Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um anticorpo bispecific GPC3-S-Fab em Escherichia coli. O GPC3-S-Fab purificado tem potente citotoxicidade contra células de câncer de fígado positivo GPC3.
Abstract
Este protocolo descreve a construção e estudos funcionais de um anticorpo bispecific (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs pode reconhecer dois diferentes epitopos através de suas duas armas diferentes. bsAbs têm sido estudados ativamente por sua capacidade de recrutar diretamente as células imunes para matar células tumorais. Atualmente, a maioria dos bsAbs é produzida na forma de proteínas recombinantes, quer como bsAbs Fc-contendo derivados de bsAb menores sem região Fc. Neste estudo, GPC3-S-Fab, um anticorpo de bispecific com base de anticorpo fragmento (Fab), foi projetado, vinculando o Fab do anticorpo anti-GPC3 GC33 com anticorpos anti-CD16 único domínio. O GPC3-S-Fab pode ser expressa em Escherichia coli e purificado por duas cromatografias de afinidade. O purificado GPC3-S-Fab especificamente pode vincular a e matar células de câncer de fígado positivo GPC3 através do recrutamento de células de assassinas naturais, sugerindo uma potencial aplicação de GPC3-S-Fab na terapia do câncer de fígado.
Introduction
Os anticorpos monoclonais são agora amplamente utilizados para tratamento de câncer1. Devido à flexibilidade dos anticorpos, vários formatos baseados em anticorpos têm sido ativamente explorados. Comparado com anticorpos monoclonais, bsAbs ter dois módulos de ligação diferente do antígeno, permitindo-lhes a reconhecer dois alvos diferentes simultaneamente e de forma eficiente acionar o recrutamento de células imunes efetoras para alvejar e matar células de tumor2.
Formatos de recombinantes bsAb atual podem ser geralmente atribuídos a duas classes: Fc-contendo bsAbs e bsAbs sem uma região de Fc. Comparado com formatos Fc-contendo principalmente produzidos em células de mamíferos, bsAbs sem uma região Fc tem as vantagens de tamanhos menores, mais facilmente são produzidos em sistemas de expressão de microorganismo e podem penetrar em tecidos de tumor mais eficientemente 3.
bsAbs sem uma região de Fc são formados comumente vinculando metades de vinculação individual, como fragmentos de variável de cadeia única (scFvs) ou Fabs3. Sem os domínios de estabilização, bsAbs com base em fragmentos scFv frequentemente ter comprometido a estabilidade térmica, baixa solubilidade ou um aumento potencial de agregação de4,5. Em contraste, bsAbs baseada na Fab são mais estáveis devido a heterodimerization do CH1 e CL no nativo moiety Fab4,6.
Domínio variável da cadeia pesada-somente anticorpos (VHHs, também conhecidos como anticorpos único domínio) são o ativo fragmento de antígeno-ligando da cadeia pesada natural anticorpos7. VHHs tem as características de alta afinidade, especificidade de convencional IgGs8, baixa imunogenicidade e rendimentos elevados em expressão bacteriana9. Comparado com fragmentos de Fv, VHHs ter maior estabilidade térmica10. Comparado com Fab metades, VHHs têm tamanhos menores devido à falta de CH1 e CL. Assim, S-Fab, o formato de bsAb obtido, vinculando o Fab com um anticorpo de domínio único, VHH, foi concebido e estudado por seus efeitos anti-tumorais11,12.
Neste estudo, foi descrita a construção de GPC3-S-Fab, vinculando o Fab de hGC3313 com um anti-CD16a VHH14 . O GPC3-S-Fab pode ser eficientemente produzido por periplasmático expressão em Escherichia coli (e. coli). Estudos funcionais de GPC3-S-Fab sugeriram que GPC3-S-Fab é uma estratégia promissora para a terapia do câncer de fígado. Assim, as vantagens do GPC3-S-Fab em técnicas alternativas com referências aplicáveis aos estudos anteriores incluem fácil produção e purificação e bsAbs mais estável.
