Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att utföra cisterna magna kanylering (CMc), ett minimalt invasivt sätt att leverera spårämnen, substrat och signalmolekyler i cerebrospinalvätskan (CSF). CMc i kombination med olika avbildningsmetoder, och möjliggör glymphatic system och CSF dynamics bedömning, samt hjärnan-omfattande leverans av olika föreningar.
Abstract
Cisterna magna kanylering (CMc) är en enkel procedur som ger direkt åtkomst till cerebrospinalvätska (CSF) utan operativa skador på skallen eller hjärnparenkymet. I sövda gnagare tillåter exponeringen av dura mater av trubbig dissektion av nackmusklerna införandet av en kanyl i cisterna magna (CM). Kanylen, består antingen av en fin avfasade nål eller Borsilikat kapillär, bifogas en spruta via ett rör av polyeten (PE). Använder en sprutpump, kan molekyler sedan injiceras på kontrollerade priser direkt i den CM, som är kontinuerlig med subaraknoidalrummet. Från subaraknoidalrummet, kan vi spåra CSF flöden av konvektiv flöde in i perivaskulär utrymmet runt genomträngande arterioler, där koncentrationsgradient utbyte med interstitiell vätska (ISF) uppstår. CMc kan utföras för akut injektioner direkt efter operationen, eller kronisk implantation, med senare injektion i sövda eller vaken, fritt rörliga gnagare. Kvantitering av tracer distribution i hjärnparenkymet kan utföras av epifluorescence, 2-foton mikroskopi och magnetisk resonanstomografi (MRT), beroende på fysikalisk-kemiska egenskaper av de injicerade molekylerna. Således erbjuder CMc i samband med olika avbildningstekniker ett kraftfullt verktyg för bedömning av glymphatic system och CSF dynamiken och funktion. CMc kan dessutom användas som en kanal för snabb, hjärnan-omfattande leverans av signalering molekyler och metaboliska substrat som inte annars kunde korsa blod-hjärnbarriären (BBB).
Introduction
Cerebrospinalvätska (CSF) badar det centrala nervsystemet (CNS) i hela den ventrikulära systemet och längs den subaraknoidal utrymmen, ett anatomiskt definierade utrymme i kontinuum med ventriklarna, som omger hjärnan och ryggmärgen. En av de viktigaste funktionerna i GSR är att ge en väg för clearance av metaboliter och föroreningar från hjärnparenkymet. Clearance underlättas via den nyupptäckta glymphatic system1, hjärnan analog till perifera lymfsystemet. Häri, vi beskriva och diskutera den cisterna magna kanylering (CMc), en minimalt invasiv metod för direkt distribution av molekyler i GSR. CMc är den viktigaste metoden för att studera funktionen glymphatic. Dessutom kan CMc också tillämpas för studiet av CSF dynamiken och för en snabb, hjärnan-omfattande leverans av icke-blood brain barrier (BBB) genomsläpplig molekyler i hjärnparenkymet, längs perivaskulär utrymmet.
CMc utnyttjar fysiologiska principer av CSF rörelse dynamik genom CNS att leverera märkt tracer molekyler eller droger i CSF-fyllda utrymmet i cisterna magna (CM). Molekyler injiceras via en kanyl som implanteras i atlantoskandisk-occipital dural membran beläggningen CM. molekylerna transporteras sedan med CSF bulkflöde in i hjärnparenkymet via paravascular utrymme1. Tracer eller kontrast agent injiceras via CMc följer rörelsen av CSF, vilket gör bedömningen av CSF rörelse och glymphatic tillströmning av kvantifiera intensitetsnivåer märkta molekyler som anger hjärnparenkymet. CMc är kompatibel med olika avbildningstekniker inklusive epifluorescence, 2-foton mikroskopi och magnetisk resonanstomografi (MRT). Denna bedömning kan också utföras både i vivo eller ex vivo. Ännu viktigare, möjliggör CMc visualisering av glymphatic systemet under narkos eller under naturlig sömn, samt i vaken, fritt rörliga djur.
