Summary
In situ bioindications consentono la determinazione dell'idoneità di un ambiente per le specie minacciate di estinzione cozza. Descriviamo due metodi basati sull'esposizione giovanile di mitili d'acqua dolce perle in gabbie all'habitat oligotrofici fiume. Entrambi i metodi sono implementati nelle varianti per open water e ambienti acquatici hyporheic.
Abstract
Conoscenza di idoneità habitat per mitili d'acqua dolce è un passo importante nella conservazione di questo gruppo di specie minacciate di estinzione. Descriviamo un protocollo per l'esecuzione in situ prove di esposizione giovanile all'interno di bacini imbriferi oligotrofe fiume sopra periodi di un mese e tre mesi. Per valutare il tasso di crescita e sopravvivenza giovanile sono disponibili due metodi (in entrambe le modifiche). I metodi e le modifiche differiscono nel valore per la località di bioindicazione e ognuno ha i suoi vantaggi così come le limitazioni. Il metodo di sabbia gabbia funziona con un grande insieme di individui, ma solo alcuni degli individui sono misurati e i risultati sono valutati alla rinfusa. Nel metodo gabbia della maglia, gli individui sono tenuti e misurati separatamente, ma un basso numero individuale viene valutato. La modifica di esposizione di acqua aperta è relativamente facile da applicare; Mostra la crescita giovanile potenziale di siti e può anche essere efficace per la prova di tossicità dell'acqua. La modifica di esposizione all'interno del letto ha bisogno di un carico di lavoro elevato, ma è più vicina alle condizioni di un ambiente naturale e giovanile ed è meglio per aver segnalato la reale idoneità di località. D'altra parte, sono necessari ulteriori repliche in questa modifica a causa della sua variabilità di ambiente alta-hyporheic.
Introduction
L'esposizione di organismi sperimentali in situ con la successiva valutazione del loro stato è uno dei modi per ottenere informazioni circa la qualità ambientale e (soprattutto) l'idoneità del sito per una specie. All'interno di animali, un tale bioindicazione è applicabile principalmente per piccoli invertebrati che sono in grado di vivere in uno spazio limitato limitato. Giovani fasi di bivalvi (Bivalvia) sono un tale organismo adatto gruppo1.
Bivalvi della famiglia Unionidae sono una componente molto importante di ecosistemi acquatici2. Tuttavia, queste specie sono spesso in pericolo critico, soprattutto nei torrenti e fiumi. Alcuni di loro sono caratterizzati come "specie ombrello" cui conservazione è strettamente correlata alla conservazione del biotopo intero flusso e che richiedono un completo approccio3. Questi animali hanno un ciclo di vita associato con molti componenti dell'ambiente, da acqua chimica4,5 a cambiamenti nelle popolazioni di pesci che servono come cozza larve ospita6. Perché i giovani cozza spesso rappresentano una fase critica del ciclo di vita della cozza, l'idoneità del sito per il loro sviluppo in questa fase è fondamentale per uno sviluppo della popolazione di successo specie in una località.
La cozza perla d'acqua dolce (FWPM, Margaritifera margaritifera; Unionida, Bivalvia) è un bivalvi in pericolo critico che si verificano nei flussi europei oligotrofici. I loro numeri sono scesi drasticamente durante il 20° secolo in tutta l'area di occorrenza. Sembra che l'attuale declino nella riproduzione di specie nella maggior parte delle popolazioni europee centrale è principalmente causato da molto basso a zero sopravvivenza del novellame durante i primi anni della loro vita. Si presume che giovanile FWPMs vivere per molti anni in hyporheic superficiale zona7, di cui le condizioni e la loro variabilità non sono ancora ben descritti. Inoltre, fino al loro secondo anno di vita, i giovani hanno solo una dimensione di fino a circa 1 mm, quindi sono molto difficili da trovare in grandi volumi di sedimenti sotto condizioni naturali8. Pertanto, gli esperimenti con i giovani in cattività sono necessari per lo studio della loro ecologia.
All'interno di Ceca piano d'azione per Freshwater Pearl cozza9, ci sono migliaia di giovani in aumento ogni anno da un programma di allevamento semi-naturale. Tuttavia, c'è una domanda di cui località e habitat sono adatti per supporto di successo della popolazione di questi giovani o reintroduzione di eventuali specie. In situ bioindications presentare un modo di trovare la risposta.
Nonostante il fatto che i tassi di sopravvivenza incoerente di cozze giovanile in gabbie di esposizione sono stati osservati in alcune opere precedenti che mettevano in discussione l'idoneità di cozze giovanile come bioindicatori10, parecchi studi recenti hanno confermato la applicabilità dei metodi di esposizione giovanile per la qualità dell'acqua test11,12,13. Inoltre, è stato dimostrato che diversi fattori devono essere considerati quando si interpretano i risultati di questi studi particolari, quali l' origine stock14 e gli effetti persistenti di condizioni larvale15.
Si pone la questione di come installare juveniles sperimentale in località testata e come valutare più efficacemente la loro condizione. La prima applicazione rigorosa di metodi di esposizione in situ con FWPMs giovanile è stata pubblicata da Buddensiek16. Gli individui FWPM giovanili sono stati tenuti in gabbie di foglio, esposti in acqua flusso libero dei flussi, e la sopravvivenza e la crescita sono stati quantificati dopo diverse settimane di esposizione. L'approccio è stato originariamente sviluppato come un metodo di allevamento semi-artificiale, ma l'autore ha anche evidenziato l'applicabilità per la valutazione delle esigenze di habitat e la qualità dell'acqua. Sebbene la sopravvivenza giovanile FWPM è naturalmente molto bassa su una scala di mesi/anni e solo un numero molto piccolo di animali sopravviveranno, il tasso di sopravvivenza può essere un buon indicatore dell'effetto ambientale su una scala di parecchie settimane16. In anni di ricerca, metodi di esposizione sono stati sviluppati a seguito degli habitat hold sperimentale giovanile cozza-streaming in diretta e per valutare i loro tassi di crescita e sopravvivenza; Questi includono sabbia caselle17, silos di cozza basato su un principio di upwelling18e vari altri esposizione gabbie (riassunte da gomma e colleghi)11. Perché i giovani si presentano naturalmente in hyporheic superficiale zona7, l'applicazione di dispositivi sperimentali all'interno del fondo di flusso è molto desiderabile.
