Summary
In diesem Artikel wird eine Methode zur Isolierung mesenchymaler Stromazellen Herzzellen von Endomyocardial bioptischen Proben von Arrhythmogenic Kardiomyopathie Patienten bereitgestellt. Deren Charakterisierung und das Protokoll zum steigern Sie ihre adipogenen Differenzierung werden beschrieben.
Abstract
Ein normales Erwachsenen Herz besteht aus mehreren verschiedenen Zelltypen, unter denen Herzmuskelzellen mesenchymale Stromazellen eine reiche Bevölkerung darstellen. Die Isolation dieser Zellen bietet die Möglichkeit, ihre Beteiligung an Herzkrankheiten zu studieren und darüber hinaus eine nützliche Primärzelle Modell um biologische Mechanismen zu untersuchen.
Hier wird die Methode für die Isolierung von C-MSC von bioptischen Proben Arrhythmogenic Kardiomyopathie Patienten beschrieben. Endomyocardial Biopsie Probenahme ist in den rechtsventrikuläre an der Narbe durch Elektro-anatomischen Mapping visualisiert angrenzenden Gebieten geführt. Die Verdauung von Biopsien in Kollagenase und ihre Beschichtung auf einer Plastikschale in Kulturmedium C-MSC Wachstum ermöglichen wird beschrieben. Die isolierten Zellen können in der Kultur für mehrere Passagen erweitert werden. Um ihre mesenchymalen Phänotyp zu bestätigen, ist die Beschreibung der Immuno-phänotypischen Charakterisierung bereitgestellt. C-MSC sind in der Lage, sich in verschiedene Zelltypen wie Adipozyten, Chondrozyten und Osteoblasten differenzieren: im Rahmen der ACM, gekennzeichnet durch Adipocyte Ablagerungen im Herzen von Patienten, die Protokolle für die adipogenen Differenzierung von C-MSC und die Charakterisierung von Lipid Droplet Ansammlung werden beschrieben.
Introduction
Mesenchymaler Stromazellen Zellen (MSC) sind adulte Zellen mit eine wichtige unterstützende Funktion in vielen Geweben1. Knochenmark stellt die historische Quelle von MSC, aber sie können aus verschiedenen Geweben einschließlich Plazenta, Fettgewebe, Nabelschnurblut, Leber und Herz1,2isoliert werden.
Im Jahr 2006 der internationalen Gesellschaft für zelluläre Therapie (ISCT) angegeben, zum ersten Mal die minimalen Kriterien, um menschliche MSC3definieren. Insbesondere muss MSC Kunststoff einhalten können. Spezifische Oberfläche Antigene ausdrücken: die Positivität CD31 hämatopoetischen und endotheliale Marker kennzeichnen für CD44, CD105 und CD29 CD90 mesenchymalen Marker und die Negativität für CD14, CD45, CD34, MSC. Aufgrund der fehlenden Ausdruck der HLA-DR MSC können Alloreactivity auslösen. Darüber hinaus sind sie multipotente Zellen mit dem Potential, in Richtung adipogenen, Knorpelzelltransplantation und Osteoblasten Linien1,3zu unterscheiden.
Fokussierung auf die kardiale zelluläre Zusammensetzung, sind mesenchymale Stromazellen Herzmuskelzellen (C-MSC) reichlich in einer normalen Erwachsenen Herzen4,5. Sie spielen eine entscheidende Rolle sowohl in der normalen Herzfunktion und pathologischen Bedingungen. Weile, physiologisch, C-MSC bieten eine Mikroumgebung, die die strukturelle und funktionelle Integrität der Herzmuskel unterstützt, bei Herzkrankheiten werden sie aktiviert in Reaktion auf eine Verletzung der Herzen an der Wundheilung und fibrotische Umbau6 ,7.
Die Einbeziehung der C-MSC Arrhythmogenic Kardiomyopathie (ACM) adipösen Ersatz neuerdings gezeigt8. ACM ist insbesondere eine genetische Erkrankung, die im Wesentlichen verursacht durch Mutationen in Desmosomal Genen, die zu Herzinfarkt Fibro-fetthaltige Ersatz, vor allem in der rechten Herzkammer9führen. Diese Substitution, erstreckt sich vom Epicardium bis Endokards, schafft ein nicht leitendem Substrat, das entlockt progressiven Herzinsuffizienz und verschlechtert ventrikuläre Arrhythmien, die in schweren Fällen zum plötzlichen Herztod führen können. Sommariva Et al. demonstriert die mesenchymale Herkunft der Pre Adipozyten in ACM Patienten explantierten Herzen Abschnitte vorhanden. Darüber hinaus C-MSC von Endomyocardial Biopsie ACM Herzen ausdrückliche Desmosomal Gene isoliert und daher durch ihre Mutationen beeinträchtigt werden kann. Insbesondere unter adipogenen Bedingungen, ACM C-MSC mehr Lipide als jene aus Kontrolle Herzen ansammeln. Diese Beweise führt zu dem Schluss, dass C-MSC sowohl eine aktive Rolle in der Pathogenese der Krankheit haben und stellen eine gültige Zellenmodell ACM zu studieren.