CMc tekniken kan utnyttjas för att studera olika aspekter av fluid dynamics i CSF, men har visat sig vara särskilt användbar för att studera det glymphatic systemet. Glymphatic verksamhet driver konvektiv flödet av CSF från periarterial rymden via akvaporin-4 (AQP-4) vattenkanaler, som är bundna i membranet i astrocytic vaskulär-wrapping endfeet. Konvektiv flödet möjliggör utbyte av CSF och interstitiell vätska (ISF) inom hjärnparenkymet. CSF/ISF som innehåller metaboliska avfall och föroreningar tas sedan bort från hjärnparenkymet via perivenous utrymme2,3. Slutligen når CSF/ISF periferin via den nyligen beskriven dural lymfkärl4,5. Glymphatic systemet har visats avgörande för clearance av skadligt avfall metaboliter såsom amyloid-β2. Vidare, glymphatic clearance är nedsatt i åldrande6, efter traumatisk hjärnskada skada7, och i djurmodeller för diabetes8 och Alzheimers sjukdom9. Särskilt är glymphatic aktivitet staten beroende, visar betydligt högre aktivitet under sömn eller anestesi i jämförelse med vakenhet1. Faktiskt, unga sövda djur uppvisar den högsta glymphatic-aktiviteten. Experimentell kvantifiering av glymphatic verksamhet är alltså kritisk när man studerar dess roll vid hälsa och sjukdom.
Flera studier har behandlat CSF dynamiken och dess utbyte med interstitiell vätska (ISF) i hjärnparenkymet. De metoder som levereras märkta molekyler är dock ganska invasiv, utlöser parenkymet hjärnskador och förändringar i det intrakraniella trycket (ICP) (se granska10). Några exempel är intraventrikulär eller intraparenchymal injektioner som innebär kraniotomi eller borrning av en burr hål i skallen. Dessa förfaranden har visat sig förändra ICP, således störa glymphatic funktion2. Även sådana invasiva metoder inducera astrogliosis och öka AQP-4 immunoreaktivitet i hjärnparenkymet skadade området och dess omgivningar11,12. Som astrocyter och AQP-4 är viktiga inslag i det glymphatic systemet, är CMc metoden för val av dess studier. De stora fördelarna med CMc jämfört med mer invasiva ingrepp är upprätthållandet av en intakt skallen och hjärnan parenkymet, undvika ICP förändringar och astrogliosis, respektive. Således, CMc i samband med olika avbildningsverktyg öppnar för ett brett utbud av möjligheter att studera inte bara det glymphatic systemet, utan också dynamiken och verkningsmekanismer vätskeflöde i homeostas, liksom i djurmodeller av neurologiska sjukdomar.
Det cisterna magna kanylering (CMc) förfarandet tillåter enkel och direkt tillgång till cerebrospinalvätska (CSF). Genom att injicera olika molekyler (t.ex. fluorescerande spårämnen, MRI kontrastmedel) kan försöksledaren spåra deras rörlighet inom CSF facket och bedöma aktiviteten av glymphatic systemet. Följande protokoll beskriver både akut CMc, för injektioner direkt efter operationen, och kronisk implantation av kanylen, där djuret återvinner från det kirurgiska ingreppet för senare injektion. Den viktigaste skillnaden mellan akut och kronisk implantation är att kronisk implantation tillåter för studien av glymphatic aktivitet i vaken möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden utfördes i enlighet med den europeiska direktiv 2010/63/EU för djurförsök och godkändes av djur experiment rådet under det danska ministeriet för miljö och mat (2015-15-0201-00535).
1. förfarandet för kanylering
- Kanyl förberedelse
Obs: Undvik att vidröra kanylen med icke-sterila handskar.- Bryta den avfasade metall spetsen av en 30G dental nål använder en nålförare.
- Använda en nålförare, förbereda kanylen genom att infoga den avfasade metall spetsen (ca 0,3 cm) i ett 30-cm längd PE10 slangar (polyeten slangen 0,024 ”OD x 0,011” ID) fylld med aCSF (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4 , 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM glukos, 26 mM NaHCO3; pH 7,4 när gasade med 95% O2 och 5% CO2).
- Spola kanylen med aCSF med en 1 mL spruta med en 30G nål (30 G x ½ ”0,3 x 12).
