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Biology

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए लघुकृत नमूना तैयारी

Published: July 27, 2018 doi: 10.3791/57310
Automatic Translation
*1,2, *1, *1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 1, 1
1Center for Cellular Imaging and NanoAnalytics (C-CINA), Biozentrum, University of Basel, 2Swiss Nanoscience Institute, University of Basel, 3BioEM lab, Biozentrum, University of Basel
* These authors contributed equally

Summary

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए nanoliter आकार के नमूना संस्करणों की तैयारी के लिए एक साधन और तरीके प्रस्तुत किया गया है । कोई कागज सोख्ता कदम की आवश्यकता है, इस प्रकार हानिकारक परिणाम यह प्रोटीन के लिए हो सकता से परहेज, काफी नमूना हानि को कम करने और दृश्य प्रोटियोमिक् के लिए एकल कोशिका lysate के विश्लेषण को सक्षम करने.

Abstract

हाल ही में तकनीकी प्रगति के कारण, क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-EM) तेजी से परमाणु संकल्प करने के लिए प्रोटीन परिसरों के संरचनात्मक विश्लेषण के लिए एक मानक विधि बनता जा रहा है । हालांकि, प्रोटीन अलगाव तकनीक और उनके लिए नमूना तैयारी तरीकों एक अड़चन बने हुए हैं । एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या (१००,००० कुछ लाख के लिए) व्यक्तिगत प्रोटीन कणों के एक कण EM दृष्टिकोण द्वारा प्रोटीन के उच्च संकल्प के विश्लेषण के लिए छवि बनने की जरूरत है, लघुकृत नमूना हैंडलिंग तकनीक और microfluidic सिद्धांतों बनाने संभव.

एक लघुकृत, कागज-सोख्ता-मुक्त उंहें नमूना पूर्व कंडीशनिंग के लिए ग्रिड तैयारी विधि, उंहें ग्रिड भड़काना और पोस्ट प्रोसेसिंग कि केवल nanoliter-नमूना की मात्रा की खपत प्रस्तुत की है । विधि उप nanoliter परिशुद्धता के साथ एक वितरण प्रणाली तरल और em ग्रिड भड़काना, ग्रिड तापमान जिससे EM ग्रिड के ऊपर सापेक्ष आर्द्रता का निर्धारण नियंत्रित करने के लिए, और एक पिकअप और डुबकी-तंत्र के लिए नमूना नियंत्रण का उपयोग करता है vitrification । क्रायो के लिए उंहें, एक em ग्रिड तापमान नियंत्रित चरण पर रखा गया है और नमूना एक केशिका में aspirated है । केशिका टिप ग्रिड सतह के लिए निकटता में तैनात है, ग्रिड नमूना के साथ भरी हुई है और अधिक microcapillary में फिर से aspirated है । बाद में, नमूना फिल्म स्थिर और थोड़ा नियंत्रित पानी ओस-बिंदु के सापेक्ष मंच तापमान की भरपाई द्वारा विनियमित वाष्पीकरण द्वारा thinned है । एक दिया बिंदु पर लेने और डुबकी तंत्र शुरू हो रहा है, तेजी से नमूना vitrification के लिए तरल एतान में प्रधानमंत्री EM ग्रिड स्थानांतरित. वैकल्पिक रूप से, नमूना कंडीशनिंग विधियों नकारात्मक दाग (NS) EM के लिए nanoliter-आकार नमूना वॉल्यूम तैयार करने के लिए उपलब्ध हैं ।

के तरीके बहुत नमूना खपत को कम करने और इस तरह के फिल्टर कागज पारंपरिक तरीकों में इस्तेमाल किया सोख्ता के रूप में संभावित प्रोटीन के लिए हानिकारक दृष्टिकोण से बचने के । इसके अलावा, नमूना आवश्यक की मामूली राशि इस तरह के तेजी से नमूना कंडीशनिंग के रूप में उपंयास प्रयोगात्मक रणनीतियों, की अनुमति देता है, के लिए एकल सेल lysis के साथ संयोजन "दृश्य प्रोटियोमिक्," या "" दोषरहित "के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए कुल नमूना तैयारी जटिल नमूने ।

Introduction

हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) द्वारा प्रोटीन परिसरों के संरचनात्मक विश्लेषण के लिए हाल के वर्षों के दौरान बड़े पैमाने पर उन्नत है । सुधार एक "संकल्प क्रांति"1,2 के लिए मार्ग प्रशस्त किया और मौलिक संरचनात्मक अनुसंधान बदल दिया है । क्रांति क्रायो के आगमन के साथ शुरू इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-EM)3,4, शारीरिक स्थितियों के करीब के तहत जैविक नमूनों की तैयारी की अनुमति जबकि विकिरण संवेदनशीलता को कम करने और रोकने संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के उच्च निर्वात में नमूना वाष्पीकरण5. अगले वर्षों में, वृद्धिशील प्रौद्योगिकीय प्रगति धीरे से संकल्प प्राप्त वृद्धि हुई । इन नवाचारों के बीच क्षेत्र के आवेदन-उत्सर्जन बंदूकें6,7थे, और, हाल ही में, बेहतर डेटा विश्लेषण एल्गोरिदम, जैसे अधिकतम संभावना8तरीके,9। प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर कैमरा10,11,12,13, मूवी मोड इमेजिंग और साथ सॉफ्टवेयर विकास14,15, 16 , 17, अंतिम सफलता प्रदान की एकल कण विश्लेषण द्वारा जैविक नमूनों के लिए परमाणु संकल्प प्राप्त करने के लिए आवश्यक (एक समीक्षा के लिए चेंग, Grigorieff, एट अल देखें । 18). क्रायो-EM के महत्व को हाल ही में रसायन विज्ञान के लिए नोबेल पुरस्कार के पुरस्कार द्वारा मांयता प्राप्त अग्रदूतों में से तीन को किया गया ।

उनि द्वारा एक जैविक नमूना छवि के लिए, नमूना के साथ EM ग्रिड लोड करने के लिए इस्तेमाल किया विधि (बाद में "ग्रिड तैयारी" के रूप में संदर्भित) यह सुनिश्चित करना चाहिए कि परिणामी नमूना परत (i) काफी पतली है (< 100 एनएम) से बचने के लिए व्यापक शोर से लोचदार या गुणा बिखरे हुए इलेक्ट्रॉनों, (ii) इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के उच्च निर्वात को झेलने, और (iii) विकिरण क्षति से अधिक अणुओं की रक्षा करता है । दो मुख्य तरीके इन अनुलाभ को पूरा करने के लिए उपयोग किया जाता है: नकारात्मक दाग(एन एस)19,20 प्रक्रियाओं (चित्रा 1एक) adsorb एक पतली कार्बन फिल्म के लिए नमूना, को अमली भारी धातु में एंबेड अणुओं एम्बेड और फिर विधानसभा को हवा में सूखने दें । यह सरल और जल्दी है, और भरी हुई EM ग्रिड (बाद में "नमूना ग्रिड" के रूप में निर्दिष्ट) को स्टोर करने के लिए आसान कर रहे हैं और समय की विस्तारित अवधि के लिए रखा जा सकता है (आम तौर पर साल). उनि में, तैयारियां उच्च एन एस के कारण विपरीत प्रदर्शन और क्रायो की तुलना में उच्च इलेक्ट्रॉन खुराक बर्दाश्त-तैयारी है, लेकिन संकल्प लगभग 20 Å. क्रायो-EM प्रक्रियाओं को सीमित है (1 आंकड़ाख) छेद कार्बन का समर्थन करता है काम करते हैं । नमूना समाधान की एक पतली फिल्म छेद भर में फैले और EM ग्रिड एक cryogen में डूब जाता है, आमतौर पर तरलीकृत एतान, तेजी से इसे नीचे-150 डिग्री सेल्सियस शांत करने के लिए । परिणाम एक अमली, vitrified, ५० के लिए १०० एनएम समर्थन छेद में समाधान की मोटी फिल्म है । यह पतली, अमली फिल्म इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में उच्च वैक्यूम का सामना करती है और, आदर्श मामले में, अपने पैतृक राज्य में जैविक संरचनाओं को बरकरार रखता है । प्रक्रिया जैविक नमूनों उच्च संकल्प पर छवि में होना करने के लिए अनुमति देता है । हालांकि, नमूना ग्रिड devitrification से बचने के लिए हर समय-१५० डिग्री सेल्सियस नीचे तापमान पर रखा जाना चाहिए । यह अपेक्षाकृत उच्च इलेक्ट्रॉन कम तापमान के कारण खुराक का उपयोग कर imaged किया जा सकता है, लेकिन इसके विपरीत और संकेत करने वाली शोर अनुपात फिर भी कम है । इसलिए, औसत तकनीक के विपरीत बढ़ाने के लिए कार्यरत है और प्रदान की, नमूना अलग कोणों से imaged है, एक उच्च संकल्प तीन आयामी (3 डी) नक्शा खंगाला जा सकता है । अब के रूप में 3 डी पुनर्निर्माण के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया और अत्यधिक सफल तरीका एकल कण दृष्टिकोण है । हाल ही में एक समीक्षा के लिए, अल.18पर चेंग देखें ।