Nel nostro articolo, descriviamo l'uso di due dispositivi di esposizione per FWPMs: io) per volta gabbie di foglio Buddensiek ("maglia gabbie") consentendo anche bioindicazione test in condizioni di hyporheal; e ii) Hruška sabbia scatole ("gabbie sabbiose"). Il protocollo descrive l'applicazione di entrambi i metodi in condizioni di acqua e hyporheic aperte (vale a dire, quattro varianti di esposizione sono descritti). I metodi sono stati gradualmente modificati e ampliati nel corso di più di 15 anni di applicazione nell'ambito del piano di azione Ceca per Freshwater Pearl cozza9 e verificati da una serie di esperimenti.
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Protocol
1. gabbia della maglia
Nota: Vedere la Figura 1.
- Preparare il materiale
- Preparare il materiale per la parte in laboratorio dell'esperimento: ~ 1-2 L di fiume acqua per gabbia di rete metallica, maglia gabbie (1 scocca in plastica, 2 coperchi, 2 fogli di tecniche speciali setacci con 340 µm pori, 4 viti e 4 dadi a gabbia), pinze , una chiave, un trinoculare dissezione microscopio stereo zoom, una griglia di calibrazione (Strumentazione del microscopio), 5 capsule di Petri di 50 mm di diametro, Becher, 2 piatti di plastica, pipette Pasteur, un colino, una fotocamera digitale (~ 25 cm x 15cm x 3 - 5 cm) e una scatola di plastica.
- Per eseguire l'installazione di hyporheal, preparare un tubo di gomma e una maglia di 100 µm-poro e una spruzzetta. Per la costruzione del dispositivo, vedere supplementari File 1: s. 1. Costruzione di gabbie della maglia.
- Assemblare il fondo e la parte centrale della maglia gabbie. Assemblate la parte della gabbia che tiene gli individui. Inserire una copertura di plastica in primo luogo, poi un foglio di plastica del setaccio, e infine sulla parte superiore del corpo principale. Usare quattro viti per fissarlo.
- Preparare materiale biologico
- Mettere la gabbia di rete metallica nel piatto di plastica contenente acqua di fiume. Assicurarsi che le camere siano mezzo piena. Prendere i giovani FWPM (vedere supplementari File 1: s. 6. Materiale biologico) fuori dalla scatola isolata termicamente e metterli nel piatto Petri.
Nota: Accertarsi che sbalzi di temperatura non superi ~ 2 ° C. - Utilizzando una spruzzetta e colino, vagliare i giovani per eliminare i detriti.
- Mettere la gabbia di rete metallica nel piatto di plastica contenente acqua di fiume. Assicurarsi che le camere siano mezzo piena. Prendere i giovani FWPM (vedere supplementari File 1: s. 6. Materiale biologico) fuori dalla scatola isolata termicamente e metterli nel piatto Petri.
- Impostare il microscopio e la fotocamera. Eseguire una calibrazione degli strumenti (vedere File1 supplementari: S. 5. Microscopio e phototechnics). Posto una piastra Petri contenente un po' acqua sotto il microscopio.
- Mettere i giovani in gabbie (attività di laboratorio sperimentale)
- Utilizzare una pipetta Pasteur per rimuovere un individuo da una capsula di Petri e posizionare nel piatto Petri sotto il microscopio.
- Verifica fitness dell'individuo guardando nell'oculare (~ 40 ingrandimenti).
Nota: "Buona" forma significa che l'individuo si muove, ruota da lato a lato, spinge il piede fuori del guscio, ecc rimuovere fitness morto o basso gli individui con un Pasteur pipetta e metterli in un piatto separato di Petri (novellame FWPM con un'apertura Shell, nessun movimento, il piede non è tirato fuori, una shell frammentata, i giovani che galleggiano in maniera incontrollata nell'acqua, una decomposizione visibile della shell, parziale decalcificazione). - Prendere due fotografie di un FWPM individuali mostrando buona forma fisica utilizzando un ingrandimento costante di ~ 80 X. Vedi File supplementari 1: s. 5. Microscopio e phototechnics. Salvare le foto.
Nota: Per una buona misura della sua lunghezza, i giovani devono essere definiti nel senso della lunghezza (vista laterale). L'obiettivo principale è quello di scattare una foto di alta qualità della lunghezza massima shell abbastanza buono per consentire un'analisi di foto in seguito. - Inserire i giovani nel vano appropriato nella gabbia, non appena le immagini sono prese. Registrare i numeri delle foto e della camera.
- Ripetere questo passaggio con ogni individuo per tutte le camere usate nella gabbia della maglia.
Nota: vedere supplementari File 1: s. 1. Costruzione di gabbie della maglia. - Una volta che tutti gli alloggiamenti utilizzati hanno mitili della perla, mettere il setaccio di plastica sulla gabbia, poi delicatamente mettere il coperchio di plastica e fissare tutte le parti insieme con i dadi.
- Nel caso di un'installazione in una zona hyporheic, una delle estremità del tubo passa attraverso uno degli alloggiamenti e fissarlo in questa posizione, poi prendere la maglia anti-intasamento e associarlo all'estremità inferiore (vedere supplementari File 1: s. 1. Costruzione di gabbie in rete).
