Molekül und die Kombination einer unbehandelten Kontrolle vor.
    3. Erstellen Sie die potenziellen Synergist Platte durch Zugabe von 50 µL der M9 Medien in jede Vertiefung. Jede Vertiefung einer Zeile fügen Sie 50 µL der Medien mit einer bestimmten Konzentration (10 µM oder 100 µM hinzu) von den potenziellen Synergist. Testen Sie 8 Moleküle pro Platte.
    4. Erstellen Sie die Eingabe-Molekül-Platte durch Zugabe von 50 µL der Medien in jede Vertiefung. Fügen Sie 50 µL mit 4 X MIC input Droge in jede Vertiefung in Spalte 1. Erstellen Sie eine Farbverlauf Verdünnung entlang der x-Achse ähnlich MIC Platten, wobei 50 µL aus Spalte 1, Dispergieren und mischen in Spalte 2. Fortfahren Sie, bis Spalte 12, 50 µL aus Spalte 12 Entsorgung. Fügen Sie eine zusätzliche 50 µL der Medien in jede Vertiefung, also Ende insgesamt für jedes gut 100 µL.
    5. Fügen Sie die Kombination Platte mithilfe einer 96-well-Platte erstellen hinzu, 50 µL der Medien in jede Vertiefung. Fügen Sie 50 µL mit 4 X MIC input Droge in jede Vertiefung in Spalte 1. Verdünnen Sie entlang der x-Achse ähnlich wie MIC Platten, wobei 50 µL aus Spalte 1, Dispergieren und mischen in Spalte 2. Auch weiterhin diese den ganzen Weg bis Spalte 12, 50 µL aus Spalte 12 Entsorgung. Fügen Sie 50 µL Medium, das die potenziellen Synergisten bei 10 µM oder 100 µM in jede Vertiefung einer Zeile enthält. Auch hier sollte eine Konzentration oder Medikament pro Zeile.
    6. Erstellen der unbehandelten Kontrolle durch Zugabe von 100 µL der M9 Medien in alle Vertiefungen der Platte.
    7. Impfen Sie alle Platten durch Zugabe von 2 µL der Bakterienkultur mit einem OD-600 von 0,002 oder 1.000 Zellen in jede Vertiefung als vor.
    8. Messen Sie die OD600 von jedem Bohrloch bei 0 und 24 h.
  5. Berechnung der Glückseligkeit Unabhängigkeit Gäste
    1. Berechnen Sie die Netto-Wachstum für jede Vertiefung der Platte durch Subtraktion der OD600 um 0 Uhr vom Wachstum um 24 Uhr mit einem Tabellenkalkulationsprogramm.
    2. Normalisieren der Brunnen, das durchschnittliche Wachstum von der keine Droge-Platte in einem Tabellenkalkulationsprogramm.
    3. Berechnen Sie Tabellenkalkulations-Software verwenden, die Hemmung durch Subtrahieren der Nettozuwachs von 1.
    4. Durchschnitt der Spalten in der Steuerelement-Platte, die nur die Eingabe Gradienten in der Tabellenkalkulations-Software enthalten.
    5. Berechnen Sie die Glückseligkeit Score für jede Vertiefung durch die Gleichung:
      Bliss-Score = (auch X + Eingabespalte X) – kombiniert gut X
    6. Suchen Sie nach negativen Punktzahlen in Brunnen unter die MIC90 des Eingangs.
      Hinweis: Negative Resultate über mehrere Konzentrationen würde eine synergistische Interaktion zeigen.

