Summary
I dette arbeidet beskriver vi en akutt, kronisk og multigenerational bioassay å studere virkningene av enkelt og kombinert stressfaktorer på turkis killifish Nothobranchius furzeri. Denne protokollen er utformet for å studere livshistorie egenskaper (dødelighet, vekst, fruktbarhet, vekt) og kritisk termisk maksimalt.
Abstract
Killifish Nothobranchius furzeri er en ny modell organisme innen økotoksikologi brukbarheten i akutt og kronisk Forurenset emballasje testing har vist. Samlet er sensitiviteten av arten til giftige forbindelser i området, eller høyere enn for andre modellen arter.
Dette verket beskriver protokoller for akutt, kronisk og multigenerational bioassay enkelt og kombinert stressor effekter på N. furzeri. På grunn av sin korte modning tid og livssyklus muliggjør denne virveldyr modellen studiet av endepunkter som modning tid og fruktbarhet i fire måneder. Transgenerational hele livsløpet eksponering forsøk kan utføres i så lite som 8 måneder. Siden denne arten produserer egg som er tørke-motstandsdyktig og være levedyktig i år, på stedet kulturen av artene er ikke nødvendig, men enkeltpersoner kan bli rekruttert ved behov. Protokollene er utformet for å måle livshistorie egenskaper (dødelighet, vekst, fruktbarhet, vekt) og kritisk termisk maksimalt.
Introduction
Følsomhet profiler av en rekke arter å strategisk valgte giftstoffer har vært beskrevet1 for europeiske nå lovgivning (registrering, evaluering, godkjenning og restriksjoner av kjemikalier). Kort eller Akutt toksisitet tester ble hovedsakelig brukt til dette formålet som de gir en rask indikasjon på en arter følsomheten. Men i sitt naturlige miljø, organismer vises over mye lengre perioder og full-sykluser eller enda flere generasjoner kan være berørt2. Videre er organismer i forurensede omgivelser vanligvis utsatt for flere stressor på et tidspunkt, som kan samhandle med hverandre, muligens resultere i synergieffekter3. Derfor kan trygt konsentrasjoner beregnet basert på akutt, enkelt stressor toksisitet tester undervurdere faktiske risikoen pålagt av giftstoffer i naturskjønne omgivelser. Det er derfor tilrådelig å også studere kronisk og multigenerational virkningene av sublethal konsentrasjoner av giftstoffer i miljømessig relevante sammenheng som fremmet av Europakommisjonen4,5 og USEPA (USAs States Environmental Protection Agency)6,7. Spesielt i virveldyr forskning er kostnadene i forbindelse med arbeid, penger og tid høyt når utføre kronisk og multigenerational eksponering studier på grunn av relativt lang levetid av virveldyr sammenlignet virvelløse modell organismer. Derfor er det lurt å velge den mest passende fisk modell organismen, avhengig av problemet. Videre, en rekke virveldyr bør være tilgjengelig for å teste omfanget av svar over arter skal kunne tilpasse regler basert på de mest følsomme artene. For nå er det behov for å utvikle nye, effektive protokoller med virveldyr modell arter preget av korte livssyklusen kostnadene å utføre kronisk og multigenerational eksponeringer på virveldyr7,8.
Turkis killifish Nothobranchius furzeri er en interessant fisk modell bruker slike langvarig eksponering eksperimenter sin korte modning tid og livssyklus (generasjonstid mindre enn 4 uker9). Dette innebærer at økologisk relevante endepunkter som modning tid og fruktbarhet kan studeres innen en kort tidsramme sammenlignet med andre fisk modeller7. Videre produsere disse fiskene-motstandsdyktig mot tørke, sovende egg som være levedyktig i flere år når lagret under standard betingelser, og dermed eliminerer behovet for en kontinuerlig kultur9. I økotoksikologiske studier innebærer dette også at gjenskape fisk kan alle være klekket på nøyaktig samme øyeblikk, som resulterer i gang synkronisering for alle dyr, selv blant grupper av egg produsert på ulike tidspunkter. Vi anbefaler å bruke laboratoriet GRZ belastning for å utføre eksponering eksperimenter. Denne belastningen utfører under laboratorieforhold, er homozygous (unntatt sex kromosomer) og genomet er også preget10,11.