- Novellame di archivio
- Mettere la gabbia nel contenitore di plastica con l'acqua del fiume, in modo che i giovani sono completamente immersi e tenerlo nella thermobox. Prima dell'installazione, lasciate che i giovani adattarsi in situ fiume acqua temperatura nel luogo di installazione (graduale raffreddamento, max 5 ° C in 24 h).
- Installare maglia gabbie
- Preparare il materiale di campo tra cui le gabbie di rete metallica con i giovani, punte d'acciaio, bulloni e dadi metallici, una chiave, Campo temperatura Datalogger (Vedi Tabella materiali e supplementari File 1: S.4.2. Misurazione di acqua), una stringa, una macchina fotografica, il protocollo di campo, un martello e una vanga.
- Trasportare i giovani FWPM al sito in un campo thermobox (cassonetto coibentato), mantenendo una temperatura dell'acqua stabile con variazioni < ~ 2 ° C. Mettere la thermobox con le gabbie di rete metallica nel fiume sul sito per lasciare che i giovani di adattarsi alle condizioni ambientali locali (pH, conducibilità, ecc.).
- Installare la gabbia di rete metallica.
- Rimuovere la gabbia di rete metallica da thermobox il campo. Fornirlo con due punte in acciaio e fissare il datalogger di campo. Ancorare la gabbia in un habitat con condizioni tipiche per FWPMs nell'area di studio (ad esempio, ai margini del flusso principale del flusso, non nel flusso d'acqua diretto, non in acqua stagnante, non in luce diretta del sole).
- Per l'acqua aperta, usando un paio di punte d'acciaio, fissare la gabbia al fondo del fiume; giaceva su un fianco e il livello con la parte inferiore del fiume, a valle con un angolo di 45° per il flusso del fiume, verso il centro del fiume. Il bordo orizzontale inferiore dovrebbe essere circa 10-15 cm sopra la superficie di fondo del fiume. Mantenere una distanza minima di 2 m tra ogni gabbia presso una località (Vedi supplementari File 1: s. 4. Gabbie di manutenzione).
- Per la zona hyporheic, scavare le gabbie nel fondo del fiume, in una posizione perpendicolare paesaggio, perpendicolare al flusso di acqua, così che il bordo orizzontale superiore della gabbia è parallelo alla superficie del fondo del fiume e le camere si trovano presso il hyporheic profondità che devono essere testati. Estrarre l'estremità superiore del tubo flessibile di gomma sopra la superficie di fondo per la possibilità di campionamento di acqua durante l'esperimento (vedere supplementari File 1: S.4.2. Misurazione di acqua).
Nota: Si raccomanda di eseguire controlli periodici e manutenzione sulle gabbie (vedere supplementari File 1: S. 4. Gabbie di manutenzione).
- Rimuovere la gabbia di rete metallica da thermobox il campo. Fornirlo con due punte in acciaio e fissare il datalogger di campo. Ancorare la gabbia in un habitat con condizioni tipiche per FWPMs nell'area di studio (ad esempio, ai margini del flusso principale del flusso, non nel flusso d'acqua diretto, non in acqua stagnante, non in luce diretta del sole).
- Disinstallare le gabbie e i giovani di trasporto dopo l'esposizione. Per questo, tirare le gabbie fuori dall'acqua, deselezionare loro di sedimenti fini pure a partire dal materiale alla deriva e metterli nella thermobox campo riempito con acqua di fiume. Trasporto le gabbie immediatamente in laboratorio e iniziare la valutazione di tasso di mortalità e crescita.
Nota: Vedere File supplementari 1: s. 3. Durata di esposizione. Nel caso di una differenza di temperatura superiore a 5 ° c tra le gabbie e l'ambiente di laboratorio, è necessario prima che la temperatura a pareggiare. - Valutare l'esperimento verificando l'idoneità di vita di ogni giovanile (vedere i passaggi 1.5.2 e 1.5.3) e prendere le 2 immagini di ogni giovanile dal vivo in una capsula Petri utilizzando un ingrandimento costante di ~ 80 X. Registrare l'idoneità e i numeri delle immagini e degli alloggiamenti.
- Completare l'esperimento (comune a tutti i metodi)
- Eseguire le misurazioni nel software di analisi di immagine. Utilizzare software di analisi per la determinazione di dimensioni corpo di ogni giovanile valutate sia le immagini di input (punto 1.5.3) e le immagini in uscita (passaggio 1,9). Uso la lunghezza massima totale shell documentato sia fotografie come valori di dimensione corpo in entrata e in uscita.
- Inserire i valori misurati il processore di tabella e calcolare l'incremento di crescita (%) per ogni superstite giovanile.
- Stimare il tasso di sopravvivenza (%) per gabbia di rete utilizzando il rapporto tra il numero di individui sopravvissuti a tutti gli individui sperimentali nella gabbia della maglia.
Nota: Dopo l'esperimento, restituire i sopravvissuti al programma di allevamento
(vedere supplementari File 1: s. 6. Materiale biologico).
2. Sandy Cage
Nota: Vedere la Figura 2.
- Preparare il materiale
- Preparare il materiale per la parte in laboratorio dell'esperimento: 2 capsule di Petri (diametro ~8.5 cm), pipette Pasteur, un colino, 25 L di acqua di fiume, una scatola di plastica, setacci (maglia taglia 1 e 2 mm), una grande scatola di plastica (25L), una gabbia di sabbia (Vedi supplementari File 1 : S. 2. Costruzione di gabbie di Sandy), ordinato una macchina fotografica digitale, un trinoculare dissezione microscopio stereo zoom, una griglia di calibrazione (Strumentazione del microscopio), sabbia di fiume dall'area di studio (Vedi punto 2.1.3) e il protocollo. Vedere tabella materiali e File supplementare 1: S. 2. Costruzione di gabbie di Sandy.