4. Hochdurchsatz-Screen mit Synergy Vorhersage Mutanten, neuartige synergistische Paare zu identifizieren

  1. Synergie-Vorhersage-Mutanten zu identifizieren
    Hinweis: Schritt 1.5 identifiziert vermeintliche Synergie Vorhersage Mutanten. Hier bestimmen wir, welche diese Mutanten funktioniert am besten in einem Hochdurchsatz-Bildschirm für synergistische Drogen. Dieser Assay in einer Bioscreen-Maschine durchgeführt, aber 96-well-Platte-Leser sollte auch akzeptabel.
    1. Wachsen Sie jede vermeintliche Synergie Vorhersage Mutanten und Wildtyp Zellen in M9 minimal Medien.
    2. Richten Sie die 100 gut Waben-Platte (oder 96-well-Platte) mit dem entsprechenden Wachstumsmedium, Wachstumsmedium + Eingabe Medikament, Wachstumsmedium + bekannte synergistische Partner der Eingabe Droge und Wachstumsmedium + bekannte nicht synergistische Droge. Sicherstellen Sie, dass Fahrzeug Steuerelemente enthalten.
      Hinweis: Wir empfehlen, dass vier Brunnen für jede Belastung/Wirkstoffkonzentration replizieren.
    3. Impfen Sie 1.000 Zellen pro Bohrloch, einschließlich der leeren Kontroll-Vertiefungen.
    4. 48 h bei 37 ° C mit schütteln, zu wachsen und alle 20 min OD600 zu lesen.
    5. Bestimmen Sie Medikament Konzentration und Zeit-Punkt, der das größte Wachstum Unterschied zwischen Wildtyp und Synergie Vorhersage mutierten Zellen in Anwesenheit der Eingabe Medikament und seine bekannten synergistische Partner zeigt. An der optimalen Zeitpunkt und Konzentration sollte nicht viel Wachstum Unterschied zwischen Wildtyp und Synergie Vorhersage mutierten Zellen wenn in Gegenwart von Drogen bekannt Handlungsfähigkeit nicht synergistisch mit dem Eingang Medikament (Abbildung 3) gewachsen.
  2. Hochdurchsatz-Bildschirm für synergistische Drogen
    1. Wachsen Sie Wildtyp Zellen und Synergie Vorhersage mutierten Zellen in M9 minimal Medien.
      Hinweis: Verwenden Sie geeignete Wachstumsmedium für Organismus von Interesse.
    2. Fügen Sie Medikamente aus der Bibliothek hinzu, um Medien so dass jeder auch die 100 µL Medien mit kleinen Molekülen in festgelegten Konzentration enthält, die im vorherigen Schritt ermittelt wurde. Sind leere Brunnen (ohne Zellen) und Brunnen mit Fahrzeug-Kontrollen (ez., DMSO) zu einer Wachstumshemmung durch das Medikament Verdünnung Fahrzeug entfallen.
      1. Bereiten Sie mindestens vier Fahrzeug-Kontroll-Vertiefungen pro Platte, im Idealfall verstreut über die Platte gut Positionseffekte berücksichtigen. Wenn Assays variabel sind, dann gehören Sie mindestens eine Fahrzeugkontrolle auch pro Zeile/Spalte und verwenden Sie jede Zeile/Spalte Kontrolle sowie die Steuerung, um Z-Scores für jede Zeile/Spalte anstatt für eine ganze Platte (Schritt 4.2.5) zu berechnen.
    3. Fügen Sie 2 µL der Kultur in jede Vertiefung als vor. (Eine Platte für Wildtyp-Bakterien und eine Platte für die vorhergesagten Synergie mutierten Bakterien).
    4. Beurteilen Sie die OD600 bei 0 und 18 h für E. Coli oder 48 h für C. Neoformans.
    5. Berechnen Sie Tabellenkalkulations-Software verwenden, die Netto-Wachstum durch Subtraktion der OD-600 von leeren Brunnen aus der Fahrzeug-Kontroll-Vertiefungen. Brunnen mit einem Z-Score von-2,5 identifizieren (Z-Score = Mittelwert - 2,5 * Standardabweichung). Diese Vertiefungen enthalten ein potenzieller Synergist kleines Molekül.
    6. Validieren Sie Bildschirm-Hits mit den Methoden in Schritt 3 beschrieben.