I økotoksikologiske studier er det viktig å velge riktig utvalg for testen. Flere supplerende metoder kan brukes til dette formålet. Nominell konsentrasjon området kan baseres på følsomheten av relaterte Art, som Nothobranchius guentheri12. Alternativt kan området baseres på følsomheten av standard fisk modeller, for eksempel sebrafisk (Danio rerio)2 som har en tilsvarende følsomhet for de fleste giftstoffer (Philippe et al. (i gjennomgang)). I kombinasjon med begge disse alternativene, bør et utvalg finne eksperimentet utføres for valg av nominell konsentrasjon området. For akutt testing bør forskere mål for konsentrasjon behandlinger med 100% dødelighet, middels dødelighet og 0% dødelighet etter 24 timer for eksponering for toxicant. For kronisk testing, er det tilrådelig å kjøre området finne eksperiment for to uker å bekrefte hvis larver dødelighet i tilstanden med de høyeste test konsentrasjonene ikke overstiger 10% i denne referansen perioden.
Protokollen kan tjene som en baseline å utføre akutte og kroniske eksponering for vannfortynnbare forurensninger på N. furzeri, undersøke virkning stressfaktorer både på personlige og mobilnettet nivå. Det kan også brukes til å utføre flere stressor forskning til en høyere økologiske relevans, blande forskjellige giftige stoffer eller studere interaktive effekter mellom forurensning og andre naturlige stressfaktorer (f.eks predasjon) eller menneskeskapte stressfaktorer (f.eks oppvarmingen skyldes klimaendringer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av den etiske komiteen av KULeuven.
1. klekking og generelt vedlikehold av N. furzeri
- Tilberede fisk medium (pH 7) ved en temperatur på 14 ° C og legge renset Type II vann, med ekstra standardisert salter, til en ledningsevne 600 µS/cm (24 ° C).
- Velg egg GRZ (Gona-Rhe-Zhou) laboratorium linjen som har vært lagret under standardiserte forholdene13. Velg egg DIII Stadium (dvs klar å klekkes), gjenkjennelig ved tilstedeværelse av golden øyne9 og forsiktig overføre dem med en myk pinsett til en plast 2 L tank (ikke mer enn ca 30 egg per tank).
Merk: For å få et tilstrekkelig antall sunt test organismer, Luke dobbelt så mange egg som antall nødvendige fiskelarver. - Legg 1 cm av fisk medium ved 12 ° C og la temperaturen gradvis konvergere til romtemperatur (24 ° C)9. Fisk vil klekke i første 12 h.
- Etter 24 timer, mate hatchlings en konsentrerte dose av fersk skravert Artemianauplii (for flere detaljer om hyppighet og mengde mat, se avl protokollen Polačik et al. 20169) og øke Havdypet 5 cm av legge fisk medium.
- Etter 36 h, mate hatchlings en konsentrerte dose av fersk skravert Artemia nauplii og legg fisken medium for å øke Havdypet 10 cm.
- Inkuber fisk beholdere under konstant temperaturer (f.eks i inkubator, klima rom eller oppvarmet vannbad) under en 14 h:10 h lys: mørk regimet.
- Før eksperimentet, komplekse fisk beholdere (uten fisk) med eksponering sammensatte ved å fylle dem med den høyeste konsentrasjonen av eksponering middels og la den over natten for å begrense overføringen av giftstoffer til beholderen i selve eksperiment.
- 48 timer etter klekking velger sunn spenstig Larvene å starte eksponering eksperimentet. Forkaste såkalte magen-glidere som ikke kunne fylle deres svømmeblære og derfor har en svekket oppdrift (kontinuerlig synke å bunnen).