-
Kirurgiskt ingrepp
Obs: Den kroniska CM kanylering kan djuren att återhämta sig från det kirurgiska ingreppet. CM injektioner görs dagen efter kanyl implantation och, ännu viktigare, kan utföras antingen sövda eller vaket djur. Eftersom detta är en återvinnande operation, bör förfaranden utföras under sterila förhållanden.- Väga musen (C57BL/6JRj, båda könen, 8 veckor) och söva den med en blandning av ketamin och xylazin (100 mg/kg; 10 mg/kg, respektive) via intraperitoneal (IP) injektion. Om det behövs förbättras ge ny musen med en halv dos av ketamin (50 mg/kg) under det kirurgiska ingreppet. Alternativt för kronisk kanylering, söva mus genom att placera det i en isofluran induktion kammare på 2,5-3% isofluran, i ca 1 L/min O2. I detta fall använda en näsa kon för att upprätthålla isofluran anestesi på 1,5-2% under hela operationen.
- När tå nypa reflexer upphör, och andningen blir långsam och stadig, placera djuret i en stereotaxic ram över en värmedyna.
- Tillämpa oftalmologiska salva. Upprepa under kirurgi vid behov.
- Raka huvudet och halsen av musen, ta bort päls och sterilisera exponerad hud först med en spritsudd och sedan två gånger med klorhexidin (0,5%) eller jodlösning (2%). Upprepa sterilisering två gånger.
Obs: Ändra den kirurgiska draperingen för att avlägsna skräp och hår efter rakning. Sedan drapera djuret för att skydda det sterila fältet. - För den kroniska kanylering, administrera 0,5 - 1 ml lidokain/bupivakain (1 mg/ml och 0,25 mg/ml, respektive) subkutant (s.c.) på webbplatsen snitt. Administrera buprenorfin (0,05 mg/kg; s.c.) för postoperativ smärtlindring.
- Fixa musen i ramen stereotaxic. Efter att säkerställa fixering, antingen intraural eller zygomatic bågen, luta huvudet något så att det bildar en vinkel på 120° till kroppen (figur 1E).
- Hitta delen av skallen utskjutande omedelbart ovanför nackmusklerna - occipital krönet. Lyft den överliggande huden med hjälp av ett par pincett och skär en mandel formad bit av huden på ca 1 cm längs mittlinjen. Använda bomullspinnar eller ögon spears att styra någon resulterande blödning.
- Med occipital krönet som en referenspunkt, dra isär ytliga bindväv för att exponera nackmusklerna nedan.
- Separata musklerna vid mittlinjen genom att försiktigt köra tången i mitten av snittet webbplatsen i främre-till-bakre axeln. Med ett par böjda pincetten i varje hand, gå med tipsen i mitten längst ned på skallen och drar musklerna åt sidan.
Obs: Detta bör exponera den CM, som visas som en liten omvänd triangel, beskrivs av lillhjärnan ovan och medulla nedan, bakom den genomskinliga dural membranen (figur 1B och 1 C). - Använder en kirurgisk öga spjut eller bomullssudd, torka dural membranet som täcker CM.
-
Införande av kanylen i CM
- Ta bort kanylen från aCSF-fyllda sprutan, att hålla 30G sprutspets till den bakre delen av slangen.
- Hur nålen 30G en destillerat vatten-fyllda 100 µL spruta ansluten till en sprutpump.
- Infoga en luftbubbla i ca 1 cm i kanylen genom att dra tillbaka luften med hjälp av en sprutpump.
- Använder en sprutpump, dra ut 12 μL av önskad CSF tracer kanylen.
- Förstå den kanyl, fyllda med CSF spårämne, nära tube täckta nålen med en böjd pincett hålls i dominerande handen. Vila långfingret på den icke-dominanta handen på baren örat på motsatt sida och hålla den stadigt för senare användning som en vila för kanylen.
- Sätt in kanylen i en vinkel på 45° i förhållande till musen huvudet, passerar in i centrera av den CM, identifieras av dess triangulära aspekt sett genom dura. Undvika eventuella penetration av lillhjärnan eller medulla. Säkerställa att nålen sätts endast till ett djup av 1-2 mm, dvs till den punkt där fasning är helt under dura. Släpp pincetten håller kanylen och låt kanylen vila på den icke-dominanta handen.
Obs: Avfasade slutet av dental nålar kommer att kräva tillämpning av någon kraft att genomborra dural membranet som täcker CM. - Om det behövs, torka av eventuella CSF läckage vid penetration med en kirurgisk öga spjut eller bomull svabb.
- Droppa 2-3 droppar av cyanoakrylat lim på dural membranet som omger kanylen. Tillsätt en droppe lim accelerator att bota limmet omedelbart. Täcka den skalle och nålen med en blandning av dentala cement (cirka 0,5 mg) och cyanoakrylat lim (3-5 droppar). Omedelbart efter, applicera en droppe lim accelerator att bota.
- För kronisk kanylering, skär slangen (lämnar ca 2-3 cm bifogas kanylen) och försegla det med en kirurgisk svets att behålla intrakraniellt tryck (ICP) nivåer, genom att förhindra CSF läckage genom slangen.
- För kronisk kanylering, administrera karprofen (5 mg/kg; s.c.)
- För kronisk kanylering, Placera musen i en bur, hålla det över en värmedyna att bibehålla kroppstemperaturen tills djuret är helt återhämtat sig från anestesi.
Obs: Djuren ska hållas ensamma i sina burar att försäkra att kanylen förblir intakt. Se till att näsan framgår av sängkläder genom att placera musen på en pappershandduk eller andra fasta substrat.
Obs: Följande dag, när djur återvunnits det kirurgiska ingreppet utförs för kanyl införande, de kan injiceras med CSF spårämnen. För injektion under anestesi, administrera en blandning av ketamin/xylazin (100 mg/kg; 10 mg/kg, respektive; i.p.) och fortsätt till steg som beskrivs i avsnitt 2. För injektion i vaket djur, gå vidare till avsnitt 3.
2. injektion av CSF spårämnen via akut inopererad CM kanyl på sövda djur
Obs: För injektion av CSF spårämnen via akut inopererad CM kanyl sövda djur, omedelbart efter steg 8 från föregående avsnitt, fortsätta till CSF tracer injektion som beskrivs nedan.
- Använder en sprutpump, börja en injektion i de CM av CSF spårämnen i en takt av 1 μL/min för 5 eller 10 min, vilket resulterar i en total volym på 5 µL eller 10 µL, respektive. I slutet av injektionen, tillåta CSF spårämne att cirkulera i hela hjärnan för 30 min med kanylen ostört.
- Efter 30 min, skär slangen ansluten till kanylen (cirka 4 cm avstånd från kanylspetsen) och försegla sitt slut med en kirurgisk svets.
- Under djup anestesi, avliva djuret genom halshuggning. Snabbt dissekerar hjärnan och fixa vävnaden genom nedsänkning i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) utspätt i fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 0.01M; pH 7,4) övernattning (o/n) vid 4 ° C.
3. injektion av CSF spårämnen via kroniskt implanteras CM kanyl i vaket djur
- Använder en sprutpump, återkalla 7 µL eller 12 µl av önskad CSF tracer in en kanyl som består av cirka 30 cm av PE10 slangar med avfasade dental nål spets med 0,5 cm.
- Försiktigt hålla djuret och skär av ca 1 cm av slangen kopplad till kanylen.
- Fortfarande under skonsam besöksförbud, snabbt ansluta kanylen fyllda med CSF tracer till CM implanteras kanylen.
- Använder en sprutpump, starta injektionen in de CM av CSF spårämnen i en takt av 1 µL/min. injicera 7 µL eller 12 µL, att uppnå en slutlig volym av CSF injiceras tracer 5 µL eller 10 µL, således kompensera den aCSF kvar i den implanterade kanylen. I slutet av injektionen, tillåta CSF spårämne att cirkulera i hela hjärnan för 30 min med kanylen ostört. Se till att slangen sitter kvar under injektion och cirkulation.
- I slutet av CSF tracer omsättning tid, vidare till dödshjälp genom halshuggning, att säkerställa att djuret är djupt sövda. Snabbt dissekerar hjärnan och fixa vävnaden genom nedsänkning i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) utspätt i fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 0.01M; pH 7,4) övernattning (o/n) vid 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vid fixering av möss eller råttor i en stereotaxic ram, är halsen muskler runt regionen occipital crest rakt på sak dissekeras för att exponera den cisterna magna (CM). Den triangulära strukturen cm känns lätt igen mellan den kaudala delen av lillhjärnan och medulla (figur 1A-1 C). Kanylen sätts 1-2 mm i CM av försiktigt piercing atlantoskandisk-occipital membranet (figur 1 d). Dura membranet är en tuff struktur och införandet av kanylen förbättras genom att luta det djura huvudet av en 120° i förhållande till kroppen. Med hjälp av en Insprutningspump injiceras annorlunda märkta molekyler sedan i cisterna magna på kontrollerade priser (figur 1E). Efter ett intervall att tillåta CSF tracer cirkulation, är djur euthanized. Hjärnan är noggrant dissekeras och fast genom nedsänkning i 4% PFA o/n vid 4 ° C. Makroskopiska dorsala utsikt över hjärnor skördas från CM-injiceras gnagare visar fördelningen av CSF spårämnen i den subaraknoidal cisterner av lillhjärnan, i luktbulben och i det paravascular utrymmet längs den mellersta cerebrala artärer (MCAs) (figur 1F ). I den ventrala delen av hjärnan visar makroskopiska vyer CSF tracer fördelning längs den Circle of Willis (figur 1 g). Histologiska sektioner av CM-injiceras hjärnor ytterligare avslöja paravascular fördelningen av spårämnen inom hjärnparenkymet. Möss som injiceras under anestesi (figur 1 H) (eller under naturlig sömn, se1) visar en anmärkningsvärd ökning i tracer fördelningen i hjärnparenkymet jämfört med möss som injiceras medan vaken och fritt rörliga i deras hem bur (figur 1I).