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Representative Results

Schachbrett-Assays sind eine semi-quantitative Methode zur Messung von synergistischer Interaktionen. Das Endergebnis ausgegeben, FICI, bestimmt wenn eine Arzneimittelkombination synergistische (FICI ≤0.5) gilt, nicht-wechselwirkenden (0,5 < FICI < 4), oder antagonistischen (FICI ≥4.0). Abbildung 1 veranschaulicht, wie die Droge Gradienten in einem Schachbrettmuster-Assay einrichten. Abbildung 2 veranschaulicht gemeinsame Ergebnisse. Betrachten Sie Wachstum (lila Brunnen), die weniger als 90 % Wachstumshemmung anzuzeigen. Nach der Messung die OD600 von jedem Bohrloch in einer Platte, normalisieren wir alles keine Drogenkontrolle gut. Alles mit einem normalisierten Wert > 0,1 (10 % des OD600 des Steuerelements gut) wird als "Wachstum" bewertet. FICI Partituren können hängt von ab, die gut ausgewählt wird; Wir wählen den Brunnen, der die niedrigsten FICI für jede Platte gibt. In Abbildung 2A, das wäre gut F9 (Spalten werden nummeriert, Zeilen beschriftet), = mit einem FICI 0,07. In Abbildung 2 b, errechnet sich der FICI aus gut C3 (FICI = 1,0). Suchen Sie für antagonistische Wechselwirkungen FICI Highscore möglich. In Abbildung 2errechnet sich der FICI aus gut A1, die geben ein FICI 8.0.

Optimale Screening Bedingungen verhindert eine hohe Anzahl von Fehlalarmen auf dem Bildschirm, die was Zeit und Geld spart. Wenn wir die Synergie Vorhersage Mutanten der Pilz Cryptococcus Neoformansoptimiert, testeten wir die Eingabe Droge (Fluconazol), vier bekannten nicht-synergistische Drogen (Koffein, Climbazole, Trimethoprim und Brefeldin A) und fünf Fluconazol synergistische Partner (Rifamycin, Myriocin, Nigericin, Rapamycin und FK506, alle ausführlich Chandrasekaran, S. Et al. 18). da wir diese Moleküle durch O2M Analyse (Abschnitte 1 und 2) entdeckten, wir erwarten die bekannten Synergizers, selektiv hemmen das Wachstum von Synergie Vorhersage mutierten Zellen aber nicht Wild-Typ-Zellen. Um das zu erwartende Wachstum Unterschied zu maximieren, haben wir eine Reihe von Konzentrationen für jedes kleine Molekül, von denen meisten sub-inhibitory wurden getestet.

Beispielergebnisse sind in Abbildung 3dargestellt. Ein Molekül, das nicht synergistisch mit Fluconazol, Brefeldin A, gehemmte Wildtyp und Synergie Vorhersage mutierte Wachstum nur geringfügig, und etwa die gleiche Menge. Rifamycin (Abb. 3 b), das Wachstum der Synergie Vorhersage Mutant (cnag_03917Δ) war gehemmt, aber Wildtyp Zellwachstum war nicht. Der größte Wachstum Unterschied war zwischen 32 und 49 h nach Impfung, so das Timepoint für das Screening in diesem Bereich war. Wachstumskurven der anderen synergistische und nicht synergistische Moleküle ähnelte derjenigen Rifamycin und Brefeldin A, beziehungsweise.

Figure 1
Abbildung 1 : Darstellung der Schachbrett-Assay aus Schritt 3. Der Test Medikament und Input Medikament Steigungen sind dargestellt A und B, beziehungsweise. Die letzte Test-Platte sollte angezeigt werden, wie C. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Grafische Ergebnisse der Schachbrett-Assay. Illustrationen von synergistischen, keine, und antagonistische Wechselwirkungen werden dargestellt A, B und C, jeweils. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Beispiel-Daten zur Identifizierung von Screening Zeit. (A) Wildtyp (grün) und Synergie-Vorhersage-Mutante (blau) von C. Neoformans gewachsen in Anwesenheit einer Brefeldin A, ein kleines Molekül, nicht mit Fluconazol synergize bekannt. Wildtyp Kontrolle (dunkelgrün) und Medikamenten behandelt (hellgrün) haben einen ähnlichen Unterschied im Wachstum der Synergie Vorhersage mutierten Kontrolle (dunkelblau) und Medikamenten behandelt (hellblau). (B) Wildtyp und Synergie Vorhersage Mutant gewachsen in Anwesenheit von Rifamycin, ein kleines Molekül, mit Fluconazol synergize bekannt. Wildtyp Kontrolle (dunkelgrün) und Medikamenten behandelt (hellgrün) haben eine kleinere Wachstumsdifferenz als Synergie Vorhersage mutierten Kontrolle (dunkelblau) und Medikamenten behandelt (hellblau). Der größte Unterschied ist bei 48 h für die bekannten synergistische Molekül beobachtet und der Unterschied ist vergleichbar zu diesem Zeitpunkt für das bekannte nicht synergistische Molekül. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Synergistische niedermolekularer Paare können ein mächtiges Werkzeug in der Behandlung von mikrobiellen Infektionen, doch sie haben nicht ihre volle klinische Potenzial erreicht, weil synergistische Paare schwierig zu identifizieren sind. Dieses Dokument beschreibt eine Methode zur Identifizierung von synergistischen Paare viel schneller als einfache paarweisen Kombinationen. Durch die Verwendung chemischer Genetik Datasets, identifiziert O2M Mutanten mit Gen-Knockouts, die dann als einer Anzeige auf Bildschirm große Bibliotheken von kleinen Molekülen verwendet werden können, um synergistische Paare vorherzusagen. Die Fähigkeit zur Vorhersage von kleiner Molekülen ermöglicht die hohe Skalierbarkeit der Bildschirme, die wiederum für große Identifikation synergistische Partner macht. Nach der Identifizierung synergistische Paare, kann eine Aufklärung der molekularen Mechanismus zugrunde liegenden synergistische Wechselwirkungen und dann rational design zusätzliche synergetische Paare11.