- Preparare il materiale per il processo di isolamento: contenitori (1 per ogni gabbia con 1 letto aggiunto), 2 piastre di Petri tondi (diametro ~ 14 cm), una pipetta Pasteur, lenti di ingrandimento e 1 L di acqua di fiume.
- Setacciare la sabbia di fiume attraverso un setaccio di 2 mm e poi attraverso un setaccio di 1 mm per ottenere un formato di grano di 1-2 mm. la sabbia asciutta e salvarlo in una forma secca fino a quando richiesto.
- Prendere il novellame (vedere supplementari File 1: s. 6. Materiale biologico) fuori la thermobox e metterli nel piatto Petri. Utilizzando una spruzzetta e colino, vagliare i giovani per eliminare i detriti.
- Impostare il microscopio e la fotocamera (vedere supplementari File 1: s. 5. Microscopio e phototechnics).
- Mettere i giovani in gabbie (attività di laboratorio sperimentale)
- Posizionare la gabbia di sabbia in scatola di plastica. Spargere la sabbia ordinata (Vedi punto 2.1.3) fino a un terzo dell'altezza della gabbia della sabbia. Versare l'acqua nella scatola. Assicurarsi che la superficie della sabbia è di circa 10 mm sotto il livello dell'acqua. Inserire la gabbia di sabbia nella casella 25 L di acqua di fiume e lo espongono alla stessa temperatura come il FWPMs giovanile (vedere supplementari File 1: S.6.2. Deposito del materiale biologico) per 12 h. evitare l'esposizione della sabbia alla luce del sole.
- Prendere la capsula di Petri con i giovani FWPM preparati.
- Verifica fitness degli individui guardando nell'oculare (Vedi punto 1.5.2).
- Eseguire la documentazione fotografica come segue. Scattare una foto di tutti gli individui scoperto (Vedi punto 1.5.3) e scegliere 10 degli individui più grandi. In alternativa, prendere le immagini di tutti i giovani insieme a basso ingrandimento (~ 40 X) per una valutazione di massa e 10 esemplari. Salvare tutte le foto e registrare i loro numeri.
- Utilizzando una spruzzetta, spostare i giovani FWPM nella gabbia sabbia preparata.
- Novellame di archivio
- Mettere la gabbia nella grande scatola di plastica con acqua di fiume, in modo che la gabbia è completamente immersa e tenerlo nella thermobox. Lasciate che i giovani adattare in situ fiume temperatura dell'acqua (graduale raffreddamento, max 5 ° C per 24 h) prima dell'installazione.
- Installare gabbie sabbiose
- Preparare il materiale per l'installazione di campo: gabbie sabbiose, un campo di ~ 25-L thermobox, una pietra piatta (minimo 1 kg di peso), una rete (maglia mm 10 x 10), una spruzzetta, Campo temperatura Datalogger (Vedi Tabella materiali e supplementari File 1: Misurazione dell'acqua S.4.2.), una vanga e il protocollo di campo.
- Trasporto le gabbie con i giovani al sito in thermobox il campo, mantenendo una temperatura dell'acqua stabile (cambiamento di ~ 2 ° C). Mettere il campo Container termico con le gabbie di sabbiose nel fiume presso il campo sito di lasciare i giovani FWPM di adattarsi alle condizioni ambientali locali (pH, conducibilità, ecc.).
- Installare le gabbie sabbiose in habitat con condizioni tipiche per FWPMs (ad es., al bordo del flusso del flusso principale in un meandro, non nel flusso d'acqua diretto, non in acqua stagnante, non in luce diretta del sole).
- Per acque aperte, fissare le gabbie sabbiose per una pietra piatta usando una rete e posizionarlo sul fondo del fiume. Assicurarsi che il lato più grande della gabbia forma un angolo di 45° con il flusso.
- Per Hyporheal, scavare le gabbie in fondo del fiume perpendicolare al flusso d'acqua affinché il coperchio di gabbia è livello con la superficie inferiore di fiume.
Nota: Si raccomanda di eseguire controlli periodici e manutenzione sulle gabbie (vedere supplementari File 1: S. 4. 1. controlli del sito).
- Disinstallare le gabbie e i giovani di trasporto dopo l'esposizione
Nota: vedere supplementari File 1: s. 3. Durata di esposizione.- Tirare le gabbie fuori dall'acqua, eliminarle del materiale alla deriva e metterli nella thermobox campo riempito con acqua di fiume.
- Trasporto le gabbie al laboratorio e iniziare la valutazione di tasso di mortalità e crescita.
Nota: Nel caso di una differenza di temperatura superiore a 5 ° c tra le gabbie e l'ambiente di laboratorio, è necessario lasciare che le temperature di pareggiare.
- Giovani dalla sabbia separati-FWPM
- Preparare in un recipiente rotondo con una profondità di 50 mm (per ogni gabbia separatamente) e un contenitore giro aggiuntivo. Trasferire la sabbia dalla gabbia nel contenitore rotondo. Utilizzare un moto vorticoso per lavare fuori le particelle più leggere in un nuovo contenitore.
- Assaggiare il contenuto da questo contenitore gradualmente e cercare juveniles passo-passo utilizzando una pipetta Pasteur e una lente di ingrandimento. Mettere i giovani in di Petri con la pipetta Pasteur. Ripetere questo passaggio fino a quando l'ultimo giovanile è stato trovato e poi un altro 10 x dopo il primo risultato negativo. Dopo ogni lavaggio, è necessario aggiungere acqua pulita del fiume al contenitore originale con sabbia.
Nota: Soprattutto dopo il primo lavaggio, correttamente esaminare il contenuto e pulirlo di zavorra come sedimenti fini e altre alluvioni.
