Summary
I denne artikel findes en metode til at isolere hjerte mesenchymale stromale celler fra endomyocardial bioptic prøver af arrhythmogenic kardiomyopati patienter. Deres karakterisering og protokollen til at øge deres adipogenic differentiering er beskrevet.
Abstract
En normal voksen hjerte er sammensat af flere forskellige celletyper, blandt hvilke hjerte mesenchymale stromale celler repræsentere en rigelige befolkning. Isolationen af disse celler giver mulighed for at studere deres inddragelse i hjerte sygdomme, og desuden giver en nyttig primære celle model for at undersøge biologiske mekanismer.
Her, er metoden til dyrkning af C-MSC fra arrhythmogenic kardiomyopati patienternes bioptic prøver beskrevet. Endomyocardial biopsi prøveudtagning er styret i områderne højre ventrikel ved siden af arret visualiseret ved electro-anatomiske kortlægning. Fordøjelsen af biopsier i collagenase og deres plating på en plastik skål dyrkningsmedium tillade C-MSC vækst er beskrevet. De isolerede celler kan udvides i kultur for flere passager. For at bekræfte deres mesenchymale fænotype, er beskrivelsen af immuno-phenotypical karakterisering fastsat. C-MSC er i stand til at differentiere i flere celletyper som adipocytter, chondrocytter og osteoblaster: i forbindelse med ACM, karakteriseret ved adipocyt indskud i patienternes hjerter, protokollerne for adipogenic differentiering af C-MSC og den karakterisering af lipid droplet ophobning er beskrevet.
Introduction
Mesenchymale stromale celler (MSC) er voksne celler med en vigtig støttende funktion i mange væv1. Knoglemarven repræsenterer den historiske kilde til MSC, men de kan isoleres fra forskellige væv, herunder moderkagen, fedtvæv, navlestrengsblod, leveren og hjertet1,2.
I 2006 angivet International Society for cellulære terapi (ISCT) for første gang, de minimale kriterier for at definere menneskelige MSC3. Især skal MSC have evnen til at overholde plast. De udtrykker specifikke overflade antigener: positivitet for CD44, CD105, CD29 og CD90 mesenchymale markører, og negativitet til CD14, CD45, CD34, CD31 hæmatopoietisk og endotel markører karakterisere MSC. På grund af den manglende udtryk for HLA-DR, MSC er ude af stand til at udløse alloreactivity. Derudover er de Multipotente celler med potentiale til at differentiere mod adipogenic, Chondrocyt og osteoblastdannelse lineages1,3.
Med fokus på hjerte cellulære sammensætning, er cardiac mesenchymale stromale celler (C-MSC) rigelige i en normal voksen hjerte4,5. De spiller en afgørende rolle både i normal hjertefunktion og patologiske betingelser. Stykke tid, fysiologisk, C-MSC giver en mikromiljø, der understøtter den strukturelle og funktionelle integritet i myokardiet, i hjertesygdomme de aktiveres som reaktion på hjerte skade deltager i sårheling og fibrotisk remodeling6 ,7.
For nylig, inddragelse af C-MSC i arrhythmogenic kardiomyopati (ACM) adipøst substitution har været demonstreret8. Især er ACM en genetisk sygdom hovedsageligt forårsaget af mutationer i desmosomal gener, der fører til Myokardie fibro-fede udskiftning, hovedsagelig i højre hjertekammer9. Denne substitution, strækker sig fra epicardium til endokardiet, opretter en ikke-ledende underlag, der fremkalder progressive hjertesvigt og forværres ventrikulære arytmier, hvilket kan føre, i svære tilfælde, til pludselig død. Sommariva et al. demonstreret mesenchymale oprindelsen af de pre adipocytter stede i ACM patienternes eksplanterede hjerte sektioner. Desuden C-MSC isoleret fra endomyocardial biopsier af ACM hjerter udtrykkelige desmosomal gener og derfor kan blive påvirket af deres mutationer. Især på adipogenic betingelser, ACM C-MSC ophobes mere lipider end dem fra kontrol hjerter. Dette beviser fører til den konklusion, at C-MSC både har en aktiv rolle i sygdom patogenese og repræsenterer en gyldig celle model til at studere ACM.
For at lette fremtidig forskning i denne sammenhæng eller i andre hjertesygdomme, som et hjerte biopsi er indiceret, præsenteres en detaljeret protokol for dyrkning af C-MSC fra små fragmenter af endomyocardial væv, deres ekspansion, deres immuno-phenotypical karakterisering og adipogenic differentiering.
Protocol
Denne tilgang er i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen og indsamling af højre ventrikel prøver blev godkendt (07-06-2012) ved "Centro Cardiologico Monzino IRCCS" etisk komité.
1. løsninger
- Gøre TMES medium for C-MSC kultur med Iscoves modificerede Dulbecco Medium (IMDM), suppleret med 20% føtal bovin Serum (FBS), 10 ng/mL basic fibroblast vækstfaktor, 10.000 U/mL Penicillin, 10.000 µg/mL Streptomycin og 0,02 M L-glutamin. Filtrer TMES medium ved hjælp af et 0,22 µm sterile filterenhed, og opbevares ved 4 ° C.
