Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以促进转基因基因的整合和生产的创始人转基因小鼠的高效能, 通过简单的注射慢病毒载体载体在 perivitelline 空间的受精卵母细胞。
Abstract
近40年来, 显微 DNA 注射液代表了转基因随机积分法生成转基因小鼠的标准方法。这种常规程序在世界范围内得到了广泛的应用, 其主要局限性在于转基因整合效果较差, 导致了创始人动物的低产量。在注射受精卵母细胞植入后出生的动物中, 只有很少一部分能整合转基因。相比之下, 慢病毒载体载体是整合基因转移的有力工具, 它们用于传感器受精的卵母细胞能够高效地生产出具有70% 以上平均产量的创始人转基因小鼠。此外, 任何小鼠菌株都可用于生产转基因动物, 显性的转基因表达极高, 高于 80%, 慢病毒载体介导转基因与 DNA 显微注射相比。慢病毒载体向量可以是货物的 DNA 片段的大小限制在 10 kb, 代表了该方法的主要局限性。在受精卵母细胞的透明透明下, 使用简单而容易执行的注射程序, 可以在单次显微注射中生产超过50种创建者动物。这种方法是高度适应的, 直接在创始人动物, 快速增益和丧失功能研究或筛选基因组 DNA 区域的能力, 以控制和调节基因表达在体内。
Introduction
戈登等在1980年的开创性工作表明, 在 pseudopregnant 小鼠植入后, 将质粒 DNA 注入受精卵母细胞的雄性pronuclei , 可以产生转基因动物的生产, 整合了质粒 DNA1。转基因哺乳动物的形成对全球生命科学产生了巨大的影响, 为基础科学和转化生物医学科学开辟了新的研究领域。在过去的四年里, DNA 微注射已经成为一种常规的做法。虽然已经生产了大量的转基因小鼠, 但标准方法对所有的老鼠菌株都没有充分的用处, 需要耗费时间 backcrosses2,3。它对其他物种的应用仍然具有挑战性4 , 转基因综合产量仅限于出生动物的少数比例5。此外, 转基因整合的功效是解释显微 DNA 注射液整体产量差的限制因素。在这方面, 集成的病毒载体是最有效的工具, 以货物和集成转基因, 从而可以提供新的手段, 以显著提高整合产量, 唯一的限制是, 转基因大小不能超过 10 kb6.
慢病毒载体载体伪类型与囊性口炎病毒 (VSV) 包络蛋白是以泛热带和高度整合的基因转移工具, 可用于传感器受精卵母细胞7。卵母细胞周围的透明透明是一种天然的病毒屏障, 需要通过它来允许慢病毒载体载体的转导。转基因动物是由传感受精卵母细胞在微钻孔或清除透明透明8,9产生的。然而, 在 perivitelline 空间的透明透明下注射似乎是最简单的方法, 传感器的受精卵, 最初描述的露易丝和同事7。
perivitelline 注射慢病毒载体载体, 可使转基因动物的产量高出70% 以上的出生动物。这种产量超过10倍以上的最佳产量, 可以达到使用标准pronuclei DNA 注射7,10,11。在这种情况下, 单一的注射疗程将产生至少50个转基因创始人 (F0)。因此, 大量的创始人是兼容分型的转基因效果直接执行对 F0 小鼠不需要产生转基因鼠标线。这种优势允许快速筛选的转基因效果, 并特别适应于执行在体内增益和丧失功能研究在几周之内。此外, 调控 DNA 元素也可以快速筛选, 以绘制促进剂和 DNA 图案绑定的转录因子11,12。随着显微注射, 转基因通常集成为多个副本在一个独特的轨迹。使用慢病毒载体向量, 集成在多个位点中作为每个轨迹10、13的单个拷贝出现。因此, 综合基因座的多样性很可能与转基因创始人所观察到的极高表达显性有关, 这使得新生成的模型更加健壮。
重要的是, 当使用显微注射 DNA 时, pronuclei过程中的可视化是绝对必要的。这一技术限制防止了受精卵母细胞的使用来自于大量的小鼠菌株。因此, 在特定菌株中生产一种pronuclei是不可见的转基因模型, 需要在允许的应变下生产动物, 随后至少有10个连续 backcrosses 在所需的小鼠中转移转基因。应变。通过慢病毒载体矢量注射, perivitelline 空间始终可见, 注射不需要高度特异的技能。以14的病毒载体注射液为例, 对不适合pronuclei注射液的转基因小鼠进行了点头/免疫治疗。
在这里, 提出了一个全面的协议, 以允许简单生产的转基因小鼠使用慢病毒载体载体注射在 perivitelline 空间的一个细胞阶段胚胎。本文详细介绍了用无处不在或细胞特异促进剂控制的转基因表达。
pTrip ΔU3 慢病毒载体骨干在本研究中使用15。这个向量允许产生复制缺陷的慢病毒载体向量, 其中 U3 序列被部分删除以移除 U3 启动子活动并生成自失活向量 (SIN)16。慢病毒载体载体是通过对 HEK-293T 细胞的瞬态转染与 p8.91 封装质粒 (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV g 编码的水泡性口炎病毒 (VSV) 糖蛋白-g17, pTRIP ΔU3重组载体。详细的生产过程作为补充方法提供。
