In de huidige studie, beschrijven we een methodologie voor het analyseren van het genotype van de C924T. Het protocol bestaat uit drie fasen: DNA-extractie, versterking van de Kettingreactie van de polymerase (PCR) en een analyse van de beperking fragment length polymorphism (RFLP) op agarose gel.
Het Thromboxaan A2-receptor (TBXA2R) gen is een lid van het G-eiwit gekoppelde superfamilie met zeven-transmembraan regio’s. Het is betrokken bij de atherogenese progressie, ischemie en myocardiaal infarct. Hier presenteren we een methode voor patiënt genotypering te onderzoeken van de post-transcriptional rol van de C924T polymorfisme (rs4523) gelegen op de 3′-regio van de TBXA2 receptor gen. Deze methode is gebaseerd op DNA-extractie van volbloed, polymerase kettingreactie (PCR) versterking van het TBXA2 gene gedeelte met de C924T mutatie, en de identificatie van wild type en/of mutant genotypen met behulp van een beperking digest analyse, specifiek een beperking fragment length polymorphism (RFLP) op agarose gel. Daarnaast werden de resultaten bevestigd door het TBXA2R gen sequencing. Deze methode beschikt over verschillende potentiële voordelen, zoals hoog rendement en de snelle identificatie van het polymorfisme van de C924T door PCR en restrictie-enzym-analyse. Deze benadering biedt een voorspellende studie voor de vorming van de plaque en atherosclerose progressie door het analyseren van de patiënt genotypen voor het polymorfisme van de TBXA2R C924T. Toepassing van deze methode heeft de potentie om de proefpersonen meer gevoelig zijn voor atherotrombotische processen, in bepaalde onderwerpen in een groep met een hoog risico, aspirine-behandeld.
TBXA2R is een lid van het G-eiwit gekoppelde superfamilie met zeven-transmembraan regio’s, die zijn grote schaal uitgedrukt en gelokaliseerd op de membranen van de cel of op de intracellulaire structuren1,2. De TBXA2R signalering traject is betrokken bij geavanceerde atherosclerotische processen3. Verhoogde expressie van de TBXA2 receptor was aangetoond tijdens de atherogenese progressie en klinische en experimentele studies toonde haar relevante rol in ischemie en myocardiaal infarct4. C924T, een single nucleotide polymorphism (SNP) van het TBXA2R gen, werd erkend als een functionele polymorfisme bij gezonde vrijwilligers en is gekoppeld aan klinische aandoeningen5. Bovendien, onze vorige studie6 aangetoond dat het polymorfisme van de C924T van de TBXA2R-gen is betrokken bij transcript stabiliteit; in het bijzonder, is er een toenemende instabiliteit van de mutant (TT) type afschrift met betrekking tot de wild-type (CC). Bovendien veroorzaakte verschillende prikkels zoals adenosinedifosfaat (ADP), adrenaline en collageen in verschillende concentraties een aggregatie van de bloedplaatjes minder effectief voor het mutant type (TT). Dit komt overeen met een vorming van verminderde trombose en hemostase. Dus, de instabiliteit van het afschrift van de TBXA2R en de bijbehorende vermindering van de aggregatie van de bloedplaatjes kunnen gepaard gaan met een beschermende rol voor de TBXA2R TT-genotype tegen atherothrombosis en de complicaties in risicovolle aspirine-behandelde patiënten6 .
Hier beschrijven we een methodologie voor de patiënt genotypering te onderzoeken van de post-transcriptional rol van C924T polymorfisme (rs4523) gelegen op de 3′-regio van de TBXA2 receptor gen. Deze methode berust op de volgende stappen: (1) DNA-extractie van volbloed, (2) PCR versterking van het TBXA2R gene gedeelte met de C924T mutatie, en (3) de identificatie van wild type en/of mutant genotypen met beperking fragment lengte polymorfisme (RFLP) op agarose gel. RFLP is een techniek die gebruik maakt van de variaties in homologe DNA-sequenties7. Deze toepassing werd detecteren DNA-polymorfismen, vooral SNPs, te zoeken en koppelen van biologische relevantie in genetische variaties8gebruikt. Het polymorfisme geanalyseerd voor de eerste keer met behulp van de RFLP-PCR bij de mens was de ABO bloed9. De RFLP-PCR-methode kan de analyse van genetische mutaties in homologe DNA-sequenties te evalueren van de aanwezigheid van fragmenten van verschillende lengtes na de spijsvertering van DNA met zeer specifieke beperkingsendonucleases10.
