Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optogenetic meevoeren van Hippocampal Theta oscillaties in het gedrag van muizen

Published: June 29, 2018 doi: 10.3791/57349
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,2
1Systems Neurophysiology Research Group, Institute of Clinical Neuroscience and Medical Psychology, Medical Faculty, Heinrich Heine University Düsseldorf, 2Behavioural Neurodynamics Group, Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP)/ NeuroCure Cluster of Excellence, 3Neuronal Circuits and Behavior Research Group, Max Planck Institute for Metabolism Research

Summary

We beschrijven het gebruik van optogenetics en elektrofysiologische opnames voor selectieve manipulaties van hippocampal theta oscillaties (5-10 Hz) in gedragend muizen. De werkzaamheid van de entrainment ritme wordt gecontroleerd met behulp van lokale veld potentieel. Een combinatie van opto- en Farmacogenetische inhibitie adressen de efferent uitlezing van hippocampal synchronisatie.

Abstract

Uitgebreide gegevens over relaties van neuraal netwerk oscillaties naar gedrag en organisatie van neuronale kwijting over hersengebieden vragen om nieuwe instrumenten te selectief manipuleren ritmes van de hersenen. Hier beschrijven we een aanpak projectie-specifieke optogenetics te combineren met de extracellulaire electrofysiologie voor HiFi-besturingselement van hippocampal theta oscillaties (5-10 Hz) in gedragend muizen. De specificiteit van de entrainment optogenetic wordt bereikt door gericht op channelrhodopsin-2 (ChR2) voor de GABAergic bevolking van mediale septal cellen, cruciaal betrokken in de generatie van hippocampal theta oscillaties, en een lokale gesynchroniseerd activering van een subset van remmende septal afferents in de hippocampus. De doeltreffendheid van het optogenetic ritme besturingselement wordt gecontroleerd door een gelijktijdige controle van het lokale veld potentiële (LFP) over lamina van de CA1-gebied en/of neuronale kwijting. Laten we zien met behulp van deze gemakkelijk uitvoerbaar voorbereiding werkzaamheid van verschillende optogenetic stimulatie protocollen voor inductie van theta oscillaties en voor het manipuleren van de frequentie en de regelmaat. Tot slot, een combinatie van de theta rhythm control met remming van de projectie-specifieke adressen de uitlezing van bepaalde aspecten van de hippocampal synchronisatie door efferent regio's.

Introduction

Neuronale activiteit bij zoogdieren wordt gecoördineerd door netwerk trillingen, die het bijstaan van informatieoverdracht binnen en tussen hersenen regio's1,2,3,4. Ritmes van de hersenen omvatten oscillaties variërend van erg traag (< 0.8 Hz) tot ultrasnelle (> 200 Hz) frequenties. Een grote hoeveelheid bewijs ondersteunt betrokkenheid van netwerk oscillaties in diverse hersenfuncties, inclusief cognitie5,6,7,8,9,10 , aangeboren gedrag11,12 , alsmede neuropsychiatrische aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson en epilepsie13,14,15. Selectieve en stoffelijk nauwkeurige methoden voor experimentele manipulatie van netwerk oscillaties zijn daarom essentieel voor de ontwikkeling van fysiologisch plausibel modellen van synchronisatie en voor de vaststelling van causale verbanden met gedrag.

Netwerksynchronisatie is bemiddeld door diverse biologische substraten en processen, variërend van moleculaire identiteit van ionenkanalen en hun kinetiek tot neuromodulatie van prikkelbaarheid en verbinding met het netwerk. Het biologische ontwerp van ritme generatoren16 is gebleken voor vele ritmes van de hersenen, verschillende aspecten van welke (b.v., frequentie en amplitude) vaak zijn veroorzaakt door de dynamiek van verschillende celtypes en netwerken. Bijvoorbeeld, zijn remmende interneuronen gericht op de waarin van de belangrijkste cellen de belangrijkste spelers over frequentiebanden en hersenen regio's17,18, met inbegrip van theta19,20, gamma20 , 21, en rimpel (140-200 Hz)22 oscillaties. Op zijn beurt wordt fase synchronisatie van verre cellen gewaarborgd door het robuuste feed-forward signalering van piramidale cellen, die het afvuren van interneuronen reset. Een cruciale parameter van trillingen, de grootte van de gesynchroniseerde neuronale bevolking, is nauw verwant aan de amplitude van de gemeten LFP trilling en, ten minste voor snelle schommelingen, afhankelijk van het excitatory station naar interneuronen2. Daarentegen langzamer oscillaties, zoals delta en theta ritmes, worden gegenereerd door lange-afstands terugkerende lussen, gevormd door cortico-thalamus23,24 en hippocampal-mediale septal projecties25, 26,27, respectievelijk. Oscillaties in dergelijke schakelingen zijn teweeggebracht door interacties van signaal doorgeven vertragingen, prikkelbaar reacties en hun frequentie voorkeur in deelnemende cellen28,29,30, 31 , 32. remmende projecties van GABAergic parvalbumin (PV)-positieve cellen van het mediale septum (MS) te interneuronen in de hippocampus25,33, de parahippocampal regio's en de Entorinale cortex26 essentieel voor de generatie van theta oscillaties in de mediale temporale kwab. Dus, fysiologische mechanismen van netwerk oscillaties en neuronale synchronisatie kunnen worden gemanipuleerd met behulp van optogenetics met een real-time precisie.

Cel type-specifieke optogenetic manipulaties zijn aangevraagd door studies van de hippocampal en corticale oscillaties in vitro34,35,,36,,37,38 en in vivo30,39,40,41,42,43,44,45, met inbegrip van functionele onderzoeken van gamma5,12,36,,46,47,48,49,50, 51,52 en rimpel oscillaties40,53,,54 en slaap spindles55,,56. We hebben onlangs een Cre-afhankelijke ChR2-virus in de lidstaat, een belangrijke regio voor de generatie van het hippocampal theta ritme, van PV-Cre muizen. Met behulp van deze voorbereiding, werden kenmerken van de hippocampal theta oscillaties (frequentie en temporele stabiliteit) gecontroleerd door optogenetic stimulatie van remmende prognoses van de lidstaten in de hippocampus11. Bovendien opgeroepen theta-frequentie optogenetic stimulatie van remmende septo-hippocampal projecties theta ritme tijdens wakker immobiliteit. De optogenetically entrained theta ritme weergegeven eigenschappen van spontane theta oscillaties in de muis LFP en neuronale activiteitenniveaus.

Belangrijkste kenmerken van dit protocol zijn: (1) gebruik van een remmende traject dat is fysiologisch essentieel voor spontane theta oscillaties terwijl het vermijden van aspecifieke effecten op hippocampal prikkelbaarheid; (2) axonale, dat wil zeggen, projectie-specifieke stimulatie te minimaliseren een directe invloed op niet-hippocampal MS-efferents; (3) lokale theta-ritmische lichte stimulatie, zorgen voor een minimale directe inmenging met theta-ritmische septo-hippocampal dynamiek en een wereldwijde bilaterale meevoeren van theta oscillaties; (4) parametrische controle theta oscillaties frequentie en regelmatigheid; en (5) kwantificering van entrainment trouw met hoge temporele resolutie met behulp van LFP om kwantitatieve causaliteit analyse in het gedrag van dieren. Aangezien deze voorbereiding in wezen speelt in op een bekende rol van de septo-hippocampal disinhibitie in theta generatie25,30, hierdoor robuuste controle over verschillende parameters van theta oscillaties in gedragend muizen. Studies waar andere minder onderzochte trajecten en celtypes van het septo-hippocampal circuits waren gemanipuleerd38,39,47,49,50,51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 onthullen verdere mechanismen van de theta-ritme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

PV-Cre knock-in mannelijke muizen59, 10-25 weken oud, werden gebruikt. Muizen werden gehuisvest onder normale omstandigheden in het dier faciliteit en bewaard op een 12 h licht/donker cyclus. Alle procedures werden uitgevoerd volgens nationale en internationale richtlijnen, en goedgekeurd door de lokale gezondheidsautoriteiten (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen).