Sistemas de expressão de mamíferos e expressão procarióticas têm sido utilizadas para expressar vários formatos de BsAbs. Em contraste com sistemas de expressão dos mamíferos, e. coli-sistemas de expressão de proteínas com base tem muitos benefícios, incluindo rendimentos elevados, baixo custos e labor-saving, a facilidade de manipulações genéticas e transformação de alta eficiência15. Para bsAbs expressão em e. coli, existem duas estratégias básicas: expressão no citoplasma e expressão no periplasm entre o citoplasma e membranas externas de célula15. Em comparação com o ambiente redutor do citoplasma, o periplasm é um oxidante mais ambiente, que promove o dobramento correto e co expressão de proteínas16. Dobramento correto desempenha um papel fundamental na geração de solubilidade, estabilidade e função de bsAbs. Portanto, um sinal sequência pelB foi adicionado para o N-terminal do Fab-S para dirigir a secreção para o periplasm de Escherichia coli17. Para garantir a correta de dobramento, solubilidade, estabilidade térmica e estabilidade conformacional, reduzindo a complexidade e o tamanho de um anticorpo é frequentemente empregado16. O formato S-Fab consiste de um fabuloso e um VHH, que se expressa muito bem em sistemas bacterianos prováveis devido à estrutura simples e pequeno tamanho.
GPC3 foi escolhido neste formato de anticorpo bispecific GPC3-S-Fab. Glypican-3 (GPC3) é um membro da família de proteoglicano de sulfato (HS) heparina que é ancorado à superfície da célula através de de glicosilfostidilinosiol (GPI)18. GPC3 é Blumental em 70% dos casos de carcinoma (HCC) hepatocelular, que representam a maioria dos cânceres de fígado19,20,21,22. Porque GPC3 raramente é expressa em tecidos normais, GPC3 tem sido proposto como um alvo potencial para HCC. Múltiplos do mouse mAbs foram produzidos contra GPC3. No entanto, apenas GC33 exibiu limitada atividade anti-tumoral 22, e que não apresentam eficácia clínica em pacientes. Neste estudo, GPC3-S-Fab foi mostrado para ser capaz de recrutar células NK para matar de células de tumor GPC314.
Para recrutar células NK, anti-CD16 VHH foi usado. CD16a é um receptor de IgG de baixa afinidade, expressado principalmente em células assassinas naturais (NK), macrófagos, monócitos e alguns subtipos de células T. Está envolvido na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) por NK células23. Células NK humanas podem ser classificadas em dois tipos, CD56 - CD16 + e CD56 + CD16-. Em contraste com as células NK CD56 + CD16−, CD56-células CD16 + NK podem liberar os níveis mais elevados de perforina e granzime B e, portanto, apresentar uma forte citotoxicidade24. Células de Kupffer (KCs), expressando a CD16a, são os macrófagos residentes no fígado. Células de Kupffer desempenham um papel importante na supressão de câncer de fígado,25. Assim, bsAbs segmentação CD16a pode ser uma estratégia mais promissora do que enfrentar as células T contra câncer de fígado.
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Protocol
Todos os procedimentos, incluindo a coleta de sangue humano foram aprovados pelo Comitê de ética Sun Yat-Sen University.
1. GPC3-S-Fab Design Estratégia
- Projeto GPC3-S-Fab, vinculando um Fab de anti-GPC3 (humanizado GC3313) com um anti-CD16 VHH14 (Figura 1).
- Sintetizar e clonar o CH1-VHH-CD16-VH e VL-CL em vetores pET26b e pET21a, como relatado anteriormente,12.
2. transformação e cultura
- Adicionar 100 ng de pET26b contendo VH-CH1-CD16 (figura 1A) e 100 ng de pET21a contendo VL-CL (figura 1A) em 100 µ l de competente BL21 (DE3) células. Misture bem e incubar no gelo por 30 min. Incubar em banho-maria para 45-90 s, transferência, 42 ° C e incubar no gelo por 3-5 min.
- Adicionar 500 µ l de meio de caldo de carne (LB) lisogenia num tubo contendo BL21 (DE3) cells e então incubar a 37 ° C, 150 rpm de 45-60 min. espalhar 100 µ l de BL21 (DE3) células na LB-ágar placas contendo 50 µ g/mL de canamicina e 100 µ g/mL de ampicilina e então incubar a 37 ° C, durante 12-16 h.
