Summary
Vários oligonucleotídeos antisenso (AONs) foram mostrados para induzir exon inclusão (modulação da tala) e resgatar a expressão SMN para atrofia muscular espinhal (SMA). Aqui, descrevemos um protocolo para lipotransfection AON induzir inclusão exon do gene SMN2 e os métodos de avaliação para determinar a eficácia em pacientes fibroblastos SMA.
Abstract
Atrofia muscular espinhal (SMA), uma doença neurológica letal causada pela perda de SMN1, apresenta um caso único no campo do oligonucleotide antisentido (AON)-mediada por terapia. Enquanto SMN1 mutações são responsáveis pela doença, AONs tala intrônicas silenciador (ISS) em sítios em SMN2, incluindo nusinersen aprovado pela FDA, foram mostrados para restaurar a expressão SMN e amenizar os sintomas. Atualmente, muitos estudos envolvendo terapia AON para SMA focar investigando romance químicos AON direcionamento SMN2 que pode ser mais eficaz e menos tóxico do que nusinersen. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliação em vitro de exon inclusão usando lipotransfection de AONs seguido por reação em cadeia da polimerase transcrição reversa (RT-PCR), reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) e mancha ocidental. Esse método pode ser empregado para vários tipos de produtos químicos da AON. Usando esse método, demonstramos que AONs composto de alternadas (LNAs) os ácidos nucleicos bloqueados e nucleotídeos do DNA (LNA/DNA mixmers) levam a eficiente SMN2 exon inclusão e restauração da proteína SMN em uma concentração muito baixa e portanto, LNA / Oligonucleotides antisentido baseado em mixmer de DNA podem ser uma estratégia terapêutica atraente para tratar a emenda defeitos causados por doenças genéticas. O in vitro avaliação método descrito aqui é rápido, fácil e sensível o suficiente para o teste de vários AONs romance.
Introduction
Atrofia muscular espinhal (SMA) é uma desordem neuromuscular fatal herdada em um padrão autossômico recessivo. É caracterizado pela degradação dos neurônios motores e tronco progressivo e21,paralisia do músculo membro. A maioria das ocorrências de SMA são devido a uma mutação homozigótica no gene de sobrevivência do neurônio motor 1 (SMN1)3. O gene de sobrevivência do neurônio motor 2 (SMN2) é uma duplicata inversa de SMN1e tem uma sequência praticamente idêntica, diferindo por apenas cinco bases4,5. Uma transição de C-a-T em SMN2 localizado no exon 7 faz o gene quase não funcionam porque a mutação leva o essencial exon 7 sendo excluídos em quase 90% de SMN2 transcrições (Figura 1um). MRNAs SMN2 faltando exon 7 não pode compensar a função SMN1 porque seu produto proteico é instável e é rapidamente degradado.
Terapia antisentida recentemente emergiu como uma estratégia promissora para o tratamento de SMA6. A recente aprovação de nusinersen por o E.U. Food and Drug Administration (FDA) disponibilizou o primeiro medicamento para o tratamento de SMA7. Nusinersen é uma 18-mer antisentido oligonucleotide (AON) com uma modificação de 2 '-O-metoxietílico (MOE) e um backbone phosphorothioate. A droga alveja o silenciador emenda intrônicas N1 (ISS-N1) localizado no intron 7 do gene SMN2 . Ligação de nusinersen de ISS-N1 promove a recuperação funcional expressão de proteína SMN completos do gene SMN2 endógenos induzindo exon 7 inclusão (Figura 1um)8,9,10 . Atualmente, muitos estudos envolvendo terapia AON para SMA focar investigando romance químicos AON que podem ser mais eficaz e menos tóxico do que nusinersen. Foi demonstrado que AONs com outros químicos induzem também eficientemente exon inclusão em SMN2 exon 7 tanto in vitro e in vivo11,12,13.