1. virale injectie

  1. Volg tijdens de hele procedure, biologische veiligheid richtsnoeren60. Draag een laboratoriumjas, een chirurgisch masker, een hairnet en twee paar handschoenen.
  2. Buizen met een steriel scalpel of schaar op ongeveer 1 m lengte gesneden, plaatst u deze in de spuit houder blok van de pomp en repareren.
    1. Vul de slang geheel met silicone olie met behulp van de spuit.
    2. Controleer of luchtbellen in de slangen worden weergegeven. Als luchtbellen worden waargenomen, vullen de buis opnieuw met olie.
    3. De zuiger naar de Opdringer blok vast te stellen.
    4. Langzaam verder de Opdringer richting de spuit houder blokkeren totdat de punt van de zuiger de slang aanraakt.
    5. Breng de tip van de zuiger in de buis en automatisch de Opdringer blok vooruit te verplaatsen op een langzame snelheid door het selecteren van "Infuse" in het opdrachtvenster en een lage infusiesnelheid (b.v., 500 nL/min), totdat de spuit houder blok wordt bereikt.
  3. De injectie naald (34G) bereiden.
    1. Verwijder de naald-hub met een duidelijke verlaging met behulp van een precisie boor/grinder aangesloten op een schijf snijden. Gebruik indien nodig een naald om metalen residuen van het vers snijvlak.
    2. Capillaire leidingen (3-4 cm lengte) draad door de naald.
    3. De naald aan de buizen gelijmd met superlijm.
    4. De injectie naald verbinden met het einde van de buis, die verbinding met de microsyringe-pomp maakt.
  4. Bevestig de naald aan de stereotaxic houder.
  5. Lucht trekken totdat een luchtbel in de transparante buis boven de naald zichtbaar is.
  6. Anesthetize de muis met 1,5-3% Isofluraan in zuurstof. Wacht ongeveer 2-3 min, dan bevestigen dat de muis is volledig verdoofd door de beoordeling van haar reactie op een snuifje teen. Tijdens de operatie bewaken van het dier ademhaling en Isofluraan concentratie aan te passen indien nodig.
  7. Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in het stereotactische frame met behulp van niet-traumatische oor houders.
  8. Bescherm de ogen van de muis met een lipide-gel.
  9. Injecteren van 0,1 mL lidocaïne intradermaal onder de hoofd huid met behulp van een 0.01-1 mL spuit en een 26G injectie canule.
  10. Scheren en desinfecteren van de muis hoofd met behulp van ethanol oplossing. Vervolgens worden drie keer 2% chloorhexidine met ethanol desinfecteren van de chirurgische site afgewisseld.
  11. Het uitvoeren van een insnijding van de middellijn met behulp van fijn en scherpe schaar tussen de achterkant van de oren gaat naar het niveau van de ogen, zodat de bregma en de lambda zichtbaar zijn.
  12. De schedel schoon door het toepassen van ongeveer 50 µL van met behulp van een injectiespuit NaCl en drogen met een tissue papier en een lucht-bladerdeeg.
  13. Plaats de muis hoofd door het dorso-ventrale niveau van de neus-klem aan te passen, zodat de bregma en de lambda zich op hetzelfde niveau dorso-ventrale (± 0,3 mm).
  14. Boor een gat boven de MS (AP 0.98 en L 0.5 mm met betrekking tot de bregma).
  15. Op dit punt, ontdooi een aliquoot gedeelte van het virus (moet bevatten ten minste 2 µL van AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato.WPRESV40) gedurende ongeveer 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  16. Centrifugeer het afgepipetteerde deel bij ongeveer 4000 x g bij RT voor 1 min.
  17. Pipetteer de 2 µL van het virus op een stuk van Parafilm; Gebruik de voorheen beschermde zijkant.
  18. De tip van de naald van de injectie in de vloeistof te dompelen en zorgvuldig trekken op ongeveer 500 nL/min met inachtneming van het niveau van de vloeistof. Om te voorkomen dat het suctioning van de lucht, door terugtrekking te stoppen voordat het virus wordt geheel in beslag genomen. Aanpassen van de opname tarief op basis van de viscositeit van de oplossing; een sneller tempo kan vergemakkelijken intrekking van een virus met een hogere viscositeit.
  19. Reinig de naald met een tissue papier.
  20. Controleer of het virus is opgenomen in de buis en het virus en olie worden gescheiden door een luchtbel. Markeer het niveau van het virus op de buis om te controleren of de virus met succes tijdens de injectie is toegediend.
  21. Plaats de naald boven het craniotomy en plaatst u deze langzaam in de hersenen bij de eerste injectie (AP 0.98, L 0,5, V-5.2, 5,5 ° laterale).
  22. Injecteren van 450 nL van het virus met een snelheid van 100-150 nL/min. 10 min. wachten zorgvuldig de naald van 0.1 mm verplaatsen en een andere 5 min wachten.
    1. De naald naar de tweede inspuittijdstip (AP 0.98, L 0,5 V-4.6) en een andere 450 injecteren nL op 100-150 nL/min.
    2. Wacht nogmaals 10 minuten alvorens de naald van 0,1 mm. wacht een ander 5 min voordat de naald verwijderd.
  23. Sutuur (geologie) de incisie met zijde zwart gevlochten hechtdraad met behulp van square knopen. Warm het dier met een rode lamp om het herstel te versnellen. Antibiotica (0.3 mL Erycinum (1:4 in steriele NaCl)) en carprofen i.p. dagelijks 2-3 dagen na de operatie beheren.
  24. Snijd de buis boven de markering die aangegeven van het niveau van het virus. De buis kan worden gebruikt voor verdere injecties. Voorbereiding van een verse injectie naald vóór elke injectie.
    Opmerking: Deze operatie duurt ongeveer 1-1,5 h. Het dier wakker meestal binnen 5 min na de operatie. Wacht minimaal 6 weken voor voldoende axonale expressie tijd maar niet langer dan 5 maanden voordat u stereotactische implantaties, zoals expressie niveaus beginnen te verlagen van ongeveer 6 maanden na de injectie van virus.

2. voorbereiding van optische vezels (figuur 1A)

  1. Gebruik optische multimode-glasvezel (105 µm core, glas geplateerd met siliciumdioxide kern, 0,22 nb). Strip 125 µm bekleding van de kern van de vezel met behulp van een micro-stripper terwijl de vezel nog steeds met de spoel van de vezel verbonden is.
  2. De vezel op een lengte van ongeveer 2-3 cm met behulp van een diamant mes gesneden.
  3. De vezel invoegen in een Zirkonia keramische stick verlengstuk (ID: 126 µm). Ongeveer 0,5-1 mm van de optische vezel moet uitsteken van de convexe kant van de verlengstuk.
  4. Met behulp van een naald, toepassing één druppel van epoxy lijm op beide uiteinden van de verlengstuk, maar niet op de zijden van de verlengstuk. Ook gebruiken een super lijm.
  5. Laat de lijm drogen voor ten minste 30 min.
  6. Pools de bolle kant van de verlengstuk met diamant lappen vezel polijsten film (3 µm grutten).
  7. Test de trouw van lichte overdracht met behulp van een optische Energiemeter.
    1. De golflengte aangezet de Energiemeter op dezelfde golflengte als de laser wordt gebruikt.
    2. Plaats de patch-kabel met de tip geconfronteerd met het middelpunt van de sensor. Schakel de laser en de lichtopbrengst van de Energiemeter leest. Record de waarde.
    3. De optische vezel verbinden met het snoer van de patch via een paring mouw en plaats het met het topje van de vezel geconfronteerd met het middelpunt van de sensor. Schakel de laser en de lichtopbrengst van de Energiemeter leest. Record de waarde.
    4. Berekenen van de overdrachtssnelheid: Verdeel de tweede waarde door de eerste waarde. Als de doorvoersnelheid minder dan 0,5, negeren van de vezel, anders gebruiken voor innesteling.
    5. Test de transmissiesnelheid voor elke vezel vóór implantatie.
    6. Voor latere experimenten, het aanpassen van de output van de lichtsterkte van de laser de doorvoersnelheid van de optische vezel: instellen van de lichtopbrengst van de patch snoer tip tot 5-15 gedeeld door de transmissiesnelheid te bereiken van een definitieve lichtopbrengst van het puntje van de vezel van 5-15 mW.
      Opmerking: Zie ook ref. 61 voor de bereiding van optische vezels.