2. kortsiktig eksponering-protokollen
Merk: Forskere bør sikte på minst 20 replikat (20 fisk i separat glass) per behandling. I tillegg til en full kontroll behandling, burde en løsemiddel kontroll være inkludert hvis lager løsning av sammensatt blir forberedt med et løsemiddel. Løsemiddel kontrollen bør inneholde beløpet løsemiddel tilsvarer løsemiddel konsentrasjonen i høyeste eksponering konsentrasjon.
- Klargjør eksperimentelle beholdere (0,5 L glass krukkene) ved å merke dem og fylle dem med riktig eksponering mediet (ulike toxicant konsentrasjoner). Legg til sammensatt å få riktig konsentrasjonen.
- Overføre Larvene (48 timer etter klekking) individuelt til containere (1 fisken per container for individuelle overvåking).
Merk: Fisk utsettes individuelt for å redusere potensielle forvirrende effekten av sosial interaksjon som konkurranse for mat og aggresjon. Fisk er imidlertid tillatt å visuelt samhandle etter etiske standarder til laboratoriebruk dyr. - Følge opp denne akutt eksponering for en varighet på opptil 2 uker. I denne perioden, mate fisken annonsen libitum med Artemia nauplii to ganger per dag, 7 dager i uken.
- Oppdater medium annenhver dag opprettholde vannkvalitet og minimere virkning sammensatte degradering. Overvåke viktige vann variabler (oppløst oksygen nivåer bør overstige 80%, ledningsevne bør variere mellom 600 og 700 µS/cm, pH mellom 7,8 og 8.2 og hardhet (som CaCO3) mellom 350 og 450 mg/L, som ligger innenfor den optimale oppdrett forhold for N. furzeri 9). Ta vannprøver før og etter forfriskende medium for å finne faktiske sammensatte konsentrasjoner.
- Endepunkt
- Når fisk for dødelighet, stress (f.eks Avvikende atferd: svømming opp ned) eller sykdom daglig (morgenen, kvelden). Se utgivelsen av Shedd et al. (1999) 12 for detaljer om observasjon av dødelighet, stress eller sykdom.
- Beregne LC50 verdier basert på dødelighet ved hjelp av dose-respons kurver (Ritz og Streibig, 2005) på ulike tidspunkt. Bruk funksjonen drm drc pakken i R v3.2.3 (R utvikling Core Team, 2016) eller lignende statistiske metoder.
3. kronisk eksponering-protokollen
Merk: Sikte på minst 25 fisk/tilstand ved utbruddet av eksperimentet å minimere sjansen for en skjev sex-forhold og å imøtekomme potensielle bakgrunn dødelighet på grunn av naturlige årsaker (dvs. alder dødelighet).
- Klekking (se avsnitt 1)
- Fase I (2 dager etter klekking-16 dager etter klekking)
- Følg protokollen som beskrevet i 2.1-2.4
- Som i den andre fasen av eksperimentet, forringer medium hele uken (ingen forfriskninger, se nedenfor). Lagre den nødvendige mengden av medium for en uke i store inert beholdere for å tillate lignende nedbrytning av sammensatt.
- Fase II (16 dager etter klekking-end)
- Forberede 2 L eksperimentelle glass krukker av complexing dem med sammensatte. Fylle glassene med korrekt eksponering mediet og legge en luft tube å aerate glasset. Huset fisk individuelt i disse glass for resten av eksperimentet. Tillate visuelle samspillet til etiske standarder.
- Oppdater medium en gang per uke. Overføre fisken med en netto til en ny jar som inneholder samme eksponering medium. Ta vannprøver hver dag hele uken for å overvåke nedbrytning av sammensatt i hver konsentrasjon behandling. Beregne en degradering kurve for hver behandling hvis flere stressfaktorer er testet (f.eks toksisitet av et sammensatt i annen temperatur regimer). Måle abiotiske parametere (pH, temperatur, % oppløst oksygen, ledningsevne) tre ganger per uke.