नकारात्मक दाग उनि (एन एम) स्क्रीनिंग और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण है, जब उच्च कंट्रास्ट की जरूरत है या जब नमूना की केवल सीमित मात्रा में उपलब्ध है (सोखना कार्बन फिल्म के लिए आम तौर पर नमूना ध्यान केंद्रित) । एकल कण क्रायो-EM सोने के मानक विधि अगर उच्च संकल्प प्रोटीन संरचना के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए उद्देश्य से कर रहे हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: उनि ग्रिड की तैयारी और शास्त्रीय (पैनल ए, बी) और एक microfluidic दृष्टिकोण (पैनल सी, डी) के बीच तुलना के सिद्धांतों । क) शास्त्रीय एनएस-em ग्रिड की तैयारी: नमूने के बारे में 3 µ एल हाथ से एक EM एक सतत कार्बन फिल्म के साथ कवर ग्रिड पर pipetted है (बाद में एक ' एन एस के रूप में संदर्भित-em ग्रिड ') (i) । लगभग 10 एस के लिए मशीन के बाद, फिल्टर कागज दूर पक्ष से अतिरिक्त तरल दाग के लिए प्रयोग किया जाता है (द्वितीय), एक पतली पानी फिल्म में adsorbed के अणुओं को छोड़कर । बाद में, प्रोटीन एक भारी धातु नमक समाधान में मशीन है, उदाहरणके लिए, 2% uranyl एसीटेट, 20 एस के लिए (iii), और फिर से तरल सोख्ता द्वारा साइड से हटा दिया जाता है फिल्टर पेपर (iv) का उपयोग कर । अंत में, EM-ग्रिड हवा में शुष्क करने के लिए छोड़ दिया है । ख) शास्त्रीय क्रायो-EM ग्रिड तैयारी: नमूना के बारे में 3 µ एल एक हाथ से एक छेद कार्बन फिल्म पर pipetted हैं । पतली नमूना फिल्म बनाने के लिए, एक या दोनों पक्षों (ii) से पेपर-सोख्ता फेस-ऑन द्वारा अधिशेष तरल निकाल दिया जाता है । अंत में, ग्रिड तेजी से तरल एतान में vitrification (iii) के लिए डुबकी लगाई है । ग) एनएस-EM ग्रिड cryoWriter सेटअप का उपयोग कर तैयारी: एक 5 nL मात्रा एक microcapillary (i) का उपयोग कर नमूना स्टॉक से aspirated है । नमूना कंडीशनिंग के लिए, microcapillary टिप कंडीशनिंग समाधान में डूब जाता है, उदाहरणके लिए, 2% अमोनियम एसीटेट । आयनों और छोटे अणुओं प्रसार (द्वितीय) द्वारा विमर्श कर रहे हैं । ध्यान दें कि microcapillary के आयामों को सुनिश्चित करना है कि पूरी प्रक्रिया प्रसार प्रेरित है । प्रोटीन नमक आयनों की तुलना में बहुत कम प्रसार स्थिरांक है और24खो काफी नहीं हैं । अंत में, नमूना ग्रिड पर तिरस्कृत और (iii) शुष्क करने की अनुमति दी है । घ) क्रायो के सिद्धांतों-em ग्रिड तैयारी cryoWriter-आधारित विधि का उपयोग कर: एक EM ग्रिड एक छिद्रित कार्बन फिल्म के साथ कवर एक तापमान नियंत्रित मंच की सतह पर रखा गया है और चिमटी द्वारा आयोजित किया जाता है । मंच के तापमान ग्रिड पर्यावरण के ओस बिंदु तापमान से एक ऑफसेट पर नियंत्रित किया जाता है । ग्रिड नमूना युक्त microcapillary के सापेक्ष ले जाया गया है और microcapillary जब तक यह ग्रिड के ऊपर कुछ micrometers है कम है । बाद में, नमूना के कुछ nanoliters इसे से तिरस्कृत कर रहे हैं, जबकि मंच एक सर्पिल पैटर्न में ले जाया जाता है; अतिरिक्त तरल re-aspirated (आई) है । EM ग्रिड भड़काने के बाद, microcapillary वापस ले लिया है और ग्रिड तापमान नियंत्रित मंच पर रहता है (बाद में एक कम समय के लिए ओस बिंदु (डीपी) चरण के रूप में भेजा) के लिए एक नियंत्रित राशि के नमूने को वाष्पित करने की अनुमति है । डुबकी ठंड के लिए, ग्रिड तेजी से चिमटी (द्वितीय), ऊर्ध्वाधर स्थिति में ९० डिग्री से फ़्लिप का उपयोग कर मंच से वापस ले लिया है, और एक cryogen स्नान (iii) (बाद में के रूप में संदर्भित करने के लिए ' उठाओ और डुबकी ' तंत्र) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

क्योंकि वे का आविष्कार किया गया दुर्भाग्य से, ग्रिड तैयारी एन एस और क्रायो-EM के लिए इस्तेमाल किया तरीकों काफी सुधार नहीं किया है । वर्तमान कमियां उच्च नमूना खपत (लगभग 1 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीन के 3 µ एल) और बड़ी राशि (> ९९%) नमूना खोया (चित्रा 1ए, बी) । इसके अलावा, शास्त्रीय विधि क्रायो के लिए ग्रिड तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटीन के लिए एक कठोर प्रक्रिया है: पहला, यह कागज पर एक व्यापक चेहरे शामिल-सोख्ता कदम (चित्रा 1बी, द्वितीय), और, दूसरा, प्रोटीन हवा के संपर्क में है पानी इंटरफ़ेस 21समय की एक महत्वपूर्ण राशि के लिए । यहां, नमूना पूर्व कंडीशनिंग के लिए एक वैकल्पिक विधि, नमूना ग्रिड की तैयारी और पोस्ट-प्रोसेसिंग (ग्रिड सुखाने या vitrification) के लिए एनएस-em (चित्रा 1C) या क्रायो-em (चित्रा 1D) प्रस्तुत किया है । में घर बनाया सेटअप, कहा जाता है "cryoWriter", लघुकृत नमूना हैंडलिंग प्रौद्योगिकी और microfluidic सिद्धांतों का उपयोग करता है महाप्राण, हालत और नमूना वितरण, कागज सोख्ता से परहेज पूरी तरह से और के लिए पतली नमूनों के लिए वैकल्पिक तरीके प्रदान क्रायो-EM । यह काफी नमूना खपत कम कर देता है और एक पूरे के रूप में नमूना तैयारी पर उपयोगकर्ता नियंत्रण में सुधार । इसके अलावा, विधि उपंयास प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों की अनुमति देता है; जैसे एक दृष्टिकोण में व्यक्तिगत कोशिकाओं के पृथक जैविक घटकों की तैयारी के रूप में कहा जाता है "एकल कक्ष दृश्य प्रोटियोमिक्"22,23,24,25।

Protocol

एक "cryoWriter" (चित्रा 2; विवरण के लिए पिछले कार्य देखें24,26,27) या समकक्ष इंस्ट्रूमेंटेशन निम्न प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक है । मुख्य भागों और उपभोग्य सामग्रियों के लिए आपूर्तिकर्ताओं की एक सूची सामग्री की तालिकामें दी गई है ।