3. voorbereiding van wolfraam draad Arrays voor LFP opnamen (figuur 1B)

  1. Lijm verschillende (bijvoorbeeld 6) 100 µm silica buis gidsen parallel aan de plakkerige kant van een stukje tape. Knip een stukje, ongeveer 4-6 mm, bestemd voor één draad matrix vergadering.
  2. Draad formvar-geïsoleerde 45 µm wolfraam draden door de buizen van de gids met pincet.
  3. Strip zes glazuur-geïsoleerde fijne koper verlijmen draden (ongeveer 5 mm lang) en een aarding draad (ongeveer 2-3 cm lang) met behulp van een scalpel om de isolatie aan beide uiteinden weg te schrapen. Soldeer ze aan de nanoconnector pinnen.
  4. Verbind elke binding draad met een wolfraam draad met een druppel van zilveren geleidende verf, respectievelijk. Laten drogen voor ten minste 30 min.
  5. Toepassing van een minimale hoeveelheid cement ter dekking van de draden. Cement zijn niet van toepassing op de draden van wolfraam, die zal worden opgenomen in het hersenweefsel of op het bovenste deel van de nanoconnector. Laat het cement droog zijn voor minstens 30 min.
  6. Uitvoeren van een hoekige knippen (5-20°) van de draden van de wolfraam gebruikmaken van botte roestvrijstalen schaar waarmee betrouwbare implantatie van draden hieronder of boven de zone ventrally grenzend aan de stratum pyramidale, waar theta amplitude te laag voor de schatting van is de entrainment trouw.
  7. Deinsulate de tip (ongeveer 2 mm) van de grond draad met behulp van een scalpel om de isolatie weg te schrapen. Behandelen met flux en presolder.
  8. Selectievakje potentiële Kruis-gesprekken tussen de elektroden met behulp van een digitale multimeter. Om dit te doen, door de pinnen van de connector te verbinden door de multimeter, dat moet worden ingesteld op de weerstand meting modus. Selectievakje paarsgewijze combinaties van kanalen; op de multimeter hieronder 5 MΩ een lezing geeft aan belangrijke cross-talk.
  9. Controleer de impedantie van de elektrode van elke draad in zoute met behulp van een impedantie-meter. De impedantie van de typische waarden zijn beneden 100 kΩ.
  10. Ter vergemakkelijking van implantatie, lijm een optische vezel aan de matrix van de draad zodat het uiteinde van de vezel op het niveau van de kortste draad is en de fiber-tip is in de nabijheid van, maar niet aanraken van de draden wolfraam. Houd de hoek van de vezel zo klein mogelijk te zijn om te voorkomen dat weefselschade tijdens implantatie.
    Opmerking: Zie ook ref. 62 voor de fabricage van wolfraam draad arrays.

4. stereotaxic implantaties

  1. Voert preparaten zoals beschreven in stappen 1.6-1.13.
  2. Verwijder het bindweefsel vanaf de bovenkant van de schedel en duw nekspieren grondig door ongeveer 2 mm om te voorkomen dat artefacten van de spier tijdens de opname.
  3. Reinig de schedel met behulp van een katoen-tip applicator en saline, en 4 gaten (2 in de voorkant) en 2 boven het cerebellum, 0.8 mm diameter boren om roestvrij stalen botschroeven (00-96 x 1/16) voor grond en stabilisatie van het implantaat (Figuur 1 d). Plaats de schroef van de grond, verbonden met één koperdraad (ongeveer 2-3 cm lengte) boven het cerebellum.
  4. Betrekking hebben op de grond-schroef compleet met cement te voorkomen spier artefacten tijdens de elektrofysiologische opnames. Het bouwen van een cement ring verbinden alle schroeven (figuur 1E).
  5. Het uitvoeren van een craniotomy boven de implantatie kant (Hippocampus, AP-1.94, L 1.4, V 1.4 met betrekking tot de bregma). Breng ongeveer 5 µL van steriele NaCl op het oppervlak van het hersenweefsel.
  6. Langzaam lager de draad array gebruikmakend van stereotaxis in de craniotomy. Voor de opnames van het unitaire, implantaat een siliconen sonde in plaats van een draad matrix63; om te voorkomen dat optoelectric licht artefacten, implantaat de optische vezel in de hippocampus apart met het topje van de vezel niet recht tegenover de sonde (Figuur 1 c -Ik). Implantaat voor onderzoek van de coördinatie van de entrainment tussen hemisferen, een extra optische vezel in het contralaterale hippocampal CA1-gebied.
  7. Breng ongeveer 5 µL van warme vloeibare wax/paraffine-olie, voorverwarmd bij 70 ° C, met een spuit boven de implantatie site te beschermen van hersenweefsel.
  8. Cement rond de draad matrix toepassen en dekking van de schedel met cement.
  9. Een druppel van flux van toepassing op de presoldered grond/verwijzing draad en de presoldered draad aangesloten op de schroef van de grond bijvoorbeeld met behulp van een naald, en zekering van de draden met behulp van een solderen machine.
  10. Betrekking hebben op de hele begane draad met cement.
  11. Beheren van 0.3 mL Erycinum (1:4 in steriele NaCl) en carprofen (5mg/mL) i.p. na de operatie en voor ten minste de twee dagen na. De muis worden binnen 15 min na de operatie meestal wakker. Warm het dier met een rode lamp op de snelheid van herstel.
  12. Het gewicht van de muis wordt dagelijks controleren gedurende de eerste week na de operatie of totdat het gewicht stabiel is. Verlies van het gewicht mag niet meer dan 10% van het gewicht van de muis opgenomen voor de operatie. Leveren om te versnellen stabilisatie van het gewicht, de muis met natte voedsel en gecondenseerde melk tijdens de eerste dagen na de operatie.
  13. Hippocampal cellulaire activiteit registreren tijdens meevoeren, implantaat een siliconen sonde in de hippocampus (AP-1.94, 1.4 L, 1 V, met het verlagen van de latere) zoals beschreven in ref. 62 (Figuur 1 c -Ik). Implantaat de optische vezel in de hippocampus bij AP -3, L 1.4, 1.6 V, 39 ° caudal-rostraal. Implantaat een extra optische vezel in de MS (AP +0.98, L 1, V 3.9, 15 ° laterale) indien stimulatie van cel waarin is gewenst.

5. Optogenetic stimulatie en elektrofysiologische Data-acquisitie

  1. Koeien de muis aan de opstelling van de opname (bv15 minuten sessies, 1-2 sessies per dag gedurende 3 dagen). Onderzoeken van het dier gedrag voordat u begint met de eerste experimenten. Als de muis beweegt in de zaal, het verkennen van de omgeving, snuiven, uitvoeren van rearings, enz., het eerste experimentele sessie starten.
  2. Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een vertrouwde kamer bij gebrek aan andere dieren in dezelfde kamer.
  3. Een LED aan het hoofd-werkgebied met zelfklevende tape om bij te houden van het dier positie koppelen. Zorg ervoor dat het LED-licht gevangen door de camera gedurende de periode genomen is dat het dier is het verkennen van de zaal opnemen voordat de experimenten. Opnemen in het donker om het bijhouden van het LED-licht. Plaats een camera boven de kamer opnemen.
  4. Controleer de lichtopbrengst van de patch koord. Schatten de lichtopbrengst van de vezel tip nadat de verbinding afhankelijk van de doorvoersnelheid van de vezel geïmplanteerd. Zorg ervoor dat de lichtopbrengst van de tip van de vezel tussen 5-15 mW, om betrouwbare meevoeren.
  5. Verbind de headstage voorversterker met de chronisch geïmplanteerde connector. Sluit de glasvezelkabel patch-kabel naar de chronisch geïmplanteerde hippocampal fiber voor optogenetic stimulatie experimenten. In controle licht stimulatie experimenten, door de optische vezel te verbinden door een dummy verlengstuk verbonden aan op de hoofdtelefoon.
  6. Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in de zaal van de opname.
  7. De software om te bepalen van de stimulus-generator voor het genereren van het protocol van de stimulatie niet openen.
  8. Selecteer het kanaal waarmee de 473 nm DPSS laser. Voer in de eerste rij 3.000 mV (1e kolom), tijd van 30 ms (2de kolom), waarde 0 mV (3e kolom), tijd van 112 ms (4e kolom), rij herhalen 840 en groep herhalen 1, voor het genereren van een protocol voor 2 min van 7 Hz stimulatie met 30 ms lange pulsen. Pas de tijdsduur in de 4e kolom en het aantal herhalingen van de rij als de stimulatie op een andere frequentie of een andere duur vereist is. In de tweede rij Selecteer 0 mW (1e kolom), tijd 500 h (2de kolom), rij herhalen 1 en groep Herhaal 1, om ervoor te zorgen dat de laser wordt uitgeschakeld nadat het protocol van de stimulatie wordt beëindigd.
  9. Klik op "bestand > opslaan als" en sla het bestand met een gewenste naam.
  10. Verzekeren dat de stimulator TTL uitgang triggering van de laser is aangesloten op de analoge input board digitale Lynx om te synchroniseren van de verwerving van elektrofysiologische en optogenetic gegevens.
  11. Als alternatief, versterkten reguleren de variabiliteit van thèta-interstadiaal frequentie, toepassing treinen van lichte pulsen op variërend tussen pulse intervallen, met periodes na een Gaussiaanse distributie. De spreiding van de Inter pulse intervallen voor verschillende protocollen, bijvoorbeelduit stap 3.2 tot 15.1 ms2te wijzigen. Toepassing van deze protocollen voor het genereren van theta tijdperken met verschillende variabiliteit van de theta-frequentie (Figuur 6).
  12. Open de software van het registratiesysteem. Klik op "ACQ" te verwerven en "REC" om op te nemen. Gewacht voordat de inleiding van de lichte stimulatie om vast te leggen van het gedrag van de basislijn (b.v., 2 min voor het ophalen van de snelheid van de basislijn of 30 min te uittreksel van de plaats van de basislijnvelden).
  13. Open de software om te bepalen van de stimulus-generator. Klik op "Bestand > openen" en selecteer het protocol bestand van keuze. Klik op "Download en Start" om te starten van de lichte stimulatie.
    Opmerking: Het experiment kan worden onderzocht, en de stimulatie gestart via de afstandsbediening; uitgesloten zijn van de aanwezigheid van de experimentator invloed op het gedrag van het dier. Afhankelijk van het doel van de studie, kan stimulatie worden gestart en beëindigd tijdens specifieke gedrag.