Zur Erleichterung der Zukunftsforschung in diesem Zusammenhang oder bei anderen Herzkrankheiten, für die eine Herzbiopsie angegeben ist, wird ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von C-MSC aus kleine Fragmente von Endomyocardial Gewebe, ihre Expansion, deren Immuno-phänotypisch vorgestellt. Charakterisierung und adipogenen Differenzierung.
Protocol
Dieser Ansatz entspricht der Deklaration von Helsinki und rechtsventrikuläre Probenahmen war (06.07.2012) vom "Centro Cardiologico Monzino IRCCS" Ethik-Kommission genehmigt.
(1) Lösungen
- Machen TMES Medium für C-MSC-Kultur mit Iscoves geändert Dulbecco Medium (IMDM), ergänzt mit 20 % fetalen Bovine Serum (FBS), 10 ng/mL grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor, 10.000 U/mL Penicillin, 10.000 µg/mL Streptomycin und 0,02 M L-Glutamin. Das TMES Medium mit einer sterilen Filtereinheit 0,22 µm filtern und Lagerung bei 4 ° C.
- Um Kollagenase Lösung vorzubereiten, Aufschwemmen Sie den Kollagenase SB4 Mix IMDM Mittel-bis eine endgültige Lösung mit einer Konzentration von 3 mg/mL zu erhalten. Wirbel sanft um das Pulver aufzulösen und die Kollagenase-Lösung mit einem 0,2 µm Spritze Filter filtern. Aliquoten 1 mL Volumen in 2 mL steriles Röhrchen und Store bei-20 ° C bis gebraucht.
- T. ADIPO Medium vorzubereiten, machen adipogenen Medium mit IMDM Medium ergänzt mit 10 % FBS, 0,5 mM 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (Pre verdünnt in Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 0,5 M und bis zur Verwendung bei-20 ° C aufbewahrt), 1 µM Hydrocortison (Pre verdünnt in DMSO bei 100 mM und weiter verdünnt, bis 10 mM in sterilem destilliertem Wasser und bei-20 ° C bis zum Gebrauch aufbewahrt) und 0,1 mM Indometacin (Pre verdünnt in DMSO bei einer Konzentration von 0,5 M und bis zur Verwendung bei-20 ° C aufbewahrt). T. ADIPO Medium mit einer 0,22 µm Sterilfilter-Einheit zu filtern und Lagerung bei 4 ° C.
- Bereiten Sie waschen Puffer bestehend aus Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung 0,0067 M PO4 (PBS), Ethylenediamine Tetra Acetic Acid (EDTA) 5 mM und 5 % Rinderserumalbumin und Store bei 4 ° C.
- Bereiten Sie Öl rot O (ORO) funktionierende Lösung durch Auflösung 1 % ORO Pulver in 60 % Isopropanol, 2 h mischen und Filtern mit 0,22 µm-Filter-Einheit um Ausfällungen zu entfernen. Speichern Sie die Arbeitslösung bei Raumtemperatur (RT).
2. Isolierung mesenchymaler Stromazellen Herzmuskelzellen
-
Herzbiopsie Erhebung und Verarbeitung
Hinweis: bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, die Kollagenase-Lösung und das TMES Medium bereit zu haben.- Setzen Sie die ACM Endomyocardial Biopsie (in der Regel etwa 5 mg des Gewebes) in ein steriles Röhrchen gefüllt mit TMES und transportieren es ins Labor.
Hinweis: ACM Biopsien werden in der Elektrophysiologie OP-Saal, nach früheren Berichten10gesammelt. Kurz, die Integration der Elektro-anatomische Zuordnung und intrakardiale Echokardiographie in der rechten Herzkammer (siehe Video 1) wird verwendet, um die Endomyocardial Biopsie führen (siehe Video 2, Durchleuchtung) in Übereinstimmung mit der Grenzzone von der erkrankten Myokard. Gesunden Kontrolle (HC) Proben werden von einer Bio-Gewebebank, erhalten von der rechtsventrikuläre freie Wand cadaveric Geber innerhalb von 24 h des Todes (Unfalltod, gesunden Probanden) geliefert. Während des Transports und vor Dissektion speichern Sie die Biopsie in TMES bei 4 ° c Begrenzen Sie die Zeit zwischen Biopsie und Gewebe Verarbeitung (Max 24 h). - Richten Sie die biologische Sicherheit Schrank mit erforderlichen Lösungen zur Durchführung des Verfahrens bis zu die enzymatische Verdauung.
- Setzen Sie den Sterilisator unter der Haube und schalten Sie das Gerät 15 Minuten vor der Verwendung bis 200-250 ° c die Temperatur steigt
- Sterilisieren Scheren und Pinzetten für 10 S. Make sicher die sterilisierte Instrumente sind vor Gebrauch kalt. Sterile Einweg-Skalpelle vorzubereiten.
- Legen Sie die Rohre mit der Biopsie in der sterilen Haube. Öffnen Sie das Rohr und übertragen Sie die Biopsie in eine sterile Platte zu.
- Waschen Sie die rechte Herzkammer Biopsie zweimal mit 3 mL sterile PBS. Wenn Sie, ein Bild von der Biopsie am Mikroskop zu nehmen möchten.