Figur 1: injektion av spårämnen i cisterna magna. (A) Schematisk översikt över mus huvud och hjärna visar platsen för den cisterna magna (CM) i förhållande till hjärnan och kraniala strukturer. (B) Photomicrograph exponerade cm efter omgivande nackmusklerna har varit rent ut dissekeras och sköt till sidorna. (C) högre förstoring av området skildras i B (svart rektangel), visar inverterade triangulära strukturen för CM (streckad linje) och dess läge i förhållande till omgivande strukturer, dvs occipital crest, lillhjärnan, och medulla. (D) fotomikrografi av kanylen infogas i CM. (E) systemet av laterala beskådar av musen fast huvudet, något lutad i en vinkel på 120 ° i förhållande till kroppen. Indrag streckad rektangel avgränsas området visar systematiken i ett parasagittal Visa system av en parasagittal syn på mus hjärnan med kanylen infogas i CM, som beskrivs i E. En spruta, som är kopplat till en Insprutningspump, används för att leverera CSF spårämnen eller kontrastmedel in CM genom en slang ansluten till en fin 30G nål. Representativa bilder av en hela musen hjärna på 30 min efter slutet av CM injektion med fluorescerande spårämne sett från dorsala (F) och ventrala (G) aspekter. (H, I,) Representativa koronalt hjärnan sektioner counterstained med DAPI (4', 6-diamidin-2-fenylindol, 1 µg/mL i PBS) av möss som injiceras med CSF spårämnen i CM under sövda (H) och vakenhet (I), 30 min efter slutet av CM injektion med en hastighet av 1 µL/min på en 5 µL volymen av en blandning av äggalbumin-AF647 konjugat (OA, 45kDa, 2% i aCSF) och dextran-FITC-konjugat (DEX, 3kDa, 2% i aCSF). Skala barer, 5 mm för B, C, F, G; 2 mm för D och 500 µm för H, I. Cb, lillhjärnan; CM, cisterna magna; CTX, cortex; och OB, luktbulben. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har lagt fram ett protokoll som beskriver ett detaljerat förfarande för cisterna magna kanylering (CMc), som erbjuder en enkel metod för att leverera märkta molekyler i CSF-facket. CMc tillåter efterföljande visualisering av CSF dynamiken, både i vivo och ex vivo, använder olika avbildningsmetoder eller histologi.
En av de främsta fördelarna med CMc tekniken ligger i dess direkt tillgång till subaraknoidalrummet utan att behöva exponera hjärnan av kraniotomi. Genom att inte kräva ett kraniala fönster eller penetration av hjärnparenkymet med nål spets, tillåter CMc leverans av molekyler i CSF facket och bedömningen av det glymphatic systemet genom en minimalt invasiv förfarande, med endast korta störning av intrakraniellt tryck (ICP).
Bland annat en injektion i CM ligger nedströms av de viktigaste källorna av CSF, den koroidea plexi ligger i ventrikulära systemet (lateral, tredje och fjärde ventriklarna). Från de laterala ventriklarna, CSF flöden till tredje ventrikeln via de intraventrikulära foramina (foramen av Monro) och från tredje till fjärde ventriklarna via cerebrala akvedukten (akvedukten av Sylvius) till hjärnstammen och ryggmärgen (recenserade i3 ). CSF når subaraknoidalrummet via CM genom att flöda genom den median bländaren (eller foramen av Magendie), och således CMc injektioner förbi hela ventrikulära systemet. Men medan detta kan vara problematiskt i vissa modeller av CSF/ISF dynamics genom ventriklar, kräver direkt injektion av spårämnen i ventriklarna invasiva kirurgiska ingrepp såsom borrning av burr hål i skallen Fönstren, och tillämpningen av ventrikulär injektioner störa väsentligen ICP13. Jämväl, tryck injektion av spårämnen i subaraknoidalrummet13,14 i våra händer avskaffar flödet av CSF spårämnen längs paravascular utrymmet. Däremot även om CMc innebär punktering av dural membranet, ICP är endast övergående perturbed och är snabbt återställd2.