Ácidos nucleicos bloqueados (LNAs) são modificados quimicamente análogos de RNA contendo uma ponte metileno conectando ocarbono 4 ' - com o 2 ' -oxigênio dentro da estrutura (Figura 1b) de furanose14,15. Em comparação com DNAs ou RNAs, LNAs têm uma maior afinidade para ligação a sequências de RNA complementares e têm o benefício adicionado de ser altamente resistente à nucleases endógenas. A química do LNA foi aplicada para uso como sondas de fluorescência em situ da hibridação (peixe) e qPCR16,17. Além disso, é utilizado para regular a expressão gênica tanto in vitro e in vivo. GapmeR AONs são uma combinação de moléculas de ADN single-stranded, ladeado por vários LNAs nas extremidades 5 ' e 3 '. Eles Derrubem a expressão gênica por ligação complementares de mRNAs alvo, levando-os a ser degradada por RNase H registrados18. LNA/DNA mixmers são AONs que são compostas de nucleotídeos do DNA integrados entre LNAs. Apresentados na presente orientação eles podem vincular miRNA para inibir sua função (LNA-antimiR)19. Alguns LNA-antimiRs atingiram o desenvolvimento clínico. Para exemplos, miravirsen (AntimiR-122) é um LNA-antimiR que inibe a miR-122 para tratar a infecção da hepatite C e vários ensaios clínicos de fase II estão actualmente em curso19,20. Recentemente, foi demonstrado que o LNA/DNA mixmers também pode modular21o splicing de RNA. Pode ligar uma sequência específica de mRNA e induzir exon saltando na inclusão de mRNA e exon distrofina em SMN2 mRNA em vitro13,22.
Neste artigo, descrevem uma metodologia para a indução do exon inclusão usando AONs e a avaliação de eficácia a nível do RNA e proteína. Para exemplificar este método, usamos o LNA/DNA mixmers direcionamento ISS-N1 no intron 7 de SMN2. AONs transfectadas em SMA pacientes células por lipotransfection induziram exon 7 inclusão no final SMN2 transcrição e upregulation de produção de proteína SMN. Uma das vantagens de usar o LNA/DNA mixmers para induzir a exon inclusão é que a concentração eficaz para o transfection é significativamente menor do que outros produtos químicos13. Esse método pode ser usado para muitos outros AONs exceto phosphorodiamidate Morpholinos oligómeros (PMOs), que, devido a sua carga neutra, precisam inserir células através de endocitose induzida pelo reagente de transfeccao co Endo-Porter.
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Protocol
1. cultura de pilha
- SMA de cultura de fibroblastos paciente no meio de crescimento (Dulbecco modificado águia médio 1:1-12 (presunto) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 0,5% penicilina/estreptomicina) numa incubadora de CO2 a 37 ° C.
- Determinar a concentração de células usando um contador de célula automatizada e diluir as células a 1 x 105 células/mL no meio de crescimento, em seguida, sementes no prato apropriado. Use placas boas 12 (1 mL por bem) por RT-PCR ou qPCR.
- Incubar as placas por 24 h numa incubadora de CO2 a 37 ° C.
2. transfecção de mixmer LNA/DNA
- Certifique-se de confluência de célula de cerca de 65-80% de eficiência optimal do transfection.
- Descongele a 10 μM LNA/DNA mixmers lentamente no gelo.
- Em um tubo de 1,5 mL, prepare uma solução de x mixmer a 20, adicionando o mixmers aos meios privados de soro para que o volume final atinge 50 μL.
- Misture a solução de mixmer com 50 μL de meios privados de soro contendo o reagente de Transfeccao de 3% (proporção de 1:1).
- Incube durante 10 minutos à temperatura ambiente.
- Adicionar 900 μL privado de soro o meio com 5% FBS para cada tubo.
- Aspirar a velha mídia da placa e substituir com 1 mL de solução de mixmer LNA/DNA contendo o reagente de transfeccao.
- Incube as celulas por 24-48 h a 37 ° C numa incubadora de CO2 .
3. extração do RNA
- Remover o meio e adicione 1 mL do reagente de tiocianato-fenol-clorofórmio guanidínio às células. Lave a parte inferior dos bem várias vezes com guanidínio tiocianato-fenol-clorofórmio e recolhê-la nos tubos de 1,5 mL.
- Vórtice em alta velocidade por 30 s e loja a-80 ° C durante 1 h ou durante a noite.
- Descongele as amostras em temperatura ambiente e vórtice bem.
- Adicionar 200 clorofórmio µ l, agitar vigorosamente por 15 s e incubar a temperatura ambiente por 3 min.