In afgelopen jaren de volgende methoden hebben gebruikt voor SNP analyse met behulp van de PCR-techniek: kruising van korte allele-specifieke oligonucleotides11, allele-specifieke PCR12, primer extensie op DNA microarrays13, Oligonucleotide afbinding assay14, directe DNA sequencing voor identificerende positie-specifieke enig-nucleotidepolymorfisme15, Taqman methode16, extractie () Matrix-Assisted Laser desorptie/ionisatie Time-Of-Flight MALDI-TOF) massaspectrometrie17en18van de GeneChips. Deze technieken zijn niet eenvoudig te gebruiken en voorschrijven dure apparatuur. Omgekeerd, de PCR-RFLP-methode is goedkoop, handig en eenvoudig te gebruiken, heeft een hoog rendement en snelle identificatie van de C924T polymorfisme kunt. Bovendien, bevestigd we de resultaten door het TBXA2R-gen met behulp van de methode Sanger15sequencing.
Deze benadering biedt een voorspellende studie van plaque vorming en atherosclerose progressie door het analyseren van de patiënt genotypen voor het polymorfisme van de TBXA2R C924T. Deze methode kan de proefpersonen meer vatbaar voor atherotrombotische processen, met name degenen onder met een hoog risico, aspirine-behandelde patiënten.
In de huidige studie, hebben we een methodologie waarmee patiënten genotypering te onderzoeken van de post-transcriptional rol van C924T polymorfisme (rs4523) gelegen op de 3′-regio van de TBXA2R-gen beschreven. Eerst, is deze methode gebaseerd op DNA-extractie uit volbloed. Met name bestaat dit eerste proces uit een zuivering van totale menselijke DNA genomic en mitochondriale, vanuit volbloed monsters vers of bevroren, met EDTA (citraat of heparine) behandeld. Voor korte termijn opslag van geheel bloedmonsters, bewaren bij 2-8 ° C voor maximaal 10 dagen. Voor opslag over 10 dagen, slaan monsters op 70 ° C. De geautomatiseerde zuiveringsproces bestaat uit 4 stappen: lyse, binden, wassen en elueer. Ten tweede, de methode is gebaseerd op PCR versterking van het TBXA2R gene gedeelte met de C924T mutatie. Tot slot, de identificatie van de wild type en/of de mutant genotype met behulp van een restrictie-enzym-analyse (RFLP) op agarose gel wordt uitgevoerd.
Kritische stappen in het protocol zijn de volgende: (i) In het geval dat een gedeelte van het agarose gel opgeslagen op RT wordt gebruikt, de gestolde agarose kan opnieuw opgeloste op een kokend waterbad (bij 60 ° C gedurende ongeveer 15-20 min) of in de magnetron (3-5 min) vóór het gieten. Opmerking: draai het GLB wanneer opnieuw smelten agarose in een fles. (ii), bovendien, wanneer opnieuw verwarming agarose, verdamping zal veroorzaken een toename van de concentratie ervan. Om deze reden zou het nuttig zijn om te compenseren door een kleine hoeveelheid water toe te voegen. (iii) DNA-fragmenten van minder dan 1000 bp werden onderscheiden zich door agarose gel en FSME buffer wordt aanbevolen voor de best mogelijke scheiding. (iv) wij liever met een agarose gel in plaats van een polyacrylamide-gel, omdat de voorbereiding van de laatste moeilijker is, en het duurt veel langer om in te stellen. (v) de keuze van de looptijd van de Elektroforese van het gel, is afhankelijk van de verwachte omvang van de amplificatie producten. Op basis van dit protocol, is het voldoende voor het uitvoeren van een elektroforese voor 20-30 min. bij 100 V in de 2% agarose gel, aangezien de grootte van de PCR fragmenten varieert van 100-500 bp. (vi) het is verplicht om te verkrijgen van 10 tot 50 ng van een goede kwaliteit sjabloon DNA geëxtraheerd uit menselijke specimens . Om deze reden liever we met een geautomatiseerde DNA-zuivering in plaats van een semi-automatische of handmatige. (vii) voorbereiden de reactie van de meester-mix voor PCR versterking en de oplossing van de meester-mix voor PCR producten spijsvertering, 10% meer (ter verantwoording voor verlies van vloeistof tijdens pipetteren) toe te voegen aan het volume berekend vermenigvuldigd met het aantal monsters voor het volume vereist voor een DNA-monster.