O2M erfordert ein Chemie-genetische Dataset und einem bekannten synergistische Paar. Glücklicherweise sind chemisch-Genetik-Datasets für eine Vielzahl von Mikroben19,20,21. Die braunen Lab zuvor nachweislich O2M synergistische Paare erfolgreich in C. Neoformans und E. Coli11,12finden können. Dies zeigt, dass die Breitenwirkung O2M als skalierbare Methode hat, die im großen und ganzen für eine Vielzahl von Organismen. Alle hier aufgeführten Schritte sind für das Wachstum eines anderen Mikroorganismus mit relativ ähnliche Ergebnisse, so dass O2M ein wertvolles Werkzeug für allgemeine Kennzeichnung von synergistischen Paaren änderbar. Mehrere andere Gruppen sind synergistische Kombinationen aus chemisch-Genetik-Datasets mit unterschiedlichen analytischen Methoden zu ermitteln, obwohl O2M zuletzt Programmierkenntnisse von jeder dieser Methoden erfordert. Jede Methode identifiziert verschiedene Sätze von synergistischen Antibiotika oder Antimykotika 18,22,23,24, was darauf hindeutet, dass eine große Anzahl von synergistischen Paare bleiben entdeckt zu werden. O2M und andere Synergie Prognoseverfahren sind auch potenziell für Säugetier-Systeme, einschließlich der Identifizierung von Krebs-Medikamenten-Kombinationen.

In der Summe beschreibt diese Methode eine schnelle Möglichkeit zum Bildschirm für synergistische Paare aus einem chemisch-Genetik-Dataset. Diese Methode auch anderen helfen synergistische Paare ein praktikabler Behandlungsoption in Kliniken werden. Darüber hinaus beweist O2M schnelle und verallgemeinerte Methode es ein wertvolles Instrument bei der Suche nach synergistischen niedermolekularer Paare.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Start-Zuschuss von der Abteilung für Pathologie, Universität von Utah, J.C.S.B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioscreen C instrument Growth Curves USA
Synergy H1 instrument BioTek
M9 broth reagent Amresco J863-500G
Casamino Acids reagent Fisher Scientific BP1424-500
Glucose reagent Sigma G7021-10KG
Nicotinic Acid reagent Alfa Aesar A12683
Thiamine reagent Acros Organics 148991000
CaCl2 Dihydrate reagent Fisher C79-500
MgSO4 Heptahydrate reagent Fisher M63-500
chemical-genetics dataset dataset examples include Nichols et al., Cell, 2011, Brown et al, Cell, 2014, and others cited in the text.
trimethoprim (example input drug; any can be used) reagent Fisher Scientific ICN19552701
sulfamethoxazole (example test drug; any can be used) reagent Fisher Scientific ICN15671125

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Genetik Ausgabe 135 Antibiotikaresistenz Antibiotikaresistenz Wirkstoffkombinationen Droge Synergie Hochdurchsatz-Screen Überlappung2 Methode
Hochdurchsatz-Identifizierung von synergistischen Wirkstoffkombinationen durch die Überlappung<sup>2</sup> Methode
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Wambaugh, M. A., Brown, J. C. S. High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method. J. Vis. Exp. (135), e57241, doi:10.3791/57241 (2018).

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