- Centrifugar a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C.
- Recolha a fase aquosa clara superior para um tubo novo. Certifique-se de evitar coletar qualquer a interfase branca que se forma entre as fases superiores e inferiores.
- Adicionar 500 µ l isopropanol e 1 µ l 8 µ g / µ l glicogênio (grau de RNA). Vórtice de 10 s e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos ou a-20 ° C durante a noite.
- Centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C e remover todo o sobrenadante. Forma a uma bolinha branca na parte inferior do tubo.
- Adicionar 1 mL de etanol a 75% frio e centrifugar a 7.500 x g por 5 min a 4 ° C.
- Retire todo o etanol e seque a pelota à temperatura ambiente até não sobrar nenhuma etanol no tubo.
- Dissolva a pelota em 30 µ l DNase/RNase livre água e incubar durante 10 minutos a 60 ° C.
- Medir a concentração de RNA usando um espectrofotômetro (em 260 nm) e ajustar a concentração de RNA para 50 ng / µ l.
4. um passo de RT-PCR para medir a taxa de inclusão exon de SMN2
- Mix 12,5 µ l de 2x do amortecedor da reação de RT-PCR, mistura de 1,0 µ l da enzima de RT-PCR de uma etapa, 0,5 µ l de cada primer (SMN2 em frente: 5'-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3', SMN2 inverso: 5'-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3', GAPDH para a frente: 5'-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3', GAPDH inverso: 5'-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3', 2 µ l de RNA total (50 ng / µ l), e água destilada, 8,5 µ l de RNase/DNase-livre.
- Depois que o cDNA é sintetizado a 50 ° C por 15 min, inicie a reação de PCR. Amplificar o SMN2 exon 6-8 com 30 ciclos PCR (94 ° C por 15 s, 60 ° C por 30 s, 68 ° C por 25 s). Amplificar a GAPDH com 20 ciclos PCR (94 ° C por 15 s, 60 ° C por 30 s, 68 ° C por 20 s).
- Adicionar 5 μL 6 x tintura para o produto do PCR, de carga e carregar 5 µ l da mistura em um gel de agarose 2% e correr por 40 min a 100 V.
- O gel de imagem e analisá-lo usando software ImageJ.
- Medir a intensidade das bandas completos e bandas Δ7. Calcular a taxa do exon 7 inclusão pelo valor de intensidade de (completos) / (full-length + Δ7 SMN2).
5. quantitativo PCR (qPCR) para medir a taxa de inclusão exon de SMN2
- Para a síntese do cDNA, misture 1 µ l Oligo dT, 1 µ l 10mm dNTPs e 11 µ l total do RNA (50 ng / µ l). Incube a 65 ° C por 5 min.
- Colocar as amostras no gelo e adicionar 4 µ l 5 x tampão, 1 µ l 0,1 M DTT, 1 inibidor de RNase µ l e o transcriptase reverso 1 µ l de cada amostra.
- Incubar a 50 ° C por 60 min e aquecer até 80 ° C por 10 min parar a reação. O cDNA pode ser armazenado a-20 ° C.
- Dilua os cDNAs com água livre de RNase (diluição 1:5). Mix 10 µ l 2 x mistura de enzima SYBR Green qPCR, primeira demão de 10 µM cada 0,8 µ l (longa-metragem SMN2 em frente: 5 '-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT-3 ', longa-metragem SMN2 reverso: 5 '-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3 ′, Δ7 SMN2 em frente: 5 ' - TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′, Δ7 SMN2 inverso: 5 '-ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC-3 ′, GAPDH para a frente: 5 '-GCAAATTCCATGGCACCGT-3 ′, GAPDH inverter: 5 '-AGGGATCTCGCTCCTGGAA-3 '), 3 µ l diluída de cDNA e água livre de RNase a µ l 5.4.
- Inicie a reação de qPCR. Use as condições: 95 ° C por 30 s e, em seguida, um ciclo de 40 repita a 95 ° C por 5 s e 60 ° C durante 20 s.
- Calcular a expressão relativa de longa-metragem SMN2 para GAPDH ou Δ7 SMN2e normalizar às células não tratadas com o algoritmo ΔΔCt.
6. mancha ocidental
- Remover a transfeccao de células e lave uma vez com tampão fosfato salino (PBS).