1. नकारात्मक दाग (एन एस) ग्रिड की तैयारी

  1. उपकरण चालू करें और सॉफ़्टवेयर को प्रारंभ करें । सभी आवश्यक मॉड्यूल (सिरिंज पंप नियंत्रक, मोटर चालित चरणों, निगरानी कैमरों, और ओस बिंदु चरण) शुरू.
  2. नमूना समर्थन और ओस बिंदु मंच ठंडा । यदि आवश्यक हो, ओस बिंदु चरण तापमान ओस बिंदु के ऊपर 1-2 ° c विनियमित है कि सुनिश्चित करें ।
    नोट: स्टेज एक PID नियंत्रक के साथ एक वाणिज्यिक Peltier डिवाइस से ठंडा है ।
  3. ns (उदा., व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 2% methylamine tungstate) के १००-१५० µ l के साथ एक १०० या २०० µ l पीसीआर ट्यूब भरकर एनएस तैयार करें । उपकरण के कूल्ड नमूना समर्थन पर ट्यूब प्लेस ।
  4. नमूना स्थिति ।
    1. नमूना (०.५-1 µ मी) एक १०० या २०० µ एल पीसीआर ट्यूब में डाल दिया । यदि नमूना के कम से ५० µ एल उपलब्ध है, एक उस्तरा ब्लेड के साथ एक पीसीआर ट्यूब के नीचे कट और यह एक नमूना के रूप में अच्छी तरह से उपयोग करें । इससे यह सुनिश्चित होगा कि microcapillary आसानी से सैम्पल तक पहुंच सके ।
      नोट: यह १०० या २०० µ l पीसीआर ट्यूबों से नमूने महाप्राण करने के लिए सबसे आसान है, क्योंकि microcapillary बाद में इस्तेमाल किया महाप्राण नमूना थोड़ा झुका हुआ है और यात्रा ऊंचाई z-अक्ष दिशा सीमित है ।
    2. वाष्पीकरण को रोकने के लिए यंत्र में कूल्ड नमूना समर्थन पर पीसीआर ट्यूब/ वैकल्पिक रूप से, नमूनों कमरे के तापमान पर सूक्ष्मदर्शी चरण शीर्ष मशीन में अच्छी तरह से प्लेटों से aspirated जा सकता है; शीतलक अच्छी तरह से प्लेटों के लिए लागू नहीं है ।
  5. पदों को परिभाषित करें । microcapillary स्थिति के लिए रेखीय x-, y-, और z-अक्ष चरणों के लिए मोटर चालित xy-चरण और सॉफ़्टवेयर नियंत्रण बटन नियंत्रित करता है जो cryoWriter जॉयस्टिक का उपयोग करें । केशिका की स्थिति की जांच करने के लिए कैमरे का उपयोग करें ।
    1. microcapillary को नमूना जलाशय तक ले जाएं । नमूना तरल में टिप विसर्जित कर दिया और "नमूना" के रूप में इस स्थिति को बचाने के ।
    2. एनएस पीसीआर ट्यूब करने के लिए microcapillary ले जाएँ, एनएस समाधान में टिप विसर्जित और "दाग" के रूप में इस स्थिति को बचाने के ।
    3. जगह microcapillary लगभग १०० µm स्लॉट के केंद्र के ऊपर जहां EM ग्रिड और तैनात किया जाएगा "grid_save" के रूप में इस स्थिति को बचाने के ।
  6. महाप्राण नमूना और यह एनएस-EM के लिए शर्त ।
    1. यदि पहले से ही स्थापित नहीं है, एक प्रेसिजन सिरिंज पंप पर एक 10-µ एल सिरिंज (०.४६ mm इनर व्यास) माउंट ।
    2. गोंद एक 30 सेमी लंबे समय से जुड़े सिलिका microcapillary (बाहरी व्यास ३६० µm, भीतरी व्यास १५० µm) सिरिंज आउटलेट के एक छोर ।
    3. प्रेस फ़िट संबंधक के माध्यम से एक छोटी (5 सेमी) लंबे पतला microcapillary को microcapillary के दूसरे छोर से कनेक्ट करें । लघु microcapillary के पतला टिप वितरण टिप रूपों ।
    4. degassed डबल आसुत जल के साथ सिरिंज भरें (ddH2हे, प्रणाली तरल) और हवा के बुलबुले के गठन से बचें ।
    5. प्रणाली तरल के nanoliters के कुछ दसियों बांटना और एक एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त ऊतक के साथ microcapillary से किसी भी बूंदें निकालें ।
    6. सहेजे गए नमूना स्थिति पर डबल-क्लिक करें । यह microcapillary के नमूने में अच्छी तरह से पदों । जबकि केशिका चलती है, बस microcapillary टिप से पहले प्रणाली तरल के 3 x ०.५ nL वितरण वहां फंस जा रहा से हवा बुलबुला रोकने के लिए नमूने में डूबे है (नीचे नोट 2 देखें) ।
    7. महाप्राण के 5 nL का सैंपल लिया ।
    8. सहेजी गई NS स्थिति पर डबल-क्लिक करें । microcapillary नमूना कंटेनर से वापस ले लिया है और एन एस जलाशय के लिए स्वचालित रूप से ले जाया गया । जबकि केशिका चलती है, मैन्युअल रूप से 3 एक्स ०.५ nL नमूना तरल का वितरण बस से पहले टिप जलाशय में डूब गया है सुनिश्चित करें कि वहाँ कोई हवा के बुलबुले हैं (नीचे नोट 2 देखें).
      नोट: महत्वपूर्ण: (1) जब आकांक्षा से मोड वितरण या इसके विपरीत करने के लिए स्विचन, वहां पिस्टन स्ट्रोक में एक छोटा सा नुकसान सिरिंज पंप के गियर्स में प्रतिक्रिया के कारण है । निर्माता के अनुसार, एक नई इकाई की प्रतिक्रिया 7 और 12 µm के बीच निहित है । ०.४६ mm का बैरल व्यास के साथ हमारे सिरिंज के लिए, यह 1-2 nL के लिए अनुवाद करता है । इसलिए, 1-2 nL "तिरस्कृत" किया जा सकता है, इससे पहले कि नमूना वास्तव में तिरस्कृत है. आमतौर पर, एक छोटी छोटी बूंद microcapillary टिप से बाहर निकलने के बाद तीसरे ०.५ nL वितरण कदम शुरू होता है । (2) एक हवाई बुलबुले के ऊपर/नीचे फंसे नमूना कम सटीक वितरण करना होगा और प्रसार द्वारा नमूना कंडीशनिंग को रोकने के ।
    9. 3-12 मिनट के लिए डूबे microcapillary छोड़ दो, नमूना बफर और नोक ज्यामिति पर निर्भर करता है ।
      नोट: अधिक नमक और/या बफर में फॉस्फेट एकाग्रता, अब आवश्यक विसर्जन समय । एन एस (अपेक्षाकृत जल्दी) नमूना प्लग में फैलाना जबकि बफर साल्ट (अपेक्षाकृत तेज) और प्रोटीन (बहुत धीमी) बाहर फैलाना । यह नमूना में बफर साल्ट की एकाग्रता को कम करती है जब लोड ग्रिड सूख जाता है सघन से उंहें रोकने । इसके अलावा, फॉस्फेट एनएस के साथ संयोजन में एक वेग बनाने के लिए जाता है ।
  7. एक ग्रिड तैयार करें और वातानुकूलित नमूने की हाजिरी जमा कराएं ।
    1. जबकि नमूना वातानुकूलित किया जा रहा है, चिपकने वाला टेप और एक PDMS ब्लॉक का एक टुकड़ा ले और लागू करने और यह सुनिश्चित करें कि कोई धूल है करने के लिए चिपकने वाला टेप को हटाने के द्वारा PDMS के ऊपर की ओर साफ । PDMS ब्लॉक को एक पेट्री डिश में डाल दें ।
      नोट: नए PDMS ब्लॉक स्वच्छ कमरे से लिया जाता है ।
    2. ध्यान से एक ग्रिड उठाओ (जैसे, घन, २०० या ४०० मेष Parlodion के साथ लेपित/ चिमटी के साथ ग्रिड के केवल किनारे को छूने के लिए सुनिश्चित करें । यह ऊपर की ओर का सामना करना पड़ कार्बन फिल्म के साथ स्वच्छ PDMS ब्लॉक पर रखें ।
    3. एक हवा चमक में ग्रिड के साथ PDMS ब्लॉक प्लेस-निर्वहन इकाई और चमक ०.४ mbar पर १०० डब्ल्यू पावर के साथ 20 एस के लिए निर्वहन । एक बंद पेट्री डिश में ग्रिड की दुकान । अब चमक निर्वहन बार आम तौर पर ग्रिड पर जमा नमूना मात्रा का एक बड़ा प्रसार करने के लिए सीसा । नतीजतन, दाग की परत पतली (कमजोर दाग) हो जाता है ।
    4. विसर्जन के समय से पहले 1 मिनट, cryoWriter चिमटी के साथ चमक-निर्वहन ग्रिड समझ । सुनिश्चित करें कि विद्युत चुंबक चालू है; अंयथा सॉफ्टवेयर में इसे चालू करें । विद्युत चुंबक पर चिमटी माउंट और ग्रिड ओस बिंदु मंच पर फ्लैट संरेखित करने के लिए मैनुअल micromanipulator पेंच का उपयोग, कार्बन फिल्म की ओर । सुनिश्चित करें कि ओस-बिंदु अवस्था तापमान नमूना लोड होने के बाद वाष्पीकरण की दर को कम करने के लिए ओस बिंदु से ऊपर 1-2 ° c विनियमित है.
    5. जब विसर्जन का समय है, "grid_save" पर डबल क्लिक करें । microcapillary टिप ग्रिड सतह के ऊपर सुरक्षित रूप से रखा जाएगा । मैंयुअल रूप से ग्रिड के साथ संपर्क में microcapillary टिप ले आओ । 10 µm द्वारा नोजल लिफ्ट और केंद्र के ऊपर यह स्थिति ।
      सावधानी: कुछ नमूनों डिटर्जेंट युक्त microcapillary की बाहरी सतह के साथ ऊपर ले जाने के लिए जब तरल कम सतह तनाव के कारण तिरस्कृत है करते हैं । इस तरह के नुकसान को रोकने के लिए ग्रिड की सतह के बहुत करीब होना जरूरी है ।
    6. ग्रिड पर नमूना के 5 nL वितरण । एक शुष्क दिन पर, जब तेजी से वाष्पीकरण microcapillary टिप पर जगह लेता है, एक भी धीरे से नमूना जब तक वितरण कर सकते है बहुत टिप पर है, और फिर जल्दी से 5 nL वितरण ।
    7. microcapillary को वापस लेने और वातानुकूलित नमूना ओस बिंदु चरण (डीपी चरण) पर धीरे से सूखी जाने ।
    8. एक बार नमूना स्थान सूख गया है, ग्रिड को हटाने और एक ग्रिड बॉक्स या पेट्री डिश में कमरे के तापमान पर यह दुकान ।
    9. microcapillary से nL प्रणाली तरल के ५०० वितरण और एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त ऊतक के साथ इसे हटा दें । या तो इथेनॉल, डिटर्जेंट या 1 मीटर NaOH के साथ केशिका 5 बार फ्लश । यह एक अलग नमूना के साथ इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति microcapillary साफ ।

2. क्रायो ग्रिड की तैयारी

  1. साधन और नमूना तैयार करने के लिए, ऊपर वर्णित १.५ करने के लिए १.१ चरणों का पालन करें । यदि NS आवश्यक नहीं है, तो चरण १.३ और 1.5.2 छोड़ दें । क्रायो के लिए नमूना बफ़र या शर्त का नमूना विनिमय करने के लिए, उदाहरणके लिए, बफर लवण की एकाग्रता को कम करने के लिए या additives परिचय (जैसे, trehalose, डिटर्जेंट) के बजाय वांछित बफर का उपयोग करने के लिए कदम १.३ और 1.5.2 में एनएस ।
  2. एक मानक क्रायो कंटेनर में तरल एतान तैयार करें ।
    1. एतान कप इकट्ठा, क्रायो बॉक्स धारक, और मकड़ी और तरल नाइट्रोजन के साथ सीमा को cryogen कंटेनर भरने; आमतौर पर के बारे में २०० मिलीलीटर की आवश्यकता है । कुछ मिनट रुको जब तक एतान कप ठंडा है और तरल नाइट्रोजन से मुक्त है ।
    2. एतान गैस की बोतल खोलो और धीरे से एतान कप में गैस की धारा चलो । यह तरल एतान के साथ भरने तक का स्तर ऊपर से नीचे 2-3 mm है; यह एक कुछ मिनट लगते है और तरल एतान के बारे में 5 मिलीलीटर की आवश्यकता है ।
    3. एक क्रायो बॉक्स ले लो और यह cryogen कंटेनर में एक मुक्त स्लॉट में जगह है ।
    4. मकड़ी निकालें, शीर्ष पर polystyrol ढक्कन जगह है, और cryoWriter में बढ़ते पर cryogen कंटेनर जगह है ।
  3. चमक निर्वहन एक EM ग्रिड ।
    1. चिपकने वाला टेप और एक polydimethylsiloxane (PDMS) ब्लॉक का एक टुकड़ा ले लो और लागू करने और चिपकने वाला टेप को हटाने के द्वारा ऊपर की ओर PDMS साफ (किसी भी धूल को हटा) । PDMS ब्लॉक को एक पेट्री डिश में डाल दें ।
    2. ध्यान से ग्रिड बॉक्स से एक ग्रिड उठाओ । चिमटी के साथ ग्रिड के केवल किनारे को छूने के लिए सुनिश्चित करें । यह ऊपर की ओर का सामना करना पड़ छिद्रित कार्बन फिल्म के साथ एक स्वच्छ PDMS ब्लॉक पर रखें ।
    3. एक प्लाज्मा क्लीनर और प्लाज्मा में ग्रिड के साथ PDMS ब्लॉक प्लेस-साफ ग्रिड सतह (उदाहरण के लिए उपयोग ७५% Ar/25% एच2, पावर ५० W, दबाव 25 mTorr) । एक पेट्री डिश में ग्लो-डिस्चार्ज ग्रिड के साथ PDMS ब्लॉक लगाएं ।
  4. उपकरण में ग्रिड की स्थिति
    1. चमक-cryoWriter चिमटी के साथ निर्वहन ग्रिड समझ । सुनिश्चित करें कि विद्युत चुंबक चालू है; अंयथा सॉफ्टवेयर में इसे चालू करें । विद्युत चुंबक पर चिमटी माउंट और ग्रिड मंच पर फ्लैट, कार्बन फिल्म की ओर संरेखित करने के लिए मैनुअल micromanipulator पेंच का उपयोग करें ।
    2. "grid_save" पर डबल-क्लिक करें । microcapillary स्थिति को समायोजित करें ताकि टिप ग्रिड सतह के ऊपर लगभग 10 µm है । सुनिश्चित करें कि microcapillary ग्रिड भर में स्वतंत्र रूप से इसे कहीं भी छूने के बिना, यदि आवश्यक हो तो microcapillary कुछ micrometers वापस ले सकते हैं ।
    3. ग्रिड के केंद्र में वापस जाओ और "ग्रिड" के रूप में नई स्थिति को बचाने के ।
      सावधानी: कार्य करने के लिए मैक्रो स्क्रिप्ट के लिए सही नामकरण अनिवार्य है ।
  5. नमूना और डुबकी-फ्रीज ग्रिड लिखें ।
    1. प्रणाली तरल के nanoliters के कुछ दसियों के साथ microcapillary फ्लश और एक एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त ऊतक के साथ microcapillary से किसी भी बूंदें निकालें ।
    2. मैक्रो स्क्रिप्ट प्रारंभ करें । मैक्रो निंन चरणों का पालन करेगा:
      1. 5 nL वितरण (टिप पर किसी भी हवा में बुलबुले को हटाने के लिए) और नमूना स्थिति के लिए जाना ।
      2. महाप्राण ६५ nL के सैंपल भरे । फ्यूज 5 nL नमूना ट्यूब में वापस । सिस्टम प्रतिक्रिया के लिए यह खातों और सिंक्रनाइज़ लेखन की अनुमति देते हैं, यानी, यह सुनिश्चित करने के लिए कि औषधालय और मंच आंदोलन एक ही समय में शुरू करते हैं ।
      3. "ग्रिड" स्थिति में ले जाएं ।
      4. शुरू ' लेखन ' पैटर्न है, जो microcapillary ग्रिड भर में स्थानांतरित करने के लिए, एक साथ नमूना के ४५ nL वितरण का कारण होगा ।
      5. बाद में, microcapillary वापस ग्रिड के केंद्र में ले जाएं, यह एक और 10 µm कम है, और अतिरिक्त नमूना तरल वापस ले लो ।
      6. microcapillary को वापस ले और विद्युत चुंबक को बंद कर दें । इस चिमटी विज्ञप्ति और डुबकी ठंड शुरू ।
  6. चिमटी पकड़ और ध्यान से गोताख़ोर से चुंबकीय अनुकूलक जारी । जल्दी से क्रायो बॉक्स युक्त cryogen कंटेनर में एतान कप से ग्रिड हस्तांतरण और एक मुक्त स्लॉट में ग्रिड जगह है ।