- For at forberede collagenase løsning, resuspend collagenase NB4 mix i IMDM medium til at opnå en endelig løsning med en koncentration af 3 mg/mL. Vortex forsigtigt at pulveret opløses, og filtrere collagenase løsning ved hjælp af en 0,2 µm sprøjte filter. Alikvot 1 mL volumen til 2 mL sterilt rør og opbevares ved-20 ° C indtil behov for brug.
- At forberede T. ADIPO medium, gøre adipogenic medium med IMDM medium suppleret med 10% FBS, 0,5 mM 3-isobutylacetophenon-1-Methylxanthin (forud fortyndet i dimethylsulfoxid (DMSO) ved en koncentration på 0,5 M og opbevares ved-20 ° C indtil brug), 1 µM hydrocortison (forud fortyndet i DMSO på 100 mM og yderligere fortyndet 10 mm i sterilt destilleret vand og opbevares ved-20 ° C indtil brug) og 0,1 mM indometacin (forud fortyndet i DMSO i en koncentration på 0,5 M og opbevares ved-20 ° C indtil brug). Filtrerer de T. ADIPO medium ved hjælp af et 0,22 µm sterile filterenhed og opbevares ved 4 ° C.
- Forberede vask buffer bestående af phosphat bufferet saltvand 0.0067 M PO4 (PBS), ethylendiamin tetra eddikesyre (EDTA) 5 mM, og 5% bovint serumalbumin og opbevares ved 4 ° C.
- Forberede olie røde O (ORO) arbejdsgruppe løsning ved at opløse 1% ORO pulver i 60% isopropanol, blande for 2 h og filtrering ved hjælp af et 0,22 µm filterenhed fjerne bundfald. Gemme brugsopløsning ved stuetemperatur (RT).
2. isolering af Cardiac mesenchymale stromale celler
-
Hjerte biopsi indsamling og behandling
Bemærk: før du starter, Sørg for at have collagenase løsning og TMES medium klar.- Sætte ACM endomyocardial biopsi (normalt omkring 5 mg af væv) i sterile rør fyldt med TMES og transportere det til laboratoriet.
Bemærk: ACM biopsier er indsamlet i operationsstuen Elektrofysiologi ifølge tidligere rapporter10. Kort, integration af electro-anatomiske kortlægning og intracardiac ekkokardiografi i højre hjertekammer (Se Video 1) bruges til at guide endomyocardial biopsi (Se Video 2, fluoroskopi) i korrespondance til grænseområdet for det syge myokardiet. Sund kontrol (HC) prøver er leveret af en væv bio-bank, fremstillet af den højre ventrikel gratis mur af dødt donorer inden for 24 timer af død (hændelig død, raske forsøgspersoner). Under transport og før dissektion, gemme biopsi i TMES ved 4 ° C. Begræns tid mellem biopsi samling og væv forarbejdning (max 24 h). - Oprettet den biologiske sikkerhed kabinet med krævede løsninger til at udføre proceduren indtil den enzymatiske fordøjelsen.
- Sætte sterilizer under kølerhjelmen og tænde instrumentet 15 min før brug, indtil temperaturen stiger 200-250 ° C.
- Sterilisere saks og pincet til 10 s. Make sure steriliserede instrumenter er koldt før brug. Forberede engangs sterile skalpeller.
- Sted rør med biopsi i sterile hætten. Åbn tuben og overføre biopsi i en steril plade.
- Vask højre hjertekammer biopsi to gange med 3 mL steril PBS. Hvis du vil tage et billede af biopsi på mikroskopet.
- Overføre højre hjertekammer biopsi, ved hjælp af steril pincet, ind i en steril 2 mL rør indeholdende 1 mL af opløsningen, collagenase.
- Skær prøven i 0,5 - 1 mm3 stykker med steril saks.
- Inkuber i 1,5 timer ved 37 ° C under kontinuerlig roterende agitation.
- Den fordøjede opløsning på 400 x g i 10 min. ved RT. der centrifugeres
- Fjern supernatanten og tilsæt 1 mL steril PBS til at vaske pelleten.
- Der centrifugeres ved 400 x g i 10 min. ved RT.
- Fjern supernatanten og resuspenderes i 1 mL af TMES medium.
- Plade opnåede suspension på sterile 60-mm vævskultur behandlet tallerken og tilføje TMES medium til den endelige mængden af 3 mL. Inkuber plade i en celle kultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
Bemærk: En større mængde af medium kan forhindre den korrekte vedhæftning af et fordøjet biopsi fragmenter. - Efter 24 h, kassere medium for at fjerne ikke-tilhænger celler og debris.
Bemærk: Enkelt dissocierede mesenchymale celler kan vedhæfte til plast overfladen og giver anledning til kloner; også, ufordøjet små biopsi fragmenter kan vedhæfte til fadet, plast og tillade celle spiring. - Vaske plade to gange med 5 mL steril PBS, og tilsættes 3 mL frisk TMES medium.
