Summary
In situ bioindications möjliggör bestämning av lämpligheten av en miljö för hotad mussla arter. Vi beskriver två metoder baserade på sötvatten pärla musslorna i burar juvenil exponering för Oligotrofa floden livsmiljöer. Båda metoderna genomförs i varianter för öppet vatten och hyporheic vattenmiljöer.
Abstract
Kunskap om habitat lämplighet för sötvatten musslor är ett viktigt steg i bevarandet av denna utrotningshotade arter grupp. Vi beskriver ett protokoll för att utföra i situ juvenil exponering tester inom Oligotrofa floden avrinningsområden över en månad och tre månaders perioder. Två metoder (i båda ändringar) presenteras för att utvärdera andelen juvenil tillväxt och överlevnad. De metoder och ändringar variera i värde för den ort bioindication och varje har dess fördelar samt begränsningar. Metoden sandstranden bur fungerar med ett stort antal individer, men endast några av individerna mäts och resultaten utvärderas i bulk. I metoden mesh bur individerna hålls och mäts separat, men ett lågt enskilda nummer utvärderas. Öppet vatten exponering ändringen är relativt lätt att tillämpa. Det visar den juvenila tillväxten potential av platser och kan också vara effektiva för vatten toxicitetstester. Inom-säng exponering ändringen behöver en hög arbetsbelastning men är närmare villkoren i en juvenil natur och det är bättre för rapportering av verkliga lämpligheten av localities. Däremot, behövs mer replikeringar i denna ändring på grund av dess hög-hyporheic miljö variabilitet.
Introduction
Exponeringen av experimentella organismer i situ med efterföljande utvärdering av deras tillstånd är ett möjligt sätt att få information om miljökvalitet och (speciellt) plats lämplighet för en art. Inom djur är en sådan bioindication tillämplig främst för små ryggradslösa djur som klarar leva i ett begränsat avgränsat utrymme. Unga stadier av musslor (Bivalvia) är en sådan lämplig organism grupp1.
Musslor i familjen målarmusslor är en mycket viktig komponent i akvatiska ekosystem2. Emellertid, dessa arter är ofta akut hotad, särskilt i bäckar och åar. Några av dem kännetecknas som 'paraply art' vars bevarande är nära relaterad till bevarande av hela strömmen biotopen och som kräver en omfattande strategi3. Dessa djur har en livscykel som är associerad med många miljö komponenter, från vatten kemi4,5 till förändringar i bestånden av fisk som tjänar som mussla larver värdar6. Eftersom musslan ungfisk representerar ofta en kritisk fas av mussla livscykel, är plats lämplighet för deras utveckling i detta skede avgörande för en framgångsrik arter befolkningsutvecklingen i en tätort.
Flodpärlmusslan (FWPM, Margaritifera margaritifera; Unionida, Bivalvia) är en akut hotad tvåskaliga förekommande i Oligotrofa Europeiska strömmar. Deras antal har sjunkit drastiskt under 20- talet över området förekomst. Det verkar som att den nuvarande nedgången i arter reproduktion i majoriteten av de centrala europeiska befolkningarna främst orsakas av mycket låg till noll överlevnad av ungfisk under de första åren av sitt liv. Det antas att juvenil FWPMs leva i många år i den grunda hyporheic zon7, där villkoren och deras variabilitet fortfarande inte är väl beskrivna. Dessutom tills deras andra levnadsåret har Ungfåglarna bara en dimension av upp till ca 1 mm, så de är mycket svåra att hitta i stora mängder sediment under naturliga förhållanden8. Experiment med fångenskap ungfisk är därför nödvändiga för att studera deras ekologi.
Inom tjeckiska handlingsplanen för Pearl flodpärlmusslan9, finns det tusentals ungfisk stigande varje år från ett delvis naturliga avelsprogram. Det finns dock en fråga som localities och livsmiljöer är lämpliga för framgångsrika befolkningen stöd genom dessa ungfisk eller för eventuell arter återinförande. In situ bioindications presenterar ett sätt att hitta svaret.
Trots att inkonsekventa överlevnaden av juvenil musslor i exponering burar observerades i några tidigare arbeten som ifrågasatte lämpligheten av juvenil musslor som bioindikatorer10, flera färska studier har bekräftat den tillämpligheten av juvenil exponering metoder för vattenkvalitet testning11,12,13. Det har dessutom visat att flera faktorer måste beaktas när man tolkar resultaten av dessa särskilda studier, såsom lager ursprung14 och de ihållande effekterna av larval villkor15.
Frågan är hur man installerar experimentella ungfisk i testade localities och hur man mest effektivt utvärdera deras tillstånd. Den första strikta tillämpningen av i situ exponering metoder med juvenil FWPMs publicerades av Buddensiek16. Juvenil FWPM individer hölls i ark burar, exponeras i det fri strömmande vattnet strömmar, och deras överlevnad och tillväxt kvantifierades efter flera veckors exponering. Metoden utvecklades ursprungligen som en semi konstgjorda avel metod, men författaren framhöll också dess tillämplighet för bedömning av krav på livsmiljö och vattenkvalitet. Även om FWPM juvenil överlevnad är naturligtvis mycket låg på en skala från månader/år och endast ett mycket litet antal djur kommer överleva, överlevnaden kan vara en bra markör för miljöpåverkan på en skala från flera veckor16. Över år av forskning utvecklades exponering metoder vidare håll experimentella juvenil mussla InStream-livsmiljöer och att utvärdera deras tillväxt och överlevnad priser; Dessa inkluderar sandiga fälten17, mussla silor utifrån en uppvällning princip18, och olika andra exponering burar (sammanfattas av tuggummi och kollegor)11. Eftersom ungdomar förekommer naturligt i grunt hyporheic zon7, är tillämpningen av experimentella enheter inom stream botten mycket önskvärt.