- Valutare l'esperimento
- Verifica l'idoneità di ogni giovanile (vedere i passaggi 2.4.3 e 1.5.2) e contare il numero dei sopravvissuti.
- Scattare una foto (Vedi punto 2.4.4.) di ciascuno separatamente, anche se questo significa che non c'è nessuna chiara identità di ogni individuo. In alternativa, prendere le foto alla rinfusa e scegliere un sottoinsieme delle 10 persone più coltivate tra i risultati finali.
Nota: Entrambe le possibilità hanno un simile valore di segnalazione. Possibilità 1 ha una limitazione di un maggiore carico di lavoro, ma anche il beneficio del più alto ingrandimento di foto e così anche una maggiore precisione.
- Completare l'esperimento
- Effettuare misurazioni in software di analisi di immagine. Completare l'esperimento come fatto nelle gabbie della maglia (Vedi punto 1.10) con la seguente eccezione: non valutare il tasso di crescita (%) di ogni giovanile ma valutare il gruppo nel suo complesso nell'esperimento sabbia gabbia.
Nota: Dopo l'esperimento, i sopravvissuti devono essere restituiti al programma di allevamento
(Vedi S.6.1 File supplementari. Sezione di un materiale biologico).
- Effettuare misurazioni in software di analisi di immagine. Completare l'esperimento come fatto nelle gabbie della maglia (Vedi punto 1.10) con la seguente eccezione: non valutare il tasso di crescita (%) di ogni giovanile ma valutare il gruppo nel suo complesso nell'esperimento sabbia gabbia.
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Representative Results
I quattro metodi di bioindicazione (gabbie aperte acqua sabbiosa, gabbie sabbiose nel letto, aprire acqua maglia gabbie e all'interno-letto maglia gabbie) sono stati applicati per studiare l'idoneità di condizione di ambiente per FWPMs in alto Moldava bacino fiume (foresta Boema, ceco Repubblica). Questo fiume rappresenta una località di residuo di FWPM all'interno di Europa centrale19. Qui, presentiamo una serie di risultati che illustrano gli aspetti più importanti dei quattro metodi appositamente selezionati. Ulteriori dettagli sono descritti in uno studio completo da Černá et al. 13.
L'ambiente fluviale è stato studiato a due livelli:
Affluenti dell'inquinamento diversa fasi (siti R e V) e (I) un profilo longitudinale del fiume è stato rappresentato dalla località principale flusso (siti A - E). Le località sono state testate sia da gabbie sabbiose maglia gabbie installate nel flusso libero dell'acqua. Inoltre, una zona hyporheic di ghiaia è stata testata da all'interno del letto sabbioso gabbie in località B, C e D.
(II) un ambiente hyporheic è stato testato in località selezionata C. L'idoneità dei diversi substrati (sabbia, ghiaia, pietre) è stato testato da gabbie di rete metallica all'interno del letto.
Il tasso di crescita e il tasso di sopravvivenza di > 1-anno-vecchio juveniles (vedere supplementari File 1: s. 6. Materiale biologico) sono stati testati. L'esperimento è stato effettuato per tutta la sua estensione nell'estate del 2014 ed è stato ripetuto in misura minore in alcune località nell'estate del 2015. All'interno di livello (I), 2-6 sandy gabbie con un minimo di 100 giovani e 6 (2014) o 4 (2015) maglia gabbie con 6 giovani sono state applicate a ogni località testato dal metodo appropriato. All'interno di livello (II), 7 maglia gabbie con 6 giovani sono state installate in ogni ambiente testato. Il tempo di esposizione è stato un mese per le gabbie di rete metallica e tre mesi per le gabbie di sabbiose.
L'analisi statistica è stata condotta in R, versione 3.1.020. Sono stati utilizzati test di Kruskal-Wallis, Kruskal-Nemenyi e Wilcoxon-Mann-Whitney. Per i dati con una distribuzione normale, regressione lineare o quadratico è stato effettuato.
Le località possono essere chiaramente distinte basato sul tasso di crescita nelle gabbie maglia aperta acqua nonostante la variabilità all'interno di una gabbia alta, anche in diversi periodi favorevoli per la crescita (Figura 3). L'esposizione più favorevole crescita nel 2015 (crescita tasso 19,3-41,8%), una tendenza significativa è stata scoperta nel profilo longitudinale dove il tasso di crescita è aumentato a valle (test di Kruskal-Wallis, p < 0,001). Cosa importante, il tasso di sopravvivenza era alto in modo equivalente in entrambe le stagioni (dall'83%) (Figura 4A).
D'altra parte, le gabbie aperte acqua sabbiosa ha mostrato una tendenza diversa tra le località principali del flusso nel 2014: il tasso di crescita aumentato a valle dalla località (52%) attraverso la località centrale C (153%) e da allora in poi è diminuito nuovamente fino alla località E (46%) (una regressione quadratica dei valori di crescita assoluta: r2adj = 0,77, F2,13 = 25,66, d.f. = 16, p < 0,001). Questa tendenza è stata confermata anche nel 2015 quando il maggior tasso di crescita è stato registrato presso la località centrale C nuovamente. Inoltre, i valori del tasso di crescita assoluta non hanno differito molto tra il 2014 e 2015. D'altra parte, il tasso di sopravvivenza ha differito fra gli anni, essendo molto più elevato nel 2015 (dal 48% al 72%) che nel 2014 (25% circa) (Figura 4B).
Un effetto di due metodi differenti dell'esposizione è anche chiaramente visibile nel tributario inquinato (località V). Le gabbie sabbiose qui esposte durante i tre mesi ha mostrato 0% di sopravvivenza, mentre un tasso di sopravvivenza di 83% con una crescita è stato registrato dall'acqua aperta maglia gabbie esposizione qui durante i 30 giorni.