- Die rechte Herzkammer Biopsie, sterilen Pinzette in eine sterile 2 mL Röhrchen mit 1 mL der Lösung Kollagenase zu übertragen.
- Schneiden Sie die Probe mit einer sterilen Schere in 0,5 - 1 mm3 Stücke.
- 1,5 h bei 37 ° C unter kontinuierlicher rotierende Bewegung inkubieren.
- Zentrifugieren Sie die verdaute Lösung bei 400 X g für 10 min bei RT
- Entfernen Sie den Überstand zu und fügen Sie 1 mL sterile PBS waschen das Pellet.
- Zentrifuge bei 400 X g für 10 min bei RT.
- Entfernen des Überstands und das Pellet in 1 mL TMES Medium aufzuwirbeln.
- Die erhaltene Suspension auf sterile 60-mm-Gewebe-Kultur behandelt Platte Platte und das Endvolumen von 3 mL TMES Medium hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte in eine Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2.
Hinweis: Ein größeres Volumen des Mediums kann verhindern, dass die richtige Haftung eine verdaute Biopsie-Fragmente. - Entsorgen Sie nach 24 h das Medium, um nicht-anhaftende Zellen und Ablagerungen zu entfernen.
Hinweis: Einzelne dissoziierte mesenchymale Zellen können die Kunststoffoberfläche beimessen und geben Anlass zu klonen; Außerdem können unverdaute kleine Biopsie Fragmente befestigen Sie an der Plastikschale und Zelle sprießen lassen. - Waschen Sie die Platte zweimal mit 5 mL sterilem PBS, und 3 mL frisches TMES Medium.
- Ersetzen Sie die TMES Medium drei Mal pro Woche, bis die Zellen 80 % Zusammenfluss sind.
Hinweis: Die Anzahl der angeschlossenen Zellen hängt von der Qualität und Menge des Gewebes, und auf die Effizienz der Verdauung.
- Setzen Sie die ACM Endomyocardial Biopsie (in der Regel etwa 5 mg des Gewebes) in ein steriles Röhrchen gefüllt mit TMES und transportieren es ins Labor.
3. Zelle Expansion
Hinweis: Vor dem Start unbedingt TMES Medium bereit haben.
- Wenn die Zellen 80 % konfluierende, Transfer sind verdauten kleinen bioptischen Proben in einer neuen sterilen 60 mm Gewebekultur Platte behandelt, und 3 mL frisches TMES Medium.
Hinweis: Die bioptischen Proben können für weitere C-MSC Isolierung wiederverwendet werden. Es ist möglich, diesen Vorgang wiederholen, bis es eine beträchtliche Anzahl von isolierten Zellen gibt. - Waschen Sie die angeschlossenen Zellen zweimal mit 3 mL sterile PBS. Fügen Sie Trypsin-EDTA-Lösung (0,5 mL für eine 60-mm-Schale) und Inkubation bei 37 ° C für 3-5 min zur Ablösung der Zelle zu ermöglichen.
- Wenn die Zellen von der Oberfläche der Platte getrennt sind, fügen Sie 0,5 mL sterile FBS zu inaktivieren die Trypsin und Zellen in eine neue 50 mL steriles Röhrchen zu sammeln.
- Waschen Sie die Platte zweimal mit 5 mL sterile PBS dasselbe Rohr verbleibenden Zellen hinzu.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 X g für 10 min bei RT
- Entfernen des Überstands und das Pellet in 1 mL TMES Medium aufzuwirbeln.
- Laden Sie 10 µL Zellsuspension in der Zelle, die Kammer zu zählen.
Hinweis: Wenn die Zellen zu konzentrieren, die erste Aussetzung 01:10 in PBS verdünnen und 10 µL der verdünnten Zellen in der Zelle zählen Kammer zu laden. - Zählen Sie unter dem Mikroskop Zellen in 3 großen Plätzen und auf den Linien von zwei ihrer Seiten und berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Zellen.
Hinweis: Um die Anzahl der Zellen/mL zu erhalten, ist der Durchschnitt der gezählten Zellen multipliziert mit 104, der Verdünnungsfaktor der Zelle zählen Kammer. Wenn die Zellen weiter abgeschwächt haben, multiplizieren Sie den Verdünnungsfaktor. Das Verhältnis zwischen der Zellzahl, Saatgut und die Zellkonzentration (Anzahl der Zellen/mL) entspricht dem Volumen (in mL) erste Hinausstellung für den nächsten Schritt (Ziffer 3.9) überzogen werden. - Die Wiederfreisetzung auf sterile 100-mm-Gewebe-Kultur behandelt Teller auf eine Endkonzentration von 5.000-10.000 Zellen/cm2 Teller und das Endvolumen von 8 mL TMES Medium hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte in eine Zelle Kultur Inkubator.
Hinweis: Wiederholen Sie Zelle Expansion Vorgang, wenn die Zellen 70-80 % Zusammenfluss sind. Bei jedem Durchgang (P) empfiehlt es sich, Bestandteil der Zellen und die Platte der Restbetrag Tiefgefrieren. Erweitern Sie die Zellen bis P3 oder P4 zu und für Leuchtstofflampen-activated Cell Sorter (FACS) Analyse (Abschnitt 4) und adipogenen Differenzierung (Abschnitt 5). - Für die Kryokonservierung nach Ablösung Zentrifugieren der Zellen bei 400 X g für 10 min bei RT
- Anzahl Zellen als beschrieben (Schritte 3,7-3,8) und 1 x 106 Zellen in 900 µL steriler FBS aufzuwirbeln. Transfer zu einem sterilen Cryo-Fläschchen und 100 µL steriler DMSO und Mischung hinzufügen.