I vår artikel, vi beskriver användningen av två exponering enheter för FWPMs: jag) modified Buddensiek ark burar (”mesh burar”) gör det möjligt för bioindication testning under hyporheal förhållanden. och ii) Hruška sandiga lådor (”sandiga burar”). Protokollet beskrivs tillämpningen av båda metoderna i öppet vatten och hyporheic förhållanden (dvsfyra varianter av exponeringen beskrivs). Metoderna ändrades gradvis och expanderat under mer än 15 år av ansökan inom den tjeckiska handlingsplanen för Pearl flodpärlmusslan9 och verifierade av en uppsättning experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mesh bur
Obs: Se figur 1.
- Förbered materialet
- Förbered materialet för i-laboratoriet delen av experimentet: ~ 1-2 L floden vatten per mesh bur, mesh burar (1 plast huvuddel, 2 plast omslag, 2 ark av särskilda tekniska siktar med 340 µm porer, 4 bultar och 4 muttrar per bur), tång , Pasteur-pipetter, en digitalkamera, en sil, käppar, en Trinokulärt dissekera zoom stereo Mikroskop, ett kalibrering rutnät (Mikroskop utrustning), 5 petriskålar av 50 mm i diameter, bägare, 2 plast rätter (~ 25 x 15 cm x 3 - 5 cm), och en plastlåda.
- För att utföra hyporheal installationen, förbereda en gummislang och en 100-µm-pore mesh och en sprutande flaska. För byggandet av enheten, se kompletterande fil 1: S.1. Mesh burar konstruktion.
- Montera botten och central del av mesh burar. Montera delen av buren som innehar individerna. Infoga en plastkåpan först, sedan ett ark av plast sikten, och slutligen viktigaste kropp ovanpå. Använd fyra bultar för att säkra den.
- Förbereda biologiskt material
- Mesh buren in plast skålen som innehåller flodvatten. Säkerställa att kamrarna är halvfullt. Ta FWPM ungfisk (se kompletterande fil 1: S.6. Biologiskt material) ur rutan värmeisolerad och sätta dem i petriskål.
Anmärkning: Se till att plötsliga temperaturförändringar inte överskrider ~ 2 ° C. - Använda en sprutande flaska och SIL, sålla bland ungfisk att rensa detritus.
- Mesh buren in plast skålen som innehåller flodvatten. Säkerställa att kamrarna är halvfullt. Ta FWPM ungfisk (se kompletterande fil 1: S.6. Biologiskt material) ur rutan värmeisolerad och sätta dem i petriskål.
- Ställ in mikroskopet och kamera. Utför en kalibrering av instrument (se kompletterande File1: S. 5. ” Mikroskop och teknik). Placera en petriskål som innehåller lite vatten under mikroskopet.
- Sätta ungfisk i burar (experimental laborationer)
- Använd en Pasteur-pipett för att ta bort en person från en petriskål och försiktigt placera den i petriskål under mikroskopet.
- Kontrollera individens fitness genom att titta i okularet (~ 40 X förstoring).
Obs: ”Bra” fitness innebär att enskilt flyttar, roterar från sida till sida, skjuter foten ur den skal, etc. bort döda eller låg fitness individer med en Pasteur pipett och placera dem i en separat petriskål (FWPM unga exemplar med en öppnat Shell, ingen rörelse, foten är inte drog ut, en fragmenterad skal, ungfisk som flyter okontrollerat i vattnet, en synlig nedbrytning av skalet, partiell urkalkning). - Ta två fotografier av en FWPM enskilda visar god kondition med hjälp av en konstant förstoring av ~ 80 X. Se kompletterande fil 1: S.5. Mikroskop och teknik. Spara foton.
Obs: Uppmätning av dess längd, barnsliga måste läggas på längden (lateral vy). Det huvudsakliga målet är att ta en högkvalitativ bild av maximal shell längd tillräckligt bra för att aktivera en bild analys efteråt. - Infoga barnsliga i lämpliga kammaren i buren så fort bilderna är tagna. Spela in antalet bilder och kammaren.
- Upprepa detta med varje individ för alla begagnade kamrarna i mesh buren.
Obs: se kompletterande fil 1: S.1. Mesh burar konstruktion. - När alla begagnade kamrarna har pärlan musslor, sätta plast sikten på buren, och sedan försiktigt sätta plastskyddet på och säkra alla delar tillsammans med nötterna.
- Vid en installation i en hyporheic zon, passerar en av slangändarna genom en av avdelningarna och fixa det i detta läge, och sedan ta anti-igensättning mesh och binda den på nederdelen (se kompletterande fil 1: S.1. Mesh burar konstruktion).
- Store ungfisk
- Sätta buren i rutan plast med floden bevattnar, så att Ungfåglarna är helt nedsänkt och hålla den i thermobox. Innan installationen, låt ungfisk anpassas i situ floden vattentemperaturen på installationsplatsen (successiv kylning, max. 5 ° C i 24 h).
- Installera mesh burar
- Förbereda fältet material inklusive mesh burar med ungfisk, stål spikar, bultar och metall nötter, käppar, fältet temperatur dataloggrar (se Tabell för material - och kompletterande fil 1: S.4.2. Vatten mätning), en sträng, en kamera, protokollet fältet, en hammare, och en spade.
- Transportera FWPM Ungfåglarna till webbplatsen i ett fält thermobox (isolerad box), att hålla en stabil vattentemperatur med variationer < ~ 2 ° C. Sätta thermobox med mesh burar i floden på webbplatsen att låta ungfisk anpassa sig till lokala miljöförhållanden (pH, konduktivitet, etc.).
- Installera mesh buren.
- Ta bort mesh buren från det fältet thermobox. Förse den med två stål spikar och fäst den fältet datalogger. Förankra buren i en livsmiljö med villkor som är typiska för FWPMs i studieområdet (t.ex., i utkanten av centrala ström flödet, inte i direkt vattenflödet, inte i stillastående vatten, inte i direkt solljus).