- Fra 2 dager etter klekking (dph) til 23 dph, mate fisken to ganger om dagen, 7 dager i uken ad lib Artemia nauplii. Fra 24 dph - 37 dph, utfylle annonse libitumArtemia kosten hakket Chironomus larver. Fra 38 dph på, mate fisken to ganger per dag, 7 dager per uke annonse libitum frosset Chironomus larver.
- Endepunkt
- Daglig sjekke fisk for dødelighet, stress eller sykdom12.
- Å finne vekst, måle kroppsstørrelse ukentlig (9 dph - 16 dph - 21 dph -...) ved å overføre fisk til en Petriskål fylt med medium fra deres reservoar. Ta 4-5 størrelse kalibrert bilder av fisken ovenfra (på en fast høyde) og analysere dem digitalt med en romlig måling program (f.eks ImageJ).
Merk: For voksne fisk, bruk en høyere Petriskål for å minimere håndtering stress ved å holde alle fisken neddykket under hele måle prosessen. - For mannlige modning, visuelt inspisere fisk daglig for farge fra 15 dph og utover. Sjekk finnene etter første tegn til ekteskapelig coloration (sekundære seksuelle karakteristiske). Bruk den første dagen der dette er synlig som en proxy for mannlige modning tid.
- Par ikke-sexed fisk med menn i samme behandling gruppe eller ikke-eksperimentelle menn tre ganger per uke fra 30 dph videre for å finne kvinnelige modning tid (dag første egget er avsatt). For dette, kan du bruke gyting protokollen beskrevet i 3.4.5.
- For fruktbarhet, par eldre kvinner med eldre menn 3 ganger / uke fra 30 dph, i deres behandlinger bruker en krysset ordningen.
- Forberede en gyting tank (1 L) for hvert par, ved hjelp av eksponering medium fra mannlige akvariet med gyting substrat (finkornete sand < 500 µm).
- Overføre både mannlige og kvinnelige i gyting tanken og tillate dem å gyte i to timer. Minimere menneskelig aktivitet eller forstyrrelse rundt gyting beholdere under denne prosessen.
- Etterpå overføre forsiktig fisk tilbake til sitt opprinnelige beholdere for bolig, uten unødvendig blanding av vannet, hvilke ville virvler opp eggene i gyting underlaget.
- Filtrere eggene ut ved å helle gyting underlaget over en 500 µm mesh. Telle egg og overføre dem (med myk pinsett) til fuktig torv moss i Petri retter9,14.
- Fjerne døde eggeskall daglig. Etter en uke, seal Petri fat med tetting film og lagre det i en temperatur kontrollert inkubator på 28 ° C og en 14:10 syklus h lys: mørke for umiddelbar utvikling til DIII fase (dvs klar å klekkes etter ca tre uker). For langtidslagring, lagre eggene ved 17 ° C i konstant mørket som egg inn den sovende fasen og være levedyktig i flere år. Når rekruttering fisk fra disse sovende egg for eksperimenter, overføre sovende eggene 28 ° C-forhold med 14:10 h lys: mørke syklus i cirka tre uker å tillate utviklingen til DIII fase.
- Måle kritiske termisk maksimum (CTmax) (et mål for ytelse15) for voksne fisk.
- Bruk et vannbad som er oppvarmet med en konstant hastighet på 0,33 ° C/min og der vannet er kontinuerlig sirkulert. Legge til flere 1 L akvarier for hver enkelt fisk.
Merk: Gitt plassbegrensninger i vannbad, er det nødvendig å arbeide i flere serie. Potensial forskjeller i forhold blant serien bør tas i betraktning når utføre statistisk analyse av inkludert 'serien' som en tilfeldig faktor. - Starte prøveversjon av tilføyer fisken å akvariet når vannet i akvariet har nådd eksperimentelle oppdrett temperaturen på fisken (vanligvis 28 ° C). Overvåke temperaturen i 1 L akvarier CTmax bad hver 5-min bruker et digitalt termometer (0,1 ° C skala).