- Speichern Sie schnell die Cryo-Röhrchen in einen eiskalten Behälter bei-80 ° C für mindestens 2 Tage und übertragen Sie dann die Fläschchen in flüssigem Stickstoff.
4. Charakterisierung mesenchymaler Stromazellen Herzmuskelzellen durch Durchflusszytometrie
Hinweis: Stellen Sie bevor Sie beginnen sicher, die Zelle Dissoziation Reagenz, Wasch-Puffer und die spezifischen Antikörper vorbereitet haben.
- Wenn die Zellzahl erreicht mindestens 3 x 10 waschen6 (Anzahl der Zellen als 3.7-3.8 beschrieben), die 100-mm-Platte zweimal mit 10 mL sterile PBS.
- Geben Sie 5 mL einer Zelle Dissoziation Reagenz hinzu und warten Sie ca. 7-10 min bei RT um die Ablösung der Zelle zu ermöglichen.
- Wenn die Zellen von der Oberfläche der Platte getrennt sind, fügen Sie 15 mL sterilem waschen Puffer und sammeln Sie die Aufhängung in eine neue 50 mL steriles Röhrchen.
- Waschen Sie die Platte zweimal mit 10 mL Waschpuffer und das gleiche Rohr fügen Sie verbleibenden Zellen hinzu.
- Die Zellen bei 400 X g für 10 min bei RT Zentrifugieren und das Pellet in 1 mL Waschpuffer aufzuwirbeln.
- Zählen der Zellen wie beschrieben (Schritte 3,7-3,8), und 3 x 106 Zellen in ein neues steriles Röhrchen zu übertragen und das Endvolumen von 1,5 mL waschen Puffer hinzufügen.
Hinweis: Die gesamte Zellzahl und das Gesamtvolumen der waschen Puffer hängt von der Anzahl der ausgewählten Marker für die Analyse (3 x 105 Zellen in 100 µL für jedes FACS-Polystyrol-Röhrchen) verwendet. - Verteilen Sie 100 µL Zellsuspension in 12 verschiedenen FACS Polystyrol Rohre zu, und fügen Sie die spezifischen Antikörper bei der Konzentration im Produktdatenblatt angegeben.
Hinweis: Für C-MSC Charakterisierung verwendeten Antikörper sind CD34, CD105 CD45, CD29, CD90, CD44, CD31, CD14 und HLA-DR (Tabelle 1). Es ist wichtig, eine Kontrollprobe bestehend aus 100 µL resuspendierte Zellen befleckt mit dem Isotype-Steuerelement zu prüfen, die Spezifität des Signals vorzubereiten. - Inkubieren Sie die Proben für 15 Minuten im Dunkeln.
- Fügen Sie 1 mL sterilem waschen Puffer jedes Rohr um die Reaktion zu stoppen hinzu.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 X g für 10 min bei RT
- Den Überstand zu entfernen und das Pellet in 250 µL Waschpuffer aufzuwirbeln.
- Fahren Sie mit C-MSC Charakterisierung mit Durchflusszytometrie.
5. adipogenen Differenzierung mesenchymaler Stromazellen Herzmuskelzellen
Hinweis: Stellen Sie bevor Sie beginnen sicher, T. ADIPO Medium und ORO Arbeitslösung vorbereitet haben.
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Kultur in T. ADIPO medium
- Lösen Sie und zählen Sie die Zellen wie in Abschnitt 3 beschrieben.
- Platte 3 x 105 Zellen auf jedem Bohrloch einer sterilen Gewebekultur 6-Well Platte in 2 mL T. ADIPO Medium behandelt.
- Lassen Sie C-MSC in T. ADIPO Medium für 72 h oder 1 Woche ändern Mediums alle 2-3 Tage zu unterscheiden.
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Öl rot O Färbung
Hinweis: Einsatz Öl rot O (ORO) Färbung um die Lipid-Ansammlung in C-MSC zu testen.- Legen Sie die 6-Well-Zellkultur-Plateunder der Dunstabzugshaube.
- Entfernen Sie das adipogenen Medium zu und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 mL PBS.
- Fügen Sie die genügend Volumen von 4 % Paraformaldehyd (PFA) jede Deckung gut. Beheben Sie die Zellen für 5 min bei RT
- PFA zu verwerfen und die Zellen zweimal mit 2 mL PBS waschen.
- Inkubieren Sie die festen Zellen mit ORO funktionierende Lösung für 1 h bei RT, mit genügend Volumen jedes bedecken gut.
Hinweis: Halten Sie die Gewebekultur 6-Well-Platte unter dem Abzug nicht während der Inkubation ORO, die Verdunstung des ORO funktionierende Lösung zu vermeiden. - Entfernen Sie alle ORO Arbeitslösung und waschen mit 2 mL PBS 3 - 5 Mal, bis die Platte komplett gereinigt wird; entsorgen Sie wäscht. Die Waschungen zu stoppen, wenn die PBS verwendet klar ist und wenn Sie nicht sehen, unter dem Mikroskop, unspezifische Färbung aus den Zellen.