- För öppet vatten med ett par stål spikar, fixa buren längst floden; lägga den på sin sida och nivå med floden botten, nedströms i 45° vinkel till floden flödet, mot mitten av floden. Den nedre horisontella kanten bör vara ca 10-15 cm ovanför floden bottenyta. Upprätthålla ett minsta avstånd av 2 m mellan varje bur på en ort (se kompletterande fil 1: S.4. Burar underhåll).
- För den hyporheic zonen, gräva burar i floden botten i en vinkelrät liggande position, vinkelrätt mot strömmen av vatten, så att den övre horisontella kanten av buren är parallellt med floden bottenyta och avdelningarna är belägna vid hyporheic djup som bör testas. Ta ut den övre änden av gummi slangen ovan bottenyta för möjligheten att vatten provtagning under experimentet (se kompletterande fil 1: S.4.2. Vatten mätning).
Obs: Det rekommenderas att utföra regelbundna kontroller och underhåll på burar (se kompletterande fil 1: S. 4. Burar underhåll).
- Ta bort mesh buren från det fältet thermobox. Förse den med två stål spikar och fäst den fältet datalogger. Förankra buren i en livsmiljö med villkor som är typiska för FWPMs i studieområdet (t.ex., i utkanten av centrala ström flödet, inte i direkt vattenflödet, inte i stillastående vatten, inte i direkt solljus).
- Avinstallera burar och transportmedel ungfisk efter exponeringen. För detta dra burarna ur vattnet, rensa dem fina sediment samt per drev material och sätta dem i det fältet thermobox fylld med flodvatten. Transport burar omedelbart till laboratoriet och starta dödlighet och tillväxt takt utvärderingen.
Obs: Se kompletterande fil 1: S.3. Exponeringens varaktighet. Vid en temperaturskillnad på mer än 5 ° C mellan burarna och laboratoriemiljö är det först nödvändigt att låta temperaturen utjämna. - Utvärdera experimentet genom kontroll av varje juvenil liv/lämplighet (se steg 1.5.2 och 1.5.3) och ta 2 bilder av varje levande ungdomsbrottslighet i en petriskål med ~ 80 X konstant förstoring. Spela in fitness och numren på de bilder och chambers.
- Slutföra experimentet (gemensamt för alla metoder)
- Utför mätningar i bild analys programvara. Använda bild analys programvara för kroppen storleksbestämning av varje utvärderade juvenile på båda ingående bilderna (steg 1.5.3) och output bilderna (steg 1,9). Använd den maximala totala shell längden in i både fotografier som kroppen storleksvärden i både ingång och utgång.
- Infoga de uppmätta värdena i tabell processorn och beräkna tillväxten ökningsvärdet (%) för varje fortleva juvenil.
- Uppskatta överlevnaden (%) per mesh bur använda förhållandet mellan antalet överlevande individer till alla experimentella individer i mesh buren.
Obs: Efter experimentet, återvända överlevandearna till avelsprogram
(se kompletterande fil 1: S.6. Biologiskt material).
2. Sandy bur
Obs: Se figur 2.
- Förbered materialet
- Förbered materialet för i-laboratoriet delen av experimentet: Pasteur-pipetter, 25 L av flodvatten, en sil, 2 petriskålar (diameter ~8.5 cm), en plastlåda, såll (mesh storlek 1 och 2 mm), en stor plastlåda (25 L), en sandig bur (se kompletterande fil 1 : S.2. Sandy burar konstruktion), en digitalkamera, en Trinokulärt dissekera zoom stereo Mikroskop, ett kalibrering rutnät (Mikroskop utrustning), sorterade floden sand från studieområdet (se steg 2.1.3), och protokollet. Se tabell över material och kompletterande fil 1: S. 2. Sandy burar konstruktion.
- Förbereda material för isolering processen: runda behållare (1 för varje bur plus 1 extra), 2 petriskålar (diameter ~ 14 cm), en Pasteur-pipett, förstoringsglas och 1 L av flodvatten.
- Sålla river sanden genom en 2 mm sikt och sedan genom en 1 mm sikt få en kornstorlek på 1-2 mm. torra sanden och spara den i en torr form tills krävs.
- Ta ungfisk (se kompletterande fil 1: S.6. Biologiskt material) ur thermobox och sätta dem i petriskål. Använda en sprutande flaska och SIL, sålla bland ungfisk att rensa detritus.
- Ställ in mikroskopet och kameran (se kompletterande fil 1: S.5. ” Mikroskop och teknik).
- Sätta ungfisk i burar (experimental laborationer)
- Placera sandstranden buren i rutan plast. Scatter-sorterad sand (se steg 2.1.3) upp till en tredjedel av höjden av sandstranden buren. Häll vatten i rutan. Kontrollera att sand yta är ca 10 mm under vattennivån. Infoga sandstranden buren i rutan 25 L river vatten och Utsätt det för samma temperatur som de barnsliga FWPMs (se kompletterande fil 1: S.6.2. Lagring av det biologiska materialet) för 12 h. Undvik all exponering av sand för solljus.
- Ta petriskål med förberedda FWPM ungfisk.
- Kontrollera individens fitness genom att titta i okularet (se steg 1.5.2).
- Utföra den fotografiska dokumentationen enligt följande. Ta en bild av alla individer upptäcktes (se steg 1.5.3) och välja 10 av de största individerna. Alternativt, ta bilder av alla ungfisk tillsammans med låg förstoring (~ 40 X) för en bulk-utvärdering och välja de 10 största individerna. Spara alla foton och spela in deras nummer.
- Använder en sprutande flaska, flytta FWPM ungfisk i beredda sandstranden buren.
- Store ungfisk
- Placera buren in i stora plast låda med flodvatten så att buren är helt nedsänkt och hålla den i thermobox. Låt ungfisk anpassas i situ floden vattentemperaturen (successiv kylning, max. 5 ° C under 24 h) före installationen.
- Installera sandstranden burar
- Förbereda materialet för fältinstallation: sandiga burar, en ~ 25-L fältet thermobox, en platt sten (minimal vikt 1 kg), ett nät (mesh storlek 10 x 10 mm), en sprutande flaska, fältet temperatur dataloggrar (se Tabell för material - och kompletterande fil 1: S.4.2. vatten mätning), en spade och fältet protocol.
