Summary
Denne protokol beskriver brugen af en krop sammensætning analyzer og metaboliske animalske overvågningssystem til at karakterisere kropssammensætning og metaboliske parametre i mus. En fedme model fremkaldt af højt fedtindhold fodring bruges som forbillede for anvendelsen af disse teknikker.
Abstract
Ændringer i kropssammensætning (fat eller lean masse), metabolisk parametre som hele kroppen iltforbrug, energiforbrug, og substrat udnyttelse og adfærd, såsom fødeindtagelse og fysisk aktivitet kan give vigtige oplysninger vedrørende de underliggende mekanismer af sygdom. Betragtning af betydningen af kroppens sammensætning og metabolisme til udviklingen af fedme og dens efterfølgende sequelae, er det nødvendigt at foretage nøjagtige foranstaltninger for disse parametre i indstillingen præ-klinisk forskning. Teknologiske fremskridt i de seneste årtier har gjort det muligt at udlede disse foranstaltninger i gnavere modeller i en non-invasiv og langsgående mode. Derfor, disse metaboliske foranstaltninger har bevist nyttige, når vi vurderer svaret fra genetiske manipulationer (f.eks knockout eller Transgene mus, viral knock-down eller overekspression af gener), eksperimentelle stof/sammensatte screening og kosttilskud, adfærdsmæssige eller fysisk aktivitet interventioner. Heri, beskriver vi de protokoller, der bruges til at måle kroppens sammensætning og metaboliske parametre ved hjælp af dyrets overvågningssystem i chow-fed og høj fedt diæt-fed mus.
Introduction
Metabolisme understøtter mange aspekter af normal cellulære, orgel og hele kroppen fysiologi. Derfor, i fastsættelsen af forskellige patologier, ændringer i stofskiftet kan bidrage direkte til den underliggende tilstand eller kan blive negativt påvirket som en bivirkning af patologi. Traditionelt, metaboliske undersøgelser og studier i energibalance, været koncentreret på feltet af fedme og relaterede sygdomme som insulinresistens, præ-diabetes, glucose intolerance, hjerte-kar-sygdom og diabetes. Denne forskning er berettiget, givet den eskalerende forekomsten af sådanne forhold på verdensplan og individuelle, samfundsmæssige, og økonomiske omkostninger disse betingelser påføre. Som sådan, udvikling af forebyggende strategier og nye therapeutics til target fedme er en vedvarende mål i forskningslaboratorier verden over og prækliniske musemodeller er stærkt påberåbes for disse undersøgelser.
Mens vejer mus giver en pålidelig vurdering af vægtøgning eller tab, giver det ikke en opdeling af de forskellige komponenter, der udgør hele kroppen sammensætning (fedtmasse, lean masse, gratis vand samt andre komponenter såsom pels og kløer). Vejning af fedtpuder ved afslutningen af undersøgelser, når musen er afdøde giver en nøjagtig måling af forskellige fedt depoter, men kan kun levere data for et enkelt tidspunkt. Som følge heraf er det ofte nødvendigt at tilmelde sig flere årgange for at undersøge udviklingen af fedme over tid, markant stigende animalske tal, tid og omkostninger. Brugen af dobbelt-energy X-ray absorptiometri (DEXA) indeholder en metode til at vurdere krop fedt og magert væv indhold og gør det muligt for forskeren at skaffe data i en langsgående mode. Dog proceduren kræver mus bedøvede1, og gentagne anfald af anæstesi kan påvirke ophobningen af fedtvæv eller påvirke andre aspekter af metabolisk regulering. EchoMRI udnytter Kernemagnetisk resonans relaxometry for at måle fedt og lean masse, gratis vand og samlede vand indhold. Dette opnås på grund af oprettelsen af kontrasten mellem de forskellige væv komponenter, med forskelle i varighed, amplitude og rumlige fordeling af genererede radiofrekvenser giver mulighed for afgrænsning og kvantificering af hver vævstype. Denne teknik er fordelagtig, da det er non-invasiv, hurtig, simpel, kræver ingen anæstesi eller stråling, og, vigtigst, er blevet positivt valideret mod kemisk analyse2.
En afgørende overvejelse af fedme og forskning er energi balance ligning. Mens fedtophobning er mere kompliceret end ren energi i (fødeindtagelse) versus energi ud (energiforbrug), er de afgørende faktorer for at kunne måle. Daglig energi udgifter er i alt fire forskellige elementer: (1) basal energi udgifter (hvile stofskifte); (2) energi udgiften på grund af den termiske effekt af mad forbrug; (3) den energi, der kræves for termoregulering; og (4) energien brugt på fysisk aktivitet. Som energi udgifter genererer varme, skal måling af varmeproduktion et dyr (kendt som direkte kalorimetri) bruges til at vurdere energi udgifter. Alternativt, måling af inspireret og udløbet koncentrationer af O2 og CO2, giver mulighed for bestemmelse af CO2 produktion, og hele kroppen O2 forbrug kan udnyttes som en måde til indirekte måling (indirekte kalorimetri) varme produktion og dermed beregne energiforbrændingen. En stigning i fødeindtagelse eller et fald i udgifter til energi vil prædisponerer mus til vægtøgning og observationer af ændringer i disse parametre kan give nyttige oplysninger for sandsynligt virkningsmekanismer i bestemte modeller af fedme. En beslægtede metaboliske parameter af interesse er respiratorisk ombytningsforhold (RER), en indikator for andelen af substrat/brændstof (dvs., kulhydrater eller fedt) der gennemgår metabolisme og bliver udnyttet til at producere energi. Derfor, måling af fødeindtagelse (energiforbruget) kombineret med fysiske aktivitetsniveau, O2 forbrug, RER og energi udgifter kan give en bred forståelse af en organisme metaboliske profil. En metode til at indsamle sådanne data er at bruge en omfattende laboratory animal overvågningssystem (MUSLINGER), som er baseret på den indirekte kalorimetri metode til at måle energiforbrug og har den ekstra kapacitet til bestemmelse af fysisk aktivitetsniveau (stråle pauser) og fødeindtagelse via skalaer indarbejdet i målingen kammer.