在生物安全二级条件下 (BSL-2) 进行高效价慢病毒载体载体的生产。对于大多数转基因来说, 这是正确的, 除了必须在 BSL-3 中产生的癌基因。因此, 大多数情况下, 生产 BSL-2 条件是足够的。此外, 大多数国家管理机构处理转基因生物 (转基因) 的使用和生产通常是脱节的。有限数量的复制无能的罪慢病毒载体载体 (低于2µg 的 p24 衣壳蛋白) 可在 BSL-1 条件下使用, 如法国转基因机构与欧洲联盟的建议所述。
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Protocol
包括动物工作在内的所有程序都获得了道德上的批准, 并得到法国研究和教育部的批准, APAFIS#5094-20 16032916219274 v6 和05311.02 号。ICM 动物设施 PHENOPARC 已被法国农业部认可的认证编号 B75 13 19。总体协议要求在图 1中总结的精确时间范围内执行每个过程。
1. 动物购买和基本化合物的制备
- 动物购买
- 命令25输精管切除术男性 B6CBAF1/JRj 8 周的年龄 (F1 世代从原始的十字架在♀C57Bl 之间或 6 JRj 和♂CBA 或 JRj)。
注意: 在到达时隔离雄性。输精管切除术雄性可以被重新使用至少一年。
每3周换一次笼子。 - 订购 50 B6CBAF1/JRj 10 周的女性, 并保持至少50只动物的游泳池。
- 订购 10-15 C57BL/6JRj 8 周龄的肥沃雄性动物。
- 订购 30 C57BL/6JRj 4 周龄的女性。
- 命令25输精管切除术男性 B6CBAF1/JRj 8 周的年龄 (F1 世代从原始的十字架在♀C57Bl 之间或 6 JRj 和♂CBA 或 JRj)。
- 麻醉和安乐死
- 麻醉是使用大量的300μL 氯胺酮/甲苯噻嗪混合, 注射腹腔 (氯胺酮的剂量 150μg/克体重, 甲苯噻嗪的剂量 0.15μg/g 体重)。动物被放在加热垫下调节体温。在开始手术前捏紧动物的尾巴来检查反射。
- 安乐死是由颈椎脱位进行的。斩首被列为一种辅助方法, 以确认动物死亡。胚胎的安乐死是通过斩首进行的。
注意: 到达后, 允许动物至少1周习惯到设施 (没有处理或交配)。重要的是, 任何老鼠菌株, 包括转基因线, 都可以作为肥沃的雄性和肥沃的雌性来进行超数排卵。应变的选择应根据科学问题的要求进行。
- 激素制剂
- 将910µL 的 PSMG (孕母马血清促性腺激素) 缓冲剂加入1冻干 PMSG 瓶中, 使100µL 整除数, 并贮存在-20 摄氏度。
注: 每个整除包含55个用户界面, 用于11只鼠标。第一次使用后, 切勿将 PMSG 整除数超过2星期。 - 添加2730µL 的 hCG (人绒毛膜促性腺激素) 缓冲成1冻干 hCG 瓶。使100µL 整除数, 并存储在-20 摄氏度。
注: 每个整除包含55个用户界面, 用于11只鼠标。
- 将910µL 的 PSMG (孕母马血清促性腺激素) 缓冲剂加入1冻干 PMSG 瓶中, 使100µL 整除数, 并贮存在-20 摄氏度。
- 透明质酸酶制剂
- 用3毫升的 M2 培养基重建1瓶透明质酸酶, 获得10毫克/毫升的库存溶液, 并使50µL 整除数。然后存储在-20 摄氏度。
- 手术工具准备
- 使用高压釜消毒所有手术工具。
2. 女性捐助者的超数排卵
- 在动物设施使用12小时昼夜周期, 注射 PMSG 在下午2点在3天。在 - 1 天上午 12 点注射 hcg , 并在 hcg 注射后与肥沃的雄配。
- 在3天, 添加1毫升的无菌 0.9% NaCl 溶液成1整除100µL 的 PMSG (55 UI)。注射 10 C57BL/6JRj 女性与100µL 腹腔使用注射器没有任何死容量。
注意: 每只鼠标将收到5个 PMSG UI。 - 在1天, 添加1毫升的无菌 0.9% NaCl 溶液成1整除的100µL 的 hCG (55 UI)。注射接受 PMSG 注射液的小鼠, 100 µL 稀释 hCG 溶液 (5UI) 腹腔。使用注射器没有任何死容量。缓慢执行注射, 并在取出针头前等待, 使液体不会泄漏。
注意: 每只鼠标都会收到5个 hCG 的 UI。注射 hCG 应在 PMSG 后46小时进行。 - 在 hCG 注射后, 将每个 C57BL/6JRj 雌性直接放置在雄螺柱的笼中。
- 检查0天早上的阴道插头, 并使用阳性雌性来收集受精卵。
3. 准备 B6CBAF1/jRj Pseudopregnant 女性
- 交配一输精管切除术男性前一天蛋收集 (天-1) 与 2 B6CBAF1/JRj 女性在下午5点。