- Transport burar med Ungfåglarna till webbplatsen i det fältet thermobox, att hålla en stabil vattentemperatur (~ 2 ° C förändring). Sätta i fältet thermobox med sandstranden burar i floden på platsen att låta FWPM ungfisk anpassa sig till lokala miljöförhållanden (pH, konduktivitet, etc.).
- Installera de sandiga burarna i livsmiljöer med villkor som är typiska för FWPMs (t.ex., i utkanten av centrala ström flödet i en meander, inte i direkt vattenflödet, inte i stillastående vatten, inte i direkt solljus).
- För öppet vatten, fäst de sandiga burarna till en platt sten som använder ett nät och placera det längst floden. Se till att den största sidan av buren bildar en vinkel på 45° med flödet.
- För Hyporheal, gräva burar i floden botten vinkelrätt mot vattenflödet så att buren locket är i nivå med floden bottenyta.
Obs: Det rekommenderas att utföra regelbundna kontroller och underhåll på burar (se kompletterande fil 1: S. 4. 1. webbplatsen kontroller).
- Avinstallera burar och transport ungfisk efter exponering
Obs: se kompletterande fil 1: S.3. Exponeringens varaktighet.- Dra burarna ur vattnet, rensa dem drev material och sätta dem i det fältet thermobox fylld med flodvatten.
- Transport burar till laboratoriet och starta dödlighet och tillväxt takt utvärderingen.
Obs: Vid en temperaturskillnad på mer än 5 ° C mellan burarna och laboratoriemiljö, det är nödvändigt att låta temperaturerna som utjämna.
- Separat FWPM yngel från sand
- Förbereda en runda behållare med ett vattendjup på 50 mm (för varje bur separat) och en extra runda behållare. Över sanden från buren till den runda behållaren. Använd en virvlande rörelse för att tvätta ur lättare partiklarna i en extra behållare.
- Prova innehållet från denna behållare gradvis och Sök för ungfisk steg för steg med hjälp av en Pasteur-pipett och ett förstoringsglas. Lägg ungfisk i petriskål med hjälp av Pasteur-pipett. Upprepa detta steg tills den sista barnsliga har hittats och sedan ytterligare 10 x efter den första negativa iakttagelsen. Efter varje tvätt steg lägga till ren flodvatten i den ursprungliga behållaren med sand.
Obs: Speciellt efter den första tvättningen ute, ordentligt undersöka innehållet och rengör av ballast som finfördelat sediment och andra slam.
- Utvärdera experimentet
- Kontrollera hälsotillståndet för varje juvenil (se steg 2.4.3 och 1.5.2) och räkna antalet överlevande.
- Ta en bild (se steg 2.4.4.) av varje individ separat, även om detta innebär finns ingen tydlig identitet för varje individ. Alternativt ta bulk bilder och välja en delmängd av de 10 bäst odlade individerna från de slutliga resultaten.
Obs: Båda möjligheter har en liknande rapportering värde. Möjlighet 1 har en begränsning av en högre arbetsbelastning men också fördelen med den högsta foto förstoringen och därmed också större noggrannhet.
- Slutföra experimentet
- Utför mätningar i bild analys programvara. Slutföra experimentet som gjort i mesh burar (se steg 1.10) med följande undantag: utvärderar inte tillväxttakten (%) av varje juvenil men utvärdera koncernen som helhet i sandiga bur experimentet.
Obs: Efter experimentet, överlevandearna ska returneras till programmet avel
(se kompletterande fil S.6.1. Seboksamling av biologiska material).
- Utför mätningar i bild analys programvara. Slutföra experimentet som gjort i mesh burar (se steg 1.10) med följande undantag: utvärderar inte tillväxttakten (%) av varje juvenil men utvärdera koncernen som helhet i sandiga bur experimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fyra bioindication metoder (öppet vatten sandstranden burar, inom-säng sandstranden burar, öppna vatten mesh burar och inom-säng mesh burar) tillämpades för att undersöka miljön skick lämplighet för FWPMs i övre Vltava avrinningsområdet (Böhmerwald, Tjeckien Republiken). Denna flod representerar en FWPM kvarstående ort inom centrala Europa19. Här presenterar vi ett speciellt utvalda uppsättning resultat som illustrerar de viktigaste aspekterna av de fyra metoderna. Ytterligare detaljer beskrivs i en omfattande studie av Černá et al. 13.
Flodområdena studerades på två nivåer:
(I) en längsgående floden profil företräddes av main-stream localities (webbplatser A - E) och bifloder av olika föroreningar faser (webbplatser R och V). Localitiesna testades både sandstranden burar och mesh burar installeras i rinnande vatten. Dessutom en grus hyporheic zon testades av inom-säng sandy burar i localitiesna B, C och D.
(II) en hyporheic miljö testades på valda orten C. Lämpligheten av olika substrat (sand, grus, stenar) testades av inom-säng mesh burar.
Den tillväxt och överlevnad på > 1-åriga ungdomar (se kompletterande fil 1: S.6. Biologiskt material) testades. Experimentet genomfördes till fullo i sommaren 2014 och upprepades i mindre utsträckning på vissa orter i sommaren 2015. Inom nivå (I), 2-6 sandy burar med ett minimum av 100 ungfisk och 6 (2014) eller 4 (2015) mesh burar med 6 ungfisk tillämpades på varje ort som testas på lämpligt sätt. Inom nivå (II) installerades 7 mesh burar med 6 ungfisk i varje testade miljö. Exponeringstiden var en månad för mesh burar och tre månader för sandstranden burar.
Den statistiska analysen genomfördes i R, version 3.1.020. Kruskal-Wallis, Kruskal-Nemenyi och Wilcoxon-Mann-Whitney test användes. För data med en normalfördelning genomfördes linjär eller kvadratisk regression.