3. सिंगल सेल Lysate तैयारी

  1. electroporation के लिए microcapillaries तैयार करें ।
    नोट: पतला (लेजर खींचा और निरीक्षण) सिलिका microcapillaries से जुड़े हुए बाहर पर एक की रक्षा polyimide कोटिंग है, टिप, जहां कोटिंग के दौरान बंद जला दिया जाता है के लिए छोड़कर पतला प्रक्रिया ।
    1. एक प्रवाहकीय परत के साथ microcapillaries कोट करने के लिए, उंहें एक धातु रेल पर ४५ ° के कोण पर माउंट, ऊपर की ओर इशारा करते हुए सुझावों के साथ । एक एल्यूमीनियम पंनी का प्रयोग करने के निचले अंत (2 सेमी) सुझावों की ढाल, के रूप में uncoat polyimide प्रेस के साथ सबसे अच्छा सील रूपों फिट connectors बाद में कार्यरत हैं ।
    2. धूम जमा 20 एनएम ती की एक चिपचिपा परत/डब्ल्यू, और फिर एक २०० एनएम-पीटी की मोटी परत ।
  2. microcapillary टिप hydrophobic बनाएं ।
    1. ेतोः में 1-dodecanethiol का 1 M हल तैयार करें ।
    2. चमक-microcapillary हवा में ०.४ mbar पर १०० डब्ल्यू पावर के साथ 1 मिनट के लिए निर्वहन ।
    3. 1 के 1 एम समाधान में microcapillary के टिप विसर्जित-dodecanethiol कुछ घंटों के लिए (आदर्श रातोंरात) ।
      नोट: यह सबसे अच्छा है युक्तियों का उपयोग करने से पहले हौसले से एक दिन तैयार ।
  3. कोई नया microcapillary स्थापित करें ।
    1. 1-dodecanethiol समाधान से microcapillary निकालें, इथेनॉल के साथ बाहर कुल्ला और एक सिरिंज का उपयोग कर इथेनॉल के साथ अंदर फ्लश ।
      नोट: यदि कोई कार्यात्मक microcapillaries उपलब्ध हैं, जल्दी से एक microcapillary की नोक निर्वहन चमक और वाणिज्यिक कार खिड़की के उपचार, जो PDMS और सल्फर एसिड का एक मिश्रण है की एक बूंद में डुबकी । परिणामस्वरूप hydrophobic functionalization 1-dodecanethiol के साथ के रूप में के रूप में अच्छा नहीं है, लेकिन आम तौर पर पर्याप्त ।
    2. एक केशिका कटर के साथ अपने अनकोट अंत सट ।
      नोट: एक साफ कटौती प्रेस फिट संबंधक के साथ एक अच्छी मुहर के लिए महत्वपूर्ण है ।
    3. कांच और polyimide कोटिंग के बीच गठित तेज बोर्डर के लिए सिल्वर पेस्ट लागू करने के लिए एक दंर्तखोदनी का प्रयोग करें जब polyimide कोटिंग केशिका खींच के दौरान लेजर द्वारा जला दिया गया था ।
      नोट: इस सुदृढीकरण के रूप में आवश्यक है पीटी कोटिंग इस क्षेत्र में बहुत कमजोर है, और विद्युत चालन आसानी से टूट सकता है ।
    4. microcapillary के polyimide छोर को एसीटोन के साथ धो लें । अंत में एसीटोन की एक छोटी सी बूंद छोड़ दो और प्रेस के छिद्र में डालें-फिट संबंधक । एक अच्छी मुहर बनाने के लिए हल्के दबाव लागू करें ।
  4. microcapillary स्थिति जांचना ।
    1. उपकरण चालू करें और चरण १.१ में वर्णित के रूप में सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें । साथ ही, माइक्रोस्कोप कैमरा और फ़ंक्शन जनरेटर प्रारंभ करें ।
    2. माइक्रोस्कोप पर स्लाइड धारक में एक ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें ।
    3. microcapillary गिलास स्लाइड के करीब कम है और यह सूक्ष्मदर्शी उद्देश्य पर केंद्र जब तक यह माइक्रोस्कोप कैमरा देखने में प्रकट होता है । छवि के केंद्र में microcapillary की नोक की स्थिति के लिए x-और y-अक्ष रेखीय चरणों का उपयोग करें । फिर धीरे से टिप कम जब तक यह थोड़ा गिलास स्लाइड छू लेती है ।
      सावधानी: अंतिम दृष्टिकोण की ओर बहुत छोटे कदम (5 µm) चुनें । अंयथा, टिप क्षतिग्रस्त हो सकता है ।
    4. प्रेस "जांचना नोजल" बटन । यह microcapillary ४० mm वापस कर देता है, और घर की स्थिति के रूप में इस स्थिति सेट करता है ।
  5. मुद्रांक PDMS मोहर तथा इतो स्लाइड तैयार करना
    1. मिश्रण PDMS और crosslinker 10:1 अनुपात में, के बारे में एक बड़ी पेट्री पकवान में डालना 2-3 mm. सेंकना एक संकरण मशीन या इसी तरह के उपकरण में कुछ घंटों के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर ।
    2. एक हथौड़ा और एक टिकट (12 मिमी व्यास) के साथ, PDMS परत में छेद में कटौती । बाद में, एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए बाहर 2 सेमी लंबे चौकों या आयत छेद सहित काटने के लिए मुद्रांकित टुकड़े कि एक खुर्दबीन स्लाइड पर फिट प्राप्त करने के लिए । आमतौर पर, दो मोहरे टुकड़े एक खुर्दबीन स्लाइड पर बढ़ रहे हैं ।
    3. PDMS टुकड़े और इतो पहले डिटर्जेंट के साथ स्लाइड धो और फिर ७०% इथेनॉल के साथ । उंहें प्लेस, गीला, एक पेट्री पकवान में और इथेनॉल पूरी तरह से ६० डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में लुप्त हो जाना
    4. चमक-निर्वहन ०.४ mbar पर १०० W पावर के साथ 1 मिनट के लिए इतो स्लाइड और फिर कोटिंग समाधान (जैसे, पाली-L-lysine (पीएलएल)) के 1 मिलीलीटर लागू होते हैं । 5 मिनट के लिए मशीन, एक पिपेट के साथ समाधान निकालें, और 1 मिनट के लिए ddH2o. थोड़ा आंदोलन के 1 मिलीलीटर लागू करें, और फिर ddH2एक पिपेट का उपयोग कर ओ हटा दें । स्लाइड को ६० डिग्री सेल्सियस पर सूखने दें ।
  6. सेल कल्चर को तैयार करें । मानक अनुयाई-सेल संवर्धन प्रोटोकॉल (जैसे, अर्नोल्ड, एट अल का पालन करें । 24 , 25). इतो पर बीज कोशिकाओं सामांय बंटवारे के दौरान/passaging चलाता है ।
    1. एक ताजा पीएलएल-लेपित इतो स्लाइड ले लो और एक PDMS टुकड़ा जोड़ें । कुछ दबाव लागू करने के लिए एक निर्विवाद मुहर फार्म । यह उनके आधार के रूप में स्लाइड के साथ छोटे कुओं पैदा करता है ।
    2. PDMS वेल्स के लिए ताजा माध्यम में निलंबित कोशिकाओं के बारे में ३०० µ एल जोड़ें । बीज बोने की सघनता प्रति ७५,००० कोशिकाओं के आसपास होना चाहिए ।
    3. मानक शर्तों के तहत 1-2 दिनों के लिए इतो स्लाइड गर्मी ।
  7. सेल lysis प्रयोग के लिए तैयार करें:
    1. पूर्व गर्म electroporation बफर के कुछ मिलीलीटर (जैसे, फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब)) ।
    2. एनएस-EM ग्रिड तैयारी के लिए सेट-अप तैयार करें
      नोट: set-up तैयार करने के लिए विवरण चरण 1.1-1.5 (NS के लिए) या चरण 2.1-2.4 (क्रायो के लिए) में दिखाए जाते हैं । यहाँ हम एनएस-तैयारी के लिए सबसे महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन करते हैं ।
      1. एनएस (जैसे, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 2% methylamine tungstate) के 100-150 µ एल के साथ एक १०० या २०० µ एल पीसीआर ट्यूब भरकर एनएस तैयार करें । उपकरण के कूल्ड नमूना समर्थन पर ट्यूब प्लेस ।
      2. एनएस पीसीआर ट्यूब करने के लिए microcapillary ले जाएँ, एनएस समाधान में टिप विसर्जित और "दाग" के रूप में इस स्थिति को बचाने के ।
    3. मानक lysis पैरामीटर, उदाहरणके लिए, lysis वोल्टेज लोड ।
    4. मशीन से इतो स्लाइड ले लो और यह माइक्रोस्कोप डालने पर माउंट । एल्यूमीनियम डालने पर स्लाइड तय करने के लिए और स्लाइड के इतो कोटिंग के बीच बिजली के संपर्क को सुनिश्चित करने के लिए दो शिकंजा का उपयोग करें और विद्युत आधारित एल्यूमीनियम फ्रेम.
    5. सेल संस्कृति मध्यम निकालें और electroporation बफर के ३०० µ एल के साथ दो बार धो लो । कक्षों को electroporation बफ़र में रखें ।
    6. प्लेस एल्यूमीनियम सेटअप पर लाइव सेल मशीन मंच में इतो स्लाइड धारण संमिलित करें ।
    7. माइक्रोस्कोप दृश्य में सेल संस्कृति का पता लगाने और कोई कोशिकाओं के साथ एक क्षेत्र का चयन करें । दृष्टिकोण इतो सतह के लिए टिप और धीरे से इसे छूने, तो टिप १०० µm वापस लेने और "कोशिकाओं" के रूप में स्थिति को बचाने के ।
    8. जल्दी से सेल संस्कृति छोड़ दो और प्रणाली तरल के nanoliters के कुछ दसियों के साथ microcapillary टिप फ्लश तो यह सेल संस्कृति में फिर से डाल दिया । PDMS में विसर्जन के दौरान कुछ nanoliters वितरण अच्छी तरह से सुनिश्चित करने के लिए कि कोई हवा में बुलबुले टिप पर फंस रहे हैं ।
    9. धीरे इतो सतह दृष्टिकोण (शुरू में, आप की स्थिति में होना चाहिए "कोशिकाओं", यानी, सतह के ऊपर १०० µm). संपर्क पर, 10 µm टिप वापस लेना ।
    10. lysis के लिए पास के किसी कक्ष का चयन करें । लक्षित कक्ष के ऊपर microcapillary की नोक रखें ।
  8. एकल-कक्ष lysis के लिए मैक्रो स्क्रिप्ट प्रारंभ करें ।
    1. वह स्थिति नाम microcapillary को किसी कक्ष के सफलतापूर्वक लीजड ड के बाद ले जाया जाना चाहिए । यह एन एस जलाशय (एनएस-em), एक साल्टिंग बफर (क्रायो-em) या em ग्रिड (क्रायो-em) होगा । वर्तनी त्रुटियों से बचें और "ok" दबाएं ।
    2. मैक्रो उपयोगकर्ता हस्तक्षेप के बिना आय:
      1. i) माइक्रोस्कोप स्टेज और कोशिका संस्कृति १०० µm बाईं ओर ले जाया जाता है, लक्षित कक्ष का एक स्नैपशॉट लिया जाता है, और ५० nL ddH2ओ प्रणाली तरल microcapillary से तिरस्कृत कर रहे हैं । यह विस्थापित और उच्च नमक बफर पतला और सेल के लिए आसमाटिक दबाव लागू होता है ।
      2. द्वितीय) चरण वापस स्थानांतरित करने के लिए लक्षित कक्ष के ऊपर टिप फिर से स्थिति है । पूर्वनिर्धारित वोल्टेज फट लागू किया जाता है, और ५०० के बाद एमएस पंप प्रणाली 2 µ l/मिनट की एक प्रवाह दर पर नमूना के 3 nL महाप्राण करने के लिए शुरू होता है ।
      3. iii) चरण को पुन: बाईं ओर ले जाया जाता है, जिससे कक्ष का निरीक्षण किया जा सके । एक विंडो प्रकट होता है, उपयोगकर्ता इनपुट के लिए पूछ ।
    3. कहते हैं कि lysis कदम सफल रहा या नहीं.
      1. यदि जवाब नहीं है, पर ले, microcapillary फ्लश और एक नया सेल लक्ष्य ।
      2. उत्तर हाँ है, तो निकाला (लीजड ड) कक्ष का एक स्नैपशॉट लिया जाता है, और उसके बाद microcapillary 3.8.1 में निर्दिष्ट स्थान पर ले जाया गया है । यदि यह NS या कोई बफ़र जलाशय है, तो 3 x ०.५ nL के तरल का वितरण करने के लिए मानक उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस का उपयोग करें, जबकि microcapillary यह सुनिश्चित करने के लिए चलती है कि कोई हवाई बुलबुले नहीं हैं । इस टिप को स्थूल द्वारा जलाशय तरल में डुबोया जाता है ।
        नोट: आप नमूना शर्त करने के लिए जारी रख सकते हैं और क्रायो-em के लिए अनुभाग 1.6.9-1.7.9 के लिए एनएस-em या खंड २.२-२.६ के लिए समझाया ग्रिड के रूप में तैयार । नीचे, एनएस-ग्रिड तैयारी के लिए आवश्यक कदम समझाए गए हैं ।
    4. छोड़ microcapillary 8-12 मिनट के लिए डूबे, नोक ज्यामिति के आधार पर
      नोट: बफ़र में उच्च फॉस्फेट एकाग्रता कंडीशनिंग के लिए एक लंबा विसर्जन समय की आवश्यकता है ।
    5. ग्रिड पर वातानुकूलित कक्ष lysate के 5 nL का वितरण करना ।
    6. microcapillary को वापस लेने और वातानुकूलित नमूने को ओस बिंदु के तापमान के ऊपर 1-2 ° c को विनियमित करने के लिए टपकती पॉइंट स्टेज (डीपी-स्टेज) पर धीरे से सूखने दें ।
    7. ग्रिड निकालें और एक ग्रिड बॉक्स या पेट्री डिश में कमरे के तापमान पर यह दुकान ।