- Udskift TMES medium, tre gange om ugen indtil cellerne er 80% sammenflydende.
Bemærk: Antallet af tilknyttede celler afhænger af kvaliteten, mængden af væv, og effektiviteten i fordøjelsen.
- Sætte ACM endomyocardial biopsi (normalt omkring 5 mg af væv) i sterile rør fyldt med TMES og transportere det til laboratoriet.
3. celle ekspansion
Bemærk: Sørg for at have TMES medium klar før du starter.
- Når cellerne er 80% sammenflydende, overførsel fordøjet lille bioptic prøverne i en ny steril 60-mm vævskultur behandlet plade, og tilsættes 3 mL frisk TMES medium.
Bemærk: Bioptic prøverne kan genanvendes til yderligere C-MSC isolation. Det er muligt at gentage denne procedure, indtil der er et betydeligt antal isolerede celler. - Vedlagte cellerne vaskes to gange med 3 mL steril PBS. Tilføje trypsin-EDTA-oploesning (0,5 mL for en 60-mm parabol), og der inkuberes ved 37 ° C i 3-5 min at tillader celle detachement.
- Når cellerne er løsrevet fra overfladen af pladen, tilføje 0,5 mL sterilt FBS til at inaktivere trypsin og indsamle celler ind i en ny 50 mL sterilt rør.
- Vask plade to gange med 5 mL steril PBS til at tilføje de resterende celler at det samme rør.
- Centrifugeres celler ved 400 x g i 10 min. ved RT.
- Fjern supernatanten og resuspenderes i 1 mL af TMES medium.
- Indlæse 10 µL af cellesuspension i cellen tælle kammer.
Bemærk: Hvis cellerne er for koncentreret, fortyndes den indledende suspension 1:10 i PBS og indlæse 10 µL af de fortyndede celler i cellen tælle kammer. - Under mikroskopet, tælle celler i 3 store pladser og på linjerne i to af deres sider og beregne det gennemsnitlige antal celler.
Bemærk: For at opnå antallet af celler/mL, gennemsnitlige optalte celler skal ganges med 104, fortyndingsfaktoren af cellen tælle kammer. Hvis cellerne har været fortyndes yderligere, multiplicere for fortyndingsfaktoren. Forholdet mellem celle nummer hen til sæd og celle koncentration (antallet af celler/mL) svarer til volumen (i milliliter) af indledende suspension til blive forgyldt for de næste skridt (punkt 3.9). - Plade ophvirvling til sterile 100-mm vævskultur behandlet plader i en endelig koncentration på 5.000-10.000 celler/cm2 og tilføje TMES medium til den endelige mængden af 8 mL. Inkuber plade i en celle kultur inkubator.
Bemærk: Gentag proceduren celle ekspansion, når cellerne er 70-80% sammenflydende. På hver passage (P) anbefales det at cryopreserve en del af celler og plade det resterende beløb. Udvid cellerne indtil P3 eller P4 og brug for fluorescerende-aktiveret celle sidesorteringen (FACS) analyse (afsnit 4) og adipogenic differentiering (afsnit 5). - For kryopræservering efter udstationering, centrifugeres celler ved 400 x g i 10 min. ved RT.
- Tælle celler som beskrevet (trin 3,7-3,8) og resuspend 1 x 106 celler i 900 µL sterilt FBS. Overføres til en steril cryo-hætteglas og tilsæt 100 µL i sterile DMSO og mix.
- Hurtigt gemme cryo-hætteglassene i en indefrysning beholder ved-80 ° C i mindst 2 dage og derefter overføre hætteglassene til flydende kvælstof.
4. Karakteristik af Cardiac mesenchymale stromale celler ved flowcytometri
Bemærk: Før du starter, Sørg for at have cellen dissociation reagens, vask buffer, og de specifikke antistoffer forberedt.
- Når celle nummer når mindst 3 x 10 vaske6 (tæller cellerne som beskrevet i 3,7-3,8), 100-mm plade to gange med 10 mL steril PBS.
- Der tilsættes 5 mL af en celle dissociation reagens og vente 7-10 min på RT for at tillade celle detachement.
- Når cellerne er løsrevet fra overfladen af pladen, der tilsættes 15 mL sterilt vask buffer og indsamle suspension i en ny 50 mL sterilt tube.
- Vaske plade to gange med 10 mL af vask buffer og tilføje de resterende celler at det samme rør.
- Centrifugeres celler ved 400 x g i 10 min. ved RT og resuspenderes i 1 mL vask buffer.
- Tæller cellerne som beskrevet (trin 3,7-3,8), og overføre 3 x 106 celler ind i en ny steril rør og tilføje vask buffer til den endelige mængden af 1,5 mL.
Bemærk: Cellen total antal og den samlede importmængde af vask buffer afhænger af antallet af udvalgte markører, der anvendes til analyse (3 x 105 celler i 100 µL for hver FACS polystyren tube). - Distribuere 100 µL af cellulære suspension i 12 forskellige FACS polystyren rør, og Tilføj det specifikke antistof på koncentration i produktet dataark.
Bemærk: Antistoffer bruges for C-MSC karakterisering er CD34, CD105, CD45, CD29, CD90, CD44, CD31, CD14 og HLA-DR (tabel 1). Det er vigtigt at forberede en stikprøve bestående af 100 µL af resuspenderede celler farves med isotype kontrol til at kontrollere specificiteten af signalet. - Inkuber prøver i 15 min. i mørke.
- Der tilsættes 1 mL sterilt vask buffer til hver tube til reaktionen standses.
- Centrifugeres celler ved 400 x g i 10 min. ved RT.
- Fjern supernatanten og resuspenderes i 250 µL af vask buffer.
- Gå til C-MSC karakterisering med flowcytometri.
5. Adipogenic differentiering af Cardiac mesenchymale stromale celler
Bemærk: Før du starter, Sørg for at have forberedt T. ADIPO medium og ORO brugsopløsning.
-
Kultur i T. ADIPO medium
- Frigør og tælle cellerne, som beskrevet i afsnit 3.
- Plade 3 x 105 celler på hvert hul i en steril 6-godt vævskultur behandlet plade i 2 mL af T. ADIPO medium.
- Lad C-MSC differentiere i T. ADIPO medium i 72 timer eller 1 uge, skiftende medium hver 2-3 dage.
-
Olie røde O farvning
Bemærk: brug olie røde O (ORO) farvning for at teste lipid ophobning i C-MSC.- Placer 6-godt vævskultur plateunder i stinkskab.
- Fjerne adipogenic medium og cellerne vaskes to gange med 2 mL PBS.
- Tilføje nok mængden af 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) til at dække hver godt. Fix celler i 5 min på RT.
- Kassér PFA og cellerne vaskes to gange med 2 mL PBS.
- Inkuber de faste celler med ORO brugsopløsning i 1 time på RT, bruger nok volumen til at dække hver godt.
Bemærk: Opbevar ikke 6-godt vævskultur plade under stinkskab under ORO inkubation at undgå fordampning af ORO brugsopløsning. - Fjerne alle ORO brugsopløsning og vask med 2 mL PBS 3 - 5 gange, indtil pladen er helt renset; Kassér vasker. Stop vasker, når PBS bruges er klar, og når du ikke kan se, under mikroskop, uspecifik farvning af celler.
- Tage 20 billeder i 20 X forstørrelse til hver brønd ved hjælp af det inverterede vævskultur fase-kontrast mikroskop.
- Åbne billeder med billede behandlingsprogram til at kvantificere celle ORO ophobning.
- Adskille de forskellige farvekanaler via funktionen "opdele kanaler" for at kvantificere kun luminans i 255-rød kanal.
- Tæl antallet af celler for hvert billede ved at tælle kerner. Normalisere ORO signal intensitet på celle nummer.
- Beregne gennemsnittet af resultaterne for hvert billede af den samme prøve.
Representative Results
Hjerte stromale celler isolation: C-MSC isolation fra endomyocardial biopsier procedure er sammenfattet i figur 1.
Hjerte stromale celler mesenchymale karakterisering: Som fastlagt af det internationale samfund for cellulære terapi (ISCT), omfatter minimal kriterierne for Multipotente mesenchymale stromale celler deres immuno-fænotypiske karakterisering3. Især for at bekræfte deres mesenchymale afstamning, er celler inkuberes med passende FITC/PE/APC-konjugerede antistoffer og analyseret ved flowcytometri. Alle af antistofferne anvendes i C-MSC karakterisering er angivet i Tabel af materialer.
Som illustreret i figur 2, er C-MSC fremstillet af biopsier positive for de specifikke mesenchymale overflade antigener CD29, CD44 og CD105. Procentdelen af CD90 positive celler er variabel, som rapporteret tidligere11. I endothelial (CD31, CD34), monocyt/makrofag (CD14), hæmatopoietisk (CD45) markører og store histocompatibility komplekse (HLA-DR) er ikke udtrykt (figur 2).
Hjerte mesenchymale stromale celler adipogenic differentiering: For at bede deres adipogenic differentiering, C-MSC fremstillet af patienter, der lider af ACM og HC skal være kulturperler i T. ADIPO medium (Se løsninger afsnit). Cellerne er fastholdt i kultur for 72 h eller 1 uge, erstatte mediet to gange om ugen.
Ophobning af intracellulære lipid dråber fremgår af ORO farvning (figur 3). Forskelle i evnen samt graden af differentiering, kan konstateres mellem cellerne opnået fra ACM og HC. Som vist i de repræsentative billeder, ophobes ACM C-MSC flere lipid dråber end HC C-MSC efter 72 h af kultur i adipogenic medium (figur 3). Disse forskelle er opretholdt også når cellerne er udsat for adipogenic differentiering betingelser for en længere periode (1 uge) (figur 3).
Video 1: Integration af electroanatomical kort og intracardiac ekkokardiografi. Endokardial unipolære electroanatomical kort i højre hjertekammer (venstre forreste skrå og lige forreste skrå visninger) hos en patient, der gennemgår endomyocardial biopsi (nederste del). Afgrænsede områder af lav spænding (rød/grøn) er synlig på apex. Endomyocardial bioptic prøver (markeret som cirkel) er indsamlet i korrespondance til den syge myokardiet og den interventrikulært septum. Real-time intracardiac ekkokardiografi kan kontrollere den korrekte position af bioptome på målområdet (øverste panel). Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Video 2: fluoroskopi video i højre forreste skrå Se. Bioptome er indsat gennem en lang-deflectable kappe og rykkede ind i ventriklen. Efter en omhyggelig kontrol af bioptome kontakt med myokardiet, er kæberne åbnet og derefter fast lukket for at indsamle prøven. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Figur 1: Procedure udkast. Endomyocardial bioptic prøven indsamles ved hjælp af et bioptome kateter, en lille pincer-formet skæring instrument. Vægten af den opnåede biopsi er ca 5 mg (A). Endomyocardial bioptic prøven er hakket i 0,5 - 1 mm3 fragmenter, med steril saks (B), og collagenase løsning er tilføjet. Prøven anbringes i et 37 ° C inkubator på en roterende platform mixer til 1,5 time med fordøjelsen (C). Den fordøjede opløsning centrifugeres og forgyldt i TMES i en plastik skål (D). C-MSC er opnået takket være deres overholdelse af plast egenskaber enten i enkelte celler eller kloner eller spiring fra små ufordøjet bioptic fragmenter (E). C-MSC er så karakteriseret ved flowcytometri (F). C-MSC er belagt i adipogenic medium og lipid droplet ophobning er testet af olie røde O farvning (G). Skalaen angiver 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative cyto-fluorimetri profil af C-MSC. Hver histogrammet viser celletal vs intensiteten af fluorescens i den angivne kanal (PE: phycoerythrin; APC: allophycocyanin; FITC: fluorescein-isothyocyanate). I hver graf isotype kontrol (hvid) og en prøve konjugeret med cellen specifikke overflade markør antistof (rød) er vist. C-MSC er positive for de mesenchymale overflade antigener CD29, CD44, CD105 og delvist, CD90, mens de ikke udtryk CD31, CD34, CD14, CD45 og HLA-DR. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Adipogenic differentiering af C-MSC. Repræsentative billeder af ACM og HC C-MSC, kulturperler i adipogenic medium for 72 h og 1 uge, farves med ORO (venstre billeder; n = 3). I de rigtige grafer, kvantificering af luminans 255-rød kanal farvning er rapporteret: intensiteten udtrykkes i arbitrære enheder (A.U.). ACM C-MSC akkumulere flere lipid dråber end kontrol. Student's T-test anvendtes, *: p < 0,05. Skalaen angiver 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
MSC og C-MSC: MSC er Multipotente celler bosiddende i de stromale brøkdel af forskellige voksen væv, såsom knoglemarv, fedtvæv, brusk, hjerne, hud, føtal bilagene og hjertet12. Forskellige undersøgelser har været udført for at isolere og karakteriserer dem for potentielle anvendelser i grundlæggende og Translationel forskning12,13.
I sund betingelser, MSC er inaktiv, selvstændig fornyelse på lave priser14. Da de er udsat for miljømæssige patologiske ændringer, reagerer de fremme væv remodellering gennem direkte transdifferentiation, matrix deposition eller paracrine virkning14.
Den kardiale MSC (C-MSC) repræsenterer en stor ikke-myocyte celle population af hjertet4. De stammer fra epicardium og overflytte i myokardiet gennemgår processen med epitelial til mesenchymale overgang15. De bidrager til den mekaniske og elektriske integritet af hjertets struktur, både i fysiologiske og patologiske stater, gennem interaktioner med cardiomyocytes og ekstracellulære matrix homøostase7,16. Men de brede vifte af C-MSC funktioner er stadig ikke helt forstået. Et dybere kendskab til deres rolle, både i fysiologiske og patologiske betingelser kan lettes ved in vitro- undersøgelser udført efter deres isolation.
C-MSC er opnået fra forskellige distrikter af det menneskelige hjerte, som atrial vedhæng2,17 og højre hjertekammer18.
For nylig, C-MSC fra menneskelige højre ventrikel endomyocardial bioptic prøver har opnået8, at kilde-væv kan være så lidt som 3-5 mg.
Mulige anvendelser: Metoden beskrevet i dette håndskrift giver mulighed for at opnå celler med få simple passager, som fordøjelse og udvalg for overholdelse af plast, fra meget små hjerte prøver.
C-MSC kan betragtes en celle model, da de er nemme at forstærke og vedligeholde i in vitro, og er i stand til at differentiere sig til celler af mesenchymale lineage (endotel, osteocytes og adipocytter). Desuden udgør muligheden for at opnå celler direkte fra patienter en stor in vitro- værktøj til Mekanistiske undersøgelser i forbindelse med personlig/præcision medicin. Ja, disse celler bære den genetiske baggrund og til sidst specifikke mutationer af donorerne, og er påvirket af den specifikke patienters karakteristika, som kliniske tilstande, alder, køn, livsstil og medicin. Desuden kan mulighed for at sortere dem for forskellige markører tillade undersøgelse af specifikke C-MSC delmængder19.
C-MSC er kendt for at være aktive spillere i forskellige hjerte-kar-sygdomme, for det meste karakteriseret ved negative remodellering af hjertet. De repræsenterer derfor kandidat mål for nye terapeutiske strategier til at modvirke hjertesygdomme8,20.
C-MSC stilk-lignende egenskaber og deres mangel på betydelig immunogenicitet antyder deres potentielle anvendelse i celleterapi for kardiale regenerativ medicin. Faktisk, ligesom MSC fra knoglemarven eller andre kilder, C-MSC kunne potentielt anvendes både autolog og allogen indstillinger, uden behov for matchning mellem donor og recipient21.
Desuden har C-MSC, isoleret direkte fra hjertet væv, fordelen at være klargjort af hjerte mikro-miljø og epigenetiske profil. I forbindelse med hjertets regenerativ medicin, kunne dette være særlig vigtigt at opnå vellykkede resultater.
Til dato har identificeret prækliniske undersøgelser af regenerativ medicin nyttigt terapeutiske potentiale i C-MSC og deres paracrine aktivitet18,22,23. Vigtigere, er kliniske forsøg, hvor cellen kilde er hjertet undervejs med cardiosfere-afledte celler eller delpopulationer af C-MSC13,24,25. Med hensyn til knogle-marv-afledte MSC, kan det være nødvendigt at få kliniske grade C-MSC26med forskellige protokoller.
C-MSC i ACM: Præsenteres protokollen er mest egnet til undersøgelse af patologier som en endokardial biopsi er indiceret. ACM patienter undergår bioptic procedurer til diagnosticeringsformål27. Deres myokardiet er gradvist erstattet med arvæv, en elektrisk inert væv består af adipocytter og fibrose. For at vejlede bioptic prøveudtagning til området ar, hvor det diagnostiske udbytte er maksimal, er endomyocardial mapping brugt10,28,29. De prøver, der indgår i denne protokol er taget i grænseområdet af syge myokardiet.
Sommariva et al. har for nylig defineret en central rolle i C-MSC i patogenesen af ACM8, viser, at C-MSC aktive spillere i ACM hjertet adipogenesis, da preadipocytes i disse hjerter er af mesenchymale oprindelse. Desuden isoleret C-MSC med den nuværende protokol fra ACM patienternes biopsier viste flere tilbøjelighed til både lipid ophobning og adipogenesis end kontrol. Derfor, kan disse celler bruges til at bekræfte nogle af de molekylære mekanismer af ACM, bevise deres egnethed som celle model for Mekanistiske undersøgelser9.
Begrænsninger, og kritiske trin: Trods fordelene ved at opnå C-MSC direkte fra patienter (Se afsnittet "Mulige applikationer"), er denne protokol underkastes forskellige begrænsninger.
Først og fremmest den kardiale bioptic procedure er invasiv og ofte undgås hvis ikke strengt nødvendigt. Faktisk, prøveudtagning hjerte væv er både etisk og teknisk problematisk. Grunde til at udføre en hjerte biopsi kan være opnåelse af en konkret diagnose i forbindelse med cardiomyopatier differential diagnosticering, overvågning af status for kardiale transplantationer, eller fastslå tilstedeværelsen af et hjerte tumor30. Derfor kan kun patienter som en endomyocardial biopsi er indiceret ved konsensus erklæring31 være tilmeldt til forskning på C-MSC. Desuden kan den kardiale bioptic procedure har kliniske komplikationer, først og fremmest i cardiomyopathic hjerter. Derfor electrophysiologist's prøveudtagninger er altid forsigtige og bioptic prøver kan være meget små, gå på kompromis med isolering af celler. Fremtidige eksperimenter kunne overvinde dette problem af tuning collagenase koncentration eller timing af fordøjelsen.
C-MSC, viser som alle primære menneskelige celler, en stor variation blandt forskellige emner i alle fænotyper. Celler fra forskellige fag er faktisk ikke kun genetisk forskellige, men også underkastet variable miljømæssige konditionering. Specifikt, inden for dette eksperiment, er en høj variabilitet i isolation, vækst og adipogenic Celledifferentiering observeret.
Kritiske trin i denne protokol skal anerkendes. Hvis bioptic prøven indeholder kapillærer, skal de fjernes for at undgå den parallelle isolation i endothelial celler, som kan forurene C-MSC kultur, og kan dokumenteres ved FACS-analyse (positivitet for CD31). For at opnå en effektiv adipogenic differentiering, skal celler være i en aktiv vækstfase. Graden af sammenløbet kan også påvirke lipid ophobning.