De meest voorkomende valkuil van de methode is de aanwezigheid van extra versterking producten als gevolg van een onjuiste thermische cycler programma’s, de voorbereiding van een onjuiste amplificatie meester-mix of een DNA sjabloon besmetting. Bovendien, het ontbreken van PCR producten kan worden veroorzaakt door geïnactiveerd Taq polymerase of een onjuiste thermische cycler uitvoeren. Bovendien, de aanwezigheid van onverwachte fragmenten mogelijk als gevolg van PCR product verontreiniging of aan een onvolledige spijsvertering van een geïnactiveerd enzym, te weinig bedrag van restrictie-enzym volume of een te korte incubatietijd.
In de afgelopen jaren, hebben de volgende methoden gebruikt voor SNP analyse met behulp van de PCR-techniek: kruising van korte allele-specifieke oligonucleotides11, allele-specifieke PCR12, primer extensie op DNA microarrays13 , oligonucleotide afbinding assay14, directe het rangschikken van DNA voor het identificeren van positie-specifieke enig-nucleotidepolymorfisme15, Taqman methode16, extractie Matrix-Assisted Laser desorptie/ionisatie Time-Of-Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie17, en GeneChips18. Deze methoden zijn niet ideaal omdat ze niet eenvoudig te gebruiken en/of dure apparatuur nodig. Omgekeerd, de methode van de PCR-RFLP beschreven in deze studie is goedkoop, eenvoudig te gebruiken, handig, heeft een hoog rendement en snelle identificatie van de C924T polymorfisme kunt. Een beperking aan de huidige methode is dat het alleen kan worden gebruikt voor een klein aantal SNPs en voor een paar monsters aan een werkvergadering.
Voor toekomstige toepassingen, kan deze methode worden gebruikt voor voorspellende studies over plaque vorming en atherosclerose progressie door het analyseren van de patiënt genotypen voor het polymorfisme van de TBXA2R C924T. Bovendien, deze methode konden de proefpersonen meer vatbaar voor atherotrombotische processen, in het bijzonder met een hoog risico patiënten behandeld met aspirine. Ten slotte, deze methode kan worden toegepast om te bestuderen van andere polymorfismen betrokken in gepersonaliseerde geneeskunde voor bepaalde geneesmiddelen (bijvoorbeeld anticoagulantia en anti-epileptica) om te begrijpen de juiste drug dosering en de farmacologische individu en klinische respons voor elke patiënt vóór het begin van de therapie en nadelige effecten te vermijden.
The authors have nothing to disclose.
Dit project werd gedeeltelijk gefinancierd door 60% Ateneo Ministero dell’Università, Italië S.M., en E.T. verleent We ontvangen ook gedeeltelijke bijdragen om het onderzoek van de uitgaven van de afdeling medische, orale en biotechnologische wetenschappen, Universiteit van Chieti “G. d’Annunzio”.
QIAsymphony SP | QIAGEN | 937055 | |
Spectrophotometer | EPPENDORF | 6131-02222 | |
UV-transilluminator | UVP | 732-110 | |
PCR tubes | EPPENDORF | H0030121589 | |
PCR thermal cycler | EPPENDORF | 5331-03721 | |
Pipettors and filter tips | EPPENDORF | H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02 | |
Horizontal minigel electrophoresis apparatus | DIATECH PHORESIS 10 | RI002-10 | |
Dry block heater | TWIN INCUBATOR | DG210 | |
QIAsymphony DNA Midi Kit | QIAGEN | 931255 | |
10X PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) | DIATECH AND TAKARA | T0100 AND R0001DM | |
Taq polymerase | TAKARA | R0001DM | |
dNTP mixture | DIATECH pharmacogenetics | NM001 | dNTP MIX 10X 100 microliters, 10mM |
PCR primers | DIATECH pharmacogenetics | \ | |
Restriction enzyme RsaI | New England biolabs | R0167L | |
Restriction enzyme 10X buffer | New England biolabs | R0167L | |
Agarose | Sigma | A9539 | DNA fragments are best separated in TBE buffer |
Tris base | Sigma | T6066 | |
Boric acid | Sigma | B7901 | |
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Sigma | E7889 | |
10% (wt/vol) ammonium persulfate | Sigma | E3678 | prepared fresh each time |
EtBr (0.5 μg/μL) | Sigma | E8751 | |
Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
Xylene cyanol FF | Sigma | X4126 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
DNA size marker | DIATECH pharmacogenetics | R1002-10 | Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI |
Sterile water (autoclaved) | DIATECH pharmacogenetics | \ |