- Adicione 100 µ l amortecedor do lysis com um inibidor da protease.
- Separar as células da parte inferior de cada poço com uma espátula de célula estéril e coletar em tubos de 1,5 mL. Incube as amostras no gelo por 30 min.
- Passe celular lisado agulha 21-G 10 vezes para esmagar as células.
- Centrifugar a 20.800 x g, durante 15 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante para novos tubos de 1,5 mL. A amostra pode ser armazenada em um congelador de-80 ° C.
- Determinar a concentração de proteína usando um Kit de ensaio de proteína BCA e ajustar a concentração de 1,0 µ g / µ l.
- Mistura de 5 µ l amostras e 5 µ l 2 x buffer de amostra de sódio Dodecil sulfato de sódio (SDS) (SDS 10%; 14% 0,5 M solução de Tris-HCl, pH 6.7; 0,5 M 1% com a solução de EDTA-2Na, pH 8.0; 20% glicerol; tintura de azul de bromofenol 0,004%, 5% β-Mercaptoetanol) e aquecer a 70 ° C por 10 min.
- Carregar as amostras em um 4-12% proteína Bis-Tris géis e executada por 1h em 150 V.
- Molhe um papel de filtro grosso em cada buffer: (buffer de ânodo concentrado: 0.3 M Tris-HCl, 20% de metanol; buffer de ânodo: 0,03 M Tris-HCl, 20% de metanol; buffer de cátodo: 25 mM Tris, 20% de metanol, o ácido 6-amino-n-hexanoico 40mm, 0,01% SDS).
- Mergulhe uma membrana (PVDF) de difluoreto de polivinilideno em metanol por 20 s, em seguida, transferi-lo para o buffer do ânodo.
- Equilibrar o gel depois de SDS-PAGE com o buffer do cátodo por 5-10 min sob agitação.
- Coloque os papéis de filtro, membranas PVDF e o gel em uma máquina de mancha semi-seca, como segue: concentrado ânodo reserva papel/ânodo reserva papel/PVDF/proteína de membrana gel/cátodo reserva papel (Figura 2).
- Cobrir a pilha e iniciar a transferência de 20 V por 30 min.
- Após a transferência, enxágue a membrana PVDF com PBST (PBS com 0,05% Tween 20) uma vez.
- Bloquear a membrana à temperatura ambiente por 30 min em 5% leite desnatado em pó dissolvido em PBST ou a 4 ° C, durante a noite.
- Dilua um anticorpo anti-SMN de rato purificado e um anticorpo anti-Cofilin 1:10,000 em 5% de leite desnatado em pó em PBST. Incube a membrana nele por 1h à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite.
- Lavar 3 vezes com PBST por 10 min.
- Dilua a anticorpos secundários (anti-rato caprinos conjugados a HRP e anti-rabbit IgG (H + L)) para 1:10,000 em 5% de leite desnatado em pó em PBST. Encube por 1h à temperatura ambiente no escuro.
- Lave a membrana 3 vezes com PBST por 10 min.
- Detecta o sinal de banda usando a kit de deteção mancha ocidental de quimioluminescência.
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Representative Results
Usando o pacientes fibroblastos SMA, escolhemos a região de silenciador de ISS-N1 no intron 7 do gene SMN2 com oito mixmers LNA/DNA antisentidos diferentes que foram transfectadas com uma concentração de 5 nM (Figura 3). Cada um do mixmers contido uma espinha dorsal modificada phosphorothioated que lhes permitiu resistir a degradação da nuclease. Para avaliar a eficácia da mixmers, a taxa de SMN2 exon 7 inclusão foi quantificada por RT-PCR e qPCR utilizando primers específicos para SMN2. A eficiência de inclusão do exon 7 variou de 78-98% quando transfected com mixmers #1-5 nas células doentes (Figura 4, b), enquanto a transfeccao utilizando mixmers #6-8 com a mesma dose não resultou em qualquer diferença significativa quando comparado com o controle. Os resultados obtidos da análise de qPCR também exibido que aumentou significativamente a quantidade de transcrição de mRNA SMN2 completos pelo mixmers #1-3 e #5 tratamentos quando comparado ao controle (Figura 4c).
Além disso, o resultado da mancha ocidental mostrou que transfeccao usando mixmers #1-5 habilitados maiores níveis de expressão de proteína SMN em pacientes fibroblastos (um 1.5 - 1.9-fold aumento do controle, Figura 5). Os tratamentos utilizando mixmers #6-8 não resultou em uma alteração do nível de expressão de proteína SMN nas células. Estes dados demonstram o transfeccao de LNA/DNA mixmers #1-5 induz a SMN2 exon 7 inclusão eficientemente em pacientes fibroblastos SMA.
Figura 1 : Estratégia de inclusão mediada por antisentido exon para tratar SMA. (a) uma transição de C-a-T no exon 7 do SMN2 leva à saltar do exon 7 em aproximadamente 90% das transcrições de SMN2 . Essas transcrições são fora-de-quadro e são rapidamente degradadas nas células. Oligonucleotídeos antisenso (AONs) vincular o silenciador emenda intrônicas N1 (ISS-N1), que induz a exon inclusão em SMN2. Os mRNAs de SMN2 exon 7-incluído pode produzir proteína SMN funcional. (b) estruturas químicas de RNA e phosphorothioated LNA. Pilares toda a mixmers que usamos neste artigo são phosphorothioated para prevenir a degradação. Esta figura foi modificada de Touznik et.al. 13. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Método de transferência semi secos para a mancha ocidental. Um papel de filtro grosso embebido em concentrado de buffer de ânodo (golpe), um papel de filtro grosso embebido no buffer do ânodo, uma membrana PVDF, um gel e um papel de filtro grosso embebido no buffer do cátodo são empilhados entre as duas placas de uma máquina de mancha semi seca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Sequência de DNA/LNA mixmer para SMN2 exon 7 inclusão. Base de DNA: G, A, T, base C. LNA (vermelho): G, + A, T, + C. Phosphorothioated DNA base: G * A *, T *, C *. Base Phosphorothioated LNA (vermelho): G *, A *, + T *, + + C *. Esta figura é reproduzida de Touznik et.al. 13. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Resultados representativos de RT-PCR e qPCR para avaliar a eficácia do LNA/DNA mixmers. Transfecção de mixmers #1-5 leva a SMN2 exon 7 inclusão em uma taxa significativamente maior do que o simulado do transfection. (um) RT-PCR de SMN2 e GAPDH em fibroblastos pacientes SMA seguindo transfeccao na concentração de 5 nM. Banda Top: exon 7-incluído completos SMN2 mRNA. A banda inferior: exon 7-excluídos SMN2 mRNA. (b) análise quantitativa de SMN2 exon 7 inclusão em fibroblastos tratados com mixmer SMA usando RT-PCR. (c) expressão relativa análise de longa-metragem SMN2 para GAPDH medido usando qPCR. Os dados foram normalizados para células controle não tratados. Barras de erro representam média ± desvio-padrão (três experimentos independentes). Foi realizada a ANOVA One-Way com teste de comparação múltipla de Dunnett. M: zombar de controle, NT: não tratados, células de fibroblastos de controle saudável h:, b: em branco. Esta figura é reproduzida de Touznik et.al. 13. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Resultados representativos da mancha ocidental para medir a expressão de proteína SMN. Transfecção de mixmers o LNA/DNA aumenta a produção de proteína SMN. (a) mancha ocidental de SMN e Cofilin (controle de carregamento) de fibroblastos SMA pacientes saudáveis e tratados com mixmer. (b) dobra aumento nos níveis de proteína SMN de fibroblastos de SMA mixmer-tratados. Transfecção de mixmers #1-5, na concentração de 5 nM aumenta significativamente a produção de proteínas de SMN. Os dados foram normalizados para a relação de SMN/Cofilin em fibroblastos de SMA não tratados. Barras representam a média ± desvio-padrão (quatro experimentos independentes). Foi realizada a ANOVA One-Way com teste de comparação múltipla de Dunnett. M: zombar de controle, NT: não tratados. Esta figura é reproduzida de Touznik et.al. 13. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O in vitro avaliação método descrito aqui é rápido, fácil e sensível o suficiente para o teste de vários AONs. Este protocolo é amplamente aplicável a exon saltando e inclusão de outros genes e vários tipos de células. Além disso, a maioria dos produtos químicos AON (exceto PMOs) podem transfected usando esse método. AONs pode regular a emenda de pre-mRNA de genes endógenos e artificialmente introduzidos e pode ser co transfectadas com vetores de plasmídeo carregando genes alvo.