I denne protokol giver vi et straight-forward beskrivelse af brugen af en krop sammensætning analyzer at vurdere kropssammensætning hos mus og en metabolisk animalsk kontrol system til at måle aspekter af metabolisme. Overvejelser og begrænsninger for disse teknikker vil blive drøftet og foreslåede metoder til analyse, fortolkning og data repræsentation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg beskrives blev godkendt af den Alfred medicinsk uddannelse Precinct dyr videnskabsetisk Komité (AMREP AEC) og mus blev tildelt humane pleje i overensstemmelse med National Health og Medical Research Rådet (NHMRC) af Australien retningslinjer på Dyreforsøg. Dyrene blev administreret deres foreskrevne kost og vand ad libitum og har til huse i en temperatur-kontrolleret miljø (~ 21-22 ° C) med en 12-timers lys og 12 h-mørke cyklus. Syv uge gamle mandlige mus (på en C57Bl/6J baggrund) blev fodret enten regelmæssige normal chow kost (energi indhold 14,3 MJ/kg, bestående af 76% af kJ fra kulhydrat, 5% fedt, 19% protein; se tabel af materialer) eller for høj fedt-fodring gruppen, en højt fedtindhold kost () (HFD) energi indhold 19 MJ/kg, bestående af 36% af kJ fra kulhydrat, 43% fedt, 21% protein, speciale Feeds) for 3 uger. Kropsvægt og body sammensætning målinger ved hjælp af en EchoMRI maskine blev foretaget ugentligt, mens den metaboliske kontrol analyse fandt sted i en MUSLINGER efter 3 uger af kosten.
1. krop sammensætning Analyzer Procedure
Bemærk: For at fungere optimalt, bør EchoMRI 4-i-1 brugt i denne protokol være indeholdt i et rum, hvor lufttemperaturen er stabil og ikke svinger. Ideelt set bør denne konstant overvåges. Flytning af maskine og afbrydelser til magt bør også undgås hvis muligt. Hvis strømforsyningen er afbrudt, og systemet skal genstartes, tillade mindst 2-3 h for maskinen at varme op før du bruger den igen. Før du starter, sikre, at du er iført korrekte personlige værnemidler.
- Før scanning mus, skal du udføre et system test på krop sammensætning analyzer maskine. Det indebærer at bruge en kalibrering standard (kaldet en raps olie system prøven (omkostninger)) til at teste præcisionen af instrumentet og sikre, er der ingen drift i dets nøjagtighed.
- Åbne systemsoftware, derefter klikke på System Test på værktøjslinjen eller trykke på "Alt + Y" samtidig.
- Før udføres prøven af computeren, vent til en påmindelse for at kontrollere, at de korrekte omkostninger (i dette tilfælde musen specifikke omkostninger) er blevet placeret inde gantry system ( figur 1). Når du har bekræftet, at dette er faktisk tilfældet, Accepter for at fortsætte med test, som vil tage nogle minutter at fuldføre.
- Når system test er blevet overskredet, fortsætte fremad med scanning.
- Hvis system-testen mislykkes, skal du gentage system test.
- Hvis maskinen fortsætter med at være uden for rækkevidde (indikerer en afvigelse er sket), kan kalibrering være nødvendigt at rette op på situationen. Komplet dette ved at følge anvisningerne eller som beskrevet i den brugervejledning, der leveres på købstidspunktet. Hvis problemet fortsætter, kontrollere den manuelle3 eller rapportere problemet til producentens supportteam og søge yderligere instruktion.
- Placere mus i en lille, animalsk præparatholderen (lang cylinder) at holde dem i maskinen. Gøre dette, placere indehaveren vandret, afhente musen og sætte det ind i åbningen af topstykke først. Langsomt og omhyggeligt skal du sætter indehaveren til lodret position, så musen er i bunden af cylinderen og klar til analyse.
- Når indehaveren, indsætte et afgrænsningstegn til at begrænse bevægelsen af musen i måleperioden. I nogle tilfælde, med meget aktive mus, kan det være nødvendigt at holde afgrænseren på plads med din fingerspids.
Bemærk: Stifte musene med placering i modellen indehaverne inden deres indledende analyse til at reducere stress. Brug af en rød farvet animalske prøveholder kan også reducere den potentielle stressrespons, som musene føler at de er i mørke. - Inden for software, skal du vælge en mappe (mappen værktøjslinjen) til at gemme data til og oprette et filnavn.
- Hvis det er nødvendigt, reducere mængden af tilfældige støj i fedt og magert målingerne ved at øge antallet af primære ophobninger af scanningen. Når softwaren er indledt, de primære ophobninger er indstillet til en anbefalede standardværdi for almindelig dagligdags brug; medmindre der er en særlig grund til at ændre disse parametre, vil standard opsætning give den nødvendige grad af præcision til brugere.
- Hvis ikke interesseret i at opnå data for frie og samlede vand, slå vandet fase ved at vælge fanen for at sige nej. Dermed vil reducere scan varighed betydeligt og forbedre overførselshastighed.