Risultati dal letto all'interno di gabbie sabbiose illustrano diverse condizioni dell'ambiente di hyporheic rispetto alle acque libere nelle località rilevanti. Il tasso di crescita era sempre inferiore nei siti hyporheal più in mare aperto, e il tasso di sopravvivenza era molto più variabile (da quasi il 50% allo 0%, Figura 4B).
Uno studio di microhabitat hyporheic utilizzando le gabbie di rete metallica all'interno del letto ha mostrato un effetto significativo della composizione substrato sulla sopravvivenza giovanile. Le migliori condizioni sono state registrate dal fondo pietroso saturo di ossigeno (un tasso di sopravvivenza quasi al 100%) mentre il peggiore (un < 40% tasso di sopravvivenza) sono stato indicato in sabbia scarsamente ossigenata, dove inoltre è stata rilevata una variabilità molto alta per sopravvivere. Ossigenazione dell'acqua hyporheic, che più volte è stata misurata durante l'esperimento, spiega questa tendenza (Figura 5).
Figura 1. Bioindicazione della gabbia con singole camere. Per ulteriori informazioni, vedere File supplementari 1 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Gabbia di sabbia di bioindicazione. Per ulteriori dettagli. vedere complementare File 1 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Variabilità individuale nel tasso di accrescimento giovanile registrato da gabbie di rete acqua aperta in località B ed E durante le due stagioni. I mezzi e la deviazione standard sono descritti per ogni gabbia di rete metallica. I valori si basano sulla misurazione di 6 giovani (o giovani di 4-5 se il tasso di mortalità > 0%) in ogni gabbia di rete metallica.
Figura 4. Risultati di esempio da un campo bioindicazione sperimentare con gabbie di rete metallica e sandy. (A), questo pannello Mostra esempio risultati da un esperimento di bioindicazione campo con maglia gabbie. Un totale di 6 località (B, C, D, E, R e V) all'interno del bacino del fiume Moldava sono stati testati in 2 diverse occasioni (nel 2014 e nel 2015). Il tempo di esposizione era 30 giorni durante la stagione estiva. Le località B - E rappresentano (in ordine) un profilo longitudinale di un tratto di circa 20 km di flusso principale del fiume. Località R e V rappresentano i profili dei 2 affluenti. Capitelli segnano la stessa località nel pannello (A) e (B). Tutte le località sono state testate con le gabbie di rete acqua aperta. Inoltre, località C è stato testato anche con all'interno letto maglia gabbie installate in 3 diversi tipi di letto del fiume (Cs = sabbia, Cg = ghiaia, Cst = pietre) nel 2014. Le gabbie sono state installate in successive, 4-7 in ogni sito. 6 novellame cozza perla d'acqua dolce 1 + anni sono stati utilizzati per gabbia di rete metallica. I tassi di crescita medi vengono contrassegnati per i 3 individui più grandi (MAX 3) da ogni testata della gabbia (colonne, asse sinistro) e il tasso di sopravvivenza media per gabbia della maglia (punti blu, asse destro). (B), in questo esempio di spettacoli pannello Risultati da un campo bioindicazione sperimentare con le gabbie di sabbiose. Una località di7 totale (A, B, C, D, E, R e V) all'interno del bacino del fiume Moldava sono stati testati sopra in 2 diverse occasioni (nel 2014 e nel 2015). Il tempo di esposizione è stato 3 mesi durante la stagione estiva. Siti A - E rappresentano (in ordine) un profilo longitudinale di un tratto lungo circa 30 km di flusso principale del fiume. Siti R e V rappresentano i profili dei 2 affluenti. Capitelli segnano la stessa località sia in questo che nel pannello precedente. Tutte le località sono state testate con gabbie aperte acqua sabbiosa. Inoltre, località B, C e D sono stati testati utilizzando all'interno-letto sabbiose gabbie installate nel substrato di letto di fiume di martelletto (Bg, Cg e Dg) nel 2014. Le gabbie sono state installate in 2-4 repliche in ogni sito. Almeno 100 juveniles cozza perla d'acqua dolce erano presenti in ogni gabbia di sabbia. Il tasso di crescita medio per 10 esemplari (MAX 10) da ogni testata gabbia di sabbia (colonne, asse sinistro) e il tasso di sopravvivenza medio per gabbia di sabbia (punti blu, asse destro) sono contrassegnati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Saturazione dell'ossigeno. Questo pannello mostra la relazione tra valori minimi della saturazione di ossigeno oltre i 30 giorni di esposizione di gabbie di rete metallica e il tasso di sopravvivenza per gabbia in gabbie di rete metallica all'interno del letto esposti in microhabitat diversi letto nel 2014. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| 2014 | 2015 | |||
| località | esposizione di 3 mesi di gabbie sabbiose | esposizione di 1 mese di maglia gabbie | esposizione di 3 mesi di gabbie sabbiose | esposizione di 1 mese di maglia gabbie |
| A | 13,9 | - | - | - |
| B | 14,4 | 13.4 | 13,9 | 17,5 |
| C | 15 | 13,8 | 14,4 | 18,3 |
| D | 15 | 13,8 | 14.3 | 18,3 |
| E | 15.5 | 14 | - | 18,7 |
| R | 13,5 | 12,8 | - | - |
| V | 14 | 13.2 | - | - |
Tabella 1. Temperatura media dell'acqua superficiale (° C) presso le località durante l'esposizione nel 2014 e nel 2015.
