Summary
Vi presenterer en metode som gir ytterligere innsikt i tidlig hendelsene underliggende neurodegeneration og basert på etablerte ex-vivo hjernen teknikken, kombinerer fordelene i vivo og i vitro eksperimenter. Videre representerer en unik mulighet for direkte sammenligning av behandlet og ubehandlet i samme anatomiske plan.
Abstract
Til tross for mange studier som forsøker å utvikle pålitelige dyremodeller som reflekterer primært behandler underliggende neurodegeneration, har svært få blitt allment akseptert. Her foreslår vi en ny prosedyre tilpasset fra velkjente ex vivo hjernen stykke teknikken, som tilbyr en nærmere i vivo-som scenariet enn i vitro preparater, for å undersøke tidlige hendelser utløser celle degenerasjon, som observert i Alzheimers sykdom (AD). Denne varianten består av enkle og å reprodusere skritt, som aktiverer bevaring av den anatomiske cytoarchitecture valgte hjernen regionen og lokale funksjonaliteten i en fysiologisk miljøet. Ulike anatomiske områder kan fås fra samme hjernen, gir muligheten til å utføre flere eksperimenter med behandlinger i spørsmålet i en område - dose- og tidsavhengige måte. Potensielle begrensninger som kan påvirke resultatene knyttet til denne metoden gjelder bevaring av vevet, dvs. vedlikehold av integriteten anatomiske slicing og inkubasjon trinnene og snittykkelsen, som kan påvirke biokjemiske og immunohistochemical analysen. Denne tilnærmingen kan anvendes for ulike formål, som utforsker molekylære mekanismer involvert i fysiologiske eller pathological betingelser, narkotikarelaterte screening eller dose-respons analyser. Til slutt kan denne protokollen også redusere antall dyr i atferdsmessige studier. Programmet rapporterte her er nylig beskrevet og testet for første gang på ex vivo rotte hjernen skiver som inneholder basale forebrain (BF), som er en av regionene cerebral hovedsakelig påvirket i Annonsen. Spesielt har det vist at administrasjon av et giftig peptid avledet fra C-terminus av acetylcholinesterase (verke) kan be en AD-lignende profil, utløser, langs antero-posterior akse BF, en differensiell uttrykk for proteiner er endret på Annonsen, som alpha7 nikotinsyre reseptoren (α7-nAChR), fosforylert Tau (p-Tau) og amyloid beta (Aβ).
Introduction
Annonsen er en kronisk patologi preget av gradvis nevrodegenerative verdifall påvirker andre hjernen områder, som entorhinal cortex (EC), BF, hippocampus (HC) og Luktelappen (SR)1,2,3, 4,5. På slutten stadier av AD utvikling føre til en progressiv kognitiv svikt, gjør denne sykdommen den vanligste formen for demens, ca sto for 70% av alle tilfeller6. Til tross for omfattende forsøk på å forstå den innledende stadiet forårsaker annonse, er det ikke en definert eksperimentelle indikasjon Klargjørende dem. Dessuten, er den mest populære teorien - "amyloid hypotesen" - stadig spurt siden det ikke gir en fullstendig profil forklarer AD pathobiology, heller en farmasøytisk mål som har vist seg effektiv7,8 ,9.
En alternativ teori som får økende oppmerksomhet antyder at første mekanismer forekommer under neurodegeneration er knyttet til en neuronal klynge primært utsatt i AD3,10,11 , 12 , 13 , 14. denne heterogene mobilnettet huben omfattet BF, mellomhjernen og hjernestammen, prosjektene til flere områder, slik som EU, HC og OB15,16. Til tross for sitt mangfold i neuronal morfologi og nevrotransmitter syntese aksjer denne kjernen av cellene en vanlig funksjon i å uttrykke verke, som kan også ha en ikke-enzymatisk funksjonen17,18. Denne ikke-klassiske rollen som en roman Signalering molekyl formidler kalsium (Ca2 +) strømme inn nerveceller som kan gjennomgå trophic eller giftig begivenheter i forbindelse Ca2 + dose, tilgjengelighet og neuronal alder17,18 , 19.
Under neurodegeneration, kan observerte mobilnettet tap derfor være tilknyttet denne ikke-enzymatisk funksjonen17,18,20, som skyldes et 30mer peptid (T30) kløyvde verke C-terminalen 20. i tråd med tidligere resultater, gjennomført på cellekultur og optisk tenkelig18,21 forberedelser, vi vist, gjennom en roman tilnærming basert på ex vivo rotte hjernen skiver med BF strukturer, som T30 indusert en AD-lignende profil22. Spesielt tilbyr denne nye metodikken et mer fysiologiske scenario enn cellekultur siden det opprettholder mange av egenskapene til en intakt vev, alt fra anatomisk til krets bevaring, om enn for et tidsvindu timer. Vi brukt denne protokollen for å utforske hendelser som skjer i de tidlige fasene av neurodegeneration, overvåking akutt svaret på T30 program.
Til tross for stor mengde litteratur om bruker hjernen skiver undersøke molekylær trasé underforstått i neuronal skade eller neurogenesis23,24, denne protokollen gir for første gang en mer umiddelbare og følsom lese ut sammenlignet til vanlig bruk av organotypic skiver. Men som er tilfellet for organotypic hjernen deler, kan denne akutt skive prosedyren også adoptert for flere formål, for eksempel evaluering av neuroprotective eller nevrotoksiske molekyler, oppdagelsen av primære molekylær omveltningene i en bestemt prosess, Immunohistochemical analyse og farmakologiske analyser for sentralnervesystemet relatert patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrestudier har utført under godkjent protokoller.
Merk: I denne delen, en rekke hovedfasene utført under den eksperimentelle prosedyren og foreslåtte tidsintervallet angis (figur 1). Videre er en detaljert beskrivelse av protokollen supplert med en illustrasjon panel, viser kritiske handlinger fra hjernen fjerning til vev homogenisering etter inkubasjonstiden (figur 2). Detaljer om materialer og instruksjoner for å bygge apparatet og påfølgende fasen for WB analyse er beskrevet tidligere22.
1. kirurgiske redskaper, Vibratome innstillinger og behandling forberedelse
Merk: Kjør følgende før du starter den eksperimentelle prosedyren:
- Forberede to forskjellige kunstig cerebrospinal væsker (aCSFs), som brukes til hjernen kutting og den andre for inkubasjon trinn som tidligere beskrevet29. Kort, arbeider konsentrasjonen (i mmol) av de to aCSFs er for "utstyr" aCSF: 120 NaCl, 5 KCl, 20 NaHCO3, 2,4 CaCl2, 2 MgSO4, 1,2 KH2PO4og 10 glukose; 6.7 HEPES salt og 3.3 HEPES syre; pH: 7.1. Stund for "opptak" aCSF: 124 NaCl, 3.7 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1,3 KH2PO4og 10 glukose; pH: 7.1.
- Bland godt løsninger og deretter lagt på is og oxygenate kutting aCSF for å få den kalde mens du fjerner hjernen og den påfølgende snitting. Holde ved romtemperatur (RT) og levere oksygen til opptak-aCSF.
- Plass instrumentene under disseksjon panseret for halshogging og hjernen fjerning, dvs, giljotinen, kirurgisk disseksjon kit (saks, pinsett, blader) og spatel.
- Angi parameterne vibratome ved å velge skive tykkelse (300 µm i dette preparatet) og frekvensen på 7 og hastigheten på 6. Sett inn vibratome kammeret i sin riktige plass, og omgir den med is.
- Åpne carbogen (95% O2, 5% CO2) ventilen for å oxygenate "kutting" (aCSF) under hjernen snitting. Velg minimum flow rate, rundt 2 mL/min.
- Ta to 15-mL rør å forberede betingelsene for å teste. Legge til en tube 10 mL av "opptak" aCSF alene (kontrollgruppen) og den andre, 10 mL av "opptak" aCSF beriket med T30 i en konsentrasjon av 2 µM (behandlet gruppe). Vortex både rør og holde dem på is inntil deres bruk inne forberedelser installasjonsfasen (del 3).
2. anestesi, hjernen utvinning og kutting
Merk: I denne studien 9 vill type P14 Wistar hannrotter ble brukt. Hjernen utvinning og påfølgende slicing utgjør en viktig del av protokollen siden de burde være raskt utført (innen 10 min) for å forhindre eller minst tregere vev utarte prosesser.
- Legge til 1,5 mL av 100% w/w i isoflurane på en bomull lag i induksjon kammeret, plassere dyret inne og stenger lokket. Vent til dyret er dypt anesthetized, bekrefter fravær av pedal refleks, og deretter halshugge dyret bruker giljotinen.
- Holde hodet av dyr i en pott som inneholder iskaldt slicing aCSF i hjernen fjerning trinn (figur 2A -C).
- Incise huden over skallen med kirurgisk blad, og kutte skallen med saks etter midtlinjen, fra den bakre delen og fortsette peke fram benet over OBs (figur 2A).
- Dra til siden de to sidene av skallen med en tang for å få tilgang til hjernen (figur 2B). Sett en slikkepott ventrally til hjernen, forsiktig scoop den ut, og hold det hydratiserte i iskalde "utstyr" aCSF i ca 5 min (figur 2C).
- Kast hjernen på filter papir og kutte ut lillehjernen med et blad (figur 2D). Fest hjernen vertikalt på vibratome platen og tilføye det innenfor skjærevindu kammeret, fylle den med iskald "utstyr" aCSF og skaffe oksygen (figur 2E).
- Juster kutte intervallet, og fortsette med hjernen snitting (figur 2F). Samle delene som inneholder regionen steder som den mediale septum (MS), diagonale band av Broca (DBB), og substantia innominata (SI), som beskrevet tidligere22. Fra topp til bunnen inneholde tre skiver rostral (R), middels (I) og caudal (C) del av BF (figur 2 g).
- Dele opp langs midtlinjen hver del med liten saks, å få to speilende hemislices (figur 2 H), brukes enkeltvis kontroll og behandlet tilstand på samme anatomiske plan.
- Holde på hemisections i det vibratome kammeret i 5-10 min og deretter overføre dem med et glass Pipetter i en boblende pott som inneholder innspillingen aCSF. Hold på RT i ca 30 min å gjenopprette.
- Fyll, i mellomtiden, tre hetteglass med 3 mL innspillingen aCSF alene (tidligere utarbeidet i trinn 1.6 for kontrollgruppen) og tre ampuller med 3 mL aCSF beriket med T30 (tidligere utarbeidet i trinn 1.6) for gruppen behandlet.
3. setup forberedelse
- Overføre til hemisections til deres tilsvarende hetteglass (figur 2I) for å få tre påfølgende hemislices (inkludert rostral, middels og caudal BF regionen) for kontrollgruppen (grønn ramme, figur 2J) og deres matchende kolleger for gruppen behandlet (rød ramme, figur 2J).
- Overføre hjernevev med to forskjellige børster, en for kontroll-hemislices og en annen for de behandlede motpartene, for å hindre enhver kontaminering mellom forhold.
- Forsegle hvert hetteglass med tilhørende lokk, presentere oksygennivået nålen (21G) (figur 2J). Koble viktigste tube apparater til carbogen kilde (figur 2 K). Lever oksygen til hemislices gjennom inkubasjonstiden med en minimal flow rate på 2 mL/min for å unngå enhver bevegelse av hjernevevet og mulig mekaniske under eksperimentet. Starte 5t inkubasjon. Utfør trinnene 3.1 3,3 innen 5 min.
Merk: Sjekk ofte (hvert 15-20 min) om oksygen leveres inn alle ampuller og at sin flyt ikke går vev fra bunnen.
4. eksempel homogenisering
- Stanse oksygen strømmen etter inkubering og fjerne alle dekslene fra hetteglass. Overføre hemislices, ved hjelp av riktig børster, til 1,5 mL rør som inneholder 250 µL av lyseringsbuffer, opprettholde rørene på is (figur 2 L). Gjøre lyse buffer, bland PBS 1 x med fosfatase og protease hemmere cocktails både utvannet på 1: 100, og homogenize vev med ulike støtere for å unngå forurens blant eksemplene. Utføre disse handlingene innen 10-15 min.
- Sentrifuge hjernen lysate 1000 x g i 5 min på 4 ° C. Overføre nedbryting til nye rør og holde eksemplene på-80 ° C.
5. lesing av Protein konsentrasjonen og Western Blot analyse
- Bestemme protein konsentrasjonen av hvert utvalg og deretter forberede dele Western blot analyse som beskrevet tidligere22.
- Utføre statistisk analyse for å vurdere effekten av behandlingen på protein uttrykk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen presenteres her angir at administrasjon av et giftig peptid, T30, modulerer på en områdeavhengige måte uttrykk for α7-nAChR, p-Tau og Aβ i BF inneholder inndelinger (figur 3A). Nikotinsyre reseptoren viser en betydelig økning i rostral-behandlet hemislice forhold til motparten kontroll (del 1, p = 0.0310) (figur 3B), mens middels skive ikke avslører endringer mellom to betingelser ( SKIVE 2, p = 0.1195) (figur 3B). I den bakre delen er en betydelig reduksjon i delen T30-eksponerte over kontrollen siden (del 3, p = 0.0476) (figur 3B). Etter T30 søknad, p-Tau nivåene er betydelig økt fremre området mot kontrollen matchende side (del 1, p = 0.0158) (Figur 3 c). På den annen side, de andre to BF inneholder delene ikke viser noen signifikant forskjell mellom betingelsene (SKIVE 2, p = 0.1014, skjær 3, p = 0.6405) (Figur 3 c). Etter T30 eksponering, Aβ er betydelig forbedret i den rostral og mellomliggende hemisections sammenlignet med sine ubehandlet kontralateral deler (del 1, p = 0.0136, skjær 2 p = 0.0109) (figur 3D). I caudal stykket, det er ingen endring mellom to behandlinger (del 3, p = 0.1231) (figur 3D). Primære antistoffer mot p-Tau gjenkjenner epitope inneholder phosphorylated Ser202 rester. Primære antistoffer mot Aβ oppdager flere isoformene, alt fra Aβ37 til Aβ42. Dataene ble analysert som beskrevet tidligere22 bruker to tailed parvis t-tester og representert som SEM. N = (hemislices per gruppe, rotter) er (27, 9).
Figur 1: sekvens og indikativ timing av de viktigste trinnene utføres under den eksperimentelle prosedyren. Tidsintervallet å fullføre det første og tredje trinnet kan variere i forhold til operatørens erfaring nivå. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: sekvensielle trinn illustrerer protokollen progresjon. (En-D) Utvinning av hjernen fra skallen og separasjon av lillehjernen fra resten av hjernen. (E) vedlegg av hjernen på vibratome plate og overføring til disseksjon kammeret, som er omgitt av is og fylt med kaldt aCSF stadig oksygenert under den kutting. (F) koronale hjernen snitting. (G) samling av sektorene, inneholder rostral (R), middels (jeg) og caudal (C) strukturer av basale forebrain. (H) separasjon av inndelingene i to samsvarende hemislices. (jeg) hver hemisection er plassert i sine tilsvarende hetteglass. (J) ampuller plassert i støtte, i boksen apparater og lukket separat. (K) Incubation periode ved tilkobling av systemet til oksygen kilden (svart sirkel). (L) homogenisering av prøvene etter behandlingen. Dette tallet er endret fra22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: T30 mediert områdespesifikke uttrykk for α7-nAChR, p-Tau og Aβ langs BF rostro-caudal aksen. (A) representasjon av hjernen koronale stykker inkludert basale forebrain kjerner (hvite stiplede linjer), delt i to utfyllende deler og utsatt for ulike forhold. (B) etter T30 eksponering, nikotinsyre reseptoren viser en betydelig økning i fremre underinndelingen (T30 1) og en markert nedtrapping på den bakre en (T30 3) sammenlignet med tilsvarende kontroll sidene (ctrl 1 og ctrl 3). Mellomliggende stykket viser ikke endringer mellom de to forholdene (ctrl 2 T30 2). (C) p-Tau uttrykk er betydelig høyere i behandlet rostral delen (T30 1) over kontrollen samsvarende motparten (ctrl 1), mens de andre to sektorene ikke avslører noen forskjell i de to gruppene (del 2 og del 3). (D) Aβ viser en betydelig økning i de fremre og mellomliggende behandlet underinndelinger (T30 1 og T30 2) i forhold til sine tilsvarende ubehandlet sider (ctrl 1 og ctrl 2). I delene caudal finnes det ingen variasjon mellom de to gruppene. Feilfeltene angi SEM. * p < 0.05.n = (hemislices per gruppe, rotter) er (27, 9). Skala er 1 mm. Dette tallet er endret fra22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det viktigste aspektet ved denne protokollen, basert på veletablerte ex vivo hjernen teknikken, kan synkront teste to speilende hemislices, fra samme anatomiske plan, overvåke deres svar etter et bestemt tilstand (kontrollere eller behandlet); Dette gir derfor en eksperimentell paradigme like strengt kontrollert som mulig. Muligheten for å vurdere i en tid - dose- og områdespesifikk måte forskjellige nevrokjemiske knyttet til nevronale svekkelse, sett i løpet av nevrodegenerative hendelser22, representerer et viktig trekk. Denne metodikken linker fordelene med et i vivo fysiologiske miljø med de i vitro preparater, som nøyaktighet i å skaffe regionen rundt og skape ideelle ekstracellulære sammenheng. Denne protokollen representerer en tilpasning av vanlige hjernen kutting prosedyren brukte for ex vivo elektrofysiologiske opptak25,26,27 og optisk tenkelig28, 29,30eller i vitro organotypic skiver, som simulerer en nærmere i vivo situasjon ved at bevaring av både strukturelle og synaptic organisasjon23,24 ,31,32.
Videre, denne prosedyren kan bidra til å redusere antall dyr som brukes i atferdsmessige studier siden det delvis replikerer en i vivo-som tilstand, som kan bli vedtatt for å bekrefte i vitro data, for eksempel cellekultur og Immunohistochemical analyse, og så forventer i vivo eksperimenter.
Foreslåtte metodikken presenterer også noen begrensninger, for eksempel snittykkelse og integritet som, når det ikke passer, kan endre det endelige resultatet. Inkubasjon tiden er også en grunnleggende komponent i denne teknikken siden det kan påvirke sammenligningen mellom kontrollgruppen og behandlet. I tillegg en rekke prosedyremessige eller tekniske problemer kan oppstå under alle trinn av protokollen, som: (1) mekaniske mens utpakking eller snitting hjernen, som kan unngås ved presis og skånsom behandling av vev; (2) flytende av hemislices under incubation på grunn av en overdreven oksygen flyt, som kan mekanisk skade vev hvis det rører oksygennivået nålen neddykket i aCSF, noe som påvirker integriteten. Dette kan forebygges ved å justere til den laveste satsen boblende; og (3) fravær eller inconstant oksygen flyt, som kan være relatert til den tomme beholderen, skade eller frakobling i rørsystem, en plugg i oksygennivået nålen, eller da er det ikke riktig nedsenket i aCSF. Siden den konstant oksygenering og dens flyt gjennom prosedyren representerer en av de viktigste aspektene ved denne protokollen, er det viktig å ofte overvåke alle disse parametrene for å opprettholde en homogen tilstand mellom de undersøkte gruppene.
Andre avgjørende skritt i protokollen er representert ved tidsvinduer kreves for å utføre hver handling, som når etterfulgt vil bevare så mye som mulig integritet og funksjonaliteten av vev. I tillegg for å vurdere disse parameterne, kan immunohistochemical analyse utføres for å oppdage bestemte markører knyttet til nevronale levedyktighet og elektrofysiologiske opptak som beskrevet tidligere23,29.
Utover resultatene som beskrives her, kan denne metoden være utformet ad hoc for spesifikke undersøkelser. For eksempel, det kan brukes å: (1) skjerm og sammenligne aktiviteten til forskjellige komponenter i flere hjernen områder, rugende dem med den valgte løsningen, som aCSF eller Neurobasal medium; (2) Utfør studier på hypoksi, siden oksygen flyten, kontrolleres selektivt i hver hemisection; (3) undersøke hjernen vev egenskaper fra transgene dyr modeller av ulike sykdommer; (4) samtidig utforske, på samme anatomiske nivå, effekten av i vivo ensidige hjernen injeksjoner og sammenligne dem med den kontroll halvkulen; og (5) utforske organer eller vev egenskaper, derfor potensielt tilrettelegging og redusere lengden av narkotikarelaterte screening prøvelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer konkurrerende økonomiske interesser. Susan A. Greenfield er grunnlegger og president for Nevro-Bio Limited, et privateid selskap og har aksjer i selskapet. Emanuele Brai og Antonella Cogoni er ansatte i Nevro-Bio Ltd.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Nevro-Bio Ltd. Vi ønsker å takke Dr. Giovanni Ferrati og Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) for deres kommentarer og råd på manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
| Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
| T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
| Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
| Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
| Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
| Glue | Brain preparation for slicing | ||
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
| Brushes | Tissue handling | ||
| Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
| 1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
| Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
| Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |
References
- Braak, H., Braak, E.
- Schliebs, R. Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer's disease--interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling. Neurochemical Research. 30 (6-7), 895-908 (2005).
- Schmitz, T. W., et al. Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer's pathology. Nature Communications. 7, 13249 (2016).
- Fjell, A. M., McEvoy, L., Holland, D., Dale, A. M., Walhovd, K. B. Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative. What is normal in normal aging? Effects of aging, amyloid and Alzheimer's disease on the cerebral cortex and the hippocampus. Progress in neurobiology. 117, 20-40 (2014).
- Kovács, T., Cairns, N. J., Lantos, P. L. Olfactory centres in Alzheimer's disease: olfactory bulb is involved in early Braak's stages. Neuroreport. 12 (2), 285-288 (2001).
- Winblad, B., et al. Defeating Alzheimer's disease and other dementias: a priority for European science and society. The Lancet Neurology. 15 (5), 455-532 (2016).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- De Strooper, B., Karran, E. The Cellular Phase of Alzheimer's Disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Arendt, T., Brückner, M. K., Lange, M., Bigl, V. Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer's disease resemble embryonic development-A study of molecular forms. Neurochemistry International. 21 (3), 381-396 (1992).
- Auld, D. S., Kornecook, T. J., Bastianetto, S., Quirion, R. Alzheimer's disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Progress in Neurobiology. 68 (3), 209-245 (2002).
- Arendt, T., Bruckner, M. K., Morawski, M., Jager, C., Gertz, H. J. Early neurone loss in Alzheimer's disease: cortical or subcortical? Acta Neuropathol Commun. 3, 10 (2015).
- Mesulam, M. The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or Side Show? Learn Mem. , 43-49 (2004).
- Schliebs, R., Arendt, T. The cholinergic system in aging and neuronal degeneration. Behavioural Brain Research. 221 (2), 555-563 (2011).
- Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Wainer, B. H., Levey, A. I. Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1-Ch6). Neuroscience. 10 (4), 1185-1201 (1983).
- Mesulam, M., Mufson, E. J., Levey, A. I., Wainer, B. H. Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 214 (2), 170-197 (1983).
- Greenfield, S. Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the C-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the C-terminal and their relevance to neurodegenerat. Chemico-Biological Interactions. 203 (3), 543-546 (2013).
- Garcia-Ratés, S., et al. (I) Pharmacological profiling of a novel modulator of the α7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains. Neuropharmacology. 105, 487-499 (2016).
- Eimerl, S., Schramm, M. The quantity of calcium that appears to induce neuronal death. Journal of neurochemistry. 62 (3), 1223-1226 (1994).
- Greenfield, S., Vaux, D. J. Commentary Parkinson's Disease, Alzheimer's Disease and Motor Neurone Disease: Identifying a Common Mechanism. Science. 113 (3), 485-492 (2002).
- Badin, A. S., Morrill, P., Devonshire, I. M., Greenfield, S. A. (II) Physiological profiling of an endogenous peptide in the basal forebrain: Age-related bioactivity and blockade with a novel modulator. Neuropharmacology. 105, 47-60 (2016).
- Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -S., Greenfield, S. A. A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer's Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291 (2017).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Jensen, M. S., Lambert, J. D. C., Johansen, F. F. Electrophysiological recordings from rat hippocampus slices following in vivo brain ischemia. Brain Research. 554 (1-2), 166-175 (1991).
- Ferrati, G., Martini, F. J., Maravall, M. Presynaptic Adenosine Receptor-Mediated Regulation of Diverse Thalamocortical Short-Term Plasticity in the Mouse Whisker Pathway. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-9 (2016).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Badin, A. S., John, E., Susan, G. High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases. Neuropharmacology. 73, 10-18 (2013).
- Greenfield, S. A., Badin, A. S., Ferrati, G., Devonshire, I. M. Optical imaging of the rat brain suggests a previously missing link between top-down and bottom-up nervous system function. Neurophotonics. 4, 31213 (2017).
- Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of visualized experiments: JoVE. (48), (2011).
- Gong, C. -X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain. Brain Research Protocols. 6 (3), 134-140 (2001).