Använda CMc, kan glymphatic aktivitet mätas i sövda djur efter akut CMc samt i vaket djur, observerar en 24-timmars återhämtningsperiod på kanyl implantation. Akut CMc är lämpad för kombination med 2-photon imaging, som ger detaljerad information om glymphatic verksamhet i cortex till ett djup av ca 200 µm1,2. Ännu viktigare, ger akut CMc också fördelen att stödja opartisk MRI studier, där tracer distribution följs dynamiskt, i förhållande till bildens enskilda baslinjen förvärvats före inledandet av CSF tracer injektion15, 16 , 17. för MRI, dental nålen används för CMc bör ersättas av ett Borsilikat kapillär (cirka 1 cm längd, spets diameter av ungefärligt 20 µm) bifogas PE slangen.
Till skillnad från akut kanylering tillåter kronisk CMc den försöksledaren att utföra CSF tracer injektion i djur under naturlig sömn eller under narkos, samt i vaken, fritt rörliga djur. Detta är en avgörande faktor eftersom glymphatic aktivitet är mycket state-dependent; Tracer inflödet till parenkymet är mycket större i djur som injicerades under narkos eller sover än hos djur som injicerades i vaket tillstånd1. Djur med en kroniskt implanterade kanyl kan får dessutom CSF tracer i deras hem bur, sålunda minimizing störfaktorer på grund av effekterna av stress och upphetsning på glymphatic verksamhet. För kronisk injektioner under anestesi, en blandning av ketamin/xylazin (100 mg/kg; 10 mg/kg, respektive) rekommenderas. Isofluran vid koncentrationer över 1,5% inducerar hjärnsvullnad och ökar inte glymphatic aktivitet jämfört med vaket tillstånd1. Observera att efter CMc implantation, djur ska vara enda inrymt, för att säkerställa att CMc implanteras djur inte skadar kanylen av varandra. Också, eftersom CMc kronisk implantation är en återhämtning kirurgiska ingrepp, det bör utföras under sterila förhållanden och djur bör få postoperativ analgetika.
Ännu viktigare, kan CMc användas som en metod för att leverera CSF spårämnen i möss och råttor, med minimala ändringar i protokollet. Lämpliga bedövningsmedel ska administreras och den högsta volymen av CSF tracer som injiceras i råttor är 30 µL, på grund av skillnaderna i storlek av ventrikulära och subaraknoidal utrymmen mellan de två arterna.
Trots dess processuella enkelhet krävs vissa utbildning och praktik för försöksledaren att framgångsrikt utföra CMc. Eftersom CM varierar i storlek mellan arter och enskilda djur, är det tillrådligt att öva erkännande av dess struktur. Öva proceduren med Evans Blue (2% i aCSF) tillåter att försöksledaren att bekräfta rätt nål införande. Ibland, ska ett fartyg placeras direkt vid mittlinjen i GH, varefter kanylen skall införas i anslutning till fartyget, men så nära som möjligt till mittlinjen. Dessa fall bör noteras, för att senare bekräfta att spårämnen fördelas jämnt, trots off-center placering av nålens spets. Ännu viktigare, atlantoskandisk-occipital membranet som täcker CM är mekaniskt tuffa och tillräckligt tryck bör tillämpas för att infoga avfasade nålens spets. Det är dock viktigt att trycket inte resulterar i störta kanylspetsen i medulla eller lillhjärnan. För att underlätta införande av nål in i CM, bör chef för djur vara lutas nedåt i en vinkel på 120° i förhållande till kroppen, vilket sträcker sig membranet. Ännu viktigare, bör vara försiktig att inte hindra andningen av detta huvud flexion. Om nålspetsen bör ange lillhjärnan, spårämnen bevaras i vävnaden och misslyckas att distribuera hela subaraknoidalrummet. Skador av medulla är ofta dödlig, medan lillhjärnan skador i kronisk kanyleringar kan leda till utmattning och allmänna avvikelser i beteendet hos djuren. För att minimera risken för denna eventualitet, kan nålar med en mindre avfasning längd användas.