Representative Results

"cryoWriter" सेटअप विकसित किया गया था ( चित्रा 2में चित्रित) क्रम में लघुकृत EM ग्रिड तैयारी का परीक्षण करने के लिए चित्रा 1सी, डीमें प्रस्तावित प्रक्रियाओं चित्रा 2 एक व्युत्क्रम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के लिए घुड़सवार विभिंन घटकों का एक सिंहावलोकन दिखाता है । एक सेल-संवर्धन मॉड्यूल माइक्रोस्कोप के बाईं ओर स्थापित किया गया है; EM ग्रिड तैयारी के लिए एक मॉड्यूल दाईं ओर स्थित है । सेल-संवर्धन मॉड्यूल (चित्रा 2बी) प्रकाश माइक्रोस्कोप द्वारा अनुयाई eukaryotic कोशिकाओं और सेल संस्कृति के रहते सेल इमेजिंग के विकास की अनुमति देता है । व्यक्तिगत कोशिकाओं आसमाटिक सदमे, electroporation और एक microcapillary (चित्रा 2बी, चित्रा 6एक)24,25में सेल सामग्री की आकांक्षा की संयुक्त कार्रवाई के द्वारा लीजड ड हैं । aspirated lysate नमूना तो एन एस के लिए ग्रिड तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता-या क्रायो-EM. वैकल्पिक रूप से, एक पीसीआर ट्यूब में एक स्टॉक प्रोटीन समाधान नमूना स्रोत हो सकता है । microcapillary (चित्रा 2बी) कार्यरत एक उच्च परिशुद्धता पंप नमूना मात्रा aspirated और उप nL परिशुद्धता के साथ तिरस्कृत करने की अनुमति प्रणाली से जुड़ा है । के रूप में प्रोटोकॉल में विस्तृत, सभी नमूना प्रसंस्करण इस microcapillary के भीतर या EM ग्रिड पर ही महत्वपूर्ण नमूना परिवहन के बिना किया जाता है. उदाहरण के लिए, एक ही microcapillary लाइसे व्यक्तिगत eukaryotic कोशिकाओं, महाप्राण lysate, यह शर्त है, और अंत में EM ग्रिड पर aliquots वितरण के लिए प्रयोग किया जाता है । ग्रिड तैयारी मॉड्यूल एक जंगम डी पी मंच है कि EM ग्रिड के तापमान पर यह ठीक से नियंत्रित किया जा करने के लिए अनुमति देता है (चित्रा 2सी) के होते हैं । एनएस-उनि के लिए, तैयार नमूना ग्रिड तो बस शीत मंच से हटाया जा सकता है और कमरे के तापमान पर हवा में शुष्क करने की अनुमति दी । हालांकि, तथाकथित कॉफी-अंगूठी प्रभाव है कि फिर परिणाम के लिए मात्रात्मक उनि जहां ' प्रोटीन ' कणों की गिनती कर रहे है के लिए बचा जा सकता है । ऐसा करने के लिए, ग्रिड धीरे धीरे वृद्धि तापमान ढाल तरल वाष्पीकरण धीमा करने के लिए का उपयोग कर डीपी-मंच पर धीमे सूख रहे हैं । क्रायो के लिए, ग्रिड के तापमान ओस बिंदु के करीब रखा है; लगभग 8 डिग्री सेल्सियस का एक सकारात्मक ऑफसेट चुना है, पतली फिल्म स्थिरीकरण और thinning के लिए नमूना तरल के नियंत्रित वाष्पीकरण की अनुमति है, जो एक संवेदक द्वारा निगरानी की जा सकती है अगर आवश्यक26। चयनित thinning समय के बाद, एक पिकअप और डुबकी प्रणाली सक्रिय है और नमूना vitrified (चित्रा 2सी) है । ध्यान दें कि इस डूबनेवाला तंत्र के लिए आवश्यक नहीं है एनएस-EM ग्रिड, जो कमरे के तापमान पर संग्रहित हैं ।