Localitiesna kan särskiljas baserat på tillväxttakten i öppet vatten mesh burar trots hög inom-bur variabiliteten, även i olika tillväxt-gynnsamma perioder (figur 3). Mer tillväxt-gynnsam exponering under 2015 (tillväxt takt 19,3-41,8%) upptäcktes en signifikant trend i den longitudinella profilen där tillväxttakten ökat nedströms (Kruskal-Wallis test, p < 0,001). Överlevnaden var huvudsakligen, ekvivalentt hög i båda säsongerna (från 83%) (Figur 4A).
Däremot, öppet vatten sandstranden burarna visade en annan trend mellan main-stream localitiesna 2014: tillväxttakten ökat nedströms från tätort en (52%) genom orten mellersta C (153%) och därefter minskade igen förrän tätort E (46%) (en kvadratisk regression av absolut tillväxt värden: r2adj = 0,77, F2,13 = 25.66, d.f. = 16, p < 0,001). Denna trend bekräftades också i 2015 när den största tillväxten registrerades på orten mellersta C igen. Också, de absolut tillväxt värdena skilde sig inte mycket mellan 2014 och 2015. Däremot, varierade överlevnaden mellan åren, är mycket högre under 2015 (från 48% till 72%) än i 2014 (cirka 25%) (Figur 4B).
En effekt av två olika exponering metoder syns också tydligt i det förorenade skattskyldigt (tätort V). Sandstranden burarna utsatt här under tre månader visade 0% överlevnad, medan en 83% överlevnad med viss tillväxt spelades av öppet vatten mesh burar exponering här under 30 dagar.
Resultat från inom-sängen sandstranden burar illustrera olika förhållanden i den hyporheic miljön i jämförelse med öppet vatten i relevanta localitiesna. Tillväxttakten var alltid lägre i hyporheal webbplatser än i öppet vatten, och överlevnaden var mycket mer variabel (från nästan 50% till 0%, figur 4B).
En studie av hyporheic småbiotoper använder inom-säng mesh burarna visade en signifikant effekt av grundmaterial sammansättning på juvenil överlevnad. De bästa förutsättningarna spelades från syre-mättade stenig botten (en överlevnad nära 100%) medan värst (en < 40% överlevnad rate) indikerades i dåligt syresatt sand där en mycket hög variabilitet i överlevande upptäcktes också. Hyporheic vatten syresättning, som mättes upprepade gånger under experimentet, förklarar denna trend (figur 5).
Figur 1. Bioindication mesh bur med individuella kammare. Se kompletterande fil 1 för ytterligare information. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Bioindication sandiga bur. Se kompletterande fil 1 för ytterligare information. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Variabilitet i juvenil tillväxttakten inspelad av öppet vatten mesh burar i localitiesna B och E under två säsonger. Medel och standardavvikelse beskrivs för varje maska bur. Värdena baseras på mätning av 6 ungfisk (eller 4-5 ungfisk om dödligheten Betygsätt > 0%) i varje maska bur.
Figur 4. Exempel på resultat från ett fält bioindication experimentera med mesh och sandy burar. (A) denna panel visar exempel på resultat från ett bioindication fältförsök med mesh burar. Sammanlagt 6 localities (B, C, D, E, R och V) inom Vltava floden avrinningsområde testades vid 2 olika tillfällen (under 2014 och 2015). Exponeringstiden var 30 dagar under sommarsäsongen. Localitiesna B - E representerar (i ordning) en longitudinell profil av en cirka 20-km sträcka av floden main-stream. Localitiesna R och V representerar profiler av 2 bifloder. Huvudstäderna Markera på samma ort både i panelen (A) och (B). Alla localities testades med öppet vatten mesh burar. Dessutom tätort C testades också använda inom-säng mesh burar installeras i 3 olika typer av flodbädden (Cs = sand, Cg = grus, Cst = stenar) under 2014. Burarna installerades i 4-7 replikationer på varje plats. 6 flodpärlmussla ungfisk av 1 + år gamla användes per mesh bur. Den genomsnittliga tillväxttakten är markerade för de 3 största individerna (3 MAX) från varje testade mesh bur (kolumner, vänster axel) och den genomsnittliga överlevnaden per mesh bur (blå punkter, höger axel). (B), exemplet panel visar resultat från ett fält bioindication experimentera med sandstranden burar. En totalt 7 localities (A, B, C, D, E, R, och V) inom Vltava floden avrinningsområde testades över vid 2 olika tillfällen (under 2014 och 2015). Exponeringstiden var 3 månader under sommarsäsongen. Platser A - E representerar (i ordning) en longitudinell profil av en ca 30 km lång sträcka av floden main-stream. Platser R och V representerar profiler av 2 bifloder. Huvudstäderna Markera på samma ort både i detta och i den föregående panelen. Alla localities testades med öppet vatten sandstranden burar. Dessutom localities B, C och D testades också med inom-säng sandstranden burar installeras i ordförandeklubban floden säng substrat (Bg, Cg och GD) under 2014. Burarna installerades i 2-4 replikationer på varje plats. Minst 100 flodpärlmussla ungfisk var närvarande i varje sandstranden bur. Den genomsnittliga tillväxttakten för de 10 största individerna (10 MAX) från varje testade sandstranden bur (kolumner, vänster axel) och den genomsnittliga överlevnaden per sandstranden bur (blå punkter, höger axel) markeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Syremättnad. I denna panel visas förhållandet mellan minimala värdena för syremättnad över 30 dagar av mesh burar exponering och andelen överlevande per bur i inom-säng mesh burar exponeras i olika säng småbiotoper i 2014. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 2014 | 2015 | |||
| tätort | 3-månaders exponering av sandstranden burar | 1 månaders exponering av mesh burar | 3-månaders exponering av sandstranden burar | 1 månaders exponering av mesh burar |
| A | 13,9 | - | - | - |
| B | 14,4 | 13,4 | 13,9 | 17,5 |
| C | 15 | 13,8 | 14,4 | 18,3 |
| D | 15 | 13,8 | 14,3 | 18,3 |
| E | 15,5 | 14 | - | 18,7 |
| R | 13,5 | 12,8 | - | - |
| V | 14 | 13.2 | - | - |
Tabell 1. Genomsnittliga ytvatten temperatur (° C) vid localitiesna under exponering under 2014 och 2015.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Exponeringstid:
Även månads utsatta mesh burar Visa en synlig tillväxt som återspeglar skillnader mellan orterna (figur 3), så de är mycket användbara för snabb och enkel detektion av en tätort karakterisering. Relevansen av resultaten beror dock på kortsiktiga tillståndet av villkorar, som kan svänga. Särskilt kan korta regn händelser spela en roll. Däremot kan oförutsägbara episodiska föroreningar inte alltid registreras. I ort V (figur 4A) upptäckt kemi vattenanalys en kort våg av stark ammonium ökning13. Detta var förmodligen ansvarig för dödligheten i tremånaders exponerade sandstranden burar men påverkade inte 30-dagars exponerade mesh burar.