- Slutt rettssaken Når fisken ikke klarer å opprettholde et dorso-ventrally stående eller starter rykninger tungt16,17. Måle temperaturen i 1 L akvariet, hvilke er kritisk maksimal temperatur. Overføre fisken tilbake til eksperimentelle kabinettet for utvinning.
- Bruk et vannbad som er oppvarmet med en konstant hastighet på 0,33 ° C/min og der vannet er kontinuerlig sirkulert. Legge til flere 1 L akvarier for hver enkelt fisk.
- Måle vekten (0,1 mg nøyaktighet) av fisk på den siste dagen av eksperimentet av klappet den tørre og overfører den på en veiing båt. Merk: Alle fisk bør måles fire timer etter siste fôring for å standardisere mat vekt i tarmkanalen.
- Euthanize fisken med 0,1% Tricaine.
4. Transgenerational eksponering protokollen
Merk: For å måle transgenerational effekter av miljøgifter på N. furzeri, følg kronisk eksponering protokollen skissert ovenfor for den første generasjonen.
- To ganger ukentlig, når utviklingen av produsert egg (dvs. andre generasjon) lagret på 28 ° C 14:10 h lys: mørke syklus betingelser ved å undersøke petri retter for embryoer i DIII fase (se Polačik et al. 20169). Når mer enn 50 gjenskapninger av hver foreldrenes behandling er fullt utviklet, Luke dem følger protokollen i 1.1.
- Utsett sunn, spenstig fisk til nøyaktig samme oppsett og behandling som foreldre fisken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene av akutt eksponering for N. furzeri ulike konsentrasjoner av kobber, beregnet som 2.5.2, vise cleardose-svar (figur 1). Det er en økning i dødelighet med økende toxicant konsentrasjon. LC50 verdier nedgang over tid, betyr at med minkende konsentrasjoner, mer tiden går før 50% av replikat dør. For detaljerte resultater på akutte og kroniske eksponering av N. furzeri til kobber, og sammenligningen av arten sensitivitet sammenliknet med andre arter, referere vi til Philippe et al. 20177.
Kronisk eksponering rettssaken er kroppsstørrelse og fruktbarhet følsom endepunkter. Det kan være omfattende variasjon i veksten av fisk, avhengig av temperatur18. Voksen størrelser mellom 30 og 50 anses mm normalt i dette oppsettet. Oppsettet kan finne forskjellene mellom behandlinger (figur 2A). I en kronisk eksponering analysen med vannbasert kobber, det var en signifikant effekt av kobber eksponering under uke tre (χ²5,34 = 40.7, P < 0,001), med N. furzeri utsatt for 19.38 µg/L Cu som mindre enn alle andre fisk (alle P < 0,001) (figur 2B). For fruktbarhet, bør kontrollverdiene variere mellom rundt 50 egg per uke per kvinne på toppen av egg produksjon7. I et annet eksperiment, vannbaserte chlorpyrifos og en 2 ° C temperaturøkning, fant vi en betydelig interaksjon mellom temperaturen stige og chlorpyrifos eksponering på fruktbarhet (χ22,202 = 25.3, P < 0,001). På 28 ° C, fisken eksponert 4 µg/L produsert mindre egg sammenlignet med fisken eksponert 2 µg/L og kontroll fisk (begge P < 0,001) (figur 2B). Ved 30 ° C, kontroll fisk produsert flere egg sammenlignet med alle chlorpyrifos utsatt fisk (begge P < 0.007). Begge viktigste effekten av eksponering for chlorpyrifos (χ22,202 = 96.8, P < 0,001) og av temperatur (χ21,202 = 10.18, P < 0,001) signifikant redusert fruktbarhet. Målingen er ganske tidkrevende fordi håndtering av fisken og plating av egg på torv9, men det er ofte det mest sensitive endepunktet.