Figure 2
चित्रा 2: cryoWriter सेटअप का अवलोकन. एक) cryoWriter सेटअप का अवलोकन एक व्युत्क्रम प्रकाश माइक्रोस्कोप (1) पर मुहिम शुरू की । ख) क्षेत्र के इनसेट में बाईं ओर पैनल ए सेल संवर्धन डिब्बे (2) में संकेत दिया, एक microcapillary के साथ (3) नमूना हेरफेर और सेल lysis एक लघुकृत PDMS के ऊपर तैनात के लिए सेल कल्चर प्लेट (4) आधारित है । C) क्षेत्र के इनसेट में सही पक्ष पर संकेत पैनल ए ' उठाओ और ' डुबकी तंत्र । एक छिद्रित कार्बन फिल्म EM ग्रिड (5) चिमटी (6) के सुझावों के बीच मुहिम शुरू की है और तापमान नियंत्रित चरण (7), मुख्य पाठ में ओस बिंदु मंच (डीपी चरण) के रूप में भेजा के साथ सीधे संपर्क में क्षैतिज स्थिति । मंच के तापमान कसकर एक PID नियंत्रक और एक पानी ठंडा Peltier तत्व के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है, यह रखने पर या बंद करने के लिए ओस बिंदु तापमान, परिवेश वातावरण पर निर्भर करता है । DP-चरण (7) ग्रिड microcapillary के सापेक्ष स्थानांतरित करने के लिए एक मोटर चालित xy अक्ष पर माउंट किया गया है । microcapillary ही एक z-मंच पर मुहिम शुरू की है और कम किया जा सकता है जब तक यह बहुत EM ग्रिड की सतह के करीब है और nanoliter वितरण के लिए इस्तेमाल किया नमूना समर्थन पर मात्रा आकार (एन एस के लिए एक सतत पतली कार्बन परत उंहें या सीआर के लिए एक छेद कार्बन फिल्म यो-EM) । ध्यान दें कि तरल तेज और वितरण एक उच्च परिशुद्धता पंप प्रणाली (8) का उपयोग किया जाता है । तिरस्कृत तरल एक सर्पिल पैटर्न में microcapillary के सापेक्ष ग्रिड चलती द्वारा वितरित किया जा सकता है । क्रायो-EM तैयारी के लिए, पिकअप और डुबकी ठंड तंत्र (9) तेजी से ठंडा और नमूना vitrification के लिए तरल एतान (10) में नमूना भरी हुई ग्रिड स्थानान्तरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 3 प्रतिनिधि NS-EM ग्रिड cryoWriter सेटअप का उपयोग कर तैयार के लिए प्राप्त परिणामों से पता चलता है । microcapillary की नोक एक शेयर समाधान से नमूना के 5 nL के साथ भरी हुई थी और कई मिनट के लिए एन एस समाधान (2% methylamine tungstate) के एक जलाशय में डूबा के लिए एन एस और नमक आयनों के प्रसार विनिमय की अनुमति (एक सैद्धांतिक चर्चा के लिए अर्नोल्ड देखें, एट al. 24). बाद में, वातानुकूलित नमूना एक एनएस-EM ग्रिड और सूखे की पतली कार्बन फिल्म पर तिरस्कृत किया गया था । चित्रा 3 एक उसी तरह से एक स्लॉट ग्रिड के उपयोग से पता चलता है पूर्ण छोटी बूंद कल्पना, के रूप में मात्रात्मक उनि के लिए आवश्यक है । आदेश में कॉफी की अंगूठी प्रभाव से बचने के लिए, हौसले से चमक-निर्वहन ग्रिड शुरू में ओस बिंदु तापमान (पानी वाष्पीकरण) पर आयोजित किया गया था और फिर धीरे से गर्म डी पी-मंच पर । ध्यान दें, कि सबसे अनुप्रयोगों के लिए (जैसे, नमूना या संरचनात्मक विश्लेषण की गुणवत्ता नियंत्रण) इस धीमी गति से सुखाने की प्रक्रिया की जरूरत नहीं है । उच्च गुणवत्ता एनएस-तैयारी इसके बिना प्राप्त कर रहे हैं, के रूप में चित्रा 3बी, सीमें दिखाया गया है । फॉस्फेट के लिए कंडीशनिंग बार-मुफ्त कम नमक बफ़र्स 3 मिनट के आसपास हैं, जैसे, कम नमक Tris के साथ बफर (20 मिमी Tris-५० mm NaCl के साथ एचसीएल पीएच ७.४), के रूप में चित्रा 3बी में दिखाया के रूप में तंबाकू मोज़ेक वायरस का उपयोग (TMV) नमूना के रूप में । चित्रा 3 सी TMV के रूप में एक सबसे ज्यादा मामले परिदृश्य प्रस्तुत करता है पंजाबियों बफर (२.७ mm KCl, १.५ mm KH2PO4, १३६.९ मिमी NaCl, ८.९ मिमी न2HPO4· 7H2O, पीएच ७.४) में था । फॉस्फेट-एन एस के भारी धातु आयनों के साथ क्षणिक क्रिस्टल फार्म ( चित्रा 5सीदेखें), कंडीशनिंग समय की आवश्यकता (7 मिनट) लंबा । अंय भारी धातु लवण भी ग्रिड तैयारी मॉड्यूल के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरणके लिए, 2% methylamine vanadate या अमोनियम molybdate (भी अर्नोल्ड, एट अल देखें । 24). हालांकि, uranyl एसीटेट उपयुक्त नहीं है; इस दाग के crosslinking प्रभाव समुच्चय की ओर जाता है अगर प्रोटीन का नमूना समाधान में वातानुकूलित है, एक कार्बन फिल्म के लिए सोखना से पहले ( चित्रा 5ईदेखें)23।

Figure 3
चित्रा 3: एन एस ग्रिड के लिए विशिष्ट परिणाम चित्र 1सीमें संकेत के रूप में cryoWriter सेटअप का उपयोग कर तैयार किया । a ) 2% methylamine tungstate के साथ कंडीशनिंग के बाद एक स्लॉट ग्रिड पर तिरस्कृत एक 3 nL छोटी बूंद की सिंहावलोकन छवि । ख) 20 मिमी TRIS बफर में TMV । इनसेट संकेत क्षेत्र के एक 3x वृद्धि से पता चलता है । अर्नोल्ड, एट अल24 से अनुकूलित (आगे की अनुमति सामग्री के अंश से संबंधित ACS करने के लिए निर्देशित किया जाना चाहिए) । ग) पंजाब में तंबाकू मोज़ेक वायरस (TMV) बफर । इनसेट संकेत क्षेत्र के एक 3x वृद्धि से पता चलता है । अर्नोल्ड, एट अल24 से अनुकूलित (आगे की अनुमति सामग्री के अंश से संबंधित ACS करने के लिए निर्देशित किया जाना चाहिए) । स्केल बार्स: A, १०० µm; बी, ५० एनएम; सी, ८० एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

ठेठ क्रायो-EM ग्रिड के लिए प्राप्त cryoWriter सेटअप का उपयोग कर तैयार परिणाम चित्रा 4में दर्शाया गया है । पैनल 4a vitrified नमूना द्वारा कवर क्षेत्र के एक ग्रिड एटलस से पता चलता है. पैनल 4B एक चयनित ग्रिड स्लॉट में अवलेह बर्फ की एकरूपता से पता चलता है । दोनों ही मामलों में, नमूना 25 मिमी HEPES में था-KOH pH ७.५, ५० mm NaCl बफर युक्त ०.०५% फोस 14 डिटर्जेंट । कई नमूनों और बफ़र्स का परीक्षण किया गया और एक तुलनीय उच्च गुणवत्ता अवलेह बर्फ प्राप्त किया गया था, लेकिन आवश्यक शर्तों बफर निर्भर हैं ( चित्रा 5की भी चर्चा देखें). पैनल 4c apoferritin कणों और एक भोजी Tris-hcl बफर में दिखाता है (20 मिमी Tris-एचसीएल, ५० मिमी NaCl, पीएच ७.४) के विपरीत बढ़ाने के लिए उच्च infocus में imaged. पैनल 4d से पता चलता है एक २०० केडीए झिल्ली प्रोटीन amphipoles द्वारा स्थिर ।

Figure 4
चित्रा 4: क्रायो EM ग्रिड के लिए विशिष्ट परिणाम चित्रा 1डीमें संकेत के रूप में cryoWriter सेटअप का उपयोग कर तैयार किया । नमूने और बफ़र्स दिखाए गए उदाहरणों में भिन्न होते हैं । सभी नमूनों को होल कार्बन फिल्मों पर लोड किया गया । a ) अवलोकन छवियों का महाविद्यालय ("ग्रिड एटलस") एक १५० केडीए झिल्ली प्रोटीन युक्त नमूने की, अवलेह बर्फ की परिधि सफेद तीर द्वारा संकेत दिया है. ख) एक ही बफर के साथ तैयार ग्रिड से बढ़े ग्रिड स्लॉट, अवलेह बर्फ के साथ छेद कार्बन फिल्म दिखा । कुछ छेद सफेद तीर से संकेत के रूप में नमूना बफर के साथ नहीं भर रहे हैं । ग) apoferritin प्रोटीन कॉम्प्लेक्स और bacteriophages युक्त vitrified नमूना के साथ कार्बन छेद । इनसेट: दोहरा इज़ाफ़ा एक भोजी की पूंछ दिखा रहा है । सफेद तारे कार्बन फिल्म इंगित करता है । ध्यान दें कि छवि उच्च infocus के साथ दर्ज की गई विपरीत वृद्धि हुई है । D) amphipols में २०० केडीए झिल्ली प्रोटीन पुनर्गठन । इनसेट: संकेत क्षेत्र के एक 2x वृद्धि इसके विपरीत वृद्धि के साथ दिखाया गया है । स्केल बार्स: A, १०० µm; ख, 10 µm; सी और डी, ८० एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

cryoWriter सेटअप इष्टतम EM-ग्रिड तैयारी की स्थिति के लिए व्यवस्थित स्क्रीनिंग की अनुमति देता है; एक उदाहरण चित्रा 5ए में (apoferritin में 25 मिमी HEPES-KOH pH ७.५, ५० mm NaCl, ०.०५% फोस 14) दिखाया गया है । इस प्रयोग में, अवलेह बर्फ "thinning" तापमान विविध था, लेकिन समय thinning (यानी, नमूना आवेदन और डुबकी ठंड के बीच समय अंतराल) लगातार (1 एस) बनी रही । कम ऑफसेट तापमान पर (जैसे, 8 K), नमूना परत बहुत मोटी थी । उच्च ऑफसेट तापमान पर, छेद में अवलेह बर्फ पतली (10 k, 12 k) था, जब तक कुछ स्तर पर (18 से ऊपर) ग्रिड पूरी तरह से शुष्क हो गया (नहीं दिखाया) । यहां प्रस्तुत परिणामों में, अवलेह बर्फ की एक बड़ी सजातीय क्षेत्र के लिए 12 K सीसा की ऑफसेट के रूप में काले तीर से संकेत दिया । इस तरह के अनुकूलन प्रयोगों "परीक्षण" प्रोटीन (जैसे apoferritin के रूप में) का उपयोग लक्ष्य नमूना के बफर के साथ किया जा सकता है । पाया सबसे अच्छा शर्तों तो लक्ष्य नमूने के लिए लागू कर रहे हैं । इसके अलावा, इष्टतम से दूर मापदंडों के साथ ग्रिड अक्सर तैयारी प्रक्रिया के दौरान पहचाना जा सकता है और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में दिखलाई जाने की आवश्यकता नहीं है, महत्वपूर्ण समय की बचत । चित्रा 5 भी ठेठ क्रायो के एक गैलरी से पता चलता है em (पैनल बी) और एन एस-em (पैनलों सी ई करने के लिए) cryoWriter सेटअप करने के लिए विशिष्ट कलाकृतियों । क्रायो-EM ग्रिड ०.१% decyl-β-D-maltopyranoside (२.७ मिमी KCl, १.५ मिमी KH2पीओ4, १३६.९ मिमी NaCl, ८.९ मिमी ना2HPO4· 7H2O, पीएच ७.४, 0.1% डीएम) युक्त पंजाब में TMV के साथ पैनल में दिखाया गया जरूरत से ज्यादा पतले था । छवि की पृष्ठभूमि दानेदार है क्योंकि नमक एकाग्रता बहुत अधिक हो गया । सामांय में, एक नमूना के दृश्य उपस्थिति के लिए नमक एकाग्रता का एक रैखिक समारोह प्रतीत नहीं होता; अनाज अचानक प्रमुख हो जब एक दहलीज एकाग्रता thinning प्रक्रिया के दौरान पहुंच गया है । ध्यान दें कि अवांछित पदार्थों को ग्रिड तैयारी से पहले एक कंडीशनिंग चरण द्वारा निकाला जा सकता है, जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग १.६ में NS-EM के लिए वर्णन किया गया है । एनएस अन्य कलाकृतियों का कारण बन सकते हैं । पैनल 5C में दिखाए गए उदाहरण में, पंजाबियों बफर (२.७ मिमी KCl, १.५ मिमी KH2पीओ4, १३६.९ मिमी NaCl, ८.९ मिमी न2HPO4· 7H2O, पीएच ७.४) नमूने के बिना 3 मिनट के लिए 2% methylamine tungstate में वातानुकूलित किया गया था । हाला और क्रिस्टल हैं जाहिर है और कार्बन दरारें अग्रणी सतह पर व्यापक बलों डालती । एक निश्चित पंजाब और एन एस एकाग्रता रेंज में ही फार्म का हाला और अब के लिए नमूना कंडीशनिंग से बचा जा सकता है ( चित्रा 3सीकी तुलना). पैनल 5d एक तिरस्कृत एनएस नमूना छोटी बूंद एक "कॉफी की अंगूठी" का प्रदर्शन की परिधि से पता चलता है । यह मात्रात्मक, कुल नमूना विश्लेषण परेशान होता है और नीचे सुखाने की प्रक्रिया को धीमा द्वारा बचा जा सकता है, यानी, नमूना आवेदन के दौरान ओस बिंदु तापमान पर EM ग्रिड रखकर, और फिर धीरे से यह शुष्क करने के लिए तापमान में वृद्धि ( चित्र 3A) देखें । पैनल 5E (20 मिमी HEPES, पीएच ७.०, वातानुकूलित 3 मिनट में apoferritin) 2% uranyl एसीटेट दाग है, जो हालत प्रोटीन नमूनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता से पहले वे कार्बन फिल्म के लिए adsorbed का समर्थन करता है की crosslinking गतिविधि से पता चलता है ।