6. een gecombineerde aanpak voor Optogenetic meevoeren en projectie-specifieke inhibitie van de Hippocampal Output

  1. Express ChR2 in MS GABAergic cellen van PV-Cre muizen, zoals beschreven in sectie 1.
  2. Daarnaast het injecteren van een totaal van 2,4 µL van afhankelijke halorhodopsin CamKIIα (eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH) in beide dorsale hippocampal halfronden (AP -1,7; L ± 1.05; V-2.05 en -1.4 mm; AP -1,7; L ± 1,7; V-2.05 en -1.55 mm; AP-2.3; L ± 1,5; V-2.2 en -1.3 mm; AP-2.3; L ± 2.2; V-1.65 en -2,45 mm).
  3. 6 weken van expressie tijd toestaan.
  4. Implantaat een wolfraam draad matrix met optische vezel in de hippocampal regio van de CA1, zoals beschreven in sectie 4. Bovendien implantaat bilateraal optische vezels in het laterale septum (LS AP 0.1, 0,25 L, V-2.25 mm en AP 0,5 L -0,3, V-2.7 mm).
  5. Uitvoeren van optogenetic theta entrainment experimenten zoals beschreven in stappen 5.4-5.5.
    1. Voor gelijktijdige inhibitie van de hippocampal de LS uitgang, genereren een protocol stimulans generatie: bijvoorbeeld, trigger het intreden van het uitvoerkanaal aangesloten op de 593 nm DPSS laser 15 s met een continue puls duurt in totaal 45 s, voor triggering de output van de pulsen naar de 473 nm DPSS laser.
    2. Sluit beide vezels in de LS via patch snoeren met behulp van een optische multimode-glasvezel-koppelstuk aan een 593 nm DPSS laser.
    3. Opnemen, downloaden en activeren van het protocol om te bepalen van de stimulus-generatie.

7. de verwerking van de gegevens

  1. Converteren van het elektrofysiologische signaal en plaats de trackingsgegevens met neurofysiologische gegevens (ND) Manager naar .dat en .pos formaten, respectievelijk64.
  2. De LFP verkrijgen door low-pass filter en down-sampling van het signaal van de wide-band tot 1.250 Hz met behulp van ND Manager66.
  3. Selecteer in elke opname, het kanaal met de maximale amplitude van theta oscillaties (met Neuroscope)19.
  4. De tijdstempels van de laserpulsen en de tijdperken stimulation detecteren met een drempel detectie algoritme (met behulp van MATLAB functie findpeaks.m of gelijkaardig)11.
  5. Als u wilt importeren het .dat-bestand in een multi-kanaals data-analysesoftware, klik op "Bestand > importeren", "binaire bestanden" selecteert als het gegevenstype en selecteer het .dat-bestand. In het dialoogvenster Configuratie voert u het juiste aantal kanalen en een sampling rate van 1.250 Hz en klik op "ok" opslaan als .smr bestand. Plot spectra van de macht door het selecteren van "Analyse > nieuwe resultaat weergave > PowerSpectrum". In de montages, selecteer het kanaal met de hoogste theta amplitude en 16.384 FFT grootte, klikt u op "Nieuw", definiëren als "starttijd" het begin van het tijdperk van de stimulatie en als "End time" het einde van het tijdperk van de stimulatie, en klik op "Proces".
  6. Berekenen van de entrainment trouw als de verhouding van de cumulatieve spectrale vermogensdichtheid (PSD) binnen de optogenetic stimulatie frequentiebereik (stimulatie frequentie ± 0,5 Hz), aan de cumulatieve PSD in de (5-12 Hz) theta-band met de multitaper methode (NW = 3, venstergrootte 8,192) voor 10 s tijdperken (b.v., toolkit < http://chronux.org/>).
  7. Uitsluiten van opname tijdperken waar de dominante PSD piek ≤ is 5 Hz uit analyse (niet-theta tijdperken, gebruik van MATLAB functie find.m).
  8. Het raster van de LFP macht spectra worden uitgezet voor alle opgenomen tijdperken volgens de berekende entrainment trouw (met MATLAB functies sortrows.m en pcolor.m). Laden van de macht spectra en entrainment trouw door te klikken op "Bestand > openen", opgeslagen variabel In. Type vermogen = sortrows(In,1); pcolor(Power(:,2:end)).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Doelgerichtheid van ChR2 naar GABAergic cellen in de MS zoals beschreven in sectie 1 wordt geïllustreerd in figuur 2A. Optogenetic stimulatie van axonen van MS GABAergic cellen in de dorsale hippocampus via een optische vezel die is geïmplanteerd boven het gebied CA1 entrains theta oscillaties op de frequentie van de prikkel in de ipsilaterale (figuur 2B) evenals contralaterale halfrond (figuur 2C). Theta oscillaties kon min of meer efficiënt entrained worden door de optogenetic stimulatie (figuur 3A), de werkzaamheid van die is berekend voor elke opname epoch als een relatieve theta LFP macht rond de stimulatie frequentie, dat wil zeggen, entrainment trouw (figuur 3B). Entrainment trouw boven 0,3, dat wil zeggen, hoger dan in de spontane licht-off opnames, werd waargenomen in ongeveer 80% van de opname tijdperken. Optostimulation bij niet-theta frequenties was minder effectief (Figuur 3 c).

Expliciete d.w.z., parametrische manipulatie van theta oscillaties frequentie wordt begeleid door opkomende wijzigingen van theta regelmatigheid: de temporele regelmatigheid van amplitude en frequentie van de theta-oscillaties werd verhoogd tijdens tijdperken met hoge entrainment trouw. De stabiliteit van oscillaties ook regelbaar versterkten door treinen van lichte pulsen, tijdvakken waarvan Gaussian verdelingen met verschillende dispersies (Figuur 4 opvolgen) toe te passen.

Optogenetic controle over de frequentie van de trillingen geëlimineerd de correlatie tussen theta frequentie en snelheid, in overeenstemming met de regeling van de frequentie via de MS door oplopende afferents tijdens beweging (figuur 5A). Optostimulation geïnduceerde ook theta oscillaties tijdens immobiliteit (figuur 5B). De preferentiële afvuren fasen vastgelegd in de CA1 in vermeende piramidale cellen en interneuronen waren ongewijzigd ten opzichte van de optogenetically entrained theta trilling in vergelijking met spontane theta (Figuur 6).

Studie van de bijdrage van de hippocampus op het traject van de laterale tussenschot in theta-gemedieerde regulering van motoriek, we optogenetically geremd dit traject. Halorhodopsin (eNpHR3.0) werd bilateraal uitgedrukt in hippocampal piramidale cellen (figuur 7A), terwijl ChR2 kwam tot uitdrukking in de cellen van de MS GABAergic als hierboven en theta oscillaties optogenetically entrained (figuur 7B waren). De theta entrainment verminderde variabiliteit van het runnen van snelheid, maar niet wanneer de hippocampus aan de LS-traject was geremd (Figuur 7 c).