- 20 Bilder mit 20 X Vergrößerung für jedes gut, das invertierte Gewebekultur Phasenkontrast-Mikroskop zu erfassen.
- Öffnen Sie die Bilder mit Bildbearbeitungsprogramm, die Zelle ORO Akkumulation zu quantifizieren.
- Trennen Sie die verschiedenen Farbkanäle über die Funktion "split Kanäle", um nur die Leuchtdichte in der 255-Rot-Kanal zu quantifizieren.
- Die Anzahl der Zellen für jedes Bild durch zählen der Kerne. Die ORO-Signalintensität auf die Handynummer zu normalisieren.
- Berechnen Sie den Mittelwert der Ergebnisse für jedes Bild der gleichen Probe.
Representative Results
Cardiac Stromazellen Zellen isoliert: Die C-MSC-Isolierung von Endomyocardial Biopsie-Verfahren ist in Abbildung 1zusammengefasst.
Cardiac Stromazellen Zellen mesenchymalen Charakterisierung: Wie von der internationalen Gesellschaft für zelluläre Therapie (ISCT) gegründet, die minimale Kriterien für die Definition von multipotenten mesenchymaler Zellen Stromazellen umfasst ihre Immuno-phänotypischen Charakterisierung3. Vor allem um ihre mesenchymaler Herkunft zu bestätigen, sind Zellen mit entsprechenden FITC/PE/APC-konjugierten Antikörpern inkubiert und durch Durchflusszytometrie analysiert. Alle in der C-MSC-Charakterisierung verwendeten Antikörper sind in Tabelle Materialienaufgelistet.
Wie in Abbildung 2dargestellt, sind C-MSC Biopsien entnommen positiv für die spezifischen mesenchymalen Oberflächenantigenen CD29, CD44 und CD105. Der Anteil der positiven Zellen CD90 ist variabel, wie bereits11berichtet. Die Endothelzellen (CD31, CD34), Monocyte/Makrophagen (CD14), hämatopoetischen (CD45) Markierungen und großen Histocompatibility complex (HLA-DR) sind nicht zum Ausdruck gebracht (Abbildung 2).
Cardiac mesenchymaler Stromazellen Zellen adipogenen Differenzierung: Um ihre adipogenen Differenzierung auffordern, C-MSC aus Patienten mit ACM und HC gewonnen haben, in T. ADIPO Medium kultiviert werden (siehe Abschnitt Lösungen). Die Zellen sind in der Kultur für 72 h oder 1 Woche ersetzen das Medium zweimal in der Woche gepflegt.
Die Anhäufung von intrazellulären Lipid Tröpfchen ist belegt durch ORO Färbung (Abbildung 3). Unterschiede in der Fähigkeit, sowie in dem Grad der Differenzierung, können zwischen den Zellen gewonnenen ACM und HC beobachtet werden. Wie die repräsentative Bilder zeigt, sammelt ACM C-MSC mehr Lipid Tröpfchen als HC C-MSC nach 72 h Kultur in adipogenen Medium (Abbildung 3). Diese Unterschiede sind auch beibehalten, wenn die Zellen adipogenen Differenzierung Bedingungen über einen längeren Zeitraum (1 Woche) (Abbildung 3) ausgesetzt sind.
Video 1: Integration von Electroanatomical Karte und intrakardiale Echokardiographie. Endokardialen unipolaren Electroanatomical Karten des rechten Ventrikels (linken vorderen schrägen und rechten vorderen schrägen Ansichten) bei einem Patienten, der endomyocardial Biopsie (untere Platten) erfährt. Begrenzte Bereiche der Niederspannung (rot/grün) sind sichtbar an der Spitze. Endomyocardial bioptischen Proben (gekennzeichnet als Kreis) sind in der Korrespondenz der Kranke Herzmuskel und die interventricular Septum gesammelt. Echtzeit-intrakardiale Echokardiographie ermöglicht die Überprüfung der richtigen Stellung des Bioptome auf den Zielbereich (obere Leiste). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Video 2: Fluoroskopie Video im rechten vorderen Schrägansicht. Die Bioptome ist durch eine lange biegungsfähigen Scheide eingeführt und in die Herzkammer vorgeschoben. Nach eine sorgfältige Prüfung des Bioptome Kontakt mit den Herzmuskel die Backen geöffnet und dann fest geschlossen, um die Probe zu sammeln. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Abbildung 1: Verfahren Entwurf. Endomyocardial bioptischen Probe wird mit einem Bioptome Katheter, eine kleine Zange-förmigen Ausschnitt Instrument gesammelt. Das Gewicht der gewonnenen Biopsie ist etwa 5 mg (A). Die Endomyocardial bioptischen Probe ist in 0,5 - 1 mm3 Fragmente mit einer sterilen Schere (B), gehackt und Kollagenase Lösung hinzugefügt. Die Probe wird in einem 37 ° C Inkubator auf einer rotierenden Plattform-Mischer für 1,5 h der Verdauung (C) gelegt. Die verdaute Lösung ist zentrifugiert und vernickelt in TMES in einer Plastikschale (D). C-MSC erhalten Sie dank ihrer Einhaltung der plastischen Eigenschaften entweder in einzelnen