Figure 5
चित्रा 5: व्यवस्थित परिवर्तन और कलाकृतियों मनाया जब cryoWriter सेट अप एन एस के लिए ग्रिड तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और क्रायो-EM. क) व्यवस्थित अवलेह बर्फ मोटाई भिन्नता; क्रायो-EM के लिए ग्रिड तैयारी का अनुकूलन । डीपी की ऑफसेट तापमान-चरण (8 k से 12 k) के लगातार thinning समय (1 ओं) को ध्यान में रखते हुए विविध था । तीर नमूना परत की परिधि से संकेत मिलता है । ख) नमक प्रभाव; बहुत अत्यधिक ध्यान केंद्रित, यानी, thinning कदम बहुत लंबा था । इनसेट संकेत क्षेत्र के एक 2x वृद्धि दर्शाया गया है । ग) नमक भारी धातु लवण की उपस्थिति में पंजाबियों बफर द्वारा गठित हाला । पंजाबियों बफ़र वाले नमूने अंय बफ़र्स में नमूनों से अधिक वातानुकूलित होना चाहिए । यहां, पंजाब के बिना नमूना बफर 3 मिनट, अन्य नमूना बफ़र्स के लिए एक विशिष्ट समय के लिए 2% methylamine tungstate में वातानुकूलित था. कार्बन फिल्म में दरार सबसे शायद शुष्क प्रक्रिया के दौरान पतली समर्थन पर अभिनय से मजबूत ताकतों के कारण ध्यान दें । घ) ' कॉफी रिंग ' प्रभाव । E) Apoferritin 3 min. uranyl आयनों के लिए 2% uranyl एसीटेट में वातानुकूलित महत्वपूर्ण crosslinking गतिविधि और Apoferritin समूहों के रूप में बड़े समुच्चय का प्रदर्शन । स्केल बार्स: A, ८० µm; बी, ८० एनएम सी, 12 µm; D, ८० µm; ई, २०० एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

छोटी राशि और EM ग्रिड cryoWriter सेटअप का उपयोग कर तैयारी के लिए आवश्यक मात्रा में प्रयोगों के नए प्रकार सक्षम बनाता है । उदाहरण के लिए, किसी एकल कक्ष की कुल सामग्री को NS-और क्रायो के लिए एकत्रित और तैयार किया जा सकता है । प्रक्रिया चित्रा 6Aमें इंगित की गई है । एक अनुयाई, eukaryotic सेल (HEK २९३) एक साथ electroporation और नमूना आकांक्षा द्वारा लीजड ड है (पैनल 6A)25. 3 nL का कुल वॉल्यूम aspirated है, जिसमें कक्ष lysate हैं, और आगे की प्रोसेसिंग के लिए microcapillary में बने रहते हैं । पैनल घमण्ड में दर्शाए गए एनएस-EM के लिए सेल-संवर्धन मीडियम को पंजाब के बफर (२.७ एमएम KCl, १.५ एमएम KH2पीओ4, १३६.९ एमएम NaCl, ८.९ एमएम ना2HPO4· 7H2O, पीएच ७.४) से पहले सेल lysis के साथ अदला-बदली की गई । सेल सामग्री बफर के 3 nL में aspirated और एन एस के एक जलाशय में वातानुकूलित के रूप में 10 मिनट के लिए चित्रा 1सी में संकेत दिया गया । बाद में, एक 5 nL मात्रा एक एनएस-EM ग्रिड के निरंतर कार्बन फिल्म पर तिरस्कृत किया गया था । व्यक्तिगत प्रोटीन, जैसे, रेशा actin, और संलग्न प्रोटीन के साथ झिल्ली पैच छवि में पहचाना जा सकता है । क्रायो के लिए उंहें, चित्रा6C, 3 nL की एक मात्रा में दिखाया फिर से आकांक्षा के बिना एक छेद कार्बन EM ग्रिड पर तिरस्कृत किया गया था तरल हटाने के लिए । नमूना गठित की अपेक्षाकृत मोटी फिल्म vitrification से पहले बड़े पैमाने पर thinned था । यह करने के लिए, डीपी-चरण तापमान धीरे-धीरे बढ़ गया था, ओस बिंदु तापमान पर शुरू । thinning प्रक्रिया एक वास्तविक समय सेंसर प्रणाली द्वारा निगरानी की गई एक पूर्व निर्दिष्ट सीमा तक पहुंच गया था ' ले और ' डुबकी तंत्र और नमूना vitrification (विवरण के लिए अर्नोल्ड, एट अल देख रहा है । 26). झिल्ली संरचनाओं और प्रोटीन छवि में पहचाना जा सकता है ।

Figure 6
चित्र 6: cryoWriter सेट-अप का उपयोग करके एकल कक्ष दृश्य प्रोटियोमिक् । क) Lysis एकल अनुयाई eukaryotic कक्ष । सेल एक कार्यात्मक, इतो लेपित (लाल) ग्लास-स्लाइड (2) में एक लघुकृत पेट्री-डिश (3)25पर उगाया जाता है (1, हरा) । इतो परत बिजली की जमीन है । सेल microcapillary (4) है, जो प्लैटिनम के साथ लेपित है द्वारा संपर्क किया है । एक प्रारंभिक आसमाटिक झटका (संकेत नहीं) lysis, जो बिजली की दालों की एक श्रृंखला द्वारा और कतरनी सेल lysate की आकांक्षा के दौरान लागू बलों द्वारा किया जाता है की सुविधा के लिए दिया जाता है । प्रक्रिया प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा निगरानी की जा सकती है; माइक्रोस्कोप के उद्देश्य लेंस (5) संकेत दिया है । विवरण के लिए, हमारे पिछले काम24,25देखें । ख) एक व्यक्ति HEK २९३ सेल से lysate की एनएस-EM छवि । संलग्न प्रोटीन के साथ रेशा actin और झिल्ली पैच दिखाई दे रहे हैं । पैनल अर्नोल्ड, एट अल से अनुकूलित ( आगे की अनुमति सामग्री से संबंधित कुछ अंश के ACS करने के लिए निर्देशित किया जाना चाहिए) । ग) एक व्यक्ति HEK २९३ सेल से lysate की क्रायो-EM छवि । इनसेट जहां जुड़े प्रोटीन के साथ ठेठ झिल्ली संरचनाओं दिखाई दे रहे है संकेत क्षेत्र के एक 2x वृद्धि से पता चलता है । पैनल सी अर्नोल्ड, एट अल से अनुकूलित 26 पैमाने सलाखों: बी, ५० एनएम; सी, ८० एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

' cryoWriter ' उपकरण और एन एस के लिए नमूना ग्रिड तैयार करने के लिए आवश्यक प्रोटोकॉल और क्रायो-EM से nL आकार कुल नमूना मात्रा और पूरी तरह से बचने शास्त्रीय कागज-सोख्ता कदम प्रस्तुत कर रहे हैं. Microfluidic सिद्धांतों और एक micromechanical प्रणाली cryoWriter में संयुक्त कर रहे है यह संभव बनाने के लिए ।

हमारे अनुभव से पता चलता है कि जब लघुकृत तरीकों इस पांडुलिपि में प्रस्तुत किया जाता है, EM-ग्रिड तैयारी के लिए पैरामीटर अंतरिक्ष शास्त्रीय तरीकों की तुलना में बड़ा है, और कडे उपयोगकर्ता नियंत्रण के अंतर्गत । महत्वपूर्ण बात, वृद्धि हुई reproducibility हासिल यह संभव नमूना बफर प्रणाली के साथ पूर्व स्क्रीन, एक आसानी से उपलब्ध परीक्षण प्रोटीन के साथ पूरित, इष्टतम मापदंडों निर्धारित करने से पहले वास्तविक प्रयोग किया जाता है । यह ब्याज का नमूना निरपेक्ष ंयूनतम करने के लिए की खपत रखता है और अत्यधिक की सिफारिश की है । एनएस-और क्रायो-EM ग्रिड तैयारी के लिए महत्वपूर्ण चरण हैं: (i) पंप सिस्टम का भड़काना; उप nanoliter मात्रा वितरण के लिए, प्रणाली तरल (पानी) degassed और बुलबुला मुक्त होना चाहिए । (ii) चमक निर्वहन या प्लाज्मा सफाई कदम का सटीक नियंत्रण; EM ग्रिड की सतह विशेषताओं reproducible परिणामों के लिए महत्वपूर्ण हैं । (iii) नमूना कंडीशनिंग; कंडीशनिंग के लिए आवश्यक समय, जैसे, एन एस के साथ, बफर प्रकार पर निर्भर करता है, नमक सामग्री और एकाग्रता (चित्रा 3), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से microcapillary24के नोजल ज्यामिति पर । (iv) मात्रात्मक em के लिए एनएस-em तैयारी के लिए वाष्पीकरण दर; कॉफी-रिंग प्रभाव एनएस-EM तैयारी का मात्रात्मक विश्लेषण निषेध कर सकते हैं, और डीपी-चरण द्वारा नियंत्रित धीमी वाष्पीकरण दरों द्वारा दबा दिया जाना चाहिए ।