Figure 1
Figuur 1: illustratie van optische vezels, elektroden en chirurgie. (A) afbeelding van een optische vezel. (B) illustratie van een draad-array op een optische vezel voor de opname van hippocampal LFP tijdens meevoeren van hippocampal theta oscillaties gelijmd. (C) voor het opnemen van de hippocampal cellulaire activiteit een siliconen sonde is gemonteerd op een microdrive. (D) miniatuur schroeven zijn gepositioneerd op de schedel. Koperen draden zijn presoldered aan de grond en verwijzing schroef voordat ze boven het cerebellum positionering. (E) Cement wordt toegepast om te dekken en verbinding maken met de schroeven. De bovenste blauwe cirkel geeft aan waar de craniotomy werd uitgevoerd voor de inplanting van de siliconen-sonde. Lagere blauwe cirkel geeft aan waar de craniotomy werd uitgevoerd voor de inplanting van de optische vezel in de hippocampus. (F) een optische vezel is geïmplanteerd in een caudal-rostraal hoek te richten op de hippocampal CA1-regio. Een tweede vezel kan worden geïmplanteerd in het mediale septum stimulatie van cel waarin is desgewenst (optioneel). (G) het silicone sonde is verlaagd tot net boven het hippocampal CA1-gebied. (H) de grenzen van de microdrive en de aansluiting op het implantaat en de bodem worden gecementeerd, en de referentie-draden worden gesoldeerd. (ik) koper mesh is gebouwd rondom het implantaat en dienen als een kooi van Faraday. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: voorbereiding van de optogenetic hippocampal theta entrainment. (A) ChR2 kwam tot uitdrukking in PV+ mediale septal cellen in PV-Cre muizen (bovenste scheme). Heldere fluorescentie in MS (1, 2) bevestigt succesvolle construct expressie in waarin. Vezels van MS project via de fornix (f) en fimbria (fi) naar de hippocampus (3-6); ACA: anterior commissuur; voorste deel. HDB: kern van de horizontale ledemaat van de diagonale band; Of: stratum oriens. De optische vezel voor optogenetic stimulatie met blauw licht is geïmplanteerd boven de piramidale laag van hippocampal ruimte CA1 (lagere scheme). Schaal bars: 500 µm (foto's 1, 3, 4) en 50 µm (foto's 2, 5, 6). (B) Hippocampal LFP tijdens de spontane theta oscillaties (links) en 7 Hz (midden) of 10 Hz (rechts) optogenetic meevoeren. Blauwe strepen geven aan de ramen van de tijd van lichte toepassing. Opmerking de fase resetten door de lichte pols aangegeven met een pijl. Opmerking gamma enveloppen tijdens spontane en meegesleepte theta, een indicator van fysiologische theta ritme. Fase omkering tussen stratum oriens (str. of.) en stratum radiatum (str. rad.) ook wordt gehandhaafd tijdens meevoeren. (C) Entrainment is betrouwbaar tijdens ipsilaterale (bovenste percelen), alsmede de contralaterale (lagere percelen) optogenetic stimulatie. Regelingen illustreren posities van vezels met betrekking tot de positie van de elektroden. In het volgende voorbeeld LFP sporen tijdens theta en toepassing van lichte pulsen worden weergegeven in het midden. Op de juiste, spectra van de macht van hippocampal LFP tijdens ipsi- en contralaterale stimulatie vergelijkende volgens stimulatie frequentie. Dit cijfer is gewijzigd van ref. 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: trouw van optogenetic hippocampal theta entrainment. (A) voorbeeld hippocampal LFP sporen tijdens de lage en hoge entrainment trouw. (B) Power spectrale dichtheden van 10 s tijdperken tijdens spontane theta, met rijen gerangschikt volgens het toonaangevende theta frequentie (links), en 7 Hz (midden) en 10 Hz (rechts) optogenetic stimulatie, met rijen gerangschikt volgens entrainment trouw. Voorbeeld van de respectieve macht spectra (aangegeven met een pijl) uitgezet boven. Opmerking betrouwbaar entrainment trouw over tijdperken. Aan de rechterkant, wordt de cumulatieve waarschijnlijkheid van de entrainment trouw theta Voorfrequenties weergegeven. (C) Entrainment vereist ritmische theta-stimulatie. Hippocampal netwerkactiviteit kan met succes worden entrained met frequenties tussen 6-12 Hz. Bij lagere frequenties (bv2 of 4 Hz) of hogere frequenties (bijv., 20 Hz) entrainment is niet betrouwbaar. Dit cijfer is gewijzigd van ref. 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: parametrische manipulatie van theta oscillaties regelmatigheid. (A) stimulatie werd toegepast op verschillende frequenties binnen het bereik van de theta met een gemiddelde frequentie van 7,8 Hz na een Gaussiaanse distributie. De standaarddeviatie van de intervallen tussen puls werd verhoogd via protocollen uit σ = 3.19 aan σ = 15.09. In totaal werden 11 protocollen gegenereerd en toegepast, elk met een totale duur van het tijdperk van de stimulatie van 1 min. Daarvan, de kansverdeling van 5 protocollen worden weergegeven aan de linkerkant van de figuur. De spectrale dichtheden van macht binnen een bereik van 1-14 Hz voor het hippocampal LFP tijdens de toepassing van de respectieve protocollen worden uitgezet in het midden van de afbeelding. De waarschijnlijkheid van de theta tussenliggende perioden in toepassing van de respectieve protocollen worden geïllustreerd aan de rechterkant. (B) de variantie van de toegepaste Inter pulse intervallen bepaald de variantie van de periode van gelijktijdige theta (Pearson's r = 0,94, p = 0.0002). (C) de relatie tussen de theta amplitude variabiliteit en de Inter pols interval (Pearson's r = 0.61, p = 0,08). Dit cijfer is gewijzigd ref. € 70. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Optogenetic ritmische theta entrainment bepaalt hippocampal LFP tijdens gedrag. (A) Optogenetic stimulatie frequentie bepaald de theta-frequentie tijdens motoriek. Vandaar, snelheid-gerelateerde afferents hebben geen invloed op hippocampal theta frequentie, en dientengevolge, snelheid is niet gecorreleerd met theta frequentie (blauw) als tijdens de spontane theta (zwart). Gegevens worden gepresenteerd zoals bedoel ± s.e.m. (B) tijdens rustig wakker, de hippocampal theta ontlokte kan worden bij gebrek aan beweging. Hippocampal LFP sporen vóór en tijdens de succesvolle entrainment zijn hierboven en voorbeeld snelheid sporen opgenomen tijdens entrainment staan hieronder (het rode spoor komt overeen met de hippocampal LFP trace verbeelden vorenstaand). Blauwe strepen markeren de tijd om windows van lichte stimulatie pulsen. Dit cijfer is gewijzigd van ref. 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: Hippocampal cellulaire activiteit tijdens theta entrainment. (A) cellulaire activiteit werd opgenomen met siliconen sondes (regeling). Enkele interneuronen en piramidale cellen werden geïsoleerd en geïdentificeerd volgens hun respectieve golfvorm. Hier afgebeeld is de gemiddelde golfvorm (midden) en de auto-correlogram van een geïsoleerde piramidale cel in het volgende voorbeeld. (B) Preferred geen kwijting fase van piramidale cellen (Pyr) was niet verschillende tijdens spontane (in zwart, n = 29 neuronen) en optogenetically entrained (in blauw, n = 30) theta (p = 0.79). (C) getoond hier is de auto-correlogram (links) en preferentiële afvuren fase van een snel-vuren interneuron tijdens spontane en optogenetically entrained theta. Hieronder het bijbehorende hippocampal LFP ritme tijdens spontane (links) en meegesleepte (rechts) theta. (D) Preferred geen kwijting fase van snel-vuren interneuronen was niet verschillende tijdens spontane (in zwart) en optogenetically entrained (in blauw, n = 28 neuronen) theta (p = 0.97). Gemiddelde auto-correlogram wordt op de linkerzijde getoond. (E) gemiddelde auto-correlogram str. oriens cellen. (F) Preferred geen kwijting fase van str. oriens interneuronen was niet anders tijdens de spontane (zwart) en optogenetically entrained (blauw, n = 10 neuronen) theta (p = 0,56). Histogrammen van voorkeur kwijting fasen worden weergegeven aan de rechterkant. (G) gemiddelde afvuren tarieven werden niet beïnvloed door theta meevoeren in piramidale cellen (p = 0,98), fast-vuren interneuronen (p = 0,96) of str. oriens interneuronen (p = 0.85). Dit cijfer is gewijzigd van ref. 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: combinatie van hippocampal theta meevoeren en optogenetic inhibitie van de hippocampal subcorticale uitgang via de LS. (A) eNpHR3.0 (halorhodopsin) kwam tot uitdrukking in hippocampal piramidale cellen (bovenste scheme). Succesvolle uitdrukking van de constructie werd bevestigd door heldere fluorescentie in waarin in de hippocampus (bovenste foto's) en axonen in de LS (onderste foto's). Optische vezels werden geïmplanteerd bilateraal boven de LS (lagere scheme). Schaal bars: 500 µm (afbeeldingen aan de linkerkant), 50 µm (afbeeldingen aan de rechterkant). (B) Hippocampal theta is met succes entrained tijdens remming van de hippocampus aan LS traject. Hier getoond zijn macht spectrale dichtheden voor 9 Hz blauw licht stimulatie tijdens uitvoer remming. (C) remming van de grote hippocampal subcorticale uitvoer pathway voorkomt effecten van hippocampal theta entrainment op snelheid. Hier getoond is afname van de snelheid variabiliteit op optogenetic entrainment (witte bar met blauwe randen), met afwezig bij gelijktijdige inhibitie van de hippocampus aan LS traject (gele balk met blauwe randen). Snelheid van de respectieve gemiddelde basislijn wordt weergegeven aan de linkerkant. Dit cijfer is gewijzigd van ref. 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier voorgesteld hebben we een breed toegankelijke methodologie later te ontlokken hippocampal theta oscillaties in het dier gedraagt. Deze aanpak kan zinvol zijn voor studies van theta ritme van functies in de informatieverwerking en gedrag. Kritieke aspecten van deze methode zijn: (1) de keuze van de opsin en doelgerichtheid van ChR2 aan de axonen van MS cellen in de hippocampus, (2) robuuste optische en elektrische kenmerken van geïmplanteerde optische vezel-draads matrix assemblages om continu stimulatie en de LFP opname in het gedrag van muizen, (3) toepassing van een optimale hoeveelheid licht bij theta frequenties, (4) post hoc kwantificering van de entrainment trouw en (5) controle van optoelectrical artefacten.