Uma etapa fundamental desse método é que a confluência de célula deve ser cerca de 65-80% quando AONs são transfectadas em fibroblastos. Esta condição pode ser diferente para outros tipos de células. A melhor concentração de AONs para transfeccao pode também ser diferente (0,5 - 100 nM), dependendo de sequências alvo e tipos de células.
Este método não é sem armadilhas potenciais. Por exemplo, a eficácia de mixmers é determinada por sequências de mixmers e composição de LNA/DNA. Para ISS-N1, um mixmer, que é composto de LNAs com DNA, sendo substituído pelo LNA em cada posição do terceira nucleotídeo, foi mais eficaz do que um mixmer com uma sequência equivalente com substituição de DNA em todos os outro nucleotídeos ou tudo-LNA do oligonucleotide13 . No entanto, isso pode ser diferente para outras sequências de destino. Portanto, é necessário otimizar as sequências de DNA/LNA mixmers e avaliar a eficácia do mixmers a nível de RNA antes de prosseguir. As espinhas dorsais inteiras de mixmers devem ser phosphorothioated para evitar a degradação. Além disso, embora esse método de transfeccao mediada por lipotransfection pode ser usado para a maioria dos produtos químicos da AON, não pode ser usado para phosphorodiamidate de carga neutra Morpholinos oligómeros (PMOs), desde lipotransfection requer negativamente oligonucleotídeos carregados. Para métodos de Transfeccao de PMO, vê em outros lugares23,24,25.
Embora este método é útil para testar novos AONs, o modelo de células de fibroblastos SMA não recapitular na vivo condições na sua totalidade. Modelos animais podem servir como uma importante fonte para testar na vivo eficácia e segurança26.
Para pular de exon/inclusão, PMO e modificação de 2 '-O-metoxietílico (2' MOE) podem ser usados em vez de LNA/DNA mixmers27,28. No entanto, a concentração ideal dessas químicas para transfeccao são normalmente muito mais elevado de29,30. Por causa da melhor eficácia em comparação com outros produtos químicos antisentidos, o uso de oligonucleotídeos antisenso baseado em mixmer LNA/DNA pode ser uma estratégia terapêutica atraente para tratar a emenda defeitos causados por doenças genéticas no futuro.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecer Nicole McRorie ajuda com os experimentos. Este trabalho foi apoiado pela faculdade de medicina e odontologia, Slipchuk SMA Research Foundation Research Grant, institutos canadenses de pesquisa da saúde (CIHR), os amigos de Garrett Cumming pesquisa fundos, HM Toupin neurológico da Universidade de Alberta Fundos de investigação científica, o Canadá de Distrofia Muscular, a Fundação do Canadá para a inovação, Alberta Enterprise e educação avançada e as mulheres e das crianças Instituto de pesquisa de saúde (WCHRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SMA Fibroblasts | Coriell NIGMS human genetic cell repository | GM03813 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol) | Thermo Fisher | 15596-018 | |
| RT-PCR Primers | Sequence 5' to 3' | ||
| SMN2 forward: | CTGCCTCCATTTCCTTCTG | ||
| SMN2 reverse: | TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC | ||
| GAPDH forward: | TCCCTGAGCTGAACGGGAAG | ||
| GAPDH reverse: | GGAGGAGTTTGGTCGCTGT | ||
| qPCR Primers | |||
| full-length SMN2 forward: | GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT | ||
| full-length SMN2 reverse: | CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT | ||
| GAPDH forward: | GCAAATTCCATGGCACCGT | ||
| GAPDH reverse: | AGGGATCTCGCTCCTGGAA | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher | R0551 | |
| ImageJ Software | |||
| Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
| Cathode Buffer | 0.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
| Anode Buffer | 0.03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
| Concentred Anode Buffer | 0.3 M Tris base + 20% Methanol | ||
| Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| PVDF membrane | GE | 10600021 | |
| Loading/sample buffer for Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
| One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
| dNTPs | Clontech | 3040 |
References
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