Zellen oder Klone sprießen aus kleinen unverdauten bioptischen Fragmente (E). C-MSC zeichnen sich dann durch Durchflusszytometrie (F). C-MSC sind in adipogenen Medium beschichtet und Lipid Droplet Anhäufung von Öl rot O Färbung (G) getestet. Maßstabsleisten zeigen 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: repräsentative Zyto-fluorimetrischen Profil von C-MSC. Jede Histogramm zeigt die Zellzahl vs. die Intensität der Fluoreszenz in den angegebenen Kanal (PE: Phycoerythrin; APC: Allophycocyanin; FITC: Fluorescein-Isothyocyanate). In jedem Diagramm die Isotype-Kontrolle (weiß) und eine Probe mit der spezifischen Zelle konjugiert werden Oberfläche Marker Antikörper (rot) angezeigt. C-MSC sind positiv für die mesenchymalen Oberflächenantigenen CD29, CD44, CD105 und, teilweise, CD90, während sie nicht ausdrücken CD31, CD34, CD14, CD45 und HLA-DR. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: adipogenen Differenzierung von C-MSC. Repräsentative Bilder von ACM und HC C-MSC, kultiviert in adipogenen Medium für 72 h und 1 Woche, befleckt mit ORO (linke Bilder; n = 3). Die richtigen Grafiken, Quantifizierung von der Leuchtdichte der Kanal 255-rote Färbung wird berichtet: Intensität äußert sich in beliebigen Einheiten (AE). ACM C-MSC akkumulieren mehr Lipid-Tröpfchen als Kontrollen. Studenten T-Test verwendet wurde, *: p < 0,05. Maßstabsleisten zeigen 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
MSC und C-MSC: MSC werden multipotente Zellen in den Stromazellen Bruchteil der verschiedenen adulten Geweben, wie Knochenmark, Fettgewebe, Knorpel, Gehirn, Haut, fetale Anhänge und Herz12ansässig. Verschiedene Studien wurden durchgeführt, um zu isolieren und zu charakterisieren sie für potenzielle Anwendungen in Grundlagen- und translationale Forschung12,13.
Unter gesunden Bedingungen sind MSC Ruhestrom, selbst erneuernde bei günstigen Tarifen14. Da sie auf pathologische Veränderungen der Umwelt ausgesetzt sind, reagieren sie Förderung Gewebe Umbau durch direkte Transdifferenzierung, Matrix Ablagerung oder parakrine Wirkung14.
Die kardiale MSC (C-MSC) stellen eine große nicht-Myozyten Zellpopulation des Herz-4. Sie stammen aus der Epicardium und Wandern in den Herzmuskel in den Prozess der epitheliale-mesenchymale Transition15. Sie tragen zu den mechanischen und elektrischen Integrität der kardialen Struktur, im physiologischen und pathologischen Zuständen, durch Interaktionen mit Kardiomyozyten und extrazelluläre Matrix Homöostase7,16. Allerdings ist die Breite C-MSC-Funktionen noch nicht vollständig verstanden. Eine tiefere Kenntnis ihrer Rolle, die beide in physiologischen und pathologischen Bedingungen durch in-vitro- Studien gefördert werden können nach ihrer Isolation durchgeführt.
C-MSC wurden aus verschiedenen Bezirken des menschlichen Herzens, wie z. B. die atrial Appendage2,17 und rechte Herzkammer18gewonnen.
Vor kurzem, C-MSC aus menschlichen rechtsventrikuläre Endomyocardial bioptischen Proben gewonnen wurden8, zeigen, dass die Quelle Gewebe so wenig wie 3-5 mg sein könnte.
Anwendungsmöglichkeiten: In diesem Manuskript beschriebene Methode erlaubt die Erlangung Zellen mit wenigen einfachen Passagen, wie Verdauung und Auswahl für die Einhaltung der Kunststoff, aus sehr kleinen Herzen Exemplare.
C-MSC kann eine Handy-Modell angesehen werden, da sie einfach zu verstärken und in-vitro-beizubehalten, und sind in der Lage, sich in Zellen mesenchymaler Herkunft (Endothel, Osteozyten und Adipozyten) differenzieren. Darüber hinaus stellt die Möglichkeit der Zellgewinnung direkt vom Patienten eine große in-vitro- Werkzeug für mechanistische Studien im Zusammenhang mit der personalisierten/Präzision Medizin dar. In der Tat, diese Zellen tragen die genetische Hintergrund und schließlich bestimmte Mutationen der Geber und werden durch die spezifischen Patienten Merkmale, wie Krankheitsbilder, Alter, Geschlecht, Lebensstil und Medikamente beeinflusst. Darüber hinaus kann die Möglichkeit für verschiedene Marker zu sortieren die Studie von spezifischen C-MSC Teilmengen19ermöglichen.
C-MSC sind dafür bekannt, aktive Spieler in verschiedenen kardiovaskulären Erkrankungen, vor allem geprägt von negativen Umgestaltung des Herzens sein. Deshalb sind sie Kandidat Ziele für neue therapeutische Strategien gegen Herzkrankheiten8,20.