- Prepare lisogenia suporte de caldo (LB): 1% wt/vol triptona, extrato de levedura 0,5% vol/wt, wt/vol. 1% NaCl.
- Inocule as células de uma única colônia em 5 mL de meio de caldo super (SB), contendo 50 µ g/mL de canamicina e 100 µ g/mL de ampicilinae cultura a 37 ° C, 220 rpm, durante a noite. Em seguida, inocule 1 mL da cultura em 100 mL de meio de SB contendo 50 µ g/mL de canamicina e 100 µ g/mL de ampicilina e cultura a 37 ° C, 220 rpm para 4 h. Em seguida, transferi 10 mL da cultura para 1 L de meio de SB contendo 50 µ g/mL de canamicina e 100 µ g/mL de ampicilina e cultura a 37 ° C, 220 rpm.
- Prepare caldo super suporte: 3,2% wt/vol triptona, wt/vol. 2% de extrato de levedura, wt/vol. 0.5% NaCl.
- Quando o OD600 atinge 0,6 - 0,8, adicionar isopropil-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) a uma concentração final de 0,2 mM. Cultura a 16 ° C, 180 rpm para 36-48 h para expressão periplasmático.
3. GPC3-S-Fab periplasmático purificação
- Preparação de fração periplasmático
- Coletar as células por centrifugação a 4.000 x g, 4 ° C por 30 min, descartar o meio e pesar as células.
- Ressuspender as células completamente em 4 mL de solução de sacarose gelada (20mm de Tris-HCl, pH 7,5; 25% (wt/vol) de sacarose e 1 mM de EDTA) por grama de células e incubar no gelo por 15 min.
- Centrifugar a 8.500 x g (centrífuga de mesa, rotor de ângulo fixo), 4 ° C por 20 min. Retire o sobrenadante (a fração da sacarose) e salve-o no gelo.
- Resuspenda as bolinhas em uma mistura de gelado 5 mM de MgCl2 e 1mm de PMSF (4 mL por grama de células). Adicionar 40 µ l da unidade populacional de lisozima (15 mg/mL) por grama e incubar no gelo por 30 min.
- Centrifugar a 8.500 x g (centrífuga de mesa, fixada do rotor ângulo), 4 ° C por 20 min. transferência do sobrenadante (a fração periplasmático) e salve-o no gelo.
- Combinar a fração da sacarose e fração periplasmático e centrifugar a 30.000 x g, 4 ° C por 30 min. Retire o sobrenadante e salvá-lo em um tubo cónico de 50 mL no gelo.
- Purificação da afinidade NI-NTA
- Resuspenda 1ml de agarose Ni-NTA misturando cuidadosamente para obter uma suspensão homogênea, retire 1 mL de Ni-NTA agarose para um tubo cónico de 15 mL e juntar 10 volumes (CV) de coluna equilibração tampão (25 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 1m de NaCl) para equilibrar.
- Centrifugar a 400 x g por 5 min e remover o sobrenadante cuidadosamente. Em seguida, adicione o agarose Ni-NTA para o tubo de 50 mL contendo a fração da sacarose e fração periplasmático. Rocha a 4 ° C por 2 h.
- Centrifugue a mistura a 400 x g, 4 ° C por 5 min. Retire com cuidado o sobrenadante para outro tubo gelado fresco como a fração não acoplado. Transferi o agarose Ni-NTA uma coluna de gravidade.
- Adicionar 10 CV de tampão de lavagem (25 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 1m de NaCl; 20 mM, 30 ou 40 mM do imidazol) para a coluna e coletar a elute como a fração de lavagem.
Nota: Estas soluções devem ser adicionadas na ordem de concentrações crescentes de imidazol. - Adicionar 3 CV de eluição (25 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 300 mM de NaCl; 100mm, 200mm, 300mm ou 400mm de imidazol) do buffer para a coluna e coletar a elute como fração de eluição, 1, 2, 3 e 4.
Nota: Estas soluções devem ser adicionadas na ordem de concentrações crescentes de imidazol. - Diálise as frações eluted em 2 L de PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM Na2HPO4, 2mm de KH2PO4, pH 7,4) usando a tubulação da diálise (12.4 kDa) a 4 ° C por 2 h. verificar a presença de GPC3-S-Fab em 12% SDS-PAGE e em seguida por Coloração azul de Coomassie.