- Indlede scanningen ved at vælge "start scanning" eller ved at trykke på F5 på tastaturet. Angiv alle relevante data om dyret (f.eks. dyr ID, kropsmasse, osv.), og tryk på "ok" eller F5 for at påbegynde den scanning, der vil tage ca 1 min.
- Når data er opnået, fjerne animalske indehaveren indeholdende musen fra maskinen og placere den animalske tilbage i sit bur. Når alle dyr er blevet scannet, eksportere data til yderligere analyse og sortering.
- Før og efter brug, grundigt rene dyr indehavere som pr vejledningen fra fabrikanten. Da disse indehavere er konstrueret af acryl plast, isopropylalkohol og ethyl alkohol bør undgås da de kan forårsage revner i indehavere og/eller hurtige forringelse af indehaveren, hvilket øger sandsynligheden for brud. I stedet bruge varmt opvaskevand løsning, eller, hvis der kræves yderligere desinfektionsmiddel, bruger F10 (ved 1:125) eller andre desinficerende eller rengøring spray (Se Tabel af materialer) og derefter tørres af.
2. metaboliske dyr kontrolprocedure System
Bemærk: Systemet kræver ~ 2 h til at varme op og stabilisere. Hvis maskinen har været slukket, skal det være tændt for at tillade Zirconia celle der skal opvarmes til 725 ° C. Vi lægger også generelt mus i kroppen sammensætningen analyzer en dag forud for at indtaste dyret overvågningssystem for at undgå eventuelle problemer med tilbageholdenhed stress.
- Sikre den computer tilsluttet det animalske overvågningssystem er tændt og åbner programmet kontrol. Vælg indstillingen "Oxymax Utility" fra værktøj menuen at indlede pumperne.
- Fylde vandflasker med passende vand, veje og inspicere sundhed af mus, og organisere mad. Hvis måling fødeindtagelse i systemet, kan du overveje at powdering maden. Fylde mad tragte ved at trykke fjederbelastede platform og tip maden ind i tragten. Sikre, at fødevarer hopper og vandflaske er helt fyldt til at sikre, at der er tilstrækkeligt med foder og vand til sidst den eksperimentelle taletid.
- Kontrollere status for drierite/tørremiddel; Hvis du bruger et farve indikator, bør det være blå og derfor tør, men hvis det er pink/lilla, det har haft betydelige fugt absorbans og bør erstattes eller toppet.
- Kontrollere tilstanden af ammoniak fælde og soda kalk og Udskift hvis nødvendigt. Hvis ammoniak fælde er tilsluttet to på et tidspunkt, hvor den anden fælde viser tegn på en farveændring af, skal du erstatte den første. En stigning i CO2 forskydning kan også betyde at skulle erstatte soda-kalk.
Bemærk: Tørremidlet kan være tørret i en ovn og genbruges, men vi følger anbefalingerne fra producenten af systemet for at bruge frisk hver gang. - Samle afdelingerne. Placere mad hopper på balancen, for at gøre dette, og derefter placere salen ovenpå med perforeret platform, der bliver gulvet i salen indsat. Omhyggeligt placere musen i salen og Fastgør låget af systemet med forsiden og tilbage klip og sikre før positionering drikkedunken og fastgørelse. Som en sikkerhedsforanstaltning, re-check alle kammer låg, mus og vand (figur 2A-D).
Bemærk: Afhængigt af størrelsen af de mus, der undersøges, kan det være nødvendigt at justere højden på rum over mad hopper, så musene har adgang til mad, men ikke nok plads, som de kan sove direkte på toppen af feeder. - Som det anbefales at gas sensorer kalibreres før hvert forsøg, kalibrere systemet.
- Bruge en gas med kendt sammensætning (0,5% CO2, 20,5% O2, balance kvælstof). Tilslut kalibrering gastank til systemet via en regulator og slange. Tænde og sikre output tanktryk læser 5-10 psi.
Bemærk: Nogle systemer vil have en anden tank, slange og regulator til brug af ren kvælstof som en "offset" gas. Det system, vi opererer i stedet udnytter soda kalk for at generere CO2 fri luft. - Følg procedurerne for at kalibrere både O2 og CO2 sensorer. Vælg "kalibrering" fra værktøjsmenuen og sekventielt kalibrere både O2 og CO2. Før kalibrering sikrer, at 1) prøven og referencen strømme er 0.400 LPM, 2) Zirconia O2 sensor temperaturen er 725 ° C (± 1 ° C), 3) prøven og referencen tørrere og luft pumper er på, og 4) kalibreringsgassen er tilsluttet og tændt.
- Hvis det er nødvendigt, når kalibrering O2 sensor, lidt justere kontrolelementet offset på forsiden af zirconia ilt sensor til at opnå en O2 forholdet mellem værdien af 1,0000 (± 0.0002). Dette er at sikre det er inden for acceptable grænser (fremhævet i grøn skrifttype i software display på skærmen).
- Efter vellykket O2 og CO2 sensor calibration, slå fra kalibrering gas cylinder og afbryde slangen fra regulator. Efter kalibrering, bør O2 for reference luften (atmosfæren) læse 20.92 (± 00,02). Hvis kalibreringen er tolerance, Gentag, og henvise til fejlfinding guider fra producenten. I modsat fald skal du kontakte producenten for yderligere instruktioner.
- Bruge en gas med kendt sammensætning (0,5% CO2, 20,5% O2, balance kvælstof). Tilslut kalibrering gastank til systemet via en regulator og slange. Tænde og sikre output tanktryk læser 5-10 psi.