När du flyttar musklerna i halsen regionen som täcker dura membranet för att infoga kanylen i CM, kan blödning uppstå. Bomullspinnar kan användas för att absorbera blödningen, men alternativt järnklorid lösning kan tillämpas. Järnklorid har en hemostatiska effekt18, och utlöser också stelhet i halsen muskler runt snittet webbplatsen, vilket bidrar till att få rätt införandet av nålen i den CM. Ferric chloride torkar också ut skallen och dural membran, presentera bättre ytor för vidhäftning av kanylen. För CMc, applicera 1-2 droppar av järnklorid lösning (10%) (cirka 1 mL) i en bomull svabba och badda nackmusklerna och occipital krönet. Dock aktuell järnklorid kan möjligen sippra ner genom membranet i GSR, med okända effekter på hjärnan homeostas. Om användningen av järnklorid är en angelägenhet, kan man istället använda såret upprullningsdon för att hålla öppna webbplatsen snitt. Noggrann borttagning av såret upprullningsdon efter applicering cyanoakrylat lim undviker oavsiktlig fastsättning till webbplatsen snitt.
CMc är ett okomplicerat och reproducerbara förfarande att leverera molekyler direkt i CSF facket. Eftersom CMc är minimalt invasiv, det är den föredragna metoden för visualisering av glymphatic systemet och kan kombineras med olika avbildningsmetoder som epifluorescence och 2-foton mikroskopi eller MRI. CMc utgör därmed, ett bra verktyg för studier av fluiddynamik, nämligen CSF och ISF, och även hjärnan vätska clearance. På grund av makroskopiska täckningen av glymphatic systemet har CMc potential att användas för att leverera molekyler hjärnan-wide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av de Novo Nordisk Foundation och nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke, NINDS/NIH (M.N.). A.L.R.X. och Elias-R är mottagare av ett postdoktorsstipendium och PhD stipendium från stiftelsen Lundbeck, respektive.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 - 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
- Xie, L., et al. Sleep Drives Metabolite Clearance from the Adult Brain. Science. , 373-377 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci. Transl. Med. 4, 147ra111 (2012).
- Jessen, N. A., Munk, A. S. F., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner's Guide. Neurochem. Res. 40, 2583-2599 (2015).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. , (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J. Exp. Med. 212, 991-999 (2015).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Ann. Neurol. 76, 845-861 (2014).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of Traumatic Injury Are Transported from Brain to Blood via the Glymphatic System. J. Neurosci. 35, 518-526 (2015).
- Jiang, Q., et al. Impairment of glymphatic system after diabetes. J. Cereb. Blood Flow Metab. , Under Revi (2016).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol. Dis. 93, 215-225 (2016).
- Orešković, D., Klarica, M. The formation of cerebrospinal fluid: Nearly a hundred years of interpretations and misinterpretations. Brain Res. Rev. 64, 241-262 (2010).
- Dusart, I., Schwab, M. E. Secondary Cell Death and the Inflammatory Reaction After Dorsal Hemisection of the Rat Spinal Cord. Eur. J. Neurosci. 6, 712-724 (1994).
- Eide, K., Eidsvaag, V. A., Nagelhus, E. A., Hansson, H. -A. Cortical astrogliosis and increased perivascular aquaporin-4 in idiopathic intracranial hypertension. Brain Res. , (2016).
- Pullen, R. G., DePasquale, M., Cserr, H. F. Bulk flow of cerebrospinal fluid into brain in response to acute hyperosmolality. Am. J. Physiol. 253, F538-F545 (1987).
- Ichimura, T., Fraser, P. A., Cserr, H. F. Distribution of extracellular tracers in perivascular spaces of the rat brain. Brain Res. 545, 103-113 (1991).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J. Clin. Invest. 123, 1299-1309 (2013).
- Ratner, V., et al. Optimal-mass-transfer-based estimation of glymphatic transport in living brain. Proc. SPIE--the Int. Soc. Opt. Eng. 9413, (2015).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. J. Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).
- Nouri, S., Sharif, M. R., Sahba, S. The effect of ferric chloride on superficial bleeding. Trauma Mon. 20, e18042 (2015).