Betydningen af metoden: Forhold til tidligere metoder til isolering af mesenchymale stromale celler er dette første gang hvor beskrivelsen af C-MSC byggetilladelse direkte fra menneskelige ventrikulær bioptic prøver foreslås det i detaljer. Selvom denne metode er foreslået til behandling af ACM patientprøver, er det potentielt gælder for alle patienter som en hjerte biopsi er indiceret.
Denne protokol udgør en nyttig gennemførelsen af tidligere metoder til opnåelse af celler, der kræves større hjerte prøver32, der ofte er vanskeligt at indsamle.
Derudover udgør eksempelkilden en interessant nyhed. Mens den ventrikulære biopsi udføres normalt på septum33, tager denne protokol konto prøver fra højre ventrikel gratis væggen. Celler, der stammer fra bydelen syge højre ventrikel kan være mere repræsentativ for den patologiske status for sygdomme der involverer RV.
Desuden, er nogle af de reagenser, der anvendes i denne protokol forskellige med hensyn til anden Christensen-MSC-isolation og differentiering metoder-32. For eksempel, type af collagenase foreslået i dette håndskrift er en blanding af klasse I og klasse II collagenases med et afbalanceret forhold af proteolytiske aktiviteter. Derudover er fordøjelsen løsning sammensat af collagenase mix opløst i samme basal medium (IMDM) anvendes til fremstilling af C-MSC næringssubstrat, så isolerede C-MSC til at tilpasse sig fremtidige vækstbetingelser.
Derudover om sortering procedurer kunne standardisere celle parti, ved hjælp af befolkningens hele C-MSC isoleret kun via egenskaben plast overholdelse af disse celler, udgør en forenkling uden at ændre immunophenotypic Karakteristik af C-MSC. Sammensætningen af T. ADIPO, der foreslås i dette håndskrift er i stand til at føre til adipogenic differentiering, undgå den metaboliske dysregulering induceret af andre komponenter såsom insulin.
Desuden, den foreslåede metode af lipid ophobning kvantificering, som er baseret på en evaluering af de ORO kolorimetriske intensitet, indeholder flere oplysninger om mængden af de akkumulerede lipider, hvis sammenlignet med metoder baseret kun på procentdelen af celler positivt at de ORO farvning. Ofte lipid ophobning er kvantificeret ved at udtrække ORO indarbejdet af celler med isopropanol og måle sin absorbans. Men denne metode kræver flere passager og udsættes for en variation på grund af isopropanol fordampning.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af italienske sundhedsministerium, Ricerca Corrente til Centro Cardiologico Monzino-IRCCS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Gibco by Life Technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN | Life Technologies Italia | 15140122 | |
| Collagenase NB4 | Serva | 17454.02 | |
| Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B | |
| L-glutammine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Tryple select 1X (cell dissociation reagent) | Gibco | 12563029 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T6689 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Paraformaldehyde (PFA) Solution 4% in PBS | D.b.a. Italia S.r.l. | sc-281692 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Antibody CD14-FITC (MφP9) | Becton Dickinson | 345784 | |
| Antibody Integrin β1 (CD29)-PE (clone MAR4) | Becton Dickinson | 561795 | |
| Antibody PECAM-1 (CD31)- APC (clone 9G11) | R&D Systems | FAB3567A | |
| Antibody Hematopoietic progenitor cell antigen (CD34)-APC (clone 581) | Thermo Fisher Scientific | CD34-581-05 | |
| Antibody H-CAM (CD44)-PE (clone G44-26) | Becton Dickinson | 561858 | |
| Antibody L-CA (CD45)-APC (clone HI30) | Thermo Fisher Scientific | MHCD4505-4 | |
| Antibody THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10) | Becton Dickinson | 561969 | |
| Antibody Endoglin (CD105)-APC (clone 266) | Becton Dickinson | 562408 | |
| Antibody HLA-DR-FITC (clone L243) | Becton Dickinson | 347400 |
|
| Gima Quick Plus sterilizer | Gima | 35642 | |
| Bench centrifuge Sigma 3-16K | Sigma Centrifuges | 10330 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| AxioVert 200M microscope | Zeiss | B 40-080 e 03/01 | |
| FACS Gallios | Beckman Coulter | 773231AF | |
| ImageJ (image processing program) | NIH | ||
| Stericup filter units | Merck S.P.A. | SCGPU05RE | |
| Conical Tubes, 50 mL | Eppendorf | 30122178 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Eppendorf | 30122151 | |
| Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
| 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 60 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430166 | |
| 6 well TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3516 | |
| Polystyrene Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Falcon | 352058 | |
| BRAND counting chamber BLAUBRAND Bürker-Türk | Sigma-Aldrich | BR719520 |
References
- Brooke, G., et al. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells. Semin Cell Dev Biol. 18 (6), 846-858 (2007).
- Rossini, A., et al. Human cardiac and bone marrow stromal cells exhibit distinctive properties related to their origin. Cardiovasc Res. 89 (3), 650-660 (2010).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Doppler, S. A., et al. Cardiac fibroblasts: more than mechanical support. J Thorac Dis. 9, Suppl 1 36-51 (2017).