注意 : 与来自不同笼子的雌配是非常重要的 , 以避免女性周期的同步。这将提高获得阴道插头的收益率。此外, 不要在过去2天内改变的男性笼中添加女性。当笼子脏的时候, 雄性的生殖行为效果会增加。
4. 受精卵的收集
- 制备
- 添加1450µL M2 到透明质酸酶溶液中, 制备透明质酸酶的工作溶液。
- 放置一滴100µL 的透明质酸酶工作溶液每位女性用于生产受精卵在100毫米培养皿和保持室温。
- 将500µL 的 M16 加入4井板中。使用2井每种类型的慢病毒载体向量将被注射: 一个井将包含注射鸡蛋和其他非注射的。安置4井板材在孵化器在37°c 与 5% CO2大气。
- 准备吸管来收集和处理胚胎。
- 通过在火焰中旋转硬玻璃毛细管管的中心, 软化玻璃压积毛细血管 (75 mm/60 µL)。
- 尽可能快地从热中取出毛细血管, 拉上一根直径约300µm 的管子. 拉上冷却油管, 以获得一个整洁的休息。
- 收集输卵管。
- 弄死 C57BL/6JRj 女性由颈椎脱位在0天上午9点。死亡是由斩首证实的。
注: 这种安乐死方法经 IACUC 批准, 并遵循欧洲的建议。 - 用剪刀进行大水平切口打开腹腔。输卵管位于子宫和卵巢之间。
- 用弯曲钳去除带突出血管的 mesometrium 和膜。
- 用弯曲钳将输卵管与卵巢分开。
- 使用弯钳作为指导, 以削减输卵管从卵巢使用弯曲剪刀。
- 用弯剪刀拉输卵管, 从子宫切开。
注意: 不要碰含有受精卵的肿胀的壶腹。使用无菌仪器执行整个过程。 - 将所有收集的输卵管在 M2 培养基 (35 毫米培养皿) 室温下放置
- 放置2输卵管在同一100µL 下降的透明质酸酶工作溶液 (0.3 毫克/毫升)。
- 弄死 C57BL/6JRj 女性由颈椎脱位在0天上午9点。死亡是由斩首证实的。
- 从受精卵中去除卵丘细胞。
- 在显微镜下, 使用2胰岛素注射器: 第一个持有输卵管和第二个把壶腹和分散受精卵进入透明质酸酶的工作溶液。
- 采取准备好的玻璃吸管收集鸡蛋和连接到油管和一个0.22 微米的过滤器安装在喉舌, 以吸入所有的鸡蛋。收集所有的鸡蛋, 并通过连续的通道洗净到6不同滴100µL 的 M2 培养基。
- 安置被洗涤的受精的蛋入湿化37°c 孵化器以 5% CO2的大气 M16 媒介。
5. 注塑吸管
- 采用薄壁玻璃毛细管 (10-15 厘米长), 外径为1毫米, 并将此毛细管钳入水平微拉拔器。
注: 在大多数水平吸管, 3 参数可以调整: 热功率, 拉强度和时间延迟之间的加热和拉动。调整这些参数以获得类似于图 2A中所示的注入滴管。对于例行进行 DNA 显微注射的用户, 请使用标准设置并调整加热和拉拔之间的延迟, 以改变吸管尖端的全球形状。
6. 使持有吸管
- 使用注射吸管准备持有吸管。
- 将注射吸管连接到 microforge。用 microforge 切割吸管, 以获得80到100µm 直径的尖锐对称尖端。然后用热在 microforge 上抛光尖端, 以获得一个对称的圆形形状, 没有尖锐的对冲。
7. 含有慢病毒载体载体的注射用吸管的制备
- 离心机的慢病毒载体向量悬浮在 160 x g 2 分钟的颗粒碎片经常出现在冷冻慢病毒载体库存。
- 恢复上清, 并将其转移到一个新的0.5 毫升管在第二类安全柜。
- 将1µL 的上清液转移到用微型装载机在步骤5中所述的注射吸管上。
- 在右侧机器人的仪表座上设置注射吸管。将保持吸管连接到左侧机器人。
注: 慢病毒载体载体的转导效价与方正生产的功效直接相关。为高功效 (> 70%), 使用病毒载体的效价在 100 p24 衣壳蛋白/µL 的范围内。当效价表示为转导单元 (tu) 时, 其效价应高于 109涂/毫升。慢病毒载体载体的股票必须通过瞬态转染293T 细胞与 p8.91 encapsidation 质粒, pHCMV g, 编码的水泡性口炎病毒 (VSV) 糖蛋白-G 如补充方法18所述。
8. 微注射
- 分配8µL 的 M2 介质在凹陷的中心滑动和覆盖轻质石蜡油 (胚胎测试), 以避免蒸发。
- 放置20鸡蛋到下降尽可能最少分散。
注意: 在沉积胚胎时不要制造气泡。 - 请确保注射吸管的尖端是打开的。如果没有, 用持有吸管轻敲注射吸管。
- 为二十年代的注射时间设置 microinjector。
注意: 病毒悬浮液的粘度允许清晰地显示 perivitelline 空间中病毒载体的弥散。注射压力应调整, 以填补整个空间在二十年代注入, 这代表了10至 100 pL 的体积。注射压力不应超过 600 hPa。 - 吸入一个受精卵, 其中包含2个临核和2个极性身体与持有吸管下的显微镜。
- 在 perivitelline 空间中, 使用8.4 中描述的设置为 microinjector 注入卵子。
注意: 不要用注射吸管接触等离子膜。 - 注射所有受精卵可提供20个鸡蛋, 并立即将注射鸡蛋放入预加热的 M16 培养基中放入加湿的37°c 孵化器中, 其大气层为 5% CO2。
注: 在胚胎移植前注射卵子至少要孵化30分钟。
9. 将胚胎转移到 B6CBAF1/JRj Pseudopregnant 雌性中
- 检查交配插头16小时后交配 B6CBAF1/JRj 女性与 B6CBAF1/JRj 输精管结扎术男性。在开始收集卵子之前就这样做。
- 为注射胚胎准备植入吸管。
- 对胚胎进行植入吸管, 如收集和处理胚胎的描述 (步骤 4.2)。选择吸管, 内径约为150µm, 长度约为4-5 厘米。
注: 提示应为火焰抛光, 以减少对鸡蛋或输卵管可能造成的损害。- 填充轻石蜡油 (胚胎测试) 就在吸管肩上方。
- 吸入一个小气泡, 然后 M2 介质, 最后是第二个气泡。
- 将胚胎一个人放在一起, 以最小化在输卵管和胚胎中注射的培养基总量。
- 完成通过装载一小滴轻的石蜡油 (胚胎测试) 大约一个胚胎宽度。
注意: 在处理吸管时要温和。
- 对胚胎进行植入吸管, 如收集和处理胚胎的描述 (步骤 4.2)。选择吸管, 内径约为150µm, 长度约为4-5 厘米。
- 胚胎移植。
- 消毒所有仪器。
- 麻醉女性使用腹腔注射 300 ul 的无菌氯化钠0.9% 溶液含有150微克每克氯胺酮的体重和0.15 微克每 g 体重的甲苯噻嗪。
- 在开始手术前, 用镊子捏紧动物的尾部并注射 subcutaneouly 0.1mg/千克止痛剂 (丁丙诺啡), 验证麻醉深度。
- 在最后一根肋骨的水平上沿脊髓两侧刮2厘米。
- 把雌性老鼠放在暖气垫上, 放在无菌的田地里。在鼠标的中间剪下2厘米 x 2 厘米的窗口。
- 在皮肤上涂上防腐剂溶液 (10% 聚维酮碘化物), 用剪刀做一个1厘米的横切口, 然后横向滑动皮肤, 直到卵巢 (橙色) 通过体壁可见。
- 在双目手术显微镜下, 用细剪刀将5毫米切口插入卵巢上方的身体壁上。
- 拿起非创伤性牛头犬钳的脂肪垫, 拉出卵巢, 输卵管和子宫顶部。
- 可视化壶腹部, 并作出一个横切与 vannas 剪刀在输卵管段, 连接卵巢和壶腹。
- 引入转移胚胎吸管, 将卵送进壶腹, 在注入吸管的第一个气泡处停止。
- 对第二个输卵管重复这个过程。
- 用伤口夹紧皮肤。
- 安置动物在恢复房间 (39 °c, 30-60 分钟) 直到完全地醒。
- 重复镇痛注射后12小时和48小时的情况下, 疼痛或窘迫的迹象。
- 手术后7-10 天内取出伤口夹。
- 植入后每3天按体重曲线检查植入雌性的妊娠。在植入后10至12天可以观察到明显的体重增加, 这将预示怀孕。
注意: 所有将在这里发展的胚胎都将代表转基因创始人。这些创始人的表型可以在任何发育阶段或出生后根据与这些转基因动物的产生相关的科学问题进行分析。
10. 基因型转基因创始人
- 制备含有10毫米三盐酸的基因型缓冲液, pH 值 8;5毫米 EDTA, pH 8.0 与 0.2% SDS (瓦特/v), 50 毫米氯化钠。通过0.22 µm 过滤器对基因分型缓冲器进行消毒, 并在室温下贮存几个月。
- 将胚外膜 (用于胚胎) 或小片尾 (用于出生的动物) 放入500µL 的过滤基因型缓冲中, 并添加15µL 的蛋白酶 K (20 毫克/毫升)。孵化过夜在55摄氏度。
- 将裂解液以 1.5万 x g 为5分钟离心, 然后用1µL 上清液进行 PCR 反应。裂解液可贮存在4摄氏度, 数月。
- 在含有 1x pcr 缓冲器、1.5 毫米氯化镁2、200µM dNTPs、每种 pcr 引物0.2 µM、1个 Taq DNA 聚合酶和1µL 的每一个消化样品的20µL 反应量中, 对转基因片段进行 PCR 扩增。作为一个负控制, 使用1µL 的 H2O。作为一种积极的控制, 使用含有转基因的慢病毒载体载体质粒的 DNA。
- 用于检测 eGFP 描述的使用:
eGFP 向前 Primer:5 ' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT 3 '
eGFP 反向底漆: 5 ' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT 3 ' - 在 thermocycler 中执行 PCR 放大: 4 分钟在94°c 之后35个周期1分钟在94°c, 1 分钟在60°c, 并且2分钟在72°c。
- 在2% 琼脂糖凝胶上加载 pcr 产品, 以可视化 300 bp eGFP PCR 产品, 如图 2B所示。
注: 所有显示 300 bp PCR 波段的个体都整合了 eGFP 转基因, 可以被认为是转基因。 - 分析转基因动物的转基因表达。例如, 执行组织学和染色, 如图 3和图 4所示, 并在补充方法中加以说明。
注: 根据全球科学问题, 转基因表达分析和表型分析均应采用相关方法进行。
11. 转基因拷贝数的量化
- 为定量 PCR 制备 DNA 样品。
- 根据制造商的指示, 从步骤10.3 中获得的蛋白酶 K 裂解物中提取基因组 DNA (gDNA)。
- 用分光光度法定量 gDNA 260 nm。
- 稀释每个 gDNA 样品到10µL 最后浓度。
- 每个样品, 准备5系列稀释 (1:5) 在 H2O 获得6管在以下浓度:10 ng/µL, 2 吴/µL, 0.4 ng/µL, 0.08 吴/µL, 0.016 ng/µL 和 0.0032 ng/µL
- 制备定量 PCR (qPCR) 反应组合。
- 为 qPCR 准备底漆组合物。为每个底漆夫妇使用 qPCR, 添加10µL 的前底漆 (100 µM 底漆库存解决方案), 10 µL 的反向底漆 (100 µM) 和80µL 的 H2O。
注: 放大 eGFP, 使用前 TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA 和反向 TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG 底漆。Cdx2基因被用作 qPCR 的标准件 (每个基因组2个拷贝)。Cdx2标准件使用前 GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG 和反向 GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT 底漆 - 准备 2 qPCR 混合, 一个与 eGFP 底漆混合和一个与 Cdx2 底漆混合。准备足够的 qPCR 混合, 以放大每 gDNA 重复的6稀释。一个 qPCR 反应包含3.8 µL2O, 5 µL 荧光绿色2x 反应混合物和0.2 µL 底漆混合物。
注: 对于每种转基因动物进行测试, 将进行 24 qPCR 反应。该反应组合为384井 qPCR 机提供。 - 为每个动物测试, 分布:12 个井与9µL eGFP qPCR 混合和12个井与9µL Cdx2 qPCR 混合。添加1µL 的每 gDNA 稀释到2井包含 eGFP qPCR 混合和2井包含 eGFP qPCR 混合。
- 为每个 qPCR 混合体留下2口井, 其中 gDNA 被 H2O 取代为负控制。
- 为 qPCR 准备底漆组合物。为每个底漆夫妇使用 qPCR, 添加10µL 的前底漆 (100 µM 底漆库存解决方案), 10 µL 的反向底漆 (100 µM) 和80µL 的 H2O。
- 放置384井板在 qPCR 机器和应用以下运行的协议:10 分钟在95°c 然后50个周期十年代在95°c 和1分钟在60°c。
- 分析数据。对于每个 gDNA 进行测试, 将 Ct 值绘制为总 gDNA 量 (6 磅重复) 日志的函数。用最小二乘法对曲线进行线性回归拟合, 并推断出与 y 轴截距对应的 Ct 值。使用 eGFP 和规范化 Cdx2 的外推 Ct 值, 可以使用标准 2ΔdCt方法11来计算相对于 Cdx2 (2 个副本) 的 eGFP 副本数。
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Representative Results
转基因动物是使用这里提出的协议生成的。具有代表性的结果表明, 无处不在和细胞类型的特定转基因表达。
转基因的本构表达
无处不在的发起人是基本的研究工具, 以持续和有效的方式表达转基因。这种促进剂被用于从体外细胞转染到小动物体内转基因的非常广泛的应用。
慢病毒载体载体的建立, 以表达绿色荧光报告基因 (eGFP) 在控制下的巨细胞病毒 (CMV) 启动器或复合启动子 CAG 的基础上融合的鸡肌动蛋白启动子和 CMV 增强。两种慢病毒载体载体均产生 (补充方法), 并以293T 细胞的效价作为转导单元 (TU) 的 eGFP 表达。两种慢病毒载体载体结构均在受精卵母细胞的 perivitelline 空间内注射, 浓度为 109涂/毫升, 并植入伪怀孕雌性小鼠体内。植入胚胎是在出生前收集和 genotyped 的 PCR 跟踪 eGFP 整合。73% (n=22) 和 83% (n=32) 的采集胚胎已将转基因用于巨细胞病毒和 CAG 慢病毒载体构造, 分别 (表 1)。然后对 eGFP 的转基因胚胎进行切片和免疫染色。如图 3所示, 只有分散的 eGFP 阳性细胞与 CMV 启动子 (图 3, 顶板), 而所有细胞表达 GFP 时, CAG 启动者使用 (图 3, 中间和底部面板)。
与 CAG 启动子, 96% 收集的转基因胚胎无所不在表达 eGFP 转基因 (表 1)。虽然这两种促进剂无处不在, 只有 CAG 启动子能够驱动的基因在所有细胞的稳健表达。替代无处不在的促进剂, 如磷酸甘油酸激酶 (PGK) 和泛素-C 推动者, 并取得了类似的结果, 与 CAG 启动者与低表达水平的 eGFP (没有显示数据)。
体内调节基因组区域的映射, 以测试组织特定的控制元素.
对于大量的应用, 转基因的表达在细胞特定的方式在转基因动物是必需的。此外, 转基因动物的产生可以很大程度上有助于筛查基因组 DNA 片段的能力, 以控制特定基因的细胞特异表达。例如, 慢病毒载体介导的转基因动物的生产被用来映射细胞特异增强剂, 控制 Neurogenin 3 (Neurog3) 表达11。Neurog3是一种基础螺旋-环-螺旋 (bHLH) 转录因子, 控制胰腺祖细胞对内分泌命运的承诺。在Neurog3突变小鼠中, 胰腺内没有内分泌细胞能区分19。相对于Neurog3转录起始点的位置-5284 和-3061 之间的 2.2 kb DNA 片段被克隆成一个慢病毒载体向量上游一个 beta 球蛋白最小启动子, 以驱动表达 eGFP 报告基因如前所述11. 在同一慢病毒载体主干中, 克隆了一个 2.4 kb 的基因间片段, 在小鼠染色体 6 (chr6: 14237279-14239685 相对于 mm9 小鼠基因组组装) 上进行了复制, 同样产生了一个控制构造。这个基因组区域在Gpr85和Ppp1r3a基因之间的1兆基长的基因沙漠中被本地化。高滴度慢病毒载体向量是下一个使用两种构造和命名的Neurog3-enh eGFP 和 Chr6-eGFP。
两个慢病毒载体载体被构造了并且被生产了 (补充方法)。由于目前尚无表达Neurog3的细胞, 因此无法确定其滴度。另外, p24 衣壳蛋白的浓度也测定了其效价。将2种载体注入受精卵母细胞的 perivitelline 空间, 植入伪怀孕雌性小鼠体内。植入胚胎在胚胎14.5 天 (E14.5) 采集, 这一发育阶段对应于胰腺中Neurog3的最大表达。胚胎是下一个 genotyped 跟随 eGFP 整合。84% (n=47) 和 71% (n=48) 采集的胚胎已分别将转基因用于Neurog3enh eGFP 和 Chr6-eGFP 慢病毒载体结构 (表 1)。对每个胚胎, 胰芽进行解剖, 然后切片, 以执行染色。92% 的Neurog3-enh-eGFP 转基因胚胎在胰腺中表达 eGFP, 如图 4顶部面板 (代表染色) 所示。重要的是, 绝大多数 eGFP 阳性细胞也 Neurog3 表达细胞 (图 4), 表明 2.2 kb Neurog3增强剂能够限制Neurog3细胞内 eGFP 表达。由反对派, 没有一个 Chr6-eGFP 胚胎表达 eGFP (图 4底部面板和表 1) 在胰腺或外部的胰腺。此外, 在Neurog3-enh-eGFP 胚11中, 胰腺外没有发现 eGFP 的异位表达。
在上述4项试验中,表 1列出了程序每一步骤的精确定量描述。这说明了这一过程的全球功效。事实上, 在将转基因与注入受精卵的数量进行比较时, 该程序的全球产量平均为44%。同样的产量与显微 DNA 注入的结构含有 Neurog3 增强剂融合到 beta 乳糖酶记者不超过3.1%。
慢病毒载体载体对受精卵母细胞的转导, 可导致在多个站点10、13上发生转基因集成。采用定量 PCR 方法对基因组 DNA 进行了相对数量的评价 (图 5)。定量 PCR (qPCR) 测定 eGFP 积分, 并规范化为Cdx2基因, 每基因组2拷贝, 如前所述11。在Neurog3enh eGFP 和 Chr6-eGFP 构造的胚胎中, 平均整合点的数量分别为19.36 到 2.468 (S.E.M.) 和 9.537 @ 1.186 (S.E.M.)。有趣的是, 用于生产这些动物的两个慢病毒载体载体呈现出不同的病毒滴度。p24 衣壳蛋白的浓度为Neurog3-enh-eGFP 向量的124µL 和 52 ng/µL, 为控制 Chr6-eGFP 载体。最有可能的是, 这种效价差异将说明在转基因胚胎的两个种群的整合站点数中观察到的显著差异 (图 5)。这表明, 在一批创建者转基因小鼠中获得的综合网站的平均数量可以通过使用不同效价的病毒种群进行调制。
重要的是, Neurog3-enh-eGFP 转基因胚胎中 eGFP 的表达与整合的转基因拷贝数量之间没有直接的相关性。换句话说, 整合Neurog3-enh-eGFP 转基因的单个或多个拷贝的胚胎也同样被发现在 Neurog3 阳性细胞中表达 eGFP。
图 1: 整个过程的流程图请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 制备微注射吸管和基因分型。
(A)显微注射吸管的示意图, 以突出滴管用于 DNA 或慢病毒载体载体注射的主要差异。左面板: 绘制两种吸管类型的整体形状。虚线圆突出了吸管尖端的放大区域。还介绍了吸管提示的图片。请注意, 对于慢病毒载体注射, 尖端需要被打破, 与虚线和相应的图片指示。右面板:鸡蛋注射设置的例子与持有吸管在左边, 受精的蛋和注射吸管在一个原核或在 perivitelline 空间。刻度条 = 50 µm. (B) eGFP PCR 产物琼脂糖凝胶的可视化从8种不同的胚胎中提取的基因组 DNA (车道1到 8)。只有胚胎 1, 2, 3, 5, 6 和8整合了 eGFP 转基因。采用 DNA 质粒 pTrip PGK eGFP 用于慢病毒载体载体生产, 作为 PCR 阳性对照。对于负控制, H2O 取代了 PCR 反应中的 DNA。MWM: 分子量标记。bp = 基对。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 无处不在的促进者驱动 eGFP 报告人在转基因胚胎中的表达。
10µm 冷冻切片的转基因胚胎被染色, 以可视化 eGFP 表达 (绿色) 和细胞核 (蓝色)。用巨细胞病毒启动子慢病毒载体构造 (左上方标签) 生成的胚胎在 E11.5 收集。用 CAG 启动子慢病毒载体构造 (下左标签) 生成的胚胎在 E18.5 收集。Pb: 胰芽, 变应性: 腹侧脊髓, 椎体,李: 肝, Ms: 腹带肌肉。缩放条 = 50 µm请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 基因在转基因胚胎中的细胞特异表达是由Neurog3增强剂驱动的.10µm 冷冻切片的 E14.5 胰腺芽的转基因胚胎被染色, 以可视化的表达 Neurog3 (红色), eGFP (绿色) 和细胞核 (蓝色), 如所述补充方法)。Neurog3 表达在胰腺中分布。结合Neurog3-enh-eGFP 构造表达 eGFP 的转基因胚胎, 大部分 eGFP 阳性细胞呈 Neurog3 阳性 (顶板)。Chr6-eGFP 构造生成的胚胎没有表达 eGFP (下板)。缩放条 = 50 µm请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 集成转基因的相对副本数.与 CDX2 基因相关的 eGFP 积分站点的量化, 如协议部分所述。方框情节从 25到75的百分比。点代表了不同的转基因胚胎的产生。两个慢病毒载体构造之间的转基因综合点的比较有显著差异 (非配对参数 t 检验, p = 0.001)。请单击此处查看此图的较大版本.
表 1: 在整个过程中逐步定量报告。在手术过程中, 对卵或胚胎的总数进行计数。第一列表示从超排处理雌性输卵管中提取的卵子总数。只有有清晰的2极体和/或可见 pronuclei 的卵被注射并报告。注射后和几个小时的文化只有注射鸡蛋没有裂解, 并有一个正常的形态学被植入。接下来, 从 pseudopregnant 雌性中收集的胚胎的总数计数。最后, 在最后两列中列出了整合转基因和表达记者的胚胎。与使用标准 pronuclei DNA 注射的实验相比, 也给出了相同的特征。在这里, 转基因包含了Neurog3增强器驱动表达的β-乳糖酶报告基因 (Neurog3enh LacZ)。请单击此处下载此文件.
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Discussion
在这里描述的受精卵母细胞中, 慢病毒载体载体的 perivitelline 注射导致了转基因胚胎的产生, 而相对于采集到的胚胎总数, 转基因胚胎的产量超过了70%。这一结果与以前的报告一致, 体现了程序2、7、10、11、12的特殊性。在比较表 1中显示的所有数据时, 可以突出显示重要的功能。首先, 植入卵子的数量对应于所有注射卵子, 这些卵具有正常的形态, 或者在培养的几个小时后没有裂解。93% 的注射卵被植入, 表明在 perivitelline 空间注射慢病毒载体载体几乎完全没有快速毒性。由于仅有44% 的注射卵子存活并被植入, 所以考虑 DNA 注射时, 情况截然不同。此外, 采集到的胚胎相对于植入卵的比例在两个过程中是相同的, 这表明慢病毒载体载体的长期毒性没有加剧。第二, 在表达与注射卵数量相结合的胚胎数量时, 慢病毒载体向量注射液与 DNA 注射液相比, 全球产量高出10倍以上。在比较两个过程中用同一 Neurog3 增强器构造表达转基因的胚胎数量时, 甚至发现了86倍的差异。
重要的是, 转基因产量似乎依赖于使用的慢病毒载体载体的转导效价。换言之, 在 109涂/毫升以上产生的慢病毒载体向量足以获得如此高的产量。如协议部分所述, perivitelline 空间中注入的体积在10到 100 pL 的范围内。这个体积将代表10到100活跃慢病毒载体粒子。与标准的pronuclei DNA 注射相比, 在使用慢病毒载体向量时, 与相同数量的出生动物生成的创始人动物的总数至少要高10倍。此外, 转基因的表达显性是非常高的这个协议, 并观察到无处不在和细胞特定的促进者, 除了 CMV 启动。通过反对细胞无处不在的促进者, CMV 启动者积极关闭的 DNA 甲基化20 , 并已证明无法维持长期表达后, 在多潜能干细胞转导21。这可以解释在转基因胚胎中观察到的 eGFP 表达细胞数量有限。因此, 慢病毒载体载体很好地适应于生产转基因动物, 其中转基因的表达是由细胞特异增强剂控制的。重要的是, 该协议可用于筛查增强剂在体内的活动, 并发现地图转录因子结合点在监管地区11,12。这种筛选方法很难使用标准的转基因来执行。需要测试所有不同的构造和达到统计学意义的创始人动物总数需要大量的注射疗程, 而它可以通过慢病毒载体介导的转基因快速获得。
标准程序与慢病毒载体方法的主要区别之一在于转基因集成。使用显微注入, 转基因在一个独特的轨迹中随机集成成多个拷贝。使用慢病毒载体向量, 集成可以发生在多个位点 (每个轨迹的一个拷贝) 而不严格随机。通过使用线性扩增介导 pcr (林 pcr) 克隆集成站点, d 组 Trono 表明, 转基因优先纳入受精卵的开放染色质区13。积分偏倚不应干扰或促进转基因小鼠的转基因表达。在一个细胞阶段胚胎慢病毒载体传导过程中的整合发生在开放的染色质, 可能不会仍然在开放的配置在发展期间或在成人。
此外, 在分析第一代动物 (F0) 或胚胎中集成转基因的复制数时, 观察到了综合转基因的数量大的变化。在本研究中, Neurog3-enh-eGFP 构造中发现了平均19个集成拷贝。这个大拷贝数可以反映高水平的嵌合体。Sauvain等人对 F0 动物的综合基因座进行了广泛的研究, 这里描述的慢病毒载体介导的方法13。他们在 11 F0 动物中跟踪了70个单独的整合站点, 并检查了每个站点从 F0 转基因小鼠到其 F1 后代的传输速率。个体综合转基因的总传输率为 44%, 这表明它们通常是在一个细胞胚胎的 s 期之后或在两细胞阶段的 s 相之前建立的。事实上, 在 s 阶段之前的整合将把整合的转基因传播到两个子细胞, 而在 s 阶段之后的整合将把它传送到一个子细胞。因此, 通过该技术获得的转基因小鼠, 个体综合转基因的嵌合体程度最小。这进一步表明 , 大多数集成将发生在第一个 12 h 对应的平均生产时间的第一次在使用的文化条件。这种集成动力学是一致的一个描述为慢病毒在 T 淋巴细胞22。
重要的是, 与大量的基因座霸转基因集成, 建立鼠标线将是不合理的。分隔所有这些位点的通道数量将相当高。这是该方法的一个重要局限性, 应用于快速筛选转基因效果或同时分析多转基因。然而, 还可以通过从 F0 动物中选择最低的综合转基因拷贝数来建立鼠标线。
自从第一次对显微 DNA 注射方法1的描述以来, 已经有了一些改进, 绕过了最初程序的许多弊端。第一组改进是基于使用卡带交换策略的精确轨迹中的目标集成。显微注射是使用创可, 翻转或 PhiC31 recombinases 连同一个综合 DNA 片段两侧 loxP, 首次登记税或 attB 地点, 分别。在这种情况下, 综合 DNA 是交换与一个集成片段两侧与相同的 recombinase 特定站点23,24。虽然60% 的第一代动物可以是转基因23使用这种方法, 与显微注射技术的限制仍然适用。第二组改善是基于细胞质注入两个循环 DNA, 一个携带的片段整合, 一个允许表达的 Tol225, 睡美人26或 piggyBac27 transposases。利用这些方法, 获得了较高的产量 (> 30%), 但更重要的是, 细胞质注入是容易执行和绕过的限制, 由于显微注射液作为慢病毒载体的协议。此外, 非常大的 DNA 片段, 如细菌人工染色体, 可以整合。
很明显, 慢病毒载体介导的转基因不会取代标准和改进的程序。这种方法仍然是快速动物模型生产和表征的有力工具, 因为它大大减少了需要的时间来生成适当数量的具有最少遗传变异的动物。此外, 该技术可以直接应用于所有的小鼠菌株, 包括任何转基因线。此外, 重要的是要提到, 全球景观的新一代动物模型将改变与最近的发展 CRISPR/Cas9 技术。今天, 显微注射的 Cas9 蛋白连同引导 RNA, 允许生产基因组编辑的动物模型, 其功效为 40%28。这种方法可以很大程度上得益于使用慢病毒载体介导的转基因。事实上, 使用非综合慢病毒载体向量29瞬时表达 Cas9 和引导 rna 可能导致更高的产量。将最新的技术与生产相关且健壮的动物模型结合起来, 将有益于参与研究疾病发病机制和治疗方法的大多数国际研究团体。
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Disclosures
作者没有披露利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢 Magali 和罗兰多梅洛尼对手稿和 iVector 和 Phenoparc ICM 核心的关键阅读分别为慢病毒载体向量生产和动物住房提供技术援助。这项工作得到了 Hospitalo-Universitaire de 神经 Translationnelles 巴黎, IHU-ICM, Investissements d ' 艾文莉 ANR-10-IAIHU-06 的支持。该协会为语言法国练习曲 Diabète 等疾病 Métaboliques (ALFEDIAM) 和联合 JDRF/INSERM 赠款提供资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMSG 50UI | Sigma | G4527 | |
| hCG 5000UI | Sigma | CG5-1VL | |
| NaCl | Sigma | 7982 | |
| 100 mm petri dish | Dutsher | 353003 | |
| 4 wells Nunc dish | Dutsher | 56469 | IVF dish |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| 0,22 µm Syringe filter | Dutsher | 146611 | |
| Hyaluronidase Enzyme 30mg | Sigma | H4272 | mouse embryo tested |
| Insulin serynge | VWR | 613-3867 | Terumo Myjector |
| Curved forceps | Moria | 2183 | |
| Curved scissors | Moria | MC26 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard apparatus | GC 100-10 | |
| Horizontal micropipette puller | Narishige | PN-30 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Inverted microscope | Nikon | Transferman NK2 5188 | Hoffman modulation contrast illumination is required |
| Micromanipulator | Eppendorf | Celltram air | |
| Controler of holding pipet | Eppendorf | Femtojet | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | mouse embryo tested |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | Can be used to inject DNA or viral vectors |
| Dumont # 5 forceps | Moria | MC 40 | |
| vannas micro scissors | Moria | 9600 | |
| Isoflurane | centravet | ISO005 | ISO-VET 100% 250ml |
| ocrygel | centravet | OCR002 | |
| Povidone iodure | centravet | VET001 | vetedine 120ml |
| Buprenorphine | centravet | BUP002 | Buprecare 0,3Mg/ml 10ml |
| Tris-HCl | Sigma | T5941 | Trizma hydrochloride |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| SDS | Sigma | 436143 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | powder |
| proteinase K | Sigma | P2308 | |
| oneTaq kit | NEB | M0480L | |
| Primers | Eurogentec | ||
| Strip of 8 PCR tube | 4titude | 4ti-0781 | |
| 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | Veriti |
| Genomic DNA mini kit | invitrogen | K1820-02 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| qPCR Master mix | Roche | 4887352001 | SYBR Green |
| Multiwell plate 384 | Roche | 5217555001 | |
| qPCR instrument 384 well | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 |
References
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