- Fortsætte med eksperimentelle set-up. Vælg "eksperimentelle fil åben" menuen eksperiment. Vælg den rette skabelon (f.eks. mus). Under "opsætning" i menuen eksperiment definere parametrene for eksperimentet, der skal registreres (fx mus ID, vægt, gruppe, osv.) fravælge enhver kamre ikke er i brug og Vælg lokationen for eksperimentet skal gemmes.
- Sikre tariffer har været tareret hvis måling af fødeindtagelse og starte optagelsen af data ved at vælge "run" i menuen eksperiment. Data er fanget for forskellige længder af tid afhængigt af fænotype, institutionelle retningslinjer på animalsk isolation og brugen af systemet.
Bemærk: I vores hænder, eksperimentet er rutinemæssigt køre for 48 h, med de første 24 timer brugt som tilvænning til det nye miljø og den anden 24 h bruges til dataanalyse. Samling dataperiode er baseret på hvor længe investigator ønsker at holde deres mus enkeltvis opstaldet og afhængige af Dyreetik godkendelse. Alternativt, hvis bestemmelser findes, mus kan være akklimatiseres i kamre før lægges ind i systemet og forbundet. Hvert kammer måles ca. en gang hver 13 min en 12 kammer system er i brug. - Regelmæssigt kontrollere og overvåge de resultater, der er fremstillet mens musene er i systemet for at sikre dyrenes velfærd, og at relevante data indsamles. Eventuelle spørgsmål kan muligvis være identificeret i denne fase og udbedret. Check på hver mus hver morgen og aften, når de er i systemet.
- Check fanen metaboliske øverst på siden data fil til de data, der indsamles i realtid for hver mus med hensyn til ilt forbrug, RER og energi udgifter. I mellemtiden, fjernlys pauser og data for fødeindtagelse kan være placeret i aktivitet og fodring fanerne, henholdsvis. Kontroller, at "O2 i" læsning omkring 20.90-20.94, "CO2 i" er omkring 0.040 - 0,050, RER er mellem 0,7 og 1, og strømningshastigheden er konstant på 0,5 - 0,6 L/min.
- Med regelmæssige mellemrum kontrollere at musene har adgang til mad og vand, og at de indtager hver. Sikre, at de ikke udviser nogen tegn på angst som grave på den perforerede gulve. Også, overvåge de resultater, der vises.
- Ved afslutningen af den tildelte tid, eksperimenterende, Vælg "stop" fra menuen eksperiment og eksportere resultaterne (som CSV-filer, fil > Eksporter > generere emne CSV'S) til analyse.
- Inspicere sundhed af mus, vejer dem og derefter vende tilbage til deres hjem bure.
- Mus kan være fjendtligt indstillet over for hinanden efter separation, så overvåge når de er opstaldet sammen igen.
- Demontere burene, fjerne overskydende mad fra tragte og tip ud nogen afføring, urin og mad fra burene. Dykke flasker og sippers i fortyndet T-bac løsning, blød, og rengør de andre komponenter i fortyndet blegemiddelopløsning. Skyl med rent vand og lad luft tørre.
- Beregne metaboliske parametre med softwaren. Softwaren benytter en række ligninger for at give de endelige data output4.
For beregning af ilt og CO2-produktionen: iltforbrug: VO2 (l/min)= V,jegO2i - VoO2o; Kuldioxid produktion: VCO2 (l/min)= VoCO2o-VjegCO2i
Hvor: Vjeg = input ventilation sats (LPM), Vo = output ventilation sats (l/min), O2i = O2 koncentration på input, O2o = O2 koncentration på output, CO2i = CO2 koncentration på input, CO2o = CO2 -koncentration på output.
For beregning af RER: RER = VCO2 / VO2. Bemærk, at protein oxidation ikke blev målt og derfor RER blev ikke justeret for dette.
Til beregning af energi-udgifter: udgifter til energi: CV = 3.815 + 1.232* RER
Varme (Kcal/h)) = CV * VO2. Hvor: CV er brændværdi (forholdet mellem mængden af forbrug af ilt og varme). Dette er afledt af "The elementer af the Science of Nutrition" omtales som tabellen Lusk, består af Graham Lusk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne ses i figur 3 viser en typisk ændring i kroppen sammensætningen parametre ved høj fedt fodring, målt via EchoMRI. Oprindelig var der ingen forskel i enhver parameter målt (figur 3A-F). Men efter bare 1 uge med højt fedtindhold fodring, var der en betydelig stigning i kropsvægt, fedtmasse og masse fedtprocent i gruppen HFD (figur 3A,B,D). Størrelsen af forskellene mellem de to grupper for disse foranstaltninger fortsatte med at stige over 3 uge kosten intervention. Lean masse, gratis vand og samlede vandindhold (figur 3 c,E,F) ikke variere mellem grupper på ethvert tidspunkt. Det kan også ses, at chow fodret mus fortsatte med at sætte på i vægt over perioden undersøgelse (figur 3A) og at dette skyldtes en stigning i lean masse (figur 3 c) snarere end en fedtmasse øge (figur 3B).