- Purificação da afinidade de igG-CH1
- Transferir 1 mL de resina de afinidade de IgG-CH1 para um tubo cónico de 50 mL e lave os grânulos com PBS primeiro. Em seguida, adicione a solução dializada contendo GPC3-S-Fab após etapa 3.2.6. Rocha a 4 ° C por 2 h.
- Centrífuga a 400 x g por 5 min, 4 ° C. Cuidadosamente Retire o sobrenadante para outro tubo gelado fresco e transferir a resina para uma coluna de gravidade.
- Adicionar 10 CV de lavagem buffer (PBS) para a coluna e recolher a eluição como a fração de lavagem.
- Prepare os tubos de coleta, acrescentando 1 M de Tris pH 9.0 (0,1 mL de cada fração eluted por mL). Eluir com tampão de eluição 3 CV (0,1 M de glicina-HCl, pH 2.7) e recolher a fração eluted; repeti 3 vezes.
- Diálise, as frações eluted em 2 L de PBS usando a tubulação da diálise (12.4 kDa) a 4 ° C por 2 h. repetir duas vezes.
- Determinar a concentração de proteína por ultramicrospectrophotometer (coeficiente de extinção Molar: 91105. um 1280 = 0,69 mg/L).
4. SDS-PAGE e Western Bloting análise
- Levar um 10 µ l da amostra em 5x do amortecedor do carregamento SDS e misture bem. Ferva a mistura de proteína a 100 ° C por 5 min.
- Prepare-se 5 x amortecedor do carregamento SDS: 250 mM de Tris-HCl, pH 6,8, wt/vol. 10% SDS, 0,5% wt/vol azul de bromofenol, 50% vol/vol glicerol, 5% vol/vol beta-Mercaptoetanol.
- Prepare um gel de SDS-PAGE com um gel de carregamento (5%) e o gel de separação (12%) como descrito anteriormente,26,,27,28.
- 10 µ l da mistura cozida da proteína e proteína de carregar e executar o SDS-PAGE.
- Manchar o gel por agitação por 20 min com solução de azul brilhante de Coomassie e em seguida, executar a descoloração.
- Para a mancha ocidental, após ser transferido para uma membrana PVDF, bloquear a membrana com TBST (20mm de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 0,1% vol/vol Tween 20) + 5% wt/vol desnatar o leite por 1h à temperatura ambiente e agitando.
- Incubar a membrana com anticorpos primários (antisua ou anti-Flag) diluído 1:2,000 em TBST + 5% de leite desnatado por 1h.
- Lavar com TBST por 5 min à temperatura ambiente e repetir 3 vezes.
- Incube a membrana em 1:2,000 anticorpo secundário (anticorpo Fc HRP-lig anti-rato) diluído em TBST + 5% de leite desnatado por 1h.
- Lavar com TBST por 5 min à temperatura ambiente e repetir 3 vezes.
- Adicionar 1 mL de substrato HPR pela película, desenvolver e captar imagens.
5. gel filtração análise
- Use a seguinte coluna: volume de coluna de 24 mL; Tampão de equilíbrio do pH PBS 7,4; Taxa de fluxo de 0,5 mL/min no quarto temperado; Volume de amostra de 200 µ l.
- Use o seguinte volume de proteína e concentração: 500 µ l de 1,2 mg/mL GPC3-S-Fab. Centrifugar a 20.000 x g durante 30 minutos e leva 200 µ l da carregar.
- Para o volume de marcador de proteína e concentração, ter 100 µ l de citocromo C (2 mg/mL, 12.4 kDa), 140 µ l de carbônica (3 mg/mL, 29 kDa), 140 µ l de albumina (10 mg/mL, 66 kDa) e 200 µ l de desidrogenase do álcool (5 mg/mL, 150 kDa) em um tubo. Centrifugar a 20.000 x g durante 30 minutos e leva 200 µ l da carregar.
- Antes de cada corrida, lavar pelo menos 2 CV de água destilada a uma velocidade de 0,5 mL/min.
- Equilibrar a coluna pelo menos 2 CV do buffer de equilibração (PBS, pH 7,4) a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min.
- Injete automaticamente a amostra em 0,5 mL/min para carregar a amostra.
- Eluir com buffer de equilibração em 0,5 mL/min e detectar a 215 e 280 nm.
6. fluxo Cytometry Analysis
- Cultura do HepG2 (GPC3 positivo), Hep3B (GPC3 positivo), Huh7 (GPC3 positivo) e células MHCC - 97H (GPC3 negativo) em pratos plásticos 100 x 20 mm, contendo meio DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS), penicilina (100 µ g/mL) e estreptomicina (50 µ g/mL) a 37 ° C, 5% de CO2.
- Células CHO (GPC3 negativo) cultura e células CHO/GPC3 abrigando completos humano GPC3 cDNA (GPC3 positivo) em pratos plásticos 100 x 20 mm, contendo meio RPMI 1640 com 10% FBS, penicilina (100 µ g/mL) e estreptomicina (50 µ g/mL) a 37 ° C, 5% de CO2.
- Cultura do NK92/CD16 abrigando humanos completos CD16 cDNA (CD16 positivo) em frasco de 25cm2 contendo meio RPMI 1640 com 10% FBS, penicilina (100 µ g/mL) e estreptomicina (50 µ g/mL) a 37 ° C, 5% de CO2.
- Quando as células são 70-90% de confluencia, descartar o meio e lavar as células com 2 mL de PBS. Adicione 1 mL de tripsina 0,25% e incubar a 37 ° C durante 2-3 minutos (ou até que as células começam a se separar da superfície). Adicione 1 mL do meio de crescimento completo para neutralizar a tripsina e ressuspender as células pipetando delicadamente acima e para baixo.
- Contar o número de células usando um hemocytometer de Neubauer e detectar a viabilidade celular por Trypan Blue.
- Colete 3 x 106 células para cada linha de celular. Adicione 1 mL de PBS + 0,2% de BSA para re-suspender as células. Centrífuga a 200 x g, 4 ° C por 5 min. repetir duas vezes.
- Adicionar 0,3 mL de PBS + 0,2% de BSA para re-suspender as células e transferir 100 µ l (aproximadamente 1 milhão) para cada tubo 5 mL de fundo redondo poliestireno.
Nota: Por favor, certifique-se de todos os passos daqui para os tubos devem ser mantidos frios no gelo. Quando o anticorpo é vinculativa para o antigénio de superfície da célula, o complexo vai começar a interiorizar. Mantendo-o frio, o processo é abrandado significativamente. - Adicionar 10 µ l de anticorpos primários (GPC3-S-Fab ou IgG1 humano, a concentração final de 5 µ g/mL) para cada tubo e incubar no gelo por 1h.
- Adicionar 1 mL de PBS + 0,2% de BSA para lavagem e centrífuga a 200 x g, 4 ° C por 5 min. repetir três vezes.
- Ressuspender em 100 µ l de PBS + 0,2% BSA e então adicione 0,5 µ l de anticorpo secundário (anti-humano IgG(H+L)-488, final concentração 10 µ g/mL) e incubar no gelo por 1 h. Nota: esta etapa, por favor, mantenha as células da luz.
- Adicionar 1 mL de PBS + 0,2% de BSA para lavagem e centrífuga a 200 x g, 4 ° C por 5 min. repetir três vezes.
- Analise as células pelo citômetro de fluxo, de acordo com o protocolo padrão de29. Adquira as células com um laser de 488 nm para a excitação.
7. citotóxicos ensaios
- Prepare as células do tumor.
- Cultura HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H e CHO células linhas como descrito nos passos 6.1-6.5.
- Diluir as células de 0,5 × 105/mL e 100 µ l células (5.000 por alvéolo) em placas de 96 poços da placa. Cultura de 6-8 h para permitir que as células anexar.
- Prepare células mononucleares de sangue periférico (PBMC).
- Dilua o sangue fresco preparado, com um volume igual de PBS em um tubo cónico de 50 mL. Por exemplo, dilua 10 mL de sangue com 10 mL de PBS.
- Ter 15 mL do meio de separação de linfócitos em um tubo de cónico de 50 mL. Transferi o sangue diluído no meio de separação de linfócitos ao longo do lado do tubo lentamente.
Nota: Mantenha o tubo vertical. Não quebre a superfície do meio de separação de linfócitos. - Centrifugar a 400 x g durante 35 min à temperatura ambiente, com o freio, fora.
- Lentamente retire a camada superior de plasma e tirar a camada de sangue branco contendo PBMCs na interface médio de separação do plasma-linfócito.
- Diluir os PBMCs com duplo volume de PBS + 2% FBS. Centrifugar a 400 x g durante 5 min.
- Lavar as células duas vezes com PBS + 2% FBS. Centrifugar a 400 x g por 5 min. contar o número de células, conforme descrito na etapa 6.5.
- Prepare células NK.
- Preparar a suspensão de PBMC na concentração de 5 x 107 células/mL de PBS + 2% FBS e lugá-los em um tubo de fundo redondo de poliestireno 5 mL.
- Adicione células NK humana Cocktail de enriquecimento em 50 µ l/mL de células. Misture bem e incubar a temperatura ambiente por 10 min.
- Ressuspender as partículas magnéticas da célula NK kit de enriquecimento e misture bem para garantir que eles estão uniformemente suspensa pipetando cima e para baixo vigorosamente mais de 5 vezes. Transferi as partículas magnéticas ressuspensão em 100 µ l/mL para a suspensão de eritrócitos. Misture bem e incubar a temperatura ambiente por 5 min.
- Traga a suspensão de eritrócitos até um volume total de 2,5 mL adicionando PBS + 2% FBS. Misture as células no tubo pipetando delicadamente acima e abaixo de 2 - 3 vezes. Coloque o tubo (sem a tampa) para o ímã. Deixa os grânulos magnéticos fixarem-se por 2,5 min à temperatura ambiente.
- Remova o Magneto. Em um movimento contínuo, inverta o tubo, decantar a suspensão enriquecido de células para um tubo novo.
- Conte o número de células, conforme descrito na etapa 6.5.
- Configure a reação citotóxica.
- Dilua as células NK × 10 55 células/ml utilizando o meio de cultura correspondente. Adicione 100 µ l de suspensão de células NK para as células do tumor banhadas em uma placa de 96 poços.
- Adicione 10 µ l de GPC3-S-Fab em diferentes concentrações, com a dose mais elevada em uma concentração final de 30 µ g/mL, 3 vezes diluição, 9 pontos (três repetições).
- Incube a 37 ° C, 5% de CO2 por 72 h.
- Após 72 h de incubação, remover o meio, adicionar 100 µ l de meio DMEM contendo 10 µ l de reagente CCK8 a cada poço em placas de 96 poços e então incubar a 37 ° C.
- Leia a placa a 450 nm a 1, 2, 3 e 4 h após a adição do reagente de CCK8.
- Analise os dados. Calcular a taxa de sobrevivência como (OD450 GPC3-S-Fab + efetoras + tumor - OD450 médio) / (OD450 tumor - OD450 médio) × 100% e (OD450 GPC3-S-Fab + tumor - OD450 médio) / ( tumor de OD450 - OD450 médio) × 100%. As células efetoras são células NK.
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Representative Results
Purificação de GPC3-S-Fab
GPC3-S-Fab foi purificado de e. coli por uma purificação da afinidade em duas etapas, primeiro com Ni-NTA-agarose, seguido de purificação de IgG-CH1 afinidade. Após a purificação da afinidade em duas fases, GPC3-S-Fab foi purificado a homogeneidade com as duas correntes perto de 1:1 (Figura 2A). A presença de polipeptídeos tanto VHH CD16-CH1-VH e VL-CL pode ser identificada por suas marcas distintas do C-terminal, antisua para o VL-CL aproximadamente 25 kDa e antibandeira para o VH-CH1-VHH aproximadamente 38 kDa (Figura 2B). Após a purificação da afinidade em duas fases, ~1.2 mg de proteína pode ser obtido de 1 L de cultura SB. Para caracterizar ainda mais o purificado GPC3-S-Fab, realizou-se o gel filtração. GPC3-S-Fab baseia os marcadores padrão (Figura 2), foi identificado como um monômero homogêneo sob a forma de um heterodímero com um tamanho molecular de aproximadamente 63 kDa (Figura 2).
Actividades de ligação GPC3-S-Fab
Para avaliar se o GPC3-S-Fab reconhece as células GPC3-positivo e células CD16-positivo, análise de citometria de fluxo foi realizado utilizando as linhas de células de câncer de fígado GPC3 positivo HepG2, Hep3B, Huh7, CHO/GPC3 e a linhagem de células de câncer de fígado GPC3-negativo, MHCC - 97H e células CHO. O GPC3-S-Fab pôde ligar para todas as células GPC3 positivo, embora com ligação mais fraca para Hep3B (Figura 3B) e células de Huh7 (Figura 3) do que para HepG2 (Figura 3A) e CHO/GPC3 (Figura 2F). Não ou vinculação mínima de células CHO e GPC3 negativo MHCC - 97H foi observada (Figura 3D, 3E). O GPC3-S-Fab também pôde se ligar às células CD16-positivo, NK92/CD16 células (Figura 3). Estes resultados são consistentes com os resultados anteriores usando os outros anti-GPC3 anticorpos30, sugerindo que GPC3-S-Fab especificamente pode ligar positivo GPC3 célula linhas e células CD16-positivo.
Para avaliar a citotoxicidade de GPC3-S-Fab, células tumorais foram incubadas com frescas células NK isoladas, com diferentes concentrações de GPC3-S-Fab. Sem as células NK, GPC3-S-Fab não tinha nenhum citotoxicidade contra células tumorais, independentemente do status de expressão GPC3 (Figura 4). Na presença de células NK, GPC3-S-Fab desencadeou forte citotoxicidade contra células HepG2, Hep3B e Huh7 de forma dose-dependente, mas não mostrou nenhum efeito nas células GPC3 negativo MHCC - 97 H (Figura 4), sugerindo que a citotoxicidade de GPC3-S-Fab depende GPC3 expressão na superfície das células do tumor.
Figura 1. Construções da GPC3-S-Fab
(A) a expressão bacteriana construções da GPC3-S-Fab. As construções de contenham uma sequência de sinal pelB , um humanizado anti-GPC3 (GC33) VH-CH1-anti-CD16 VHH (cadeia pesada), ou um VL-CL (cadeia leve). Para facilitar a deteção de proteínas e a purificação, uma marca de bandeira ou marca His8 foi adicionada para o C-terminal. (B) diagrama de GPC3-S-Fab após expressão co.
Figura 2. GPC3-S-Fab purificação de e. coli.
Painel da esquerda (A), após cromatografia de afinidade Ni-NTA; Painel à direita, após cromatografia de afinidade anti-IgG-CH1; M, peso molecular escada; Coloração azul de Coomassie. (B) painel à esquerda, depois de cromatografia de afinidade Ni-NTA; Painel à direita, após cromatografia de afinidade anti-IgG-CH1; M, peso molecular escada; Western-mancha. (C) análise de filtração de GPC3-S-Fab do Gel. Painel superior, marcadores padrão; painel inferior, GPC3-S-Fab. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. GPC3-S-Fab reconhece GPC3 células positivas e células CD16-positivo.
Fluxo cytometry análise de HepG2 (A), Hep3B (B), Huh7 (C), MHCC - 97 H (D), (E), de CHO CHO/GPC3 (F) e (G) de NK92/CD16 células foi realizada conforme descrito no protocolo. Linha vermelha: tumor de células; Linha verde: isotipo controle, célula de tumor humano IgG1 + anti-humano IgG(H+L)-488; linha azul: célula de tumor, GPC3-S-Fab + IgG (H + L)-488 anti-humano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. GPC3-S-Fab promove a morte celular das células cancerosas de GPC3-positivo.
Ensaios de citotoxicidade dose-dependente foram realizados conforme descrito no protocolo para HepG2 (A), Hep3B (B), Huh7 (C) e MHCC - 97 H (D). As concentrações de GPC3-S-Fab eram de 0.0045 µ g/mL a 30 µ g/mL. Os dados são da média dos triplica com barras de erro , que representa o desvio-padrão. Círculo sólido, apenas GPC3-S-Fab; Praça sólida, GPC3-S-Fab+ NK, células NK (50.000 por alvéolo) e nas células-alvo (5.000 por alvéolo). As misturas foram incubadas durante 72 h antes da medição da citotoxicidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, apresentamos uma estratégia para construir um novo formato de bsAbs, GPC3-S-Fab, que pode recrutar células NK como alvo as células de tumor positivo GPC3. O S-Fab baseia-se a Fab natural formato adicionando um anti-CD16 VHH11,12. Comparado com a região de Fc contendo bsAbs, GPC3-S-Fab pode ser facilmente produzida no periplasm de bactérias em grande escala.
Usando a estratégia de expressão e purificação descrita no protocolo, obtivemos um solúvel e funcional GPC3-S-Fab em grandes quantidades. Para facilitar a expressão periplasmático, um sinal sequência pelB foi adicionado para o N-terminal para dirigir a secreção para o periplasm de Escherichia coli17. Em contraste com o citoplasma, o ambiente mais oxidante no espaço periplasmático entre as membranas citoplasmáticas e externas está equipado com uma série de proteínas importantes para o enrolamento de proteínas e montagem e assim promove a dobradura corrigindo e solubilidade de proteínas recombinantes16. No entanto, as máquinas para enrolamento de proteínas e exportação para o periplasm em e. coli tem capacidade limitada. Alta expressão de proteínas recombinantes, muitas vezes resulta no acúmulo de produto insolúvel no periplasm16. Para evitar a alta expressão da proteína durante um curto período de tempo, foram aplicados neste protocolo para evitar o acúmulo de proteína insolúvel IPTG baixa (0,2 mM) e baixa temperatura (16 ° C) em meio nutritivo. Neste estudo, obteve-se de 1 L de meio, melhorar o rendimento de pelo menos 2 dobras em comparação com anteriores obras12~1.2 mg de proteína.
Para evitar a degradação de proteínas, todas as frações contendo GPC3-S-Fab em várias etapas que devem ser mantidas no gelo. Com a sua marca no C-terminal da VL-CL, Ni-NTA-agarose foi utilizado para a purificação. No entanto, único Ni-NTA-agarose purificação não é suficiente para remover proteínas indesejadas, tais como proteína de VL-CL não pareada. Para purificar a homogênea heterodimérica GPC3-S-Fab, a segunda etapa, purificação anti-IgG-CH1 afinidade, foi aplicado. A proteína purificada tinha alta pureza e dois polipeptídeos perto de 1:1 (Figura 2A-2B).
Cromatografia de gel filtração pode determinar os pesos moleculares de proteínas com base em seus tamanhos moleculares e formas; analisar o grau de pureza; e determinar se a proteína purificada é um monômero, dímero, ou composto de agregados15. Por cromatografia de gel filtração, GPC3-S-Fab foi identificado com o tamanho esperado molecular de aproximadamente 63 kDa, que é sob a forma de um monômero com heterodimerization de GPC3-S-Fab (Figura 2).
Citometria de fluxo pode determinar se um anticorpo pode vincular seu antígeno na membrana celular, comparada com o tradicional Ocidental-mancha e ELISA, que detectam apenas reações de ligação do antígeno-anticorpo. Análise de citometria de fluxo, GPC3-S-Fab reconhecida a GPC3 na membrana celular, sugerindo que a fracção GPC3-Fab foi funcional. Ao realizar a análise de citometria de fluxo, é fundamental para manter todos os passos no gelo ou a 4 ° C, depois que o anticorpo é adicionado. Quando o anticorpo liga para o antigénio de superfície da célula, o complexo antígeno-anticorpo iniciará a internalização. Mantendo-o frio, o processo de internalização é abrandado significativamente.
PBMC e células NK foram eficientemente isoladas do sangue periférico humano por centrifugação usando separação de linfócitos médio, seguido por célula magnética ativado estratégias de classificação. GPC3-S-Fab mostrou potente citotoxicidade contra células GPC3 positivas quando a proporção de células NK para células-alvo (células tumorais) foi de 10:1, e a proporção de células NK para células-alvo pode variar de 50: 1 para 5:1.
Em resumo, GPC3-S-Fab, que pode ser produzido em um sistema de expressão de microorganismo, fornece uma nova avenida para criar formatos funcionais de bsAbs contra tumores.
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Disclosures
Os autores declaram não há conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado financeiramente pela R & D plano da província de Guangdong (China PR) (2016A050503028).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
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