Modning tid er ofte påvirket av miljøgifter i menn. Mannlige modning tid var betydelig påvirket av kronisk eksponering for vannfortynnbare chlorpyrifos (χ22,41 = 11.79, P = 0.003), med menn utsatt for 4 µg/L CPF (C2) har en 18% tregere modning sammenlignet kontroll menn (figur 3A ). Dette svaret bør imidlertid, tolkes med varsomhet ettersom modning tid scores indirekte av utbruddet av ekteskapelig farge som proxy. Selv om menn anses å modne noen dager etter farge9, kan det være noen feil på eksakt tidspunkt for modning bruker dette tiltaket.
Nær termisk maksimalt utstilling fisk uberegnelig svømming, økt opercular bevegelse og tap av evnen til å forbli i en dorso-ventrally stående 16,17. CTmax verdier er forskjellige N. furzeri stammer. Naturlige populasjoner har CTmax verdier mellom 39 ° C og 42 ° C når oppdratt i temperaturer mellom 24 og 28 ° C (figur 3B). Innavlet GRZ belastningen, men når allerede sitt termisk maksimum på rundt 37-38 ° C, selv når reared i 28 ° C. Mens denne prosedyren ikke er dødelig for fisken, sjeldne tilfeller av dødelighet oppstår. Slike er best utelukket fra CTmax analysen, som de sannsynligvis representerer fisk i relativt dårlig generelle helsetilstand.
Tidligere resultater mest viste at CTmax kan påvirkes av forurensende, i dette tilfellet, 3,4-DCA (χ22,71= 17,65, P < 0,001) med fisken eksponert 0,1 mg/L 3,4-DCA har 0.32 ° C lavere termisk maksimalt sammenlignet kontroll fisk (P < 0,001). Også CTmax var påvirket av oppdrett temperaturen (χ21,71= 322.0, P < 0,001) og fisk som var oppdratt på 28 ° C hadde en 1.3 ° C høyere CTmax sammenlignet med fisk som var oppdratt på 24 ° C.
Figur 1: Dose-respons kurve for kobber eksponering. Dose-respons kurver viser akkumulert dødelighet av Nothobranchius furzeri i funksjonen for kobber eksponering konsentrasjon (µg/l Cu og i forhold til eksponeringstid). Prikkene angir LC50 verdier. Dette tallet er endret fra Philippe et al. 20172. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: effekter på størrelse og fruktbarhet som endepunktene. A) størrelsen (i cm) på Nothobranchius furzeri utsatt for ulike konsentrasjoner av kobber i uke 3, 7, 11 og 15. Stjerne angir at C5 fisk er mindre etter tre uker signifikansnivå p på < 0,05. Verdier vises som betyr ± SEM. Sample størrelser er n = 6; 6. 7; 7; 7; 7 i uke 3, n = 6; 6. 7; 7; 4 i uke 7, n = 5; 4; 5. 5. 3 i uke 11 og n = 5; 3; 3; 5. 2 i uke 15. B) fruktbarhet gjennom av fisken eksponert ulike konsentrasjoner av chlorpyrifos, krysset med to temperatur behandlinger, målt som antall egg per uke. For å forbedre lesbarheten og interpretability av figuren, vises ikke feilfelt på grafer. Antallet hunner hver behandling på begynnelsen og slutten av egg legging periode indikeres bruker bokstaven 'n'. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: modning tid og CTmax. A) middelalder (i dager) som første tegn på farge dukket opp i menn Nothobranchius furzeri forskjellige chlorpyrifos konsentrasjoner (0 µg/L (C0), 2 µg/L (C1) og 4 µg/L CPF (C2)) og to temperaturer (28 ° C og 30 ° C). B) mener kritiske termisk maksimum (CTmax) av fisken eksponert ulike konsentrasjoner av 3,4-DCA (0 mg/L 3,4-DCA (C0), 0,05 mg/L 3,4-DCA (C1) og 0,1 mg/L 3,4-DCA (C2)) og to temperaturer (24 ° C og 28 ° C). Nominell konsentrasjoner presenteres som middelverdien ± SE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette verket beskriver en ny bioassay med Nothobranchius furzeri, en ny modell organisme, studere enkelt og kombinert langtidseffekter av giftstoffer og andre stressfaktorer. Presentert