Temperaturväxlingar kan också påverka kortsiktiga exponering resultat. Månads medeltemperatur under mesh bur exponering skiljer sig mellan åren (tabell 1). Tillväxten varierar också där högre temperaturer åtföljdes av högre tillväxt (Kruskal-Wallis test p < 0,001). Däremot, den genomsnittliga vattentemperaturen på samma orter under tre månaders sandstranden bur exponeringen var mycket lika i båda åren (tabell 1) och tillväxttakten skilde sig inte signifikant (figur 4B).
Fördelar och brister i de beskrivna metoderna:
En öppet vatten exponering är relativt enkelt att utföra men är av begränsat värde för habitat bioindication. Metoden för öppet vatten mesh burar är relativt gammal16 och har använts flera gånger med mindre modifieringar10,11,12,13,21,22 , 23. Trots dessa burar är inte begränsade av syre, vars brist är troligen ansvarig för många unga dödsoffer i hyporheic villkor. Således, öppet vatten mesh burar kan visa god utveckling även i localities med ökad mortalitet och en vikande tillväxttakt i öppet vatten sandstranden burar (tätort E) eller en 100% dödlighet i inom-säng sandstranden burar, som på ort D 2014 (figur 4B). Tydligen, öppet vatten mesh burarna visar tätort tillväxt potential, men detta kanske inte är realistisk eftersom den är beroende av den verkliga tillgången på hyporheic småbiotoper inom en tätort. Eftersom öppet vatten mesh burar har hög överlevnad (figur 4A), ända upp till en 100% överlevnad kurs13förmåga, kan de fungera väl för bioindication av kronisk toxicitet (eller akut toxicitet om det förväntas vid en given tidpunkt). Dessutom kan de en nyttig mat källa närvaro testning i viss utsträckning.
Som en ny och ovanlig metod simulera öppet vatten sandstranden burarna bättre hyporheic habitat villkor. Rörlighet för ungfisk mellan sandkornen är möjligt i denna apparat, som hjälper till att minska biofilm tillväxten på juvenil skalet. En hyporheic syrebrist kan orsakas av aktiviteten av mikrober kolonisera sand kornen; Denna effekt kan också delvis uppstå i burar placeras ovanför en flodens botten. Ändå på grund av nödvändiga periodisk rengöring av igensättning drivande material från en bur, fina sediment tas också bort och således villkoren ändras jämfört med den naturliga hyporheic livsmiljön. Så, tillväxttakten kan också betraktas som tätort tillväxt potential i öppet vatten sandstranden burar. Detta är dock närmare verklig tätort lämplighet än i öppet vatten mesh burar. Därför, de längsgående tillväxt Tan lutningarna inspelad av sandstranden burar (figur 4B) också verkar vara mer sannolik och indikerar en mer lämplig floden sträcka. Dessutom i sandiga burar är möjligheten att ungfisk och ungbjörnar avel upp till könsmognad verifierade9, så sandig burar kan fungera som en säker metod för avel och biologisk övervakning samtidigt.
Sandy burar och mesh burar placeras i positionen inom-säng är närmast till de verkliga förhållandena i ett grunt hyporheal. Genom att låta en ung rörelse, erbjuda sandiga burar, i synnerhet dem båda en vertikal och horisontell gradient av flera centimeter i skala. Denna förmåga att flytta kan vara mycket viktig för att fly från tillfälliga syre-brist mikro-zoner. Denna möjlighet är frånvarande i inom-sängen mesh burar. Därför behövs ett relativt högt antal bioindication enheter, eftersom hyporheic är mycket variabel13,24 (figur 5) och förluster på grund av en olämplig plats är vanliga.
I sammanfattning motsvara de bioindication metoder som används i denna forskning antas juvenil naturliga förhållanden i följande ordning:
1. öppna vatten mesh burar,
2. öppna vatten sandstranden burar,
3. inom-säng mesh burar,
4. inom-säng sandstranden burar.
Arbetsbelastningen per enhet ökar i samma ordning. Dessutom erhålls det juvenila antal som krävs för en statistisk testning av resultaten ökningar inom-säng exponeringar alltför. Det verkar som inom-säng sandstranden burar representerar en dyrare men exakt bioindication metod. Denna nya metod behöver fler tester i framtiden och jämförelse med andra typer av hyporheic studier baserade på piezometer mätningar25,26. I synnerhet finns det ett behov av att studera graden av likhet med en direkt sond mäter fysikalisk-kemiska förhållandena i burar och hyporheic omgivningen.