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Discussion
Tempo di esposizione:
Anche un mese esposti maglia gabbie Visualizza una crescita visibile che riflette le differenze tra le località (Figura 3), quindi sono molto utilizzabile per la rilevazione rapida e facile di una caratterizzazione di località. Tuttavia, la rilevanza dei risultati dipende dallo stato a breve termine delle condizioni, che possono oscillare. In particolare, eventi di pioggia breve possono svolgere un ruolo. Al contrario, imprevedibile inquinamento episodica non può essere sempre registrata. In località V (Figura 4A), analisi chimica dell'acqua rilevata un'onda corta di ammonio forte aumento13. Questo era probabilmente responsabile per la mortalità nelle gabbie sabbiose esposte tre mesi ma non ha colpito le gabbie di rete esposti 30 giorni.
Le fluttuazioni di temperatura possono colpire anche i risultati di esposizione a breve termine. La temperatura media di un mese durante l'esposizione di gabbia di rete metallica differisce tra gli anni (tabella 1). Il tasso di crescita varia anche dove le temperature più elevate sono stati accompagnati da tassi di crescita superiori (test di Kruskal-Wallis p < 0,001). D'altra parte, la temperatura media dell'acqua allo stesso località durante l'esposizione di tre mesi sabbia gabbia era molto simile in entrambi gli anni (tabella 1) e il tasso di crescita non hanno differito significativamente (Figura 4B).
Vantaggi e difetti dei metodi descritti:
Un'esposizione di acqua aperta è relativamente facile da effettuare, ma è di scarso valore per habitat bioindicazione. Il metodo delle gabbie di rete acqua aperta è relativamente vecchio16 ed è stato usato ripetutamente con modifiche minori10,11,12,13,21,22 , 23. Tuttavia, queste gabbie non sono limitate da ossigeno, la cui carenza è probabilmente responsabile di molte morti giovanile in condizioni hyporheic. Così, gabbie di rete acqua aperta possono mostrare buon sviluppo anche in località con la mortalità aumentata e una diminuzione del tasso di crescita in gabbie aperte acqua sabbiosa (località E) o un tasso di mortalità del 100% all'interno letto sabbia gabbie, come in località D 2014 (Figura 4B). A quanto pare, le gabbie di rete di acque aperte mostrano località crescita potenziale, ma questo potrebbe non essere realistico come dipende la reale disponibilità di microhabitat hyporheic all'interno di una località. Perché le gabbie di rete di acque aperte hanno la capacità di sopravvivenza elevata (Figura 4A), anche fino a un tasso di sopravvivenza 100%13, possono servire bene per la bioindicazione della tossicità cronica (o tossicità acuta se ci si aspetta in un dato momento). Inoltre, possono essere una presenza di origine alimentare utile test in una certa misura.
Come un metodo nuovo e raro, le gabbie aperte acqua sabbiosa meglio simulano condizioni di habitat hyporheic. Movimento del novellame tra granelli di sabbia è possibile con questo dispositivo, che aiuta a ridurre la crescita di biofilm sulle coperture giovanile. Una carenza di ossigeno hyporheic può essere causata dall'attività dei microbi colonizzando i granelli di sabbia; Questo effetto può verificarsi anche parzialmente in gabbie posizionate sopra un fondo di fiume. Tuttavia, dovuto la necessaria pulizia periodica di intasamento del materiale alla deriva da una gabbia, sedimenti fini vengono anche rimossi e quindi le condizioni sono cambiate rispetto dell'habitat naturale hyporheic. Così, il tasso di crescita può anche essere considerato come crescita località potenziale in gabbie aperte acqua sabbiosa. Tuttavia, questo è più vicino alla idoneità località reali che in mare aperto maglia gabbie. Di conseguenza, i gradienti di tasso di crescita longitudinale registrati anche da gabbie sabbiose (Figura 4B) sembrano essere più plausibile e indicare un tratto di fiume più adatto. Inoltre, in gabbie di sabbiose, la possibilità di novellame e subadults allevamento fino a maturità sessuale è verificato9, quindi gabbie sabbiose possono servire come un sicuro metodo di allevamento e biomonitoraggio contemporaneamente.
Gabbie di Sandy e maglia gabbie collocate in posizione all'interno del letto sono i più vicini alle condizioni reali in un hyporheal poco profonde. Consentendo il movimento di un giovanile, gabbie di sabbiose, in particolare, entrambi offrono un gradiente verticale e orizzontale di diversi centimetri in scala. Questa capacità di muoversi potrebbe essere molto importante per fuggire dalla temporanee ossigeno-carente micro-zone. Questa possibilità è assente nel letto all'interno della maglia gabbie. Di conseguenza, un numero relativamente elevato di bioindicazione unità è necessario, perché le condizioni di hyporheic sono molto variabile13,24 (Figura 5) e le perdite dovute a una posizione non idoneo sono comuni.
In sintesi, i metodi di bioindicazione utilizzati in questa ricerca corrispondono con presunto giovanile condizioni naturali nell'ordine seguente:
1. Aprire acqua maglia gabbie,
2. Aprire gabbie acqua sabbiosa,
3. gabbie di rete metallica all'interno di-letto,
4. all'interno-letto sabbiose gabbie.
Il carico di lavoro per unità aumenta nello stesso ordine. Inoltre, il numero giovanile richiesto per un esame statistico dei risultati ottenuti aumenti nelle esposizioni all'interno del letto troppo. Sembra che l'entro-letto gabbie sabbia rappresentano un più costoso ma il metodo di bioindicazione accurata. Questo nuovo metodo ha bisogno di più test in futuro e confronto con altri tipi di studi hyporheic basato sul piezometro misure25,26. In particolare, c'è la necessità di studiare il grado di somiglianza usando una sonda diretta condizioni fisico-chimiche nelle gabbie e nell'ambiente circostante hyporheic di misura.