Som det kan ses i figur 4, førte tre uger af høj fedt fodring til en række ændringer som påvist i metaboliske dyret overvågningssystem. VO2 når justeret for kropsvægt var betydeligt højere i de tungere højt fedtindhold fodret mus (figur 4A). Navnlig, resulterede normalisering af VO2 via to forskellige faktorer i to forskellige resultater. Normalisering til kroppens samlede vægt førte til nogen forskel i VO2 mellem den standard chow fodret og højt fedtindhold fodret mus, mens normalisering til lean masse produceret en signifikant forskel (figur 4B,C). Disse resultater viser, at normalisering af VO2 data ved at dividere med masse variabler betydeligt påvirket resultaterne, og forsigtighed bør udvises, når tolkning VO2 data, når det kommer til udtryk på en sådan måde. Se den fremragende diskussion i Tschop, et al. for en detaljeret diskussion af, hvordan du udtrykke VO2 data og effekter for normalisering af forskellige parametre 5 i deres guide til analyse af musen energimetabolisme, Tschop og kolleger foreslå brugen af analyse af Kovarians (ANCOVA) statistisk afhøre virkningerne af kropsvægt og kropssammensætning på energi-udgifter og mad indtag data . I dette tilfælde afslører udfører en ANCOVA på de data, der er vist i figur 4A, ved hjælp af kropsvægt som covariate, at der ingen statistisk signifikant forskel eksisterer mellem normal chow og HFD, der således angiver, når regnskab for kropsvægt, der er ingen forskel i forbrug af ilt mellem grupperne. Dette resultat kan let visualiseres når plotte VO2 mod kropsvægt som en scatterplot som vist i figur 4D. Plotte VO2 mod kropsvægt (figur 4D) viser, at VO2 data ligger på en fælles linje i forhold til kropsvægt, med tungere dyrene forbruge mere ilt. Bemærk viser plotte VO2 mod lean masse, VO2 data ligger på to særskilte linjer i forhold til lean masse (figur 4E).
RER var betydeligt lavere i de højt fedtindhold fodret mus, der angiver fedt udnyttelse over kulhydrat udnyttelse når fodret den højt fedtindhold kost (figur 5A). Energiforbrug (varme) uden normalisering blev øget i de tungere dyr, sandsynligvis på grund af de dyr, som har mere metabolisk aktive væv (figur 5B), med denne forskel går tabt når normaliseret for kropsvægt (figur 5 c). Bemærk også stigninger i VO2, RER og energi udgifter i den mørke cyklus i forhold til den lys cyklus, når musene er mere aktive. Disse forskelle udgør de klassisk daglige ændringer i stofskiftet, der forekommer i mus. I dette eksempel har vi inddelt data i 12-timers blokke, opdeling af data yderligere i mindre tid epoker kan også være nyttige. Fysiske aktivitetsniveau er også en faktor, der bidrager til energi udgifter. Disse var ikke anderledes mellem grupper, hvilket tyder på, at et fald i bevægelse ikke var føreren af den fede fænotype i det høje fedt fodret mus (fig. 5 d).
Anden siden af energi balance ligning er mængden energi, der forbruges og trænger ind i kroppen. For at se på dette aspekt af metabolisme analyserede vi mængden af mad, musene forbruges i metaboliske dyret overvågningssystem. Som kan ses i figur 6A, spiste mus den samme mængde af fødevaren målt i vægt, eller når normaliseret for kropsvægt (fig. 6B). (ANCOVA kan igen bruges til at vurdere virkningen af kropsvægt på fødeindtagelse.) Normalisering af fødeindtagelse til kropsvægt kan være et vigtigt skridt til at overveje, hvis energi udgifter også er blevet normaliseret til vægt, dermed holde hver side af energiligningen i balance. Mens mus spiste den samme mængde af fødevaren, er det vigtigt at tage højde for energitæthed af hver af de diæter, der anvendes. Når tages hensyn til denne faktor, vi observerer mus på HFD forbruge mere energi (figur 6 c) og fra disse eksperimenter er det sandsynligt, at det er at køre den fede fænotype. Det er, da musene tager i mere energi, men de ikke proportionalt expending mere energi, deres fedme kan henføres til energilagring.
Statistik
Alle data i denne hvidbog præsenteres som mean ± standardfejl af middelværdien (SEM). Statistisk signifikans blev sat på p < 0,05. * angiver p < 0,05, ** angiver p < 0,01, *** angiver p < 0,001, og n = 6 pr. gruppe, medmindre angivet. Efterforskere har ikke kunnet blive blændet at kosten gruppe intervention på grund af en forskel i farven på kost. Musene blev tilfældigt valgt, hvilken kost de fik.
Figur 1 : Korrekt placering af musen omkostninger og små dyr præparatholderen indeholdende mus i kroppen sammensætningen analyzer. At udføre en system test ved hjælp af en kalibrering standard (omkostninger) eller til scanning af mus inden for små dyr præparatholderen, placere hver inde gantry af systemet. De røde pile indikerer cylinderen hvor musene vil være indeholdt indtastning gantry af maskinen.
Figur 2 : Samling af individuelle kamre. A) placere mad hopper i midten af saldoen. B) indsætte platformen i hvert kammer og sted kammer over i tragten. C) placere mus i afdelingerne individuelt og sikre låg. D) Position drikkedunken og fastgør.
Figur 3 : Body sammensætning analyse over 3 uger af en høj fedt diæt. A) kropsvægt, B) fedt masse, C) lean masse, D) fedt masse procentdel, E) gratis vandindhold, og F) samlede vandindhold. Cirkler repræsenterer normal chow kost, firkanter repræsenterer HFD. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Metaboliske parametre fremstillet af metabolisk kontrol system dyreforsøg efter 3 uger af de respektive kost. Mus har været opstaldet i kamre for 48 h med den første 24 h som fortrolige. Oplysningerne fra den anden 24 h blev analyseret og præsenteret i disse tal. A) rå VO2 satser, B) VO2 normaliseret for kropsvægt C) VO2 normaliseret til lean masse, D) scatterplot ujusterede VO2 (samlede 24 h periode) at kroppen vejer, t og E) ukorrigeret VO2 til lean masse. A-C Hvide søjler repræsenterer normal chow kost, sorte søjler repræsenterer højt fedtindhold kost. D-E Cirkler repræsenterer normal chow kost, firkanter repræsenterer HFD. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : A) respiratoriske ombytningsforhold (RER), B) varme (energi udgifter), og C) varme normaliseret for kropsvægt. D) aktivitetsniveau beregnes som summen af Ambulant X og Y stråle pauser og Z beam pauser. Hvide søjler repræsenterer normal chow kost; sorte søjler repræsenterer HFD.
Figur 6 : Mad indtag data indhentet i systemet for endelige 24 h. A) fødeindtagelse i gram, B) fødeindtagelse normaliseret for kropsvægt og C) beregnede energiindtag. n = 4-5 (3 mus blev udelukket på grund af at gøre en stor rod med deres mad). Hvide søjler repræsenterer normal chow kost; sorte søjler repræsenterer HFD. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin
De protokoller, der er beskrevet heri giver et eksempel på måder at foranstaltning kropssammensætning og forskellige metaboliske parametre i mus ved hjælp af en krop sammensætning analyzer og en metabolisk dyr overvågningssystem. Begge teknikker er det af afgørende betydning at sikre, at maskinerne fungerer optimalt, og for at gøre dette, er det bydende nødvendigt, at forskeren udfører et system test for krop sammensætning analyzer og kalibrerer til en kendt gas sammensætning for de metaboliske animalsk kontrol system forud for brug af udstyr. Dette vil sikre større konsekvens af resultater og mulighed for at opdage eventuelle problemer med maskinen.
Den måde, hvorpå dataene er normaliseret for de metaboliske kontrol dyreforsøg er også yderst vigtigt at sikre gyldigheden af resultaterne fra teknikken. Som anført i vores repræsentative resultater (figur 4A-E) VO2 kan rapporteres i en række forskellige måder: sin absolutte hastighed (L/min), i forhold til kropsmasse af musen (mL/kg * min), eller i forhold til muskelmassen (mL/kgLBM * min) Hvis dataene er tilgængelige (f.eks fremstillet af en krop sammensætning analyzer). Afhængigt af fænotype, kan det være mere hensigtsmæssigt at normalisere værdierne en særlig måde at udelukke enhver potentiel bias. For eksempel, hvis et dyr har øget kropsmasse, de har mere væv, der er tilgængeligt og i stand til at forbruge ilt og naturligvis deres energi-udgifter er højere. Normalisere at kroppens samlede masse kan ikke være den bedste løsning da det vil bias mod observation af et fald i iltforbrug pr. enhed af masse, selvom iltforbruget af væv ikke kan være anderledes. Som et alternativ til at normalisere at kropsvægt, kan man normalisere at muskelmassen af musen. Som magert væv masse er hovedansvarlig for forbrug af ilt, og lean masse er typisk uændret eller kun beskedent forskellige mellem eksperimentelle grupper, normalisering på denne måde kan være en mere repræsentativ måde at udtrykke VO2 data. Det skal bemærkes, at lean masse rum består af mange forskellige væv, alle med forskellige stofskifte, og derfor normalisering på denne måde kan ikke være passende eller give nogen indsigt i hvilke lean masse komponent er drivkraften bag den ændre. Det udelukker også bidrag af fedt masse komponenten på stofskiftet.
I betragtning af disse spørgsmål, har en alternativ statistisk baseret metode også været foreslået5,6. Analyse af Kovarians () ANCOVA) er en statistisk test, der giver mulighed for sammenligning af en variabel (f.eks. energi udgifter) på tværs af flere grupper samtidig korrigere for andre faktorer eller variabler betegnes kovariater. I denne måde faktorer såsom kropsvægt, fedtmasse og lean masse kan medtages som variabler, der har indflydelse på energi-udgifter, men selv denne metode har sine egne specifikke antagelser6, herunder det faktum, at ved hjælp af flere variabler i ANCOVA forventes at afkræfte det, medmindre variablerne, der er uafhængige af hinanden. Der synes at være nogen perfekt eller universelt aftalte enkelt måde at normalisere og præsentere VO2 eller energi udgiftsdata, kan det være hensigtsmæssigt at vise og præsentere data i en række forskellige måder at give læseren det tydeligste billede af Fænotypen. Fysiske aktivitetsniveau kan øge iltforbrug, og så i dyrene har aktivitet fænotyper (en forhøje eller afmatning), det kan også være nødvendigt at konto/normalisere ændringer i bevægelse for at finde ud af, hvis dette kan tegne helt eller delvist konto for enhver ændring i VO2.
Ændringer og fejlfinding
De repræsentative resultater, der vises i denne protokol blev indhentet fra eksperimenter udført ved en rumtemperatur på 21-22 ° C. Thermoneutral en mus er ca. 30 ° C, så i et traditionelt dyr hus med sin temperatur, sat til 20-22 ° C for menneskers komfort, en mus er sat under termisk stress. For at imødegå dette, er ikke-rystede termogenese aktiveret på disse koldere temperaturer, resulterer i en op til en 2-fold stigning i energi udgifter mellem mus til huse ved 20 ° C sammenlignet med dem, der har til huse på 30 ° C7. Den miljømæssige boliger af mus er en vigtig overvejelse for disse eksperimenter som det har vist sig at boliger af mus på thermoneutrality kan forstærke udviklingen af nogle betingelser, såsom åreforkalkning8 og højt fedtindhold kost-induceret ikke-alkoholiske fedtlever sygdom (NAFLD) patogenese9. Miljømæssige temperatur er også derfor en vigtig overvejelse ved gennemføre eksperimenter i en metabolisk dyr overvågningssystem, som en fænotype kan være til stede ved bestemte temperaturer, men ikke på andre, som kunne pege på en potentiel mekanisme af handling. Et sådant scenario kunne være en fænotype, der indebærer aktivering af rekrutterede beige fedt hvorved en større mængde af dette væv giver mulighed for en større stigning i termogenese under køligere forhold10. Således, det kan være nødvendigt at ændre den miljømæssige sæt op, der blev beskrevet i disse nuværende eksperimenter og at udføre eksperimenter under flere miljømæssige temperaturer til at få en nøjagtig skildring af den sande metaboliske status af modellen. I forbindelse med fejlfinding på grund af tekniske fejl, kan det være nødvendigt at kontakte producenterne direkte til instruktion. Hvis der er problemer med denne type af krop sammensætning analyzer anbefales det at udføre en Gentag scanner test, der kører 25 scanninger mod omkostningerne. Virksomheden skal bruge disse oplysninger til diagnosticering. Ligeledes med det metaboliske animalske overvågningssystem, hvis spørgsmål opstår, indsamle datafiler fra den seneste systemet fungerede godt og filer fra Hvornår problemerne opstod således at støtte kan gøre en sandsynlige diagnose.
Begrænsninger
Mens body sammensætning analyzer giver fremragende data på hele kroppen fedtophobning, tillader det ikke til bestemmelse af regionale fedt depoter. Dette er vigtigt inden for fedme forskning, som ikke alle fedt er de samme, med den placering, fedt har akkumuleret og dets funktionelle egenskaber er særlig vigtig. De beskyttende effekt af subkutant fedt depoter (eller metabolisk sunde fedt) har været beskrevet11. Mikro-beregnet tomografi (mikro-CT) kan skelne mellem subkutane og visceralt fedt12, som kan magnetisk resonans imaging (MR) analyse13. Brug af disse teknikker kan give yderligere oplysninger om stedet af fedt ophobning. Metaboliske dyret overvågningssystem også har sine begrænsninger. Mens samlede daglige energiforbrug kan måles, er systemet ikke i stand til kræsne mellem de forskellige komponenter, der udgør energi udgifter. En yderligere begrænsning af systemet er, at det er muligt, at fedme kan udvikle sig uden et målbart fald i energi udgifter registreres via disse typer af systemer, selv uafhængigt af mad/energi indtag ændringer. Undersøgelser har vist, at små fald i udgifter til energi, som er stor nok til at forårsage betydelig vægt vinde på lang sigt, ikke kan registreres håndfast i sådanne metaboliske systemer over kort sigt14,15, 16. Mens vi har brugt en n 6 per gruppe i den aktuelle undersøgelse for at påvise denne metode som et eksempel undersøgelse, kræver for at opdage små forskelle i energiforbrug, der kan bidrage til fedme sandsynligvis mange flere mus5. Fremskridt i løsningen af påvisning i disse systemer og evnen til at udføre disse typer af undersøgelser over en længere periode vil støtte i evnen til at opdage disse små men betydelige ændringer. Med hensyn til måling af fødeindtagelse, har vi typisk observeret 24 h fødeindtagelse i mus har til huse i metaboliske dyret overvågningssystem er lavere end ville blive overholdt i burene, sandsynligvis på grund af grundene diskuteret ovenfor. Derfor, ud over overvågning fødeindtagelse i dette system, vi desuden vurdere indtagelsen af mad i hjem bure af mus. Mens dette kan kun gøres i en situation, hvor mus fra særlige eksperimentelle grupper er opstaldet separat, har det fordelen, at nær løbende daglig vurdering. Investigator blot vejer mængden af mad i hopper på et bestemt tidspunkt på dagen, altid tegner sig for fødevarer, spredt rundt i buret, og derefter opdeler denne samlede mængde mad indtages efter antallet af mus i buret.
Fremtidige ansøgninger
Mens vi har brugt fedme erhvervet via højt fedtindhold fodring som et eksempel på en sygdom stat hvor måler kropssammensætning og metaboliske parametre er nyttige, brugen af dette udstyr er langt fra begrænset til dette forskningsområde inden for denne gennemgang. Brug af disse teknikker er også værdifulde, når at studere sygdomme såsom diabetes, hjerte-kar-sygdom, aldersrelaterede sarcopenia, skrøbelighed, kræft-kakeksi, muskuløse dystrophies og lipodystrofi. Mens de indledende udgifter til indkøb af sådan infrastruktur er betydelig, evnen til at bruge udstyret på tværs af flere og forskellige områder af medicinsk forskning afbøder denne indledende omkostninger. Derudover er løbende reagens og forbrugsmaterialer omkostninger minimal for disse maskiner; forebyggende vedligeholdelse og servicering skal dog betragtes og budgetteret.