- Moore-Morris, T., Guimaraes-Camboa, N., Yutzey, K. E., Puceat, M., Evans, S. M. Cardiac fibroblasts: from development to heart failure. J Mol Med (Berl). 93 (8), 823-830 (2015).
- Jugdutt, B. I. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108 (11), 1395-1403 (2003).
- Brown, R. D., Ambler, S. K., Mitchell, M. D., Long, C. S. The cardiac fibroblast: therapeutic target in myocardial remodeling and failure. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 45, 657-687 (2005).
- Sommariva, E., et al. Cardiac mesenchymal stromal cells are a source of adipocytes in arrhythmogenic cardiomyopathy. Eur Heart J. 37 (23), 1835-1846 (2016).
- Sommariva, E., Stadiotti, I., Perrucci, G. L., Tondo, C., Pompilio, G. Cell models of arrhythmogenic cardiomyopathy: advances and opportunities. Dis Model Mech. 10 (7), 823-835 (2017).
- Casella, M., et al. Electroanatomical mapping systems and intracardiac echo integration for guided endomyocardial biopsy. Expert Rev Med Devices. 14 (8), 609-619 (2017).
- Beltrami, A. P., et al. Multipotent cells can be generated in vitro from several adult human organs (heart, liver, and bone marrow). Blood. 110 (9), 3438-3446 (2007).
- da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P. C., Nardi, N. B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119, Pt 11 2204-2213 (2006).
- Cencioni, C., et al. The double life of cardiac mesenchymal cells: Epimetabolic sensors and therapeutic assets for heart regeneration. Pharmacol Ther. 171, 43-55 (2017).
- Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
- Germani, A., Foglio, E., Capogrossi, M. C., Russo, M. A., Limana, F. Generation of cardiac progenitor cells through epicardial to mesenchymal transition. J Mol Med (Berl). 93 (7), 735-748 (2015).
- Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A.
- Di Maggio, S., et al. Non-oxidizable HMGB1 induces cardiac fibroblasts migration via CXCR4 in a CXCL12-independent manner and worsens tissue remodeling after myocardial infarction. Biochim Biophys Acta. , (2017).
- Czapla, J., et al. Human Cardiac Mesenchymal Stromal Cells with CD105+CD34- Phenotype Enhance the Function of Post-Infarction Heart in Mice. PLoS One. 11 (7), 0158745 (2016).
- Gambini, E., et al. C-kit+ cardiac progenitors exhibit mesenchymal markers and preferential cardiovascular commitment. Cardiovasc Res. 89 (2), 362-373 (2010).
- Gourdie, R. G., Dimmeler, S., Kohl, P. Novel therapeutic strategies targeting fibroblasts and fibrosis in heart disease. Nat Rev Drug Discov. 15 (9), 620-638 (2016).
- Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 31 (10), 890-896 (2003).
- Detert, S., et al. The Atrial Appendage as a Suitable Source to Generate Cardiac-derived Adherent Proliferating Cells for Regenerative Cell-based Therapies. J Tissue Eng Regen Med. , (2017).
- Miteva, K., et al. Human cardiac-derived adherent proliferating cells reduce murine acute Coxsackievirus B3-induced myocarditis. PLoS One. 6 (12), 28513 (2011).
- Bassetti, B., Capogrossi, M. C., Pompilio, G. Power Is Nothing Without Control: The Enduring Search for the Best Cell in Cardiac Cell Therapy at a Crossroads. Circ Res. 119 (9), 988-991 (2016).
- Nigro, P., et al. Cell therapy for heart disease after 15 years: Unmet expectations. Pharmacol Res. , (2017).
- Ikebe, C., Suzuki, K. Mesenchymal stem cells for regenerative therapy: optimization of cell preparation protocols. Biomed Res Int. 2014, 951512 (2014).
- Marcus, F. I., et al. Diagnosis of arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy/dysplasia: proposed modification of the task force criteria. Circulation. 121 (13), 1533-1541 (2010).
- Pieroni, M., et al. High prevalence of myocarditis mimicking arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy differential diagnosis by electroanatomic mapping-guided endomyocardial biopsy. J Am Coll Cardiol. 53 (8), 681-689 (2009).
- Casella, M., et al. Feasibility of combined unipolar and bipolar voltage maps to improve sensitivity of endomyocardial biopsy. Circ Arrhythm Electrophysiol. 8 (3), 625-632 (2015).
- Cooper, L. T., et al. The role of endomyocardial biopsy in the management of cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association, the American College of Cardiology, and the European Society of Cardiology Endorsed by the Heart Failure Society of America and the Heart Failure Association of the European Society of Cardiology. Eur Heart J. 28 (24), 3076-3093 (2007).
- Leone, O., et al. 2011 consensus statement on endomyocardial biopsy from the Association for European Cardiovascular Pathology and the Society for Cardiovascular Pathology. Cardiovasc Pathol. 21 (4), 245-274 (2011).
- Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circ Res. 121 (2), 113-124 (2017).
- From, A. M., Maleszewski, J. J., Rihal, C. S.