De belangrijkste valkuil van het eerste punt is de injectie van een veilige virus spaarde de mediaal gelegen veneuze plexus. Suboptimaal chirurgische uitvoering van deze stap kan verminderen het succestarief van injecties en potentieel vertragen de verwerving van resultaten. Kinetiek van een opsin moet worden overwogen, ChR2 (activering time: 2 ms, inactivatie tijd: 9 ms-65). Het tweede punt eist van de controle op de lichttransmissie trouw en de impedantie van het opnemen van elektroden vóór implantatie, en meestal profiteert van tijdige fabricage van extra implantaten.

De derde overweging is gemeenschappelijk voor optogenetics die gericht zijn op grote schaal circuit manipulaties, en omvat lichtbronnen en optische interconnecties, die via een 100 µm vezel licht macht in het brein van 5-15 mW leveren. Voor elke muis en vóór elke opname, kan een opname van de test worden uitgevoerd om de lichtopbrengst ingesteld op de optimale intensiteit voor het experiment. De lichtopbrengst moet hoog genoeg om het activeren van een voldoende aantal projecties om betrouwbare meevoeren van theta oscillaties, maar niet te hoog, om te voorkomen dat thermisch opgeroepen reacties en weefselbeschadiging.

De weer aspect betreft de synchronisatie van licht pulsen en gegevens van de LFP, bereikt met de hoogste precisie steekproefsgewijs beide gegevenstypen via de dezelfde AD-converter. Gesynchroniseerde tijdstempels zijn met name nodig voor andere potentiële toepassingen die gericht zijn op studies van neuronale kwijting en LFP. Entrainment werkzaamheid kan variëren tussen en binnen de stimulatie tijdperken; Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt door rhythmicity storing instellen door optogenetic stimulatie met intrinsieke - en/of zintuiglijke gedreven signalen, als gevolg van meerdere generatoren van de theta ritme16,66,,67, 68. kwantificering van de momentane trouw van deze hoogdynamische optogenetic manipulatie69 is daarom zeer nuttig voor causale gevolgtrekking, dat wil zeggen, voor het openbaren van de relatie tussen een effect grootte (bv , wijzigen in gedrag) en de kortstondige doeltreffendheid van de controle van de optogenetic van geselecteerde synchronisatie aspecten. Nog belangrijker is, het meerdere trilling parameters kunnen worden beïnvloed door stimulatie van de optogenetic, bijvoorbeeld, entrainment bemiddelt niet alleen frequentie vergrendeling maar ook een meer regelmatige amplitude van theta oscillaties11.

Ten vijfde, de stimulatie van de optogenetic wordt vaak geassocieerd met optoelectrical artefacten, opgeroepen in metalen elektroden door het photoelectrochemical effect. Hun mate is afhankelijk van het materiaal van de elektrode, nabijheid van de elektrode-tip van de optische vezel, en de lichte macht. In de experimenten die hier worden beschreven, optoelectrical artefacten kunnen worden vermeden door het vergroten van de afstand tussen de vezels en de opname-elektrode, sluit positionering van die niet essentieel zijn voor de controle van de trilling van de theta. Optoelectrical artefacten in tijd en tussen kanalen weergeven van consistente vorm en daarom, tijdens de piek sorteren ze zijn meestal gegroepeerd in een afzonderlijke cluster, en elkaar niet overlappen met opgenomen neuronen70. Op hetzelfde moment, een klein deel van de actie potentieel, golfvormen die worden gewijzigd door artefacten, niet door te sorteren algoritmen met andere pieken afgevuurd door een neuron zijn gegroepeerd. Laminaire LFP profielen verkregen met behulp van verschillende configuraties van de elektrode, inclusief draad matrices (figuur 2B) en lineaire siliconen sondes, een duidelijke differentiatie van artefacten en ware LFP patronen, gebaseerd op de constante fase van eerstgenoemde in staat te stellen en fysiologische laminaire fase verschuivingen van de laatstgenoemde. Basislijnregistratie voorafgaand aan stimulatie inschakelen exploratie van karakteristieke thèta-functies zoals typische laminaire fase profielen.

Optogenetic controle van theta oscillaties leidt tot theta meevoeren in alle lagen van de hippocampal CA1-laag en zelfs tot contralaterale meevoeren. Dit moet worden gehouden aan account als een experiment is gericht op een lokale stimulatie (als de gevolgen van een stimulatie van een beperkte subregionaal of een subpopulatie zijn gericht moeten worden onderzocht). Aan de andere kant, kunt het ruimtelijk beperkte stimulatie van de hippocampal prognoses inzake MS PV+ -cellen gepresenteerd hier een minder deterministische manipulatie van theta oscillaties, dat wil zeggen, entrainment, dan somatische optogenetic stimulatie van doet MS PV+ -cellen recent toegepast in verdoofde muizen71. De laatste somatische stimulatie consequent resulteert in frequenties van hippocampal oscillatie tot 40 Hz en vormt aldus het geval van een zeer betrouwbare ritmische tempo. In tegenstelling, de axonale stimulatie hier gepresenteerd is effectief bij voorkeur in de theta-frequentieband (Figuur 3 c), en daarom is meer vergelijkbaar met de entrainment, eventueel via de Kuramoto overgang72, dat wil zeggen, werken bij frequenties dicht bij degenen die aanwezig zijn op de stimulatie begin spontane theta oscillaties.