C-MSC Stamm-ähnliche Eigenschaften und ihren Mangel an bedeutenden Immunogenität schlägt ihre mögliche Anwendung in der Zelltherapie für kardiale regenerative Medizin. In der Tat könnte wie MSC aus Knochenmark oder anderen Quellen, C-MSC potenziell in autologen und allogenen Einstellungen, ohne die Notwendigkeit für den Abgleich zwischen Spender und Empfänger21verwendet werden.
Darüber hinaus haben C-MSC, direkt von Herzgewebe, isoliert den Vorteil wird durch die kardiale Mikro-Umgebung und das epigenetische Profil vorkonditioniert. Dies könnte im Rahmen der kardialen regenerativen Medizin besonders wichtig, um erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen.
Bisher identifiziert präklinische Studien der regenerativen Medizin nützliches therapeutisches Potenzial in der C-MSC und deren parakrine Aktivität18,22,23. Wichtiger ist, sind klinische Studien, in denen die Zelle Quelle das Herz ist, im Gange mit Cardiosfere gewonnenen Zellen oder Subpopulationen von C-MSC13,24,25. Jedoch können für Bone-Marrow-derived MSC, verschiedene Protokolle klinische Klasse C-MSC26erhalten erforderlich.
C-Master of Science in ACM: Die vorgestellte Protokoll ist vor allem geeignet für die Erforschung von Krankheiten, für die eine endokardialen Biopsie indiziert ist. ACM Patienten unterziehen bioptischen Verfahren für Diagnosezwecke27. Der Herzmuskel wird allmählich durch Narbengewebe, ein elektrisch inert Gewebe bestehend aus Adipozyten und Fibrose ersetzt. Um die bioptischen Probenahme zu den Narbenbereich führen wo die diagnostische Ausbeute maximal ist, ist Endomyocardial Zuordnung verwendete10,28,29. In diesem Protokoll verwendeten Proben sind im Grenzgebiet von erkranktem Myokard.
Sommariva Et Al. hat vor kurzem eine zentrale Rolle des C-MSC definiert, in der Pathogenese der ACM8, zeigen, dass C-MSC aktiven Spielern in ACM Herz angereizte, da Präadipozyten in jene Herzen mesenchymalen Ursprungs sind. Darüber hinaus isoliert C-MSC mit dem vorliegenden Protokoll von ACM Patienten Biopsien zeigten mehr Neigung zur Lipid-Akkumulation und angereizte als Kontrollen. Aus diesem Grund konnte diese Zellen verwendet werden, um die molekularen Mechanismen der ACM, beweisen ihre Eignung als einem Zellmodell für mechanistische Studien9zu bestätigen.
Einschränkungen und wichtige Schritte: Trotz der Vorteile der Beschaffung von C-MSC direkt vom Patienten (siehe Abschnitt "Anwendungen"), wird dieses Protokoll unterschiedliche Einschränkungen unterworfen.
Zu aller erst die kardiale bioptischen Verfahren ist invasiv und oft vermieden werden, wenn nicht unbedingt notwendig. In der Tat ist die Probenahme Herzgewebe sowohl ethisch als auch technisch problematisch. Gründe für die Durchführung einer Herzbiopsie können die Verwirklichung der eine eindeutige Diagnose im Rahmen der Kardiomyopathien in Differentialdiagnose, Überwachung des Zustands der kardialen Transplantationen oder Feststellung der Anwesenheit von ein Herz Tumor30sein. Daher können nur Patienten, für die eine Endomyocardial Biopsie durch Konsens Anweisung31 angegeben ist, für die Erforschung von C-MSC angemeldet werden. Darüber hinaus kann das kardiale bioptischen Verfahren klinische Komplikationen, vor allem in cardiomyopathic Herzen haben. Daher der Elektrophysiologe Kostproben sind immer vorsichtig und bioptischen Proben wäre sehr klein, die Isolation der Zellen zu beeinträchtigen. Zukünftige Experimente könnte dieses Problem durch tuning Kollagenase Konzentration oder Timing der Verdauung überwinden.
C-MSC, zeigen als alle primären humanen Zellen eine hohe Variabilität unter verschiedenen Themen in alle Phänotypen. In der Tat sind Zellen aus verschiedenen Fächern nicht nur genetisch verschieden, sondern auch unterworfenen Variable Umwelt Klimaanlage. Insbesondere wird in diesem Experiment, eine hohe Variabilität in Isolation, Wachstum und adipogenen Differenzierung beobachtet.
Wichtige Schritte dieses Protokolls müssen anerkannt werden. Wenn das bioptischen Beispiel Kapillaren enthält, müssen sie entfernt werden, um die parallele Isolation der Endothelzellen, zu vermeiden, kann die C-MSC-Kultur verunreinigen, und kann durch die FACS-Analyse (Positivität für CD31) nachgewiesen werden. Um eine effiziente adipogenen Differenzierung zu erhalten, müssen die Zellen in einer aktiven Wachstumsphase sein. Der Grad der Zusammenfluss kann auch Lipid-Ansammlung beeinflussen.
