Summary
I denne studien, vi beskriver en metode for å analysere C924T genotype. Protokollen består av tre faser: DNA utvinning, forsterkning av polymerasekjedereaksjons (PCR) og analyse av begrensning fragment lengde polymorfisme (RFLP) på agarose gel.
Abstract
Thromboxane A2 reseptor (TBXA2R) genet er medlem av G-protein kombinert gruppe med sju-transmembrane regioner. Det er involvert i atherogenesis progresjon, iskemi og hjerteinfarkt. Her presenterer vi en metode for pasienten genotyperingteknologi å undersøke post-transcriptional rollen som C924T polymorfisme (rs4523) ligger i regionen 3 av TBXA2 reseptor genet. Denne metoden er avhengig av DNA utvinning fra fullblod, polymerase kjedereaksjon (PCR) forsterkning av TBXA2 genet delen inneholder C924T mutasjon, og identifikasjon av vill-type og/eller mutant genotyper bruker en begrensning digest analyse, spesielt en begrensning fragment lengde polymorfisme (RFLP) på agarose gel. I tillegg ble resultatene bekreftet av sekvensering TBXA2R genet. Denne metoden har flere potensielle fordeler, for eksempel høy effektivitet og rask identifisering av C924T polymorfisme av PCR og begrensning enzym. Denne tilnærmingen kan en prediktiv studie for plakk formasjon og aterosklerose progresjon ved å analysere pasienten genotyper for TBXA2R C924T polymorfisme. Anvendelsen av denne metoden har potensial til å identifisere emner som er mer utsatt for aterotrombotiske prosesser i fagene i en høy-risiko, aspirin-behandlet gruppe.
Introduction
TBXA2R er medlem av G-protein kombinert gruppe med sju-transmembrane regioner, som er uttrykt og lokalisert på cellemembraner eller på intracellulær strukturer1,2. TBXA2R signalveien er involvert i avansert aterosklerotisk prosesser3. Økt uttrykk for TBXA2 reseptoren var vist under atherogenesis progresjon, og kliniske og eksperimentelle studier viste sin relevante rolle i iskemi og hjerteinfarkt4. C924T, en single nukleotid polymorfisme (SNP) av TBXA2R genet, ble anerkjent som en funksjonell polymorfisme hos friske frivillige, og har vært knyttet til kliniske lidelser5. Videre vist våre tidligere studie6 at C924T polymorfisme av TBXA2R genet er involvert i transkripsjon stabilitet; det oppstår en øket ustabilitet av mutant (TT) type transkripsjon forhold til wild type (CC). I tillegg indusert flere stimuli som adenosindifosfat (ADP), adrenalin og kollagen i ulike konsentrasjoner trombocyttaggregasjon mindre effektiv for den muterte (TT). Dette er i tråd med redusert dannelse og hemostasen. Dermed kan ustabilitet i TBXA2R transkripsjon og tilknyttede reduksjon av trombocyttaggregasjon være assosiert med en beskyttende rolle for TBXA2R TT genotype mot atherothrombosis og dens komplikasjoner i høyrisikoatferd aspirin-behandlede pasienter6 .
Her beskriver vi en metode for pasienten genotyperingteknologi å undersøke post-transcriptional rollen som C924T polymorfisme (rs4523) ligger i regionen 3 av TBXA2 reseptor genet. Denne metoden er avhengig av følgende: (1) DNA utvinning fra fullblod, (2) PCR forsterkning av TBXA2R genet delen inneholder C924T mutasjon, og (3) identifikasjon av vill-type og/eller mutant genotyper bruker begrensningen fragment lengde polymorfisme (RFLP) på agarose gel. RFLP er en teknikk som utnytter variasjoner i homologe DNA-sekvenser7. Dette programmet ble brukt til å oppdage DNA polymorfismer, spesielt SNPs, og for å finne og knytte biologiske relevans i genetisk variasjoner8. Polymorfisme analysert for første gang ved hjelp av RFLP-PCR hos mennesker var ABO blod9. Metoden RFLP PCR tillater analyse av genetiske mutasjoner i homologe DNA-sekvenser ved å evaluere tilstedeværelsen av fragmenter av ulike lengder etter DNA fordøyelsen bruker svært spesifikke begrensning endonucleases10.
I tidligere år har de følgende metodikkene har vært benyttet for SNP analyse ved hjelp av PCR teknikk: hybridisering kort allel-spesifikke oligonucleotides11, allel-spesifikke PCR12, primer forlengelse på DNA microarrays13, oligonucleotide ligation analysen14, direkte DNA sekvensering for identifiserende posisjon-spesifikke enkelt-nukleotid polymorfismer15, Taqman metoden16, utvinning Matrix-Assisted Laser desorpsjon/ionisering Time Of Flight ( MALDI-TOF) massespektrometri17, og GeneChips18. Disse teknikkene er ikke enkel å bruke og krever dyrt utstyr. Derimot metoden PCR-RFLP er rimelig, enkel å bruke, praktisk, har en høy effektivitet, og tillater rask identifisering av C924T polymorfisme. I tillegg har vi bekreftet resultatene av sekvensering TBXA2R genet bruker Sanger metoden15.
Denne tilnærmingen kan en prediktiv studie av plakk dannes og aterosklerose progresjon ved å analysere pasienten genotyper for TBXA2R C924T polymorfisme. Denne metoden kan identifisere fag mer utsatt for aterotrombotiske prosesser, spesielt de blant høyrisikoatferd, aspirin-behandlede pasienter.
Protocol
Protokollen følger retningslinjene i medisinsk forskning etikk komiteen av universitetet av Chieti.
1. reagens oppsett
- Forberede Tris-EDTA (TE) bufferen (pH 8.0). Legg til 200 µL av EDTA 0,5 M og 1 mL av Tris-Cl 1 M i et beaker og bringe til 100 mL med sterilt vann. TE buffer siste konsentrasjon: 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA. Lagre ved romtemperatur (RT).
- Forberede 1 L 10 x lagerløsning geleelektroforese buffer (TBE). Oppløse 108 g Tris base, 55 g borsyre og 40 mL av EDTA 0,5 M (pH 8) i et beaker, og volumet av 1 L med sterilt vann. Butikken på RT.
- Forberede gel lasting fargestoff. Oppløse 0,25 g bromophenol blå, 0,25 g xylen cyanol FF, 50 g av glyserol, 1 mM av EDTA (pH 8) i 60 mL ikke-ionisert eller destillert vann, og føre til et volum av 100 mL med sterilt vann. Lagre på 4 ° C (for et par måneder) eller på 20 ° C (i år)
-
Forberede 200 mL 2% agarose gel. Bruk det frisk eller, eventuelt lagre styrket på RT for opptil flere uker.
- Oppløse 4 g agarose i 200 mL 1 x TBE buffer i en 600 mL kanne. Rør med en magnetisk blandebatteri i ca 5 min til agarose er helt suspendert.
- Heat 2% agarose løsningen i kokende vann eller på en varm plate (for ca 10 min før agarose er fullstendig oppløst). Merk at kanne med agarose gel må være dekket med aluminiumsfolie. Alternativt, varme avdekket begeret i en mikrobølgeovn på høy temperatur for ca 3-5 min.
- Swirl 2% agarose løsningen med et magnetisk blandebatteri, sjekker at agarose er fullstendig oppløst.
Merk: Partikler av agarose vises som gjennomsiktig korn før fullstendig oppløsning. Det kan være nødvendig å varmes opp partikler i flere minutter (ca 5-10 min). - Hvis en lagret porsjon agarose gel brukes, varme begeret, dekket med aluminiumsfolie, i et varmt vann bad (på ca 60 ° C) inntil agarose er oppløst. Fjerne med en Pasteur pipette "spor" av befestet agarose fra overflaten før strømme.
2. DNA rensing
-
Gjør følgende før du starter rensing:
- Bruk menneskelige frisk hele blodprøver, eller tine fullblod frosne prøvene raskt (i ca 2-3 min) i et vannbad (på 37 ° C) bruke en mild agitasjon og deretter equilibrate å RT før bruk.
- Blande frisk eller tinte blodprøver invertere rør flere ganger.
- Start den rensing prosedyren ved å følge leverandørens protokoller for 100 µL elueringsrør volum.
-
Kvantifisere og beregne renheten av DNA måle absorbansen på 260, 280 og 320 nm.
- Bruk sterilt vann å fortynne prøvene og kalibrere spektrofotometeret.
- Bruk følgende formel for å beregne konsentrasjonen av DNA-prøve = 50 µg/mL x (en260 − A320) x fortynningsfaktoren og renhet av DNA = (en260 − A320) / (en280 − A320), med en akseptabel ratio 1.7 og 1,9.
3. PCR forsterkning av DNA-prøver
- Forberede 25 µL av reaksjonsblandingen i en 0,2 mL mikro-forsterkning tube, som vist i tabell 1.
- Utføre et PCR-forsterkning av de renset DNA-prøvene ved å bruke et automatisert termisk cycler, følge forsterkning programmet vist i tabell 2.
- På slutten av PCR forsterkning, innom PCR reaksjonene forlater DNA-prøver på 4 ° C.
4. RFLP PCR produkter
- Klargjøre 22,5 µL av master-mix løsning for hver prøve, slik at den valgte begrensning enzymet fordøyer PCR produkter, som vist i tabell 3.
- Overføre 2,5 µL av PCR-produkt til en ny PCR tube for hver prøve, bruker en pipette og filter tips.
- Legge til 22.5 µL av fordøyelsen master-mix løsning til rør som inneholder PCR produktet av hver prøve, bruker en pipette og filter tips.
- Inkuber reaksjonsblandingen (master-mix løsning og PCR produkt) på 37 ° C 4 h.
5. gel geleelektroforese analyse av PCR-RFLP prøver
- Flekk agarose gel ved å legge ethidium bromide (EtBr) på 0,5 µg/mL gel for 10 min. EtBr binder til DNA, som kan visualiseres under ultrafiolett (UV) lys.
Advarsel: Det er viktig å bruke hansker og andre verneinnretninger under håndtering, lager og salg av EtBr, fordi det er en mutagen med potensielle kreftfremkallende. - Hell i forberedt agarose gel i en gel skuff med godt kammen på plass, og vente til det er styrket.
- Plass befestet agarose gel i boksen gel (geleelektroforese enhet).
- Fyll boksen gel med 1 x TBE til gel er dekket.
- Med en pipette og filter tips, Legg 6 µL av forsterket sammendraget DNA (spesielt laste 5 µL av hvert utvalg og 1 µL av gel lasting fargestoff) i brønnene av agarose gel. Legge til merketråd DNA størrelse i en egen godt og parallelt med prøvene.
- Kjør gel i 20-30 min 100 V.
- Med en UV-transilluminator, visualisere cleaved DNA fragmenter eller ufordøyd PCR produktene, sammenligne fragmenter med DNA størrelse markør og registrere resultatene av fotografi følge instruksjonene fra produsenten.
Advarsel: Bruk beskyttende enheter (vernebriller eller en ansiktsmaske) rundt UV lys kilder.
Representative Results
Målet med denne metoden er å evaluere Thromboxane A2 reseptor genotype med hensyn til C924T polymorfisme. Menneskelige TBXA2R genet ligger på 19p13.3, strekker seg 15 kbp og består av tre exons atskilt med to introns. C924T polymorfismer av TBXA2R genet (av 539 bp) ble forsterket bruker PCR primere vist i figur 1, som var godt utviklet å forsterke et bestemt DNA-område, men ikke en orthologous eller paralogous uspesifikke regionen. I tillegg en RFLP analyse med et RsaI begrensning enzym (figur 1) på PCR produktene ble utført og resultatene var visualisert på et agarose gel, for å karakterisere den bestemte studerte SNP.
Basert på tilstedeværelsen av ulike fragment lengder etter fordøyelsen av DNA, er det mulig å diskriminere pasientens genotype for C924T polymorfisme. Faktisk, som vist på figur 2, viser homozygosity av de store allelet (CC) to band (395 og 144 bp), fordi begrensningen enzymet nøyaktig kutt delen TBXA2R gene på webområdet C924T polymorfisme. Homozygosity av de mindre allelet (TT) er demonstrert av et enkelt band (539 bp), fordi begrensningen enzym kutte ikke oppstår. Det heterozygote (CT) allelet viser tre band (539, 395 og 144 bp). Som vist i figur 2, er den C924T polymorphism, definert av RsaI fordøyelsen PCR produkt, bekreftet av sekvens analyse.
| Komponent | Volum (µL) | Siste konsentrasjon |
| 10 x PCR buffer Tween-20 (15 M MgCl2) | 0,25 | 1.5 MgCl2 mmol/L |
| dNTP blanding (10 mM) | 1 | JEKTET 200 ΜM BAKOVER |
| Primer (fremover) (10 pmol/µM) | 1 | 0,4 ΜM/ΜL |
| Primer (omvendt) (10 pmol/µM) | 1 | 0,4 ΜM/ΜL |
| Taq utvalg (5 U/µL) | 0,2 | 1 U/ΜL |
| Prøve DNA (42 ng/µL) | 1 | 42 ng/µL |
| DNase-gratis-vann | 20.55 | |
| Totalt | 25 |
Tabell 1: PCR forsterkning oppsett. En 25 µL master-mix reaksjonen blanding satt opp i en 0,2 mL PCR tube å forsterke en enkelt DNA-prøve.
| Standard PCR | |||
| Første aktivering trinn | 5 min | 95 ° C | |
| 3-trinns sykling | |||
| Rødsprit | 30 s | 94 ° C | |
| Avspenning | 60 s | 55 ° C | |
| Utvidelse | 60 s | 72 ° C | |
| Antall sykluser | 30 sykluser | ||
| Endelig utvidelse | 8 min | 72 ° C | |
Tabell 2: PCR forsterkning programmet. Sette opp et automatisert termisk cycler for å utføre PCR og forsterke malen DNA. PCR reaksjoner er stoppet av chilling på 4 ° C.
| Komponent | Volum (µL) (n = 1) | Volum (µL) (n = 10) * |
| 10 x enzym buffer | 2.5 | 27.5 |
| Begrensning enzym (5 U/µL) | 0,5 | 5.5 |
| DNase-gratis-vann | 19,5 | 214.5 |
| Totalt | 22,5 | 247.5 |
Tabell 3: Begrensning enzym fordøyelsen av PCR. En master-mix løsning er forberedt slik at valgte begrensning enzymet fordøyer PCR produktene. *: Sette opp en master-mix løsning for 10 prøver, legge 10% mer, til slutt gjør opp 11 prøver.
Figur 1: PCR primere og RsaI begrensning enzym. Revers primerne beregnet på forsterke den TBXA2R gene delen av 539 bp som inneholder C924T polymorfisme. RsaI er begrensning enzymet valgt å gjenkjenne GTAC nettsteder. ˅: kutte området av RsaI enzym. C(/T): C924T polymorfisme. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Electrophoretic mønster og DNA sekvens analyse. (A) C924T genotype er anerkjent av RFLP mønsteret etter fordøyelsen med bestemte RsaI enzymet. (B) DNA sekvens analyse: resultatene av RFLP etter fordøyelsen med RsaI begrensning enzymet ble bekreftet sekvens analyse viser C924T polymorfisme. Dette tallet er endret fra De Iuliis et al., prostaglandiner & andre Lipid meglere6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
I studien, har vi beskrev en metode som tillater pasientens genotyperingteknologi for å undersøke post-transcriptional rollen som C924T polymorfisme (rs4523) ligger i regionen 3 av TBXA2R genet. Først denne metoden er avhengig av DNA utvinning fra fullblod. Spesielt består denne første prosessen av en renselse av totale menneskelige DNA, genomisk og mitokondrie, fra hele blodprøver friske eller frosne, behandlet med EDTA (citrate eller heparin). For kort sikt lagring av hele blodprøver, lagre på 2-8 ° C for opp til 10 dager. For lagring lagre over 10 dager, prøver på-70 ° C. En automatisert renselsesprosess omfatter 4 trinn: lyse, binder, vaske og elute. Andre bruker metoden PCR forsterkning av TBXA2R genet delen inneholder C924T mutasjon. Til slutt, identifikasjon av vill type eller mutant genotype bruke en begrensning enzym analyse (RFLP) på agarose gel utføres.
Avgjørende skritt i protokollen er følgende: (i) i saken som en del av agarose gel lagret på RT brukes, befestet agarose kan være nytt oppløst over et kokende vann bad (på 60 ° C i ca 15-20 min) eller i en mikrobølgeovn (3-5 minutter) før strømme. Merk: løsne hetten da re smelter agarose i en flaske. (ii), videre når varme agarose, fordampning forårsaker en økning av konsentrasjonen. Derfor kan det være nyttig å kompensere ved å legge en liten mengde vann. (iii) DNA fragmenter av mindre enn 1000 bp var atskilte av agarose gel, og TBE buffer anbefales å få best mulig separasjon. (iv) vi foretrekker å bruke en agarose gel i stedet for en polyakrylamid gel fordi utarbeidelse av sistnevnte er mer vanskelig, og det tar mye lengre tid å sette opp. (v) valg av kjøretiden til gel geleelektroforese er avhengig av den forventede størrelsen av forsterkning produktene. Basert på denne protokollen, er det tilstrekkelig å utføre en geleelektroforese i 20-30 min 100 V i 2% agarose gel, siden størrelsen på PCR fragmenter spenner fra 100-500 bp. (vi) er det obligatorisk å få 10 til 50 ng av en god mal DNA utdraget fra menneskelige prøver . Derfor foretrekker vi å bruke en automatisert DNA-rensing i stedet for en semi-automatisk eller manuell. (vii) forberede master-mix reaksjonen for PCR forsterkning og master-mix løsningen for PCR produkter fordøyelsen, å legge 10% mer (å konto for tap av væske under pipettering) volumet beregnes multiplisert med antall utdrag for volumet kreves for en DNA-prøve.
Den vanligste fallgruven metoden er ekstra forsterkning produkter på grunn av en feil termisk cycler program, en feil forsterkning master-blanding forberedelse eller en DNA mal forurensning. Videre kan fravær av PCR produkter være grunn deaktivert Taq utvalg eller et feil termisk cycler kjøre. I tillegg kan tilstedeværelsen av uventet fragmenter være PCR kontaminering av produktet eller en ufullstendig fordøyelsen fra et deaktivert enzym, for lite mengden begrensning enzym volum eller gangen for kort inkubasjon.
I de siste årene har de følgende metodikkene har vært benyttet for SNP analyse ved hjelp av PCR teknikk: hybridisering kort allel-spesifikke oligonucleotides11, allel-spesifikke PCR12, primer forlengelse på DNA microarrays13 , oligonucleotide ligation analysen14, direkte DNA sekvensering identifisere posisjon-spesifikke enkelt-nukleotid polymorfismer15, Taqman metoden16, utvinning Matrix-Assisted Laser desorpsjon/ionisering Tid-av-fly (MALDI-TOF) massespektrometri17, og GeneChips18. Disse metodene er ikke ideelt fordi de ikke er enkelt å bruke og/eller krever dyrt utstyr. Derimot PCR-RFLP metoden beskrevet i denne studien er rimelig, enkel å bruke, praktisk, har en høy effektivitet, og tillater rask identifisering av C924T polymorfisme. En begrensning til stede metoden er at det kan bare brukes for et lite antall SNPs og noen eksempler i en arbeidsøkt.
For framtidige applikasjoner, kan denne metoden brukes for prediktiv studier om plakk formasjon og aterosklerose progresjon ved å analysere de pasient genotyper for TBXA2R C924T polymorfisme. Videre denne metoden kunne identifisere fag mer utsatt for aterotrombotiske prosesser, spesielt høy risiko pasienter behandlet med aspirin. Til slutt denne metoden kan brukes for å studere andre polymorfismer involvert i personlig medisin for bestemte stoffer (for eksempel antikoagulanter og antiepileptika) for å forstå den aktuelle narkotika doseringen og enkelt farmakologiske og klinisk respons for hver pasient før du begynner terapi og for å unngå bivirkninger.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble delvis finansiert av 60% Ateneo tilskudd fra Ministero dell'Università, Italia S.M. og E.T. Vi har også fått delvis bidrag til forskning utgifter av Institutt for medisinsk, Oral og bioteknologisk vitenskap, Universitetet i Chieti "G. d'Annunzio".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAsymphony SP | QIAGEN | 937055 | |
| Spectrophotometer | EPPENDORF | 6131-02222 | |
| UV-transilluminator | UVP | 732-110 | |
| PCR tubes | EPPENDORF | H0030121589 | |
| PCR thermal cycler | EPPENDORF | 5331-03721 | |
| Pipettors and filter tips | EPPENDORF | H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02 | |
| Horizontal minigel electrophoresis apparatus | DIATECH PHORESIS 10 | RI002-10 | |
| Dry block heater | TWIN INCUBATOR | DG210 | |
| QIAsymphony DNA Midi Kit | QIAGEN | 931255 | |
| 10x PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) | DIATECH AND TAKARA | T0100 AND R0001DM | |
| Taq polymerase | TAKARA | R0001DM | |
| dNTP mixture | DIATECH pharmacogenetics | NM001 | dNTP MIX 10x 100 microliters, 10 mM |
| PCR primers | DIATECH pharmacogenetics | \\ | |
| Restriction enzyme RsaI | New England biolabs | R0167L | |
| Restriction enzyme 10x buffer | New England biolabs | R0167L | |
| Agarose | Sigma | A9539 | DNA fragments are best separated in TBE buffer |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| Boric acid | Sigma | B7901 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E7889 | |
| 10% (wt/vol) ammonium persulfate | Sigma | E3678 | prepared fresh each time |
| EtBr (0.5 μg/μL) | Sigma | E8751 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
| Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| DNA size marker | DIATECH pharmacogenetics | R1002-10 | Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI |
| Sterile water (autoclaved) | DIATECH pharmacogenetics | \\ |
References
- Shen, R. F., Tai, H. H. Thromboxanes: synthase and receptors. J Biomed Sci. 5 (3), 153-172 (1998).
- Nusing, R. M., Hirata, M., Kakizuka, A., Eki, T., Ozawa, K., Narumiya, S. Characterization and chromosomal mapping of the human thromboxane A2 receptor gene. J Biol Chem. 268 (33), 25253-25259 (1993).
- Cyrus, T., Ding, T., Praticò, D. Expression of thromboxane synthase, prostacyclin synthase and thromboxane receptor in atherosclerotic lesions: correlation with plaque composition. Atherosclerosis. 208 (2), 376-381 (2010).
- Cipollone, F., et al. A Polymorphism in the Cyclooxygenase 2 Gene as an Inherited Protective Factor Against Myocardial Infarction and Stroke. JAMA. 291 (18), 2221-2228 (2004).
- Fontana, P., et al. Identification of functional polymorphisms of the thromboxane A2 receptor gene in healthy volunteers. Thromb Haemost. 96 (3), 356-360 (2006).
- De Iuliis, V., et al. Differential TBXA2 receptor transcript stability is dependent on the C924T polymorphism. Prostaglandins Other Lipid Mediat. pii. (17), (2017).
- Saiki, R. K., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230 (4732), 1350-1354 (1985).
- Collins, F. S., Brooks, L. D., Chakravarti, A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation. Genome Res. 8 (12), 1229-1231 (1998).
- Lee, J. C. -I., Chang, J. -G. ABO genotyping by polymerase chain reaction. J. Forensic Sci. 37 (5), 1269-1275 (1992).
- Masao, O., Hirofumi, F., Jerzy, K. K., Hidetoshi, I. Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. Nature Protocols. 2 (11), 2857-2864 (2007).
- Iwasaki, H., et al. Accuracy of genotyping for single nucleotide polymorphisms by a microarray-based single nucleotide polymorphism typing method involving hybridization of short allele-specific oligonucleotides. DNA Res. 9 (2), 59-62 (2002).
- Papp, A. C., Pinsonneault, J. K., Cooke, G., Sadee, W. Single nucleotide polymorphism genotyping using allele-specific PCR and fluorescence melting curves. Biotechniques. 34 (5), 1068-1072 (2003).
- O'Meara, D., Ahmadian, A., Odeberg, J., Lundeberg, J. SNP typing by apyrase-mediated allele-specific primer extension on DNA microarrays. Nucleic Acids Res. 30 (15), e75 (2002).
- Pickering, J. Integration of DNA ligation and rolling circle amplification for the homogeneous, end-point detection of single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 30 (12), e60 (2002).
- Chatterjee, P. D. Direct sequencing of bacterial and P1 artificial chromosome-nested deletions for identifying position-specific single-nucleotide polymorphisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (23), 13276-13281 (1999).
- Livak, K. J. Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay. Genet. Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Res. 7 (4), 378-388 (1997).
- Gunderson, K. L., Steemers, F. L., Lee, G., Mendoza, L. G., Chee, M. A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology. Nat. Genet. 37 (5), 549-554 (2005).