Terwijl de voorbereiding van de optogenetic die hier worden beschreven kunt manipulatie van thèta-interstadiaal functies, somatische optogenetic inhibitie van de remmende neuronen MS voor efficiënte remming van de theta oscillaties tijdens de REM-slaap73zijn toegepast. Integratie van de twee technieken met behulp van optogenetic-aandrijvingen voor tegengestelde controle van neuronale prikkelbaarheid (b.v., 12) kunnen potentieel bidirectionele controle van het ritme van de theta in hetzelfde dier voor verdere studies van causale verbindingen tussen netwerk oscillaties en verschillende aspecten van gedrag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We bedank Maria Gorbati voor deskundige hulp bij data-analyse en Jennifer Kupferman voor commentaar op het manuscript. Dit werk werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; Uitm 257 NeuroCure, TK en AP; Prioritaire programma 1665, 1799/1-1(2), Heisenberg programma, 1799/2-1, AP), de Duits-Israëlische Stichting voor wetenschappelijk onderzoek en ontwikkeling (GIF; Ik-1326-421.13/2015, TK) en het Human Frontier Science Program (HFSP; RGY0076/2012, TK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PV-Cre mice The Jackson Laboratory B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J
Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotaxis David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA Model 963 Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument
Drill bits, 0.8 mm Bijoutil, Allschwil, Switzerland 49080HM
0.01-1 ml syringe Braun, Melsungen, Germany 9161406V
Sterican cannulas Braun 26 G, 0.45x25 mm BL/LB
Fine and sharp scissors Fine Science Tools Inc., Vancouver, Canada 14060-09
Forceps Fine Science Tools Inc. 11210-10 Dumont AA - Epoxy Coated Forceps
Blunt stainless steel scissors Fine Science Tools Inc. 14018-14
Soldering station Weller Tools GmbH, Besigheim, Germany WSD 81
Erythromycin Rotexmedica GmbH, Trittau, Germany PZN: 10823932 1g Powder for Solution for Infusion
Name Company Catalog Number Comments
Optogenetics
Hamilton pump PHD Ultra, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA model 703008 PHD Ultra Syringe Pump with push/pull mechanism
Hamilton 5 µL Syringe, 26 gauge PHD Ultra, Harvard Apparatus Model 75 RN SYR
Hamilton 5 µL Plunger PHD Ultra, Harvard Apparatus Model 75 RN SYR
Tubing Fisher Scientific, Pittsburgh, USA PE 20 Inner diameter 0.38 mm (.015"), Outer diameter 1.09 mm (.043")
Sterican cannulas Braun, Melsungen, Germany 27 G, 25x0.40 mm, blunt
Precision drill/grinder Proxxon, Wecker, Luxemburg fbs 240/e
Cutting disks Proxxon NO 28812
Cre dependent channelrhodopsin Penn Vector Core, Philadelphia, PA, USA AV-1-18917P Contruct name: AAV2/1.CAGGS.flex.ChR2.tdTomato, titer: 1.42x1013 vg/ml
Cam kinase dependent halorhodopsin Penn Vector Core AV-1-26971P Construct name: eNpHR3.0, AAV2/1.CamKIIa.eNpHR3.0-EYFP.WPRE.hGH, titer: 2.08_1012 vg/ml
Multimode optic fiber ThorLabs, Dachau, Germany FG105LCA 0.22 NA, Low-OH, Ø105 µm Core, 400 - 2400 nm
Ceramic stick ferrule Precision Fiber Products, Milpitas, CA, USA CFLC126 Ceramic LC MM Ferrule, ID 126um
Polishing paper Thorlabs LF3D 6" x 6" Diamond Lapping (Polishing) Sheet
Power meter Thorlabs PM100D Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD
Multimode fiber optic coupler Thorlabs FCMM50-50A-FC 1x2 MM Coupler, 50:50 Split Ratio, 50 µm GI Fibers, FC/PC
Fiberoptic patch cord Thorlabs FG105LCA CUSTOM-MUC custom made, 3 m long, with protective tubing, Tubing: FT030, Connector 1: FC/PC, Connector 2: 1.25mm (LC) Ceramic Ferrule
Sleeve Precision Fiber Products, Milpitas, CA, USA ADAL1 Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25 mm (LC/PC) Ferrules
473 nm DPSS laser Laserglow Technologies, Toronto, ON, Canada R471005FX LRS-0473 Series
593 nm DPSS laser Laserglow Technologies R591005FX LRS-0594 Series
MC_Stimulus II Multichannel Systems, Reutlingen, Germany STG 4004
Impedance conditioning module Neural microTargeting worldwide, Bowdoin, USA ICM
Name Company Catalog Number Comments
Electrophysiology
Tungsten wires California Fine Wire Company, Grover Beach, CA, USA CFW0010954 40 µm, 99.95%
Capillary tubing Optronics 1068150020 ID: 100.4 µm
Omnetics nanoconnector Omnetics Connector Corporation, Minneapolis, USA A79038-001
Screws Bilaney, Düsseldorf, Germany 00-96x1/16 stainless-steel
Silicone probe NeuroNexus Technologies, Ann Arbor, MI, USA B32
Headstage Neuralynx, Bozeman, Montana USA HS-8 miniature headstage unity gain preamplifiers
Silver conductive paint Conrad electronics, Germany 530042
Liquid flux Felder GMBH Löttechnik, Oberhausen, Germany Lötöl ST DIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11)
LED Neuralynx HS-LED-Red-omni-10V
Name Company Catalog Number Comments
Software
MATLAB Mathworks, Natick, MA, USA
MC_Stimulus software Multichannel, Systems
Neurophysiological Data Manager NDManager, http://neurosuite.sourceforge.net
Klusters http://neurosuite.sourceforge.net, Hazan et al., 2006
Software of the recording system Neuralynx Cheetah https://neuralynx.com/software/cheetah
Multi-channel data analysis software Cambridge Electronic Design Limited, Cambridge, GB Spike2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salinas, E., Sejnowski, T. J. Correlated neuronal activity and the flow of neural information. Nat Rev Neurosci. 2 (8), 539-550 (2001).
  2. Buzsaki, G., Wang, X. J. Mechanisms of gamma oscillations. Annu Rev Neurosci. 35, 203-225 (2012).
  3. Cannon, J., et al. Neurosystems: brain rhythms and cognitive processing. Eur J Neurosci. 39 (5), 705-719 (2014).
  4. Fries, P. Neuronal gamma-band synchronization as a fundamental process in cortical computation. Annu Rev Neurosci. 32, 209-224 (2009).
  5. Cardin, J. A., et al. Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses. Nature. 459 (7247), 663-667 (2009).
  6. Colgin, L. L., et al. Frequency of gamma oscillations routes flow of information in the hippocampus. Nature. 462 (7271), 353-357 (2009).
  7. Csicsvari, J., Jamieson, B., Wise, K. D., Buzsaki, G. Mechanisms of gamma oscillations in the hippocampus of the behaving rat. Neuron. 37 (2), 311-322 (2003).
  8. Gray, C. M., Singer, W. Stimulus-specific neuronal oscillations in orientation columns of cat visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (5), 1698-1702 (1989).
  9. Lisman, J. E., Jensen, O. The theta-gamma neural code. Neuron. 77 (6), 1002-1016 (2013).
  10. Sirota, A., et al. Entrainment of neocortical neurons and gamma oscillations by the hippocampal theta rhythm. Neuron. 60 (4), 683-697 (2008).
  11. Bender, F., et al. Theta oscillations regulate the speed of locomotion via a hippocampus to lateral septum pathway. Nat Commun. 6, 8521 (2015).
  12. Carus-Cadavieco, M., et al. Gamma oscillations organize top-down signalling to hypothalamus and enable food seeking. Nature. 542 (7640), 232-236 (2017).
  13. Bragin, A., Engel, J., Wilson, C. L., Fried, I., Buzsaki, G. High-frequency oscillations in human brain. Hippocampus. 9 (2), 137-142 (1999).
  14. Wang, J., et al. High-frequency oscillations in Parkinson's disease: spatial distribution and clinical relevance. Mov Disord. 29 (10), 1265-1272 (2014).
  15. Hammond, C., Bergman, H., Brown, P. Pathological synchronization in Parkinson's disease: networks, models and treatments. Trends Neurosci. 30 (7), 357-364 (2007).
  16. Buzsaki, G. Theta oscillations in the hippocampus. Neuron. 33 (3), 325-340 (2002).
  17. Gulyas, A. I., et al. Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release site. Nature. 366 (6456), 683-687 (1993).
  18. Buhl, E. H., et al. Physiological properties of anatomically identified axo-axonic cells in the rat hippocampus. J Neurophysiol. 71 (4), 1289-1307 (1994).
  19. Wulff, P., et al. Hippocampal theta rhythm and its coupling with gamma oscillations require fast inhibition onto parvalbumin-positive interneurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3561-3566 (2009).
  20. Korotkova, T., Fuchs, E. C., Ponomarenko, A., von Engelhardt, J., Monyer, H. NMDA receptor ablation on parvalbumin-positive interneurons impairs hippocampal synchrony, spatial representations, and working memory. Neuron. 68 (3), 557-569 (2010).
  21. Buhl, D. L., Harris, K. D., Hormuzdi, S. G., Monyer, H., Buzsaki, G. Selective impairment of hippocampal gamma oscillations in connexin-36 knock-out mouse in vivo. J Neurosci. 23 (3), 1013-1018 (2003).
  22. Racz, A., Ponomarenko, A. A., Fuchs, E. C., Monyer, H. Augmented hippocampal ripple oscillations in mice with reduced fast excitation onto parvalbumin-positive cells. J Neurosci. 29 (8), 2563-2568 (2009).
  23. Contreras, D., Steriade, M. Cellular basis of EEG slow rhythms: a study of dynamic corticothalamic relationships. J Neurosci. 15 (1 Pt 2), 604-622 (1995).
  24. Herrera, C. G., et al. Hypothalamic feedforward inhibition of thalamocortical network controls arousal and consciousness. Nat Neurosci. 19 (2), 290-298 (2016).