protokollene ble brukt for å måle følsomhet av arter i en rekke av giftstoffer (kobber, kadmium, 3,4-dichloroaniline og chlorpyrifos). Rask-livssyklusen, denne virveldyr modellen tillater for vurdering av sublethal og transgenerational effekter i fire måneder. En annen stor fordel av å bruke denne fiskearter som modell for toksisitet screening er det faktum at det produserer tørke-resistente egg. Dette gjør at forskere lagre egg eller skaffe dem fra en leverandør og eliminerer behovet for en kostbar og tidkrevende stedets kultur. Videre kan embryoene lagres i flere år før skilpadder er nødvendig12.
Etter å ha studert følsomheten på N. furzeri til en rekke referanse giftstoffer, kan vi legge til at sensitiviteten av arter i området med, eller høyere enn andre modell arter, avhengig av testet sammensatte. Måle effekt på fruktbarhet, særlig kan øke sammenlignbarheten følsomheten på studerte arter, som det er en rutinemessig målt sluttpunkt i andre modellen arter. Til slutt, sonen som flere stressfaktorer utøve bivirkninger, når administreres individuelt eller kombinert, er avhengig av evaluerte sluttpunktet og eksponering konsentrasjonen.
Det er fortsatt noen begrensninger når du arbeider med N. furzeri. En av de viktigste begrensningene er standardisering av mat. Bunker med Artemia cyster eller bloodworms kan varierer i kvalitet og kan derfor påvirke resultatene av studien. Det er derfor tilrådelig å bestille en stor gruppe av mat å bruke under hele lengden av eksperimentet.
Vi tror at denne protokollen gjelder mye for økotoksikologiske screening. N. furzeri utvikler raskt seg til en standard test Art i økotoksikologi. Tilgjengeligheten av denne standardprotokoll kan drivstoff etableringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til gruppen sfære av UAntwerpen og Institutt for avlingsvern av Ugent for analyse av vannprøver. Støtte i dette prosjektet ble gitt av Excellence Center "Eco og sosio-evolusjonære dynamikk (PF/10/007) i KU Leuven Research Fund. AFG (11Q0516N) og ESJT (CVE-SB151323) ble finansiert som doktorgrad og TP (12F0716N) som post-doc fellow ved CVE Flandern (Fonds Wetenschappelijk Onderzoek).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
purified water Type 1 (milli Q) | Millipore | ||
Sea Salt | Instant Ocean | ||
2L plastic tank | SAVIC | Always separate material for control and toxicity treatments | |
1L plastic tank (spawning) | Avamoplast | Always separate material for control and toxicity treatments | |
nets | Aqua bilzen | Always separate material for control and toxicity treatments | |
2L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
0,5L glass jars | Sepac-Flacover | Always separate material for control and toxicity treatments | |
Artemia eggs | Ocean Nutrition | ||
chironomus | Ocean Nutrition | frozen | |
tricaine | Sigma aldrich | ||
petri dishes | VWR | ||
Parafilm | VWR | ||
pipettes | MLS | ||
tweezers | FST | ||
500 µm mesh sieve | / | self-made | |
microcentrifuge tube (2ml) | BRAND | To store fish in freezer | |
glass vials | Sigma aldrich | For water analysis | |
weighing boat | MLS | ||
Jiffy 7c pellets | Jiffy | ||
water bath | Gilac | for Ctmax | |
liquid nitrogen | Air liquide | ||
digital thermometer | Testo AG | testo 926 | |
HETO therm heater | Anker Schmitt | ||
calibrated balance | Mettler-Toledo AG | ||
camera | / | ||
platform for camera | / | self-made | |
Multiparameter kit | HACH | ||
Freezer (-80°C) | Panasonic Ultra low temperature freezer | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fysio | |||
homogenisation buffer | VWR | 0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 and 0.2 % Triton X-100 | |
chloroform:methanol | Sigma Aldrich | ||
glyceryl tripalmitate | Sigma Aldrich | ||
amyloglucosidase | Sigma Aldrich | A7420 | |
glucose assay reagent | Sigma Aldrich | G3293 | |
Biorad protein dye | VWR | ||
96-well microtiter plate | Greiner Bio-one | ||
384 microtiter plates | Greiner Bio-one | ||
2 ml glass tubes | Fiers | For fat analysis | |
2,5ml eppendorf tubes | VWR | ||
homogeniser | Ultra-turrax TP 18/10 | ||
photospectrometer | Infinite M200 TECAN | ||
heater for glass tubes | Hach COD REACTOR | ||
centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5415 R | ||
Incubator | Bumako |
References
- European-Chemicals-Bureau. TAPIR Three point three-A Project for the Information Requirements of REACH. Final Report-2 August 2005. Scoping study on the development of a Technical Guidance Document on information requirements on intrinsic properties of substances (RIP 3.3-1). , (2005).
- Philippe, C., et al. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , 26-35 (2017).
- Noyes, P. D., Lema, S. C. Forecasting the impacts of chemical pollution and climate change interactions on the health of wildlife. Current Zoology. 61 (4), 669-689 (2015).
- Consommateurs, S. S. d Health & Consumer Protection Directorate-General European Commission. 4, Brussels (BE). SANCO/3268/2001 rev. 4 (final) (2002).
- Commission, E. E. Guidance document on aquatic ecotoxicology. Under Council directive 91/414/EEC. SANCO/3268/2001 Rev 4. 2002b. , (2002).
- EPA. Ecological Effects Test Guidelines, OPPTS 850.1500 Fish life cycle toxicity. , Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-07/documents/850-1500.pdf (1996).
- Philippe, C. Acute and chronic sensitivity to copper of a promising ecotoxicological model species, the annual killifish Nothobranchius furzeri. Ecotoxicol Environ Saf. , (2017).
- Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
- Polačik, M., Blažek, R., Reichard, M. Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri. Nature Protocols. 11 (8), 1396-1413 (2016).
- Reichwald, K., et al. Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish. Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).
- Valenzano, D. R., et al. The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan. Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).
- Shedd, T. R., Widder, M. W., Toussaint, M. W., Sunkel, M. C., Hull, E. Evaluation of the annual killifish Nothobranchius guentheri as a tool for rapid acute toxicity screening. Environ. Toxicol. Chem. 18 (10), 2258-2261 (1999).
- Platzer, M., Englert, C. Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more. Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).
- Watters, B. The ecology and distribution of Nothobranchius fishes. J Am Killifish Assoc. 42, 58-61 (2009).
- Op de Beeck, L., Verheyen, J., Stoks, R. Competition magnifies the impact of a pesticide in a warming world by reducing heat tolerance and increasing autotomy. Environ Pollut. 233, 226-234 (2018).
- Patra, R. W., Chapman, J. C., Lim, R. P., Gehrke, P. C. The effects of three organic chemicals on the upper thermal tolerances of four freshwater fishes. Environ. Toxicol. Chem. 26 (7), 1454-1459 (2007).
- Beitinger, T. L., Bennett, W. A., McCauley, R. W. Temperature tolerances of North American freshwater fishes exposed to dynamic changes in temperature. Environ Biol Fishes. 58 (3), 237-275 (2000).
- Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology. Biological Reviews. , (2015).