Il numero di individui misurato in una gabbia:
Rispetto per gabbie in rete, non è possibile misurare l'incremento di crescita del novellame specifici in gabbie sabbiose come non c'è alcuna informazione su quale individuo dal set di input è che uno nell'output. È necessario lavorare con un valore medio. Se contato per tutti gli individui, questo valore può essere molto basso a causa di un numero di esemplari molto lentamente crescenti; Tuttavia, un paio di individui può crescere molto rapidamente (ponticelli di crescita). Tale crescita irregolare è tipico per cozze27. La variabilità di crescita tra i giovani aumenta con l'aumento di tempo di esposizione e grandi differenze possono verificarsi, soprattutto nelle stagioni favorevoli per la crescita. Inoltre, una lunga esposizione conduce a tassi di mortalità maggiori nelle gabbie della maglia (per una rassegna Vedi Lavictoire, Moorkens, Ramsey, Sinclair e Sweeting28), così possiamo lavorare con un numero significativamente inferiore di individui alla fine dell'esperimento rispetto alla set degli avannotti di input. Solo i più giovani più crescenti di misura è un metodo possibile.
L'esperienza di allevamento di FWPM nell'ambito del piano di azione Ceca per Freshwater Pearl cozza9,29, così come i risultati dagli esperimenti su mare bivalvi30,31, suggerisce quella giovanile di crescita-carenti bivalvi hanno un alto tasso di mortalità, e c'è solo una trascurabile possibilità della loro vita alla maturità. Al contrario, ponticelli di crescita hanno un più alto tasso di sopravvivenza e sono cruciali per un recupero di popolazione. Il parametro 10 MAX (la maggior parte-in rapida crescita individui 10) tiene conto dei ponticelli di crescita e può aumentare il valore informativo dell'esperimento, anche se alta mortalità avviene (Figura 4B, stagione 2014). Si noti che la stima di crescita ottenuta con tale metodo non può essere un falso positivo. Si può solo essere leggermente sottovalutato perché molti dei giovani più grandi alla fine dell'esperimento sarebbe cresciuto un po ' più in questo caso. Inoltre, il carico di lavoro è minore se solo 10 individui vengono valutati. Allo stesso modo, una misura di tre individui al massimo crescente (MAX 3) ha dimostrato di essere appropriato in maglia gabbie, eliminando l'influenza degli individui crescenti lentamente, non-prospettiva, che potrebbe influenzare la vera immagine del potenziale di crescita del sito.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Michal Bílý e Ondřej P. Simon sono stati sostenuti da sovvenzioni da Università Ceca di scienze biologiche [interno Grant Agenzia della facoltà di scienze ambientali, CULS Praga (42110 1312 3175 (20164236))]. Karel Douda sostenuto da Fondazione Scienza Ceca (13-05872S). Dati sulla bioindicazione e presente occorrenza di mitili della perla sono stati raccolti nel corso dell'attuazione del piano d'azione di Ceca per mitili d'acqua dolce perla gestito dall'agenzia di conservazione natura della Repubblica Ceca, che è finanziato dal governo della Repubblica Ceca ed è disponibile presso
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| biological material maintenance and care | |||
| Freshwater pearl mussel juveniles | any | NA | from a FWPM breeding programme |
| plastic boxes | any | NA | |
| thermobox | MERCI | 212,070,600,030 | There are many possibilities. This is one example only. |
| field thermobox (ca25 l) | any | NA | cold box (insulated box) commonly used for food transport |
| river water | any | NA | |
| Petri dishes | any | NA | |
| plastic Pasteur pipettes with balloon bulb (droppers) | any | NA | hole diameter 1 mm |
| hydrogen peroxide | any | NA | |
| plastic container (ca 50 l) for river water | any | NA | |
| plastic tea strainer | any | NA | commonly used in kitchen |
| mesh cages construction | |||
| main plastic bodies | any | NA | |
| plactic covers | any | NA | |
| special technical sieves 340 µm | Silk &Progress | UHELON 20 T | |
| special technical sieves 100 µm | Silk &Progress | UHELON 67 M | |
| rubber hose (diameter 5.5 mm) | any | NA | |
| steel bolts | any | NA | |
| steel nuts | any | NA | |
| spanner | any | NA | |
| steel spikes | any | NA | |
| pliers | any | NA | |
| beakers | any | NA | |
| plastic dishes (ca. 25x15x3-5cm) | any | NA | |
| squirt bottle | any | NA | |
| field protocols | any | NA | |
| stationery | any | NA | |
| plastic container | any | NA | |
| string | any | NA | |
| hammer | any | NA | |
| sandy cages construction and use | |||
| sieve 1 mm | any | NA | |
| sieve 2 mm | any | NA | |
| special technical sieves 340 µm | Silk &Progress | UHELON 20 T | |
| plastic boxes with tight-fitting lid | any | NA | |
| hot melt adhesive | any | NA | |
| plastic box (ca 250 x 150 x 100 cm) | |||
| big plastic box (ca 25 l) | any | NA | |
| flat stone | any | NA | |
| net | any | NA | |
| river sand | any | NA | |
| round containers | any | NA | |
| magnifying glasses | Carson | Carson CP 60 | There ar many possibilities. This is one example only |
| cages installation and maintenance | |||
| field temperature dataloggers | ONSET | UA-001-64 | http://www.onsetcomp.com/products/data-loggers/ua-001-64 |
| spade | any | NA | |
| toothbrush | any | NA | |
| experiment evaluation | |||
| trinocular dissecting zoom stereo microscope | Bresser optic | ICD 10x-160x | There are many possibilities. This is one example only. |
| digital camera/ electronic eyepiece | Bresser optic | MikroCamLab 5M | There are many possibilities. This is one example only. |
| Calibration gird | Am Scope | SKU: MR100 | There are many possibilities. This is one example only. |
| external power source with two movable light guides | Arsenal | K1309010150021 | There are many possibilities. This is one example only. |
| Image software | ImageJ software | There are many possibilities. This is one example only. | |
| table processor | MS excel | There are many possibilities. This is one example only. |
References
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