Ligesom lean masse opnået via krop sammensætning analyse kan være en vigtig normalisering faktor for iltforbrug stammer fra metaboliske dyret overvågningssystem, bruges lean masse bestemmelse også til at normalisere narkotika-test doser. For eksempel, i metaboliske undersøgelser er det almindeligt at udføre en intraperitoneal eller oral glukose tolerance test (GTT), eller en intraperitoneal insulin tolerance test (ITT). Disse tests undersøge muligheden for en mus til at disponere over en glucose belastning eller reagere på insulin. Ændringer i blodsukkerniveauet som svar på disse prøver indeholder oplysninger på niveauet for hel-krops glukose og insulin tolerance i modellen. Traditionelt, doseres glukose og insulin bolus administreres i disse tests efter kropsvægt af musen. Men som modeller for fedme akkumulerer fedtmasse over lean masse, dosering pr. kropsvægt kunne skævhed den tungere model mod glukose intolerance i en GTT som de modtager flere glukose. Dette er skyldes, at leveren, skeletmuskulatur og hjerne, organer, der råder over flertallet af glukose i post prandial stat17, er komponenter af lean masse måling og sjældent eller mildt ændre i de fleste modeller. Omvendt, i et ITT når doseres til kropsvægt, en tungere model, der ville modtage mere insulin muligvis mere følsomme over for glucose sænkende virkninger af insulin, udelukkende fordi det har modtaget en større mængde. Derfor, hvis investigator har adgang til krop sammensætningsdata, lean masse kan være den mest hensigtsmæssige foranstaltning, i stedet for hel-krops masse, for sådanne dosering beregninger18. Tager det yderligere, kan lean masse data indhentet fra krop sammensætning analyse også bruges til dosis eksperimentel medicin, hvis behovet opstod konto for lean masse på udelukkelse af fedtmasse. En anden anvendelse af metaboliske dyret overvågningssystem, er ikke blevet drøftet eller påvist i dette håndskrift er knyttet en lukket motoriseret løbebånd til systemet således at parametrene metaboliske drøftede heri kan også måles i løbet øvelse.
Procedurerne i denne gennemgang kan bruges til at karakterisere kropssammensætning og forskellige metaboliske parametre i mus. Disse foranstaltninger gælder for en bred vifte af forskningsområder og kan give vigtige oplysninger til karakterisering af en fænotype. Data, der udledes fra disse metoder kan også give beviser mod underliggende mekanismer køre en bestemt metabolisk fænotype. Yderligere udvikling og forbedring af disse teknologier vil sætte forskerne til at fremme deres resultater over for terapeutiske resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takke personalet fra Alfred medicinalforskning og uddannelse Precinct dyre tjenester (AMREP som) team for deres bistand og pleje af de mus, der anvendes i denne undersøgelse og for støtten, ordningens operationelle infrastruktur støtte den victorianske stats Regeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 in 1 system | EchoMRI | 4 in 1 system | Whole body composition analyser |
| Canola oil test sample (COSTS) | EchoMRI | Mouse-specific (contact company for cat number) | |
| Animal specimen holder | EchoMRI | 103-E56100R | |
| Delimiter | EchoMRI | 600-E56100D | |
| 12 chamber system | Columbus Instruments | Custom built | Metabolic Caging System; includes control program |
| Drierite | Fisher Scientific | 238988 | CLAMS consumable |
| Calibration gas tank | Air Liquide | Mixed to order | Gas calibration (0.5% CO2, 20.5% O2, balance nitrogen). |
| Normal chow diet | Specialty Feeds | Irradiated mouse and rat diet | |
| High fat diet | Specialty Feeds | SF04-001 | |
| Balance | Mettler Toledo | PL202-S | Balance for weighing mice |
| TexQ Disinfectant spray | TexWipe | ||
| Hydrogen Peroxide cleaning solution | TexWipe | TX684 |
References
- Chen, W., Wilson, J. L., Khaksari, M., Cowley, M. A., Enriori, P. J. Abdominal fat analyzed by DEXA scan reflects visceral body fat and improves the phenotype description and the assessment of metabolic risk in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 303 (5), E635-E643 (2012).
- Kovner, I., Taicher, G. Z., Mitchell, A. D. Calibration and validation of EchoMRI whole body composition analysis based on chemical analysis of piglets, in comparison with the same for DXA. Int J Body Compos Res. 8 (1), 17-29 (2010).
- EchoMRI. Software User Manual: Whole body composition analyzer. , (2016).
- Columbus Instruments. Oxymax for Windows User Manual. , September (2014).
- Tschop, M. H., et al. A guide to analysis of mouse energy metabolism. Nat Methods. 9 (1), 57-63 (2011).
- Speakman, J. R. Measuring energy metabolism in the mouse - theoretical, practical, and analytical considerations. Front Physiol. 4, (2013).
- Swoap, S. J., et al. Vagal tone dominates autonomic control of mouse heart rate at thermoneutrality. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (4), H1581-H1588 (2008).
- Tian, X. Y., et al. Thermoneutral housing accelerates metabolic inflammation to potentiate atherosclerosis but not insulin resistance. Cell Metab. 23 (1), 165-178 (2016).
- Giles, D. A., et al. Thermoneutral housing exacerbates nonalcoholic fatty liver disease in mice and allows for sex-independent disease modeling. Nat Med. 23 (7), 829-838 (2017).
- Lee, M. W., et al. Activated type 2 innate lymphoid cells regulate beige fat biogenesis. Cell. 160 (1-2), 74-87 (2015).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity. Nat Med. 18 (10), 1539-1549 (2012).
- Judex, S., et al. Quantification of adiposity in small rodents using micro-CT. Methods. 50 (1), 14-19 (2010).
- Chaurasia, B., et al. Adipocyte ceramides regulate subcutaneous adipose browning, inflammation, and metabolism. Cell Metab. 24 (6), 820-834 (2016).
- Matthews, V. B., et al. Interleukin-6-deficient mice develop hepatic inflammation and systemic insulin resistance. Diabetologia. 53 (11), 2431-2441 (2010).
- Tschop, M., Smiley, D. L., Heiman, M. L. Ghrelin induces adiposity in rodents. Nature. 407 (6806), 908-913 (2000).
- Garcia, M. C., et al. Mature-onset obesity in interleukin-1 receptor I knockout mice. Diabetes. 55 (5), 1205-1213 (2006).
- Kowalski, G. M., Bruce, C. R. The regulation of glucose metabolism: Implications and considerations for the assessment of glucose homeostasis in rodents. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (10), E859-E871 (2014).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297 (4), E849-E855 (2009).