Bedeutung der Methode: In Bezug auf die bisherigen Methoden der Isolierung mesenchymaler Stromazellen Zellen ist dies das erste Mal wo die Beschreibung des C-MSC Einholung direkt von ventrikulären bioptischen Humanproben im Detail vorgeschlagen. Obwohl diese Methode für die Verarbeitung von ACM Patientenproben vorgeschlagen wird, ist es möglicherweise für alle Patienten, für die eine Herzbiopsie angegeben ist.
Dieses Protokoll stellt eine nützliche Umsetzung der bisherigen Methoden für die Einholung der Zellen, die größere kardiale Proben32, erforderlich, die oft schwer zu erfassen sind.
Darüber hinaus bildet der Probe eine interessante Neuerung. Während die ventrikuläre Biopsie in der Regel auf das Septum33durchgeführt wird, berücksichtigt dieses Protokolls Konto Proben aus der rechtsventrikuläre freie Wand. Zellen aus der erkrankten rechtsventrikuläre Bezirk möglicherweise weitere Vertreter des pathologischen Status von Krankheiten mit RV
Darüber hinaus sind einige der in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien in Bezug auf andere C-MSC Isolation und Differenzierung Methoden32verschiedene. Zum Beispiel die Art der Kollagenase vorgeschlagen, in diesem Manuskript ist eine Mischung aus der Klasse I und Klasse II Collagenases durch ein ausgewogenes Verhältnis von proteolytischen Aktivitäten. Darüber hinaus besteht der Aufschlusslösung aus der Kollagenase-Mix in dem gleichen basal Medium (IMDM) verwendet für die Herstellung von C-MSC Kulturmedium, so dass isolierte C-MSC Anpassung an zukünftige Wachstumsbedingungen aufgelöst.
Darüber hinaus obwohl Sortierung Verfahren die Zelle Charge, mit der gesamten C-MSC-Bevölkerung, standardisieren könnten nur durch die Einhaltung von Kunststoff-Eigenschaft dieser Zellen isoliert, stellt eine Vereinfachung ohne Veränderung der immunophenotypic Eigenschaften von C-MSC. Die Zusammensetzung des T. ADIPO vorgeschlagen, in diesem Manuskript ist in der Lage zu adipogenen Differenzierung, Vermeidung der metabolischen Dysregulation durch andere Komponenten wie z. B. Insulin induziert führen.
Darüber hinaus bietet die vorgeschlagene Methode der Lipid Ansammlung Quantifizierung, basiert auf der Bewertung der ORO farbmetrischen Intensität, mehr Informationen über die Menge der angesammelten Lipide mit Methoden, die nur ausgehend vom prozentualen Anteil im Vergleich von Zellen positiv auf die ORO-Färbung. Oft Lipid Ansammlung wird durch Extraktion das ORO quantifiziert durch Zellen mit Isopropanol und Messung der Extinktion aufgenommen. Allerdings ist diese Methode erfordert mehr Passagen und Variabilität durch Isopropanol Verdunstung ausgesetzt ist.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom italienischen Gesundheitsministerium, Ricerca Corrente, Centro Cardiologico Monzino-IRCCS finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IMDM | Gibco by Life Technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN | Life Technologies Italia | 15140122 | |
| Collagenase NB4 | Serva | 17454.02 | |
| Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B | |
| L-glutammine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Tryple select 1X (cell dissociation reagent) | Gibco | 12563029 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T6689 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Paraformaldehyde (PFA) Solution 4% in PBS | D.b.a. Italia S.r.l. | sc-281692 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Antibody CD14-FITC (MφP9) | Becton Dickinson | 345784 | |
| Antibody Integrin β1 (CD29)-PE (clone MAR4) | Becton Dickinson | 561795 | |
| Antibody PECAM-1 (CD31)- APC (clone 9G11) | R&D Systems | FAB3567A | |
| Antibody Hematopoietic progenitor cell antigen (CD34)-APC (clone 581) | Thermo Fisher Scientific | CD34-581-05 | |
| Antibody H-CAM (CD44)-PE (clone G44-26) | Becton Dickinson | 561858 | |
| Antibody L-CA (CD45)-APC (clone HI30) | Thermo Fisher Scientific | MHCD4505-4 | |
| Antibody THY1 (CD90)-FITC (clone 5E10) | Becton Dickinson | 561969 | |
| Antibody Endoglin (CD105)-APC (clone 266) | Becton Dickinson | 562408 | |
| Antibody HLA-DR-FITC (clone L243) | Becton Dickinson | 347400 |
|
| Gima Quick Plus sterilizer | Gima | 35642 | |
| Bench centrifuge Sigma 3-16K | Sigma Centrifuges | 10330 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| AxioVert 200M microscope | Zeiss | B 40-080 e 03/01 | |
| FACS Gallios | Beckman Coulter | 773231AF | |
| ImageJ (image processing program) | NIH | ||
| Stericup filter units | Merck S.P.A. | SCGPU05RE | |
| Conical Tubes, 50 mL | Eppendorf | 30122178 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Eppendorf | 30122151 | |
| Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
| 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 60 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 430166 | |
| 6 well TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3516 | |
| Polystyrene Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Falcon | 352058 | |
| BRAND counting chamber BLAUBRAND Bürker-Türk | Sigma-Aldrich | BR719520 |
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