प्रस्तुत ग्रिड तैयारी विधियों के विभिंन पहलुओं को आज़ादी से विशिष्ट नमूनों के लिए बहुमुखी प्रोटोकॉल के विकास की अनुमति संयुक्त किया जा सकता है । ठेठ उदाहरण एक पदार्थ है कि उच्च संकल्प उंहें रोकता है, जैसे, ग्लिसरॉल, क्रायो के लिए ग्रिड तैयार करने से पहले एक कंडीशनिंग कदम से हटाने का होगा; लाइगैंडों के रूप में मध्यस्थ अणुओं का परिचय, ग्रिड तैयार कर रहे हैं पहले कंडीशनिंग द्वारा; या एनएस-या क्रायो-EM (चित्रा 6) द्वारा एकल कोशिका lysate की परीक्षा ।

प्रस्तुत विधियों में microfluidics और न्यूनतम नमूना मात्राओं का उपयोग कागज़-सोख्ता चरणों की आवश्यकता को पूरी तरह से निकाल देता है. यह एक महान लाभ है, क्योंकि कागज सोख्ता प्रोटीन के लिए एक कठोर उपचार है, संभावित अवांछित आयनों के साथ नमूना दूषित और स्वाभाविक बड़े पैमाने पर नमूना नुकसान के लिए अग्रणी. दूसरी ओर, संभावित प्रभाव क्रायो-EM नमूने शास्त्रीय तरीके से तैयार किए जाते हैं जब cryoWriter का उपयोग किया जाता है जब का गठन पतली नमूना फिल्म का हवा-पानी इंटरफेस की वजह से. क्रायो-EM के लिए उपयुक्त ग्रिड नमूना अनुप्रयोग और vitrification (दिखाया नहीं गया डेटा) के बीच एक से कम ०.२ s प्रतीक्षा समय के साथ तैयार किया जा सकता है । हालांकि, के रूप में प्रोटीन प्रसार द्वारा कुछ नैनोसेकंड में एक नैनोमीटर के कुछ दसवें यात्रा, वहां अभी भी पर्याप्त समय के लिए उंहें एक १०० एनएम मोटी नमूना फिल्म के हवा पानी अंतरफलक के साथ टकराने के लिए कई बार है । हालांकि, हवा पानी अंतरफलक से चिपके प्रोटीन की राशि काफी इन कम समय अंतराल से कम हो सकता है और प्रोटीन विकार या प्रतिबंधित कण उंमुखीकरण को रोकने सकता है । एक और आशाजनक दृष्टिकोण है कि हवा से संवेदनशील प्रोटीन की रक्षा कर सकते है पानी अंतरफलक को कम आणविक भार सतह सक्रिय पदार्थों द्वारा नमूना फिल्म को कवर है । इन यौगिकों तेजी से ग्रिड तैयारी से पहले cryoWriter में एक कंडीशनिंग कदम से शुरू किया जा सकता है । microfluidic प्रणालियों के उच्च सतह से मात्रा अनुपात cryoWriter की एक और सीमा है, के रूप में नमूना संभावित microcapillary सतह के लिए विशिष्ट सोखना द्वारा खो दिया जा सकता है और कण गिनती द्वारा मात्रात्मक विश्लेषण परेशान । समस्या दो तरीकों से संबोधित किया है: पहले, नमूना microcapillary के भीतर लंबी दूरी की यात्रा नहीं करता है । दरअसल, nanoliter नमूना मात्रा प्रसंस्करण भर में केशिका टिप पर रहता है । दूसरा, मात्रा अनुपात करने के लिए सतह और अपेक्षाकृत बड़े भीतरी व्यास के साथ microcapillaries का उपयोग करके कम है, जैसे, १८० µm. तीसरा, microcapillaries की सतहों आसानी से passivated जा सकता है यदि आवश्यक हो, जैसे, उन्हें इलाज के द्वारा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध polylysine इथेनॉल glycols (पीएलएल-खूंटी) के साथ ।

एकल कण दृष्टिकोण द्वारा प्रोटीन के उच्च संकल्प विश्लेषण EM में इस्तेमाल केवल व्यक्तिगत प्रोटीन कणों के कुछ लाख छवियों के लिए १००,००० की आवश्यकता है । इसका मतलब यह है कि microfluidic तकनीक संरचनात्मक जांच के लिए पर्याप्त प्रोटीन परिसरों प्रदान कर सकते हैं । एक लघुकृत इंयूनो प्रोटीन परिसरों के तेजी से अलगाव (लगभग 1 घंटे) के लिए न्यूनतम सेल मात्रा (करीब ४०,००० कोशिकाओं) से पूर्व में विकसित किया गया था पहले28। इस विधि अब सीधे cryoWriter के लघुकृत नमूना तैयारी चरण से जोड़ा जाएगा । अंतिम लक्ष्य के लिए एक एकीकृत microfluidic पाइपलाइन विकसित करने के लिए अल्ट्रा फास्ट प्रोटीन अलगाव और क्रायो-EM ग्रिड की तैयारी है कि सभी में दो घंटे से भी कम की आवश्यकता है । इसके अलावा, के रूप में 6 चित्रा, मिनट राशि और नमूना तैयारी और लगभग दोषरहित कंडीशनिंग और ग्रिड तैयारी प्रक्रिया के लिए आवश्यक सामग्री की मात्रा के द्वारा प्रदर्शन किया cryoWriter का उपयोग कर हासिल की, यह प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए संभव बनाने व्यक्तिगत कोशिकाओं के परिसरों । साथ में, लघुकृत इंयूनो-वर्षा विधि और cryoWriter एक नई प्रोटियोमिक् विधि की नींव रखना "एकल सेल दृश्य प्रोटियोमिक्" कहा जाता है, के रूप में हम हाल ही में गर्मी सदमे प्रयोगों24के लिए प्रदर्शन किया । डेटा विश्लेषण "दृश्य प्रोटियोमिक्" छवियों के विश्लेषण के लिए तैयार एल्गोरिदम वर्तमान में परीक्षण किया जा रहा है ।

Disclosures

लेखक स्टीफन ए अर्नोल्ड, Henning Stahlberg और थॉमस रचाई निंनलिखित प्रतिस्पर्धा वित्तीय ब्याज की घोषणा: cryoWriter अवधारणा पेटेंट आवेदन पीसीटी का हिस्सा है/EP2015/065398 और EP16194230 ।

Acknowledgments

लेखक उनके समर्थन के लिए विश्वविद्यालय बेसल के Biozentrum की कार्यशाला का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, महत्वपूर्ण चर्चा के लिए एस. ए. म्यूलर और ध्यान से पांडुलिपि पढ़ने के लिए, ए Fecteau-EM, रिकार्डो Adaixo, फ्रैंक के साथ तकनीकी सहायता के लिए डेमियन झिल्ली प्रोटीन परीक्षण नमूनों के लिए लेहमेन (सभी सी से CINA, Biozentrum, बेसल विश्वविद्यालय) और ए. Engel, एमेरिटस विश्वविद्यालय बेसल अपने प्रेरणादायक बातचीत के लिए । परीक्षण के नमूनों को पी Ringler, एम.-ए द्वारा प्रदान किया गया था । माही, और Schwede (Biozentrum, बेसल विश्वविद्यालय), पी Leiman (संरचनात्मक जीव विज्ञान और जैव भौतिकी, EPFL की प्रयोगशाला) और आर Diaz-Avalos (ंयूयॉर्क संरचनात्मक जीवविज्ञान केंद्र, संयुक्त राज्य अमरीका) । इस परियोजना को स्विस Nanoscience इंस्टीट्यूट (SNI, प्रोजेक्ट P1401, ARGOVIA प्रोजेक्ट MiPIS) और स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (SNF, प्रोजेक्ट 200021_162521) ने समर्थन दिया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Liquid handling
Microcapillary tip New Objective FS360-100-30-N-20 SilicaTips 30 µm tip ID, 100 µm ID , pk. 20
FS360-150-30-N-20 SilicaTips 30 µm tip ID, 150 µm ID , pk. 20
Conductive sleeve New Objective CONGAS-1  Conductive Elastomer for HV contact, 12" long
Fused silica tubing BGB-Analytik TSP-150375 TSP Standard FS Tubing, 150 µm ID, 363 µm OD, 5 meter
PressFit Connector BGB-Analytik 2525LD Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25 
Syringe 10 µl BGB-Analytik HA-80001 Hamilton 1701 LT - Luer Tip (needle not included) 
Syringe pump controller Cetoni A3921000093 neMESYS controller
Syringe pump dosing unit Cetoni A3921000095 neMESYS dosing unit
Temperature control
Dew point sensor Meltec UFT75-AT Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL
Temperature sensor Sensorshop24.ch LS7-PT1000-1.0-3L Surface mountable temperature sensor Pt1000
Peltier controller Cooltronic TC2812  PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output
Peltier element Distrelec.ch PE-127-14-15-S 40x40 mm
Water-cooling block - - Water cooling block for 40x40 mm peltier element, copper base
Water pump Digitec.ch 294877 XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4
Water heat exchanger block - - Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water
Small water coolers PCHC.ch 223050 Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs
Small peltier elements Distrelec.ch PE-031-10-15-S Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 °C, 2 pcs
Mechanics
Linear stage z-axis Dyneos AG M-404.2PD High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor
Stage controller Dyneos AG C-863 Mercury Servo Controller
Microscope xy-axis stage Prior Scientific H117EIL5 Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope
Small permanent magnets Supermagnete S-05-08-N Rod magnet Ø 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10
Small electromagnet Schramme EG1025A02/110 Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W
Controller electromagnet Conrad.ch MST-1630.001 7 Electromagnet control PCB board
Solenoid hub Distrelec.ch HD8286-R-F-24V100% Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W
Mini tweezers Electron Microscopy Sciences 0302-M5S-PS Dumont Type 5 mini, super thin tips
Various optomechanical parts Thorlabs - -
Various mechanical parts Workshop Biozentrum, University Basel - Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files
Optics
Laser diode Thorlabs CPS780S 780 nm laser diode module 2.5 mW
Photo detector Thorlabs PDA100A-EC Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2
EM grids
DURASIN FILM TEM emsdiasum.com DTF-03523 30 nm DuraSiN™ silicon nitride membranes for TEM, pack of 5
Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1 Quantifoil Micro Tools GmbH
Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3 Quantifoil Micro Tools GmbH
Buffers / Neg. stain
PBS Sigma D8537 SIGMA Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline
NanoVan 2% nanoprobes.com Negative stain vanadium based
NanoW 2% nanoprobes.com Negative stain tungsten based
Software
openBEB The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable
CryoWriter control software (openBEB plugin) Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Schmidli, C., Rima, L., Arnold, S. A., Stohler, T., Syntychaki, A., Bieri, A., Albiez, S., Goldie, K. N., Chami, M., Stahlberg, H., Braun, T. Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (137), e57310, doi:10.3791/57310 (2018).

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