Antalet individer som mäts i en bur:
Jämfört med mesh burar, är det inte möjligt att mäta tillväxt ökningen av specifika ungfisk i sandiga burar så det finns ingen information på som individ från den ingångarna som är som en i utdata. Det är nödvändigt att arbeta med ett genomsnittligt värde. Om räknas för alla individer, kan värdet vara mycket låg på grund av ett antal mycket långsamt växande exemplar; men ett par individer kan växa mycket snabbt (tillväxt byglar). En sådan ojämn tillväxt är typisk för musslor27. Tillväxt variationen bland ungfisk stiger med ökande exponeringstid och stora skillnader kan förekomma, särskilt i tillväxt-gynnsamma säsonger. Dessutom en lång exponering leder till större dödlighet i mesh burar (för en översikt se Lavictoire, Moorkens, Ramsey, Sinclair och Sweeting28), så att vi kan arbeta med ett betydligt lägre antal individer i slutet av experimentet jämfört med den ingång ungfisk set. Mätning endast flera bäst växande Ungfåglarna är en möjlig metod.
Upplevelsen av FWPM avel inom tjeckiska handlingsplanen för Pearl flodpärlmusslan9,29, samt resultat från experiment på havet musslor30,31, antyder att tillväxt-brist juvenil musslor har hög dödlighet, och det finns bara en försumbar chans att lever till förfall. Däremot tillväxt byglarna har en högre överlevnad och de är avgörande för en befolkning återhämtning. Parametern 10 tillväxt byglarna tar hänsyn till MAX (10 mest-snabbt växande individer) och kan öka informativa värdet av experimentet, även om hög dödlighet sker (figur 4B, säsongen 2014). Det bör noteras att den tillväxt uppskattning erhålls med denna metod inte kan vara ett falskt positivt. Det kan bara vara något underskattad eftersom många av de största ungfisk i slutet av experimentet skulle ha ökat lite mer i det här fallet. Arbetsbelastningen är också mindre om bara 10 individer utvärderas. Likaså en mätning av tre maximally växande individer (3 MAX) visat sig vara lämplig i mesh burar, att eliminera påverkan av långsamt växande, icke-perspektiv individer, som kunde bias den verkliga bilden av webbplats tillväxtpotential.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Michal Bílý och Ondřej P. Simon stöddes av bidrag från den tjeckiska universitet av Life Science [inre bevilja byrån av fakulteten miljövetenskap, CULS Prag (42110 1312 3175 (20164236))]. Stöd för Karel Douda kom från den tjeckiska vetenskapsstiftelsen (13-05872S). Uppgifter om bioindication och nuvarande förekomst av pärla musslorna samlades in under genomförandet av den tjeckiska handlingsplanen för Freshwater Pearl musslor förvaltas av byråns natur bevarande av Republiken Tjeckien, som finansieras av regeringen av den Tjeckien och finns på
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| biological material maintenance and care | |||
| Freshwater pearl mussel juveniles | any | NA | from a FWPM breeding programme |
| plastic boxes | any | NA | |
| thermobox | MERCI | 212,070,600,030 | There are many possibilities. This is one example only. |
| field thermobox (ca25 l) | any | NA | cold box (insulated box) commonly used for food transport |
| river water | any | NA | |
| Petri dishes | any | NA | |
| plastic Pasteur pipettes with balloon bulb (droppers) | any | NA | hole diameter 1 mm |
| hydrogen peroxide | any | NA | |
| plastic container (ca 50 l) for river water | any | NA | |
| plastic tea strainer | any | NA | commonly used in kitchen |
| mesh cages construction | |||
| main plastic bodies | any | NA | |
| plactic covers | any | NA | |
| special technical sieves 340 µm | Silk &Progress | UHELON 20 T | |
| special technical sieves 100 µm | Silk &Progress | UHELON 67 M | |
| rubber hose (diameter 5.5 mm) | any | NA | |
| steel bolts | any | NA | |
| steel nuts | any | NA | |
| spanner | any | NA | |
| steel spikes | any | NA | |
| pliers | any | NA | |
| beakers | any | NA | |
| plastic dishes (ca. 25x15x3-5cm) | any | NA | |
| squirt bottle | any | NA | |
| field protocols | any | NA | |
| stationery | any | NA | |
| plastic container | any | NA | |
| string | any | NA | |
| hammer | any | NA | |
| sandy cages construction and use | |||
| sieve 1 mm | any | NA | |
| sieve 2 mm | any | NA | |
| special technical sieves 340 µm | Silk &Progress | UHELON 20 T | |
| plastic boxes with tight-fitting lid | any | NA | |
| hot melt adhesive | any | NA | |
| plastic box (ca 250 x 150 x 100 cm) | |||
| big plastic box (ca 25 l) | any | NA | |
| flat stone | any | NA | |
| net | any | NA | |
| river sand | any | NA | |
| round containers | any | NA | |
| magnifying glasses | Carson | Carson CP 60 | There ar many possibilities. This is one example only |
| cages installation and maintenance | |||
| field temperature dataloggers | ONSET | UA-001-64 | http://www.onsetcomp.com/products/data-loggers/ua-001-64 |
| spade | any | NA | |
| toothbrush | any | NA | |
| experiment evaluation | |||
| trinocular dissecting zoom stereo microscope | Bresser optic | ICD 10x-160x | There are many possibilities. This is one example only. |
| digital camera/ electronic eyepiece | Bresser optic | MikroCamLab 5M | There are many possibilities. This is one example only. |
| Calibration gird | Am Scope | SKU: MR100 | There are many possibilities. This is one example only. |
| external power source with two movable light guides | Arsenal | K1309010150021 | There are many possibilities. This is one example only. |
| Image software | ImageJ software | There are many possibilities. This is one example only. | |
| table processor | MS excel | There are many possibilities. This is one example only. |
References
- Goldberg, E. D. The mussel watch-a first step in global marine monitoring. Marine Pollution Bulletin. 6 (7), 111-114 (1975).
- Vaughn, C. C. Ecosystem services provided by freshwater mussels. Hydrobiologia. , In Press (2017).
- Lopes-Lima, M., et al. Conservation status of freshwater mussels in Europe: state of the art and future challenges. Biological Reviews. 92 (1), 572-607 (2017).
- Strayer, D. L., Malcom, H. M. Causes of recruitment failure in freshwater mussel populations in southeastern New York. Ecological Applications. 22 (6), 1780-1790 (2012).