  25. Freund, T. F., Antal, M. GABA-containing neurons in the septum control inhibitory interneurons in the hippocampus. Nature. 336 (6195), 170-173 (1988).
  26. Unal, G., Joshi, A., Viney, T. J., Kis, V., Somogyi, P. Synaptic Targets of Medial Septal Projections in the Hippocampus and Extrahippocampal Cortices of the Mouse. J Neurosci. 35 (48), 15812-15826 (2015).
  27. Hangya, B., Borhegyi, Z., Szilagyi, N., Freund, T. F., Varga, V. GABAergic neurons of the medial septum lead the hippocampal network during theta activity. J Neurosci. 29 (25), 8094-8102 (2009).
  28. Bartho, P., et al. Ongoing network state controls the length of sleep spindles via inhibitory activity. Neuron. 82 (6), 1367-1379 (2014).
  29. Giocomo, L. M., et al. Grid cells use HCN1 channels for spatial scaling. Cell. 147 (5), 1159-1170 (2011).
  30. Stark, E., et al. Inhibition-induced theta resonance in cortical circuits. Neuron. 80 (5), 1263-1276 (2013).
  31. Crandall, S. R., Cruikshank, S. J., Connors, B. W. A corticothalamic switch: controlling the thalamus with dynamic synapses. Neuron. 86 (3), 768-782 (2015).
  32. Steriade, M., McCormick, D. A., Sejnowski, T. J. Thalamocortical oscillations in the sleeping and aroused brain. Science. 262 (5134), 679-685 (1993).
  33. Joshi, A., Salib, M., Viney, T. J., Dupret, D., Somogyi, P. Behavior-Dependent Activity and Synaptic Organization of Septo-hippocampal GABAergic Neurons Selectively Targeting the Hippocampal CA3 Area. Neuron. , (2017).
  34. Schlingloff, D., Kali, S., Freund, T. F., Hajos, N., Gulyas, A. I. Mechanisms of sharp wave initiation and ripple generation. J Neurosci. 34 (34), 11385-11398 (2014).
  35. Craig, M. T., McBain, C. J. Fast gamma oscillations are generated intrinsically in CA1 without the involvement of fast-spiking basket cells. J Neurosci. 35 (8), 3616-3624 (2015).
  36. Pastoll, H., Solanka, L., van Rossum, M. C., Nolan, M. F. Feedback inhibition enables theta-nested gamma oscillations and grid firing fields. Neuron. 77 (1), 141-154 (2013).
  37. Akam, T., Oren, I., Mantoan, L., Ferenczi, E., Kullmann, D. M. Oscillatory dynamics in the hippocampus support dentate gyrus-CA3 coupling. Nat Neurosci. 15 (5), 763-768 (2012).
  38. Mattis, J., et al. Frequency-dependent, cell type-divergent signaling in the hippocamposeptal projection. J Neurosci. 34 (35), 11769-11780 (2014).
  39. Vandecasteele, M., et al. Optogenetic activation of septal cholinergic neurons suppresses sharp wave ripples and enhances theta oscillations in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (37), 13535-13540 (2014).
  40. Stark, E., et al. Pyramidal cell-interneuron interactions underlie hippocampal ripple oscillations. Neuron. 83 (2), 467-480 (2014).
  41. Blumberg, B. J., et al. Efficacy of nonselective optogenetic control of the medial septum over hippocampal oscillations: the influence of speed and implications for cognitive enhancement. Physiol Rep. 4 (23), (2016).
  42. Courtin, J., et al. Prefrontal parvalbumin interneurons shape neuronal activity to drive fear expression. Nature. 505 (7481), 92-96 (2014).
  43. Nagode, D. A., Tang, A. H., Yang, K., Alger, B. E. Optogenetic identification of an intrinsic cholinergically driven inhibitory oscillator sensitive to cannabinoids and opioids in hippocampal CA1. J Physiol. 592 (1), 103-123 (2014).
  44. Bitzenhofer, S. H., et al. Layer-specific optogenetic activation of pyramidal neurons causes beta-gamma entrainment of neonatal networks. Nat Commun. 8, 14563 (2017).
  45. Kondabolu, K., et al. Striatal cholinergic interneurons generate beta and gamma oscillations in the corticostriatal circuit and produce motor deficits. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (22), E3159-E3168 (2016).
  46. Sohal, V. S., Zhang, F., Yizhar, O., Deisseroth, K. Parvalbumin neurons and gamma rhythms enhance cortical circuit performance. Nature. 459 (7247), 698-702 (2009).
  47. Pina-Crespo, J. C., et al. High-frequency hippocampal oscillations activated by optogenetic stimulation of transplanted human ESC-derived neurons. J Neurosci. 32 (45), 15837-15842 (2012).
  48. Iaccarino, H. F., et al. Gamma frequency entrainment attenuates amyloid load and modifies microglia. Nature. 540 (7632), 230-235 (2016).
  49. Kim, H., Ahrlund-Richter, S., Wang, X., Deisseroth, K., Carlen, M. Prefrontal Parvalbumin Neurons in Control of Attention. Cell. 164 (1-2), 208-218 (2016).
  50. Lu, Y., et al. Optogenetically induced spatiotemporal gamma oscillations and neuronal spiking activity in primate motor cortex. J Neurophysiol. 113 (10), 3574-3587 (2015).
  51. Kim, T., et al. Cortically projecting basal forebrain parvalbumin neurons regulate cortical gamma band oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (11), 3535-3540 (2015).
  52. Siegle, J. H., Pritchett, D. L., Moore, C. I. Gamma-range synchronization of fast-spiking interneurons can enhance detection of tactile stimuli. Nat Neurosci. 17 (10), 1371-1379 (2014).
  53. Gan, J., Weng, S. M., Pernia-Andrade, A. J., Csicsvari, J., Jonas, P. Phase-Locked Inhibition, but Not Excitation, Underlies Hippocampal Ripple Oscillations in Awake Mice In. Neuron. 93 (2), 308-314 (2017).
  54. van de Ven, G. M., Trouche, S., McNamara, C. G., Allen, K., Dupret, D. Hippocampal Offline Reactivation Consolidates Recently Formed Cell Assembly Patterns during Sharp Wave-Ripples. Neuron. 92 (5), 968-974 (2016).
  55. Kim, A., et al. Optogenetically induced sleep spindle rhythms alter sleep architectures in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20673-20678 (2012).
  56. Latchoumane, C. V., Ngo, H. V., Born, J., Shin, H. S. Thalamic Spindles Promote Memory Formation during Sleep through Triple Phase-Locking of Cortical, Thalamic, and Hippocampal Rhythms. Neuron. 95 (2), 424-435 (2017).
  57. Robinson, J., et al. Optogenetic Activation of Septal Glutamatergic Neurons Drive Hippocampal Theta Rhythms. J Neurosci. 36 (10), 3016-3023 (2016).
  58. Fuhrmann, F., et al. Locomotion, Theta Oscillations, and the Speed-Correlated Firing of Hippocampal Neurons Are Controlled by a Medial Septal Glutamatergic Circuit. Neuron. 86 (5), 1253-1264 (2015).
  59. Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3 (5), e159 (2005).
  60. Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
  61. Armstrong, C., Krook-Magnuson, E., Oijala, M., Soltesz, I. Closed-loop optogenetic intervention in mice. Nat Protoc. 8 (8), 1475-1493 (2013).
  62. Buzsaki, G., et al. Multisite recording of brain field potentials and unit activity in freely moving rats. J Neurosci Methods. 28 (3), 209-217 (1989).
  63. Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. J Vis Exp. (61), e3568 (2012).
  64. Hazan, L., Zugaro, M., Buzsaki, G. Klusters, NeuroScope, NDManager: a free software suite for neurophysiological data processing and visualization. J Neurosci Methods. 155 (2), 207-216 (2006).
  65. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  66. Korotkova, T., et al. Reconciling the different faces of hippocampal theta: The role of theta oscillations in cognitive, emotional and innate behaviors. Neurosci Biobehav Rev. , (2017).
  67. Vertes, R. P., Hoover, W. B., Viana Di Prisco, G. Theta rhythm of the hippocampus: subcortical control and functional significance. Behav Cogn Neurosci Rev. 3 (3), 173-200 (2004).
  68. Hasselmo, M. E., Hay, J., Ilyn, M., Gorchetchnikov, A. Neuromodulation, theta rhythm and rat spatial navigation. Neural Netw. 15 (4-6), 689-707 (2002).
  69. Witt, A., et al. Controlling the oscillation phase through precisely timed closed-loop optogenetic stimulation: a computational study. Front Neural Circuits. 7, 49 (2013).
  70. Korotkova, T., Ponomarenko, A. In Vivo Neuropharmacology and Neurophysiology. , Springer Science. Series Neuromethods (2017).
  71. Dannenberg, H., et al. Synergy of direct and indirect cholinergic septo-hippocampal pathways coordinates firing in hippocampal networks. J Neurosci. 35 (22), 8394-8410 (2015).
  72. Pikovsky, A., Rosenblum, M., Kurths, J. Synchronization: A universal concept in nonlinear sciences. 70, American Journal of Physics. (2002).
  73. Boyce, R., Glasgow, S. D., Williams, S., Adamantidis, A. Causal evidence for the role of REM sleep theta rhythm in contextual memory consolidation. Science. 352 (6287), 812-816 (2016).

Tags

Neurowetenschappen kwestie 136 Optogenetics elektrofysiologische opnamen in vivo gedrag theta trilling hippocampus piramidale cellen interneuronen septum motoriek farmacogenetica
Optogenetic meevoeren van Hippocampal Theta oscillaties in het gedrag van muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bender, F., Korotkova, T.,… More

Bender, F., Korotkova, T., Ponomarenko, A. Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice. J. Vis. Exp. (136), e57349, doi:10.3791/57349 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter