ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
ويرد هنا بروتوكولا لتقليد مدخل المركبات المشتقة من البكتيريا بعد خرق جدار الأمعاء. كان حقن جرعة منخفضة المقاسة من lipopolysaccharide النظامية في الفئران، التي رصدت للحقن بعد 24 ساعة. تم تحديد التعبير عن السيتوكينات الموالية التحريضية في العديد من النقاط الزمنية في الطحال والكبد، والقولون.
Abstract
يفصل الجدار الظهارية المعوية المضيف من الحجمية هو عادة التسامح أو تجاهله. نتائج الإخلال بهذا الحاجز في مدخل البكتيريا أو المنتجات المشتقة من البكتيريا في البلد المضيف، والوصول إلى تداول المضيفة وأجهزة الداخلية مما يؤدي إلى الالتهاب غير المنضبط وكما لوحظ في المرضى الذين يعانون من مرض التهاب الأمعاء (بنك التنمية بين الأمريكتين)، التي تتميز زيادة نفاذية الظهارية معوية.
لتقليد مدخل المركبات المشتقة من البكتيريا في البلد المضيف، قد اعتمد في التي lipopolysaccharide (LPS)، عنصرا من عناصر خلية الجدار الخارجي للبكتيريا سلبية الغرام نموذج اندوتوكسيميا، تم حقن الفئران. في هذه الدراسة، تم حقن جرعة المقاسة من لبس إينترابيريتونيلي وفي وقت لاحق تم رصد الفئران ح 8 باستخدام درجة مرض. وعلاوة على ذلك، التعبير تم تحليل مستويات السيتوكينات الالتهابية Il6، Il1b، و تنفا في الطحال والكبد والقولون قبكر في نقاط زمنية مختلفة بعد حقن لبس. هذا النموذج يمكن أن يكون مفيداً للدراسات المتعلقة بتحقيق استجابات المناعية بعد الغزو من الكائنات المجهرية أو المنتجات المشتقة من البكتيريا الناجمة عن خرق حاجز من أسطح الجسم.
Introduction
هو استعمار الأمعاء البشرية مع مجموعة كبيرة من الكائنات الحية الدقيقة التي تشكل الحجمية، الذي أقام علاقة متبادلة مع المضيف أثناء التطور. المضيف في هذه العلاقة، يوفر مكاناً أمنا الحجمية، بينما يوفر الحجمية الفيتامينات والمغذيات الهضم والحماية من مسببات الأمراض إلى المضيف، حيث يتواجد الحجمية1. عندما يتم تضطرب هذه العلاقة المفيدة بين البلد المضيف والحجمية، يمكن وضع الأمراض، مثل مرض التهاب الأمعاء (بنك التنمية بين الأمريكتين). بنك التنمية بين الأمريكتين هو مرض التهاب مزمن المتعددة العوامل الأمعاء الناجمة عن العوامل الوراثية والبيئية التي تحدث في شكلين الرئيسية، المرض (CD) كرون والتهاب القولون التقرحي (UC). وعلى الرغم من أوجه التشابه بين هذين الشكلين بنك التنمية بين الأمريكتين، تتسم ببعض الاختلافات في موقع وطبيعة التعديلات التحريضية. مؤتمر نزع السلاح هو اضطراب تحريضية transmural النكس يمكن أن يحتمل أن تمتد إلى أي جزء من الجهاز الهضمي، بينما تفرد غير ترانسمورال، ويقتصر على القولون. وعلاوة على ذلك، حدوث طفرات في النوكليوتيدات ملزمة أوليجوميريزاتيون التي تحتوي على المجال البروتين 2 (NOD2)، مستقبلات اعتراف بنمط (بر) تسلم موراميل dipeptide (الديمقراطي)، مكون من جدار الخلية البكتيريا الأكثر إيجابية والسلبيه، المرتبطة مع القرص المضغوط2. وعلاوة على ذلك، الإشريكيّة القولونية ()، الليستيريا و العقديّات ومنتجاتها جميع عثر داخل الضامة في المرضى مؤتمر نزع السلاح التي دخلت البلد المضيف بعد خرق حاجز3. عندما تدخل البكتيريا أو منتجاتها المضيف أثناء وضع مؤتمر نزع السلاح، يطور المناعي استجابة مما يؤدي إلى إنتاج أجسام مضادة للبكتيريا4تعميم. ربما، والأدلة الأكثر إقناعاً لدور الحجمية في الآلية المرضية لبنك التنمية بين الأمريكتين ينبع من نماذج الماوس. عند الحيوانات تعامل مع المضادات الحيوية، أو عندما يتم الاحتفاظ الفئران في ظروف خالية من جرثومة (GF)، يتم تقليل شدة المرض في معظم النماذج التهاب القولون، مثل في إيل-10-/--الفئران التي لا تتطور التهاب القولون في فرنك غيني مرافق5،6. وعلاوة على ذلك، التهاب القولون تزعج أيضا تكوين الحجمية، الذي يتميز تركيبة غير متوازنة وخفض ثراء تسمى ديسبيوسيس7. يمكن أن يكون نتيجة لبنك التنمية بين الأمريكتين زيادة نفاذية معوية التي يمكن أن تؤدي إلى مدخل للمنتجات المستمدة من الجراثيم والميكروبات في البلد المضيف.
في الحيوانات، والحث على التطبيق من كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS) خرق الظهارية معوية مما يؤدي إلى زيادة نفاذية الحاجز الظهارية8. المدخل لبس تركيزات مرتفعة في الحيوانات ب التهاب القولون DSS9. من المثير للاهتمام، الحيوانات تفتقر ج نوع يكتين مستقبلات الالتصاق داخل الخلايا المحددة الجزيء-3 الاستيلاء على نونينتيجرين المتصلة هومولوج 1 (تسجيل-R1) محمية من مفاجآت التهاب القولون والمستحثه بلبس اندوتوكسيميا10. للتوسع في نشر في البلد المضيف، أن البكتيريا أو منتجات البكتيريا تستمد اجتياز الحاجز الأوعية الدموية11، التجويف الصفاقى، الذي يوجد الأمعاء الصغيرة والكبيرة والليمفاوية المساريقي العلوي و/أو الكبد12. لتقليل تعقيد هذا النظام، تم استخدام مركب معرفة المستمدة من البكتيريا. لبس، الذي يسبب اندوتوكسيميا بعد داخل (القائمة) أو في الوريد (رابعا) حقن13 تم حقن الفئران، لدراسة التعبير عن interleukins Il6 و إيلب وسيتوكين تنفا استجابة للبس.
لبس هو المرتبطة بالعوامل الممرضة جزيئية نمط (بمب) أعرب كمكون جدار خلية من البكتيريا سلبية الغرام، يتكون من الدهن A (بمب الرئيسية في الهيكل للبس)، oligosaccharide أساسية ويا جانب سلسلة14. تسلم مستقبلات مثل عدد القتلى 4 (TLR4) عن طريق الخلايا الجذعية والضامة، والخلايا الظهارية لبس15، يتطلب مستقبلات المشارك للربط المناسبة. المرحلة الحادة البروتين ملزمة لبس البروتين (ليرة لبنانية) يربط لبس لتشكيل مجمع نقل لبس لكتلة التمايز 14 (CD14)، بروتين غشائي مرتبط جليكوسيلفوسفاتيديلينوسيتول. CD14 كذلك المكوكات لبس مستضد لمفاويات 96 أو يعرف أيضا باسم MD-2، الذي يرتبط بالمجال خارج الخلية من TLR4. ييسر ربط لبس للعضو المنتدب-2 ثنائي TLR4/MD-2 للحث على التغييرات conformational تجنيد الجزيئات داخل الخلايا محول لتنشيط المصب مما يشير إلى مسار14، الذي يشمل المرحلة الابتدائية التمايز النقوي استجابة الجينات 88 (MyD88)-تعتمد المسار وفي النقل الدولي البري المحتوية على المجال الذي يحفز محول الانترفيرون-بيتا (طريف)-مسار يعتمد16. ثم الاعتراف بلبس من TLR4 ينشط في مسار NF-κB والحث على التعبير عن السيتوكينات proinflammatory، مثل TNFα، وايل-6، وايل-1β17.
على وجه الخصوص، عندما يتم حقن لبس في الحيوانات، وتركيز لبس نظراً للحيوانات، وقد الخلفية الوراثية للحيوانات والغذاء النظر. تركيزات عالية من لبس ويؤدي إلى صدمة التفسخ، تتميز بانخفاض ضغط الدم وفشل الجهاز متعددة، وأخيراً إلى وفاة18. الفئران أقل حساسية للبس مقارنة بالبشر، وقادرة على حمل عاصفة سيتوكين19فيها تركيزات لبس بين 2-4 نانوغرام/كيلوغرام من وزن الجسم (الأسلحة البيولوجية). للفئران، الجرعة القاتلة (LD50)، الذي يؤدي إلى الموت في نصف عدد النطاقات الفئران من 10-25 مغ/كغ وزن الجسم20 اعتماداً على سلالة الماوس المستخدمة. بالنسبة الجرعة المميتة 50 في المائة (LD50) سلالات الماوس استخداماً، C57Bl/6 وبالب/ج، 10 مغ/كغ وزن الجسم. وفي المقابل، محمية سلالات C3H/HeJ و C57BL/10ScCr من لبس الناجم عن اندوتوكسيميا، الذي سبب الطفرات في Tlr421. ونتيجة لذلك، الفئران التي تفتقر إلى Tlr4 هيبوريسبونسيفي للحقن مع لبس22. خطوط الماوس المعدلة وراثيا الأخرى، مثل PARP1/الفئران23 مقاومة للصدمة السمية التي يسببها لبس.
هنا يستخدم نموذج الماوس ووصف جرعة المقاسة من لبس تدار النظامية لتقليد المترتبة على نشر لبس بعد خرق حاجز من الأسطح في الجسم. عدم حمل تركيز لبس المختارة (2 مغ/كغ وزن الجسم) وفيات في الفئران C56Bl/6، ولكن إطلاق سراح المستحث السيتوكينات الموالية التحريضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ولدت الفئران والاحتفاظ بظروف معينة خالية من مسببات الأمراض (SPF) في منشأة الحيوان من إدارة الطب الحيوي، جامعة بازل (بازل، سويسرا). أجريت جميع التجارب التي الماوس وفقا "الاتحادية السويسرية" واللوائح الكانتونات (بروتوكول الحيوان رقم 2816 [كانتون بازل-شتات]).
1-إعداد حل لبس
- فتح مخزون لبس تنقيته من الإشريكيّة القولونية 0111:B4 تحت ظروف معقمة وإعادة تشكيل ذلك في المياه بتركيز 5 ملغ/مل.
- تمييع الأسهم لبس مع المياه المالحة الفوسفات العقيمة مخزنة (PBS) إلى تركيز العامل 0.2 ميكروغرام/ميليلتر.
2-داخل حقن لبس للفئران
- نضح لبس يعمل الحل في حقنه 0.5 مل بإبرة ز 30 في تدفق هواء الصفحي.
- تزن الإناث الفئران C57Bl/6 (ستة إلى عشرة أسابيع من العمر) وحساب كمية لبس التي سيتم حقنها: 10 ميليلتر (2 ميكروغرام)/g وزن الجسم.
ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان ماوس يزن 20 غرام، ثم ميليلتر ز 20 × 10 = 200 ميليلتر لبس يعمل الحل يحتاج إلى حقن. - التعامل مع الماوس برفق ولكن بحزم، وكبح جماح هذا الحيوان في يد واحدة. تأكد من أن الحيوانات قادرة على التنفس بشكل طبيعي ولكن ليس على تطور وتحول أثناء ضبط النفس.
- إمالة الآنف الماوس قليلاً نحو الكلمة لتعريض البطن للحقن. تحديد خط الوسط في البطن ومكان الحقن في البطن المنخفض الأيمن أو الأيسر من خط الوسط. حقن PBS القائمة بدلاً من لبس في مكافحة الفئران.
- مع اليد الحرة، حقن حجم مناسب (حجم المحسوبة في الخطوة 2، 2) من لبس يعمل الحل. تأكد من أن الإبرة دخلت في التجويف الصفاقى على خلاف ذلك، قد يحدث سوء الحقن في طبقة العضلات البطن. لا يزال، لا تذهب عميقة جداً مع الإبرة في التجويف الصفاقى لتجنب إصابة الأجهزة الداخلية الموجودة في هذا المجال.
- العودة الحيوان بعناية إلى القفص مع الفئران تصل إلى 5 في قفص.
3-رصد الفئران
- مراقبة الحيوانات في وقت الحقن وكل ح 2 بعد الحقن ح 8 عن وقوع وشدة اندوتوكسيميا. ولذلك، استخدم ورقة نقاط (الجدول 1) التي قد تم تكييفه من مخطوطة منشورة سابقا 24.
-
نقاط لبس حقن الفئران للمعلمات التالية المدرجة في الجدول 1
- تحقق من ظهور الفراء وعادة السلس. إذا ظهر الفراء الفراء تكدرت، وشائك أو منتفخ مما يشير إلى عدم الراحة أو الألم، نقاط منهم 1 أو 2 أو 3.
- تحقق من وجود نشاط الماوس.
ملاحظة: الفئران عادة التنقل بحرية حول القفص كله الأكل، والشرب، وتسلق الجبال، ولكن نشاط الممنوعة أو المقيدة يمكن أن يكون علامة على الألم. - التحقق من مستوى وعيه.
ملاحظة: الفئران غريبة جداً، وأنها تتحرك عادة حول القفص التحقيق في المناطق المحيطة. غياب أو يمكن أن تشير إلى انخفاض حركة الألم والانزعاج. - فحص العيون.
ملاحظة: من المتوقع عيون مفتوحة بالكامل في الفئران صحية، ولكن العيون مغلقة جزئيا أو كلياً، وربما مع إفراز، يمكن أن يكون مؤشرا للألم. - تحقق من معدل التنفس.
ملاحظة: الفئران صحية عادة ما يكون معدل تنفس الطبيعي والسريع، بمعدل انخفاض تنفس يمكن أن يكون مؤشرا على عدم الراحة). - التحقق من جودة التنفس.
ملاحظة: احتملت في التنفس مع أو بدون يلهث علامة على الألم.
4-الأنسجة العينات لاستخراج الحمض النووي الريبي (الرنا) والتجانس
- إعداد أنابيب جمع/التجانس: إضافة 1 مل خطوة واحدة كاشف عزل الحمض النووي الريبي لأنابيب 2 مل المعبأة مع مجالات السيراميك 1.4 ملم.
- نقاط الوقت المناسب (قبل (ح 0) وح 2، ح 4 وح 8 بعد حقن لبس) euthanize الماوس مع جرعة مخدر (إيسوفلوراني) تليها اكسسانجوينيشن والمضي قدما في التشريح.
- قطع الجلد وطبقة العضلات فضح تجويف البطن مع الأجهزة الداخلية مع زوج من مقص.
- عناية تشريح الطحال، والكبد، والقولون وتنظيف الأجهزة من الدهون والاحتفاظ بها في برنامج تلفزيوني على الجليد.
- قطع قطعة صغيرة (حوالي 0.5 سم) من كل جهاز باستخدام مقص أو مشرط.
ملاحظة: من المهم دائماً أن القطعة من تقريبا نفس الجزء من الجهاز في كل الماوس (نفس فص من الكبد، والدانية أو القاصي جزء من القولون). - قريبا الجاف للأنسجة على قطعة من الورق الأنسجة ووضعه في أنبوب جمع/التجانس مع التأكد من أنها هي مغمورة تماما في كاشف عزل الحمض النووي الريبي.
- مجانسة الأنسجة في الخالطون benchtop عالية السرعة. للأنسجة الرخوة مثل الطحال والكبد والقولون استخدم دورة 1 من التجانس في سرعة 6.00 ل 30 ثانية.
- احتضان هذه العينات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- بدقة مكان الأنبوبة في النيتروجين السائل لانجذاب تجميد الأنسجة ليستي. تخزين المفاجئة المجمدة في-80 درجة مئوية حتى عزل الحمض النووي الريبي.
5-الجيش الملكي النيبالي الاستخراج من الأنسجة
ملاحظة: تعتبر الكواشف عزل الحمض النووي الريبي، كلوروفورم والكحول كمواد خطرة. القيام باستخراج الحمض النووي الريبي تحت غطاء كيميائية. استخدام مصدقة الكواشف رناسي خالية والمعدات للمحافظة على بيئة خالية من رناسي.
-
فصل المرحلة
- ذوبان الجليد الأنسجة المجمدة ليستي على الجليد.
- الطرد المركزي العينة على 1,000 ز x لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية بيليه جزيئات الأنسجة المتبقية التي يمكن أن يترك.
- نقل المادة طافية إلى أنبوب خالية nuclease 1.5 مل جديدة.
- إضافة 200 ميليلتر كلوروفورم المثلج كل 1 مل من الحمض النووي الريبي العزلة الكاشف واهتز بشدة باليد ل s 10-15.
- احتضان لمدة 2-3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- أجهزة الطرد المركزي في 12، 000 x ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: العينة سوف الآن تحتوي على 3 مراحل: تخفيض كلوروفورم الفينول الأحمر مرحلة، في الطور البيني والعلوي عديم اللون مائي. الجيش الملكي النيبالي موجود في المرحلة المائية العليا. - جمع المرحلة المائية العليا (50% حجم الإجمالي)، ونقل في أنبوب خالية نوكلاس 1.5 مل جديدة.
-
الجيش الملكي النيبالي هطول الأمطار
- إضافة 0.5 مل الايزوبروبانول المثلج كل كاشف عزل الحمض النووي الريبي 1 مل وتخلط بلطف بعكس الأنبوب 5-6 مرات.
- احتضان لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- أجهزة الطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: بيليه الجيش النيبالي الملكي يجب أن تكون مرئية في هذه المرحلة.
-
الغسيل من الحمض النووي الريبي بيليه
- إزالة المادة طافية المحتوية على الكحول دون إزعاج بيليه.
- أغسل بيليه مع المثلج الإيثانول 75% 1 مل كل 1 مل كاشف عزل الحمض النووي الريبي المستخدمة لتحلل الأولية.
- دوامة العينة بإيجاز.
- أجهزة الطرد المركزي العينة في ز خ 7,500 (أو 12,000) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
-
حل الجيش الملكي النيبالي
- إزالة تماما الإيثانول في المادة طافية دون إزعاج بيليه.
- اترك فتح الأنبوب تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية لمدة 3-5 دقيقة أيردري بيليه الجيش الملكي النيبالي في درجة حرارة الغرفة (عدم الإفراط الجاف كما في تلك الحالة سيكون من الصعب حل الجيش الملكي النيبالي).
- حل بيليه الجيش الملكي النيبالي في 20-50 ميليلتر خالية نوكلاس المياه التي بيبيتينج بعناية صعودا وهبوطاً.
- احتضان العينة في 55 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة لمواصلة تحسين حل الجيش الملكي النيبالي.
ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في-80 درجة مئوية حتى إجراء مزيد من التحليل.
6-هضم الحمض النووي الباقية
- قياس تركيز الحمض النووي الريبي مع جهاز المطياف الضوئي قبل بيبيتينج قاسمة (2 ميليلتر) إلى جهاز المطياف الضوئي وضبط لتركيز الموصى بها.
- تبدأ عملية الهضم من تلويث الحمض النووي مع ماكس. الجيش الملكي النيبالي 10 ميكروغرام في المياه خالية من نوكلياسي 50 ميليلتر.
- إضافة 0.1 حجم 10 x الدناز أنا المخزن المؤقت وردناسي 1 ميليلتر أنا كل عينة والمزيج بلطف بيبيتينج أعلى وأسفل.
- احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة.
- دوامة "الدناز المنظمة الكاشف" وإضافة 0.1 حجم العينة خلط جيدا مع الماصة.
- احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة خلط أحياناً باليد.
- الطرد المركزي في 10,000 ز x 1.5 دقيقة.
- نقل المادة طافية تتضمن خالية من الحمض النووي الريبي في أنبوب نوكلاس الحرة الجديدة.
- قياس تركيز الحمض النووي الريبي والجودة بجهاز المطياف الضوئي.
7-عكس النسخ
- استخدام أدوات نسخ عكسي (RT) كدنا حمض الخلوي الصبغي متاحة تجارياً للنسخ العكسي.
ملاحظة: هنا، ما يصل إلى 2 ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي يمكن عكس يدون. - حساب الحجم، الذي يحتوي على 2 ميكروغرام الجيش الملكي النيبالي. "الماصة؛" 2 ميكروغرام الجيش الملكي النيبالي في أنبوب بكر جديدة.
- إضافة المياه خالية من نوكلاس للعينة في أنبوب PCR إلى وحدة التخزين النهائي من 10 ميليلتر.
- إعداد 2 x ميكس ماجستير بخلط المكونات التالية المدرجة في الجدول 2
- إضافة 10 ميليلتر 2 x ميكس الرئيسية إلى 10 ميليلتر الحمض النووي الريبي للحصول على 1 x ميكس ماجستير في إجمالي حجم 20 ميليلتر.
- إغلاق أنبوب بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد) وتدور أسفل العينة بإيجاز.
- وضع العينات في "ثيرموسيكلير بكر" وتعيين الإعدادات المسرودة في الجدول 3.
- تخزين كدنا ولدت في-20 درجة مئوية لمزيد من التحليل.
8-الكمية بكر (قبكر)
- القيام برد فعل قبكر مع مجموعة متاحة تجارياً.
- الذاتي تصميم واختبار الإشعال التي تغطي إنترون، قبل الاستخدام، مع تركيزات مختلفة من كدنا القالب. تحليل فعالية التمهيدي عن طريق إنشاء منحنى قياسي واستخدام كبسولة تفجير بكفاءة عالية ومنحنيات ذوبان الصحيح.
ملاحظة: يتم سرد تسلسل الإشعال المستخدمة في هذه التجربة في الجدول 2. - إعداد سلسلة من ردود الفعل (qPCR) البلمرة الكمية في لوحة 384-جيدا مع رد فعل الإعداد المبينة في الجدول 4.
- الاحتفاظ بجميع الحلول ولوحة على الجليد باستخدام رقائق الألومنيوم لمنع لوحة البلل عند إعداد الخليط رد فعل.
- أداء جميع ردود الفعل في تريبليكاتيس.
- القيام برد فعل بكر على ثيرموسيكلير استخدام الإعداد المدرجة في الجدول 5.
- حساب متوسط قيمة الأشعة المقطعية لجميع ردود فعل تريبليكاتيس. تطبيع جميع الجينات المستهدفة إلى مستوى التعبير جليسيرينيلدهيدي-3-الفوسفات-نازعة (جابده) الجينات التدبير المنزلي بحساب 2^(-ΔCt).
ملاحظة: جميع الهدف الجينات مع الأشعة المقطعية متوسط > 35 كانت تعتبر تحت حد الكشف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لمحاكاة الآثار للمضيف بعد دخول البكتيريا أو المنتجات المشتقة من البكتيريا التي تحدث بعد خرق جدار الأمعاء، لبس تم حقن الفئران C57Bl/6 في جرعة المقاسة (2 ميكروغرام/غرام وزن الجسم). رصد كل واحدة بالماوس وسجل لحدوث اندوتوكسيميا مع المعلمات المسرودة في الورقة إلى النتيجة التي تشمل ظهور الفئران، والنشاط للحيوانات، والشرط من العيون، ومعدل التنفس والجودة (الجدول 1) . الحيوانات تظهر عليهم علامات سريرية للمرض الذي بلغ ذروته ح 6 إلى 10 بعد الحقن لبس واسترجاعها، في غضون 24 ساعة (الشكل 1). وكانت الفئران الفردية يضحي ح 2، ح 4 وح 8 بعد الحقن لبس. وجمعت قطع الأنسجة من الطحال والكبد والقولون. وكان الجيش الملكي النيبالي معزولة من هذه الأجهزة وعكس نسخها إلى كدنا. كدنا كان استخدامه كقالب ل qPCR لتحديد مستويات التعبير Il1b (الشكل 2) Il6 (الشكل 2A)، تنفا (الشكل 2) و Il10 (الشكل 2D) مع الإشعال المستخدمة قبكر المدرجة في الجدول 6. التعبير عن Il6 ح 2 وصل إلى ذروته بعد الحقن في الطحال والقولون، و 4 ح بعد الحقن في الكبد. التعبير عن Il1b، تنفا، و Il10 ح 4 وصل إلى ذروته بعد الحقن في الطحال والكبد، والقولون. ضمن 8 ح بعد الحقن، والتعبير عن Il6، Il1b، تنفا، و Il10 عاد إلى مستويات خط الأساس.
رقم 1: حقن لبس (2 ميكروغرام/غرام وزن الجسم) الناجم عن علامات سريرية من اندوتوكسيميا في C57Bl/6mice- بعد حقن 2 ميكروغرام/غرام من وزن الجسم للبس، ورصدت الفئران الفردية وفقا لدرجة المرض المعروضة في الجدول 1 الذي يتضمن المظهر والنشاط للحيوانات، وفتح عيونهم ومعدل التنفس ونوعية كل ح 2 ح 12 والمعونة لأجل التجارة ح 24 أية حقن لبس. درجة المرض تم مسح المحور (ص) إلى وقت كل منها محور (س). يعني ± يرد SD للفئران 4-5 لكل نقطة في الوقت الواحد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: لبس الحقن (2 ميكروغرام/غرام وزن الجسم) الحث على التعبير عن السيتوكينات الموالية التحريضية في الفئران C57Bl/6- تم حقن الفئران مع 2 ميكروغرام/غرام من وزن الجسم للبس، ومستويات التعبير Il6 (A)، Il1b (ب)، تنفا (ج) (د) من Il10 تم تحليلها بواسطة qPCR في الطحال والكبد والقولون في الوقت المشار إليه نقاط بعد الحقن. تم تطبيع جميع مستويات التعبير سيتوكين للتعبير عن جابده. يعني ± يرد SD للفئران 4-5 لكل نقطة في الوقت الواحد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1: ورقة نقاط المرض لرصد C57Bl/6 في الفئران بعد الحقن بلبس- المعلمات التي يتم مراقبتها بعد حقن لبس. ورصدت الحيوانات كل ح 2 بعد الحقن لمدة 12 ساعة، وقدمت عشرات لكل معلمة الفردية المدرجة في الجدول. والنتيجة النهائية لكل الحيوانات يمثل مجموع كل الحسابات الفردية. وهذا مقتبس من مرجع24. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
| المبلغ | كاشف |
| 2 ميليلتر/عينة | 10 × RT المخزن المؤقت |
| 0.8 ميليلتر/عينة | 25 x ديوكسينوكليوتيدي (دنتب) مزيج (100 مم) |
| 1 ميليلتر/عينة | RT كبسولة تفجير عشوائي |
| 4.2 ميليلتر/عينة | المياه خالية من نوكلاس |
الجدول 2: الكواشف المستخدمة لإعداد مزيج الرئيسي للنسخ العكسي.
| درجة الحرارة | الوقت |
| 25 درجة مئوية | 10 دقيقة |
| 37 درجة مئوية | 120 دقيقة |
| 37 درجة مئوية | 5 دقيقة |
| 4 درجة مئوية | عقد |
الجدول 3: ثيرموسيكلير الإعدادات المستخدمة للنسخ العكسي.
| المبلغ | كاشف |
| 5 ميليلتر/جيد | 2 x ميكس ماجستير |
| 0.05 ميليلتر/جيد | صبغ مرجع |
| 500 نانومتر النهائي/جيد | التمهيدي إلى الأمام |
| 500 نانومتر النهائي/جيد | عكس التمهيدي |
| بين 10 و 100 نانوغرام/حسنا، استخدمنا 40 نانوغرام/جيد | قالب كدنا المخفف في "تمييع القالب المخزن المؤقت" (تمييع 1/100 من هذا المخزن المؤقت بالمياه خالية من نوكلاس واستخدامه لتمييع كدنا القالب). تمييع القالب في هذا المخزن المؤقت يسمح تصور الآبار حيث تتم إضافة القالب كرد فعل التغييرات لون من الأزرق إلى الأخضر |
| المياه خالية من نوكلاس إلى الحجم النهائي 10 ميليلتر/بئر | المياه خالية من نوكلياسي |
الجدول 4: وصف لتفاعل PCR.
| درجة الحرارة | الوقت | |
| 95 درجة مئوية | 2 دقيقة | |
| 95 درجة مئوية | 5 s | دورات 40 |
| 60 درجة مئوية | 20 s | |
| 95 درجة مئوية | 15 s | انصهار منحنى أنالايسيس |
| 60 درجة مئوية | 1 دقيقة | |
| 95 درجة مئوية | 15 s |
الجدول 5: ثيرموسيكلير الإعدادات المستخدمة لبكر.
| التمهيدي | التسلسل | درجة حرارة الانصهار | طول المنتج |
| و Il6 | اسكت TCG ﻷعمالهم بنا CAC نقل واكتساب التكنولوجيا ATG تي عقاري | 60.3 | 94 شركة بريتيش بتروليوم |
| Il6-R | جكاتكاتكجتجتكاتاكاتكا | 58.2 | |
| Il1b إف | تجتجااتجككاككتتتجا | 56.1 | 94 شركة بريتيش بتروليوم |
| Il1b-R | جتكااجتتجاجكاج | 57.2 | |
| Il10 إف | أتكجاتتكتككككتجتجا | 56.2 | 108 شركة بريتيش بتروليوم |
| Il10-R | تجتكااتكاتكاتجككت | 56.1 | |
| تنفا-F | ككاككاكجكتكتكتجتكتاك | 60.4 | 103 بي بي |
| تنفا-R | أججتكتججككاتاجاكت | 60 | |
| و جابده | كاتكاجاجتجتجاجك | 56.7 | 199 bp |
| جابده-R | ككتجتجكتجتاجككجتات | 58 |
الجدول 6: الإشعال المستخدمة في رد فعل qPCR. تسلسل الإشعال المستخدمة ل qPCR للكشف عن الماوس السيتوكينات والجينات التدبير المنزلي جابده.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول يحاكي العمليات المناعية التي تحدث بعد الغزو بالمنتجات المشتقة من الجراثيم. الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول يتم اختيار السطر الماوس، وحالة النظافة الفئران، الجرعة من لبس، مراقبة الحيوانات لحدوث اندوتوكسيميا، ونقطة وقت إنهاء التجربة. الأهم من ذلك، قد الخلفية الجينية لسلالة الماوس التي سينظر فيها. سلالات مختلفة من الماوس لها حساسية مختلفة للبس. على سبيل المثال، C3H/