- Douda, K. Effects of nitrate nitrogen pollution on Central European unionid bivalves revealed by distributional data and acute toxicity testing. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 20 (2), 189-197 (2010).
- Modesto, V., et al. Fish and mussels: importance of fish for freshwater mussel conservation. Fish and Fisheries. , In Press (2017).
- Ecology and evolution of the freshwater mussels Unionoida. Bauer, G., Wächtler, K. 145, Ecological Studies. 1-394 (2001).
- Neves, R. J., Widlak, J. C. Habitat ecology of juvenile fresh-water mussels (Bivalvia, Unionidae) in a headwater stream in Virginia. American Malacological Bulletin. 5, 1-7 (1987).
- Švanyga, J., Simon, O. P., Mináriková, T., Spisar, O., Bílý, M. Záchranný program pro perlorodku říční v ČR (Action plan for the endangered freshwater pearl mussel in the Czech Republic). , NCA CR. Prague, Czech Republic. (2013).
- Schmidt, C., Vandré, R. Ten years of experience in the rearing of young freshwater pearl mussels (Margaritifera margaritifera). Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 20 (7), 735-747 (2010).
- Gum, B., Lange, M., Geist, J. A critical reflection on the success of rearing and culturing juvenile freshwater mussels with a focus on the endangered freshwater pearl mussel (Margaritifera margaritifera L.). Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 21 (7), 743-751 (2011).
- Denic, M., Taeubert, J. E., Lange, M., Thielen, F., Scheder, C., Gumpinger, C., Geist, J. Influence of stock origin and environmental conditions on the survival and growth of juvenile freshwater pearl mussels (Margaritifera margaritifera) in a cross-exposure experiment. Limnologica. 50, 67-74 (2015).
- Černá, M., Simon, O. P., Bílý, M., Douda, K., Dort, B., Galová, M., Volfová, M. Within-river variation in growth and survival of juvenile freshwater pearl mussels assessed by in situ exposure methods. Hydrobiologia. , In Press (2017).
- Denic, M., Taeubert, J. E. Trophic relationships between the larvae of two freshwater mussels and their fish hosts. Invertebrate Biology. 134 (2), 129-135 (2015).
- Douda, K. Host-dependent vitality of juvenile freshwater mussels: implications for breeding programs and host evaluation. Aquaculture. 445, 5-10 (2015).
- Buddensiek, V. The culture of juvenile freshwater pearl mussels Margaritifera margaritifera L. in cages: a contribution to conservation programmes and the knowledge of habitat requirements. Biological Conservation. 74 (1), 33-40 (1995).
- Hruška, J. Experience of semi-natural breeding program of freshwater pearl mussel in the Czech Republic. Die Flussperlmuschel in Europa: Bestandssituation und Schutzmaßnahmen. , Albert-Ludwigs Universität: Freiburg. Kongressband. WWA Hof 69-75 (2001).
- Barnhart, M. C. Buckets of muckets: a compact system for rearing juvenile freshwater mussels. Aquaculture. 254 (1), 227-233 (2006).
- Simon, O. P., Vaníčková, I., Bílý, M., Douda, K., Patzenhauerová, H., Hruška, J., Peltánová, A. The status of freshwater pearl mussel in the Czech Republic: several successfully rejuvenated populations but the absence of natural reproduction. Limnologica. 50, 11-20 (2015).
- R Core Team. A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: https://www.r-project.org/ (2013).
- Hastie, L. C., Yang, M. R. Conservation of the freshwater pearl mussel I: captive breeding techniques. 2, Natural England. Peterborough, UK. Conserving Natura 2000 Rivers Conservation Techniques Series No. 2 (2003).
- Hruška, J. Nahrungsansprüche der Flußperlmuschel und deren halbnatürliche Aufzucht in der Tschechischen Republik. Heldia. 4 (6), 69-79 (1999).
- Scheder, C., Lerchegger, B., Jung, M., Csar, D., Gumpinger, C. Practical experience in the rearing of freshwater pearl mussels (Margaritifera margaritifera): advantages of a work-saving infection approach, survival, and growth of early life stages. Hydrobiologia. 735 (1), 203-212 (2014).
- Braun, A., Auerswald, K., Geist, J. Drivers and spatio-temporal extent of hyporheic patch variation: implications for sampling. PLoS ONE. 7 (7), e42046 (2012).
- Franken, R. J. M., Storey, R. G., Williams, D. D. Biological, chemical and physical characteristics of downwelling and upwelling zones in the hyporheic zone of a north-temperate stream. Hydrobiologia. , 183-195 (2001).
- Roley, S. S., Tank, J. L. Pore water physicochemical constraints on the endangered clubshell mussel (Pleurobema clava). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (12), 1712-1722 (2016).
- Larson, J. H., Eckert, N. L., Bartsch, M. R. Intrinsic variability in shell and soft tissue growth of the freshwater mussel Lampsilis siliquoidea. PLoS ONE. 9 (11), e112252 (2014).
- Lavictoire, L., Moorkens, E., Ramsey, A. D., Sinclair, W., Sweeting, R. A. Effects of substrate size and cleaning regime on growth and survival of captive-bred juvenile freshwater pearl mussels, Margaritifera (Linnaeus, 1758). Hydrobiologia. 766 (1), 89-102 (2015).
- Hruška, J. Experience of semi-natural breeding programme of freshwater pearl mussel in the Czech Republic. Die Flussperlmuschel in Europa: Bestandssituation und Schutzmassnahmen. , 69-75 (2000).
- Bayne, B. L. Physiological components of growth differences between individual oysters (Crassostrea gigas) and a comparison with Saccostrea commercialis. Physiological and Biochemical Zoology. 72 (6), 705-713 (1999).
- Tamayo, D., Azpeitia, K., Markaide, P., Navarro, E., Ibarrola, I. Food regime modulates physiological processes underlying size differentiation in juvenile intertidal mussels Mytilus galloprovincialis. Marine Biology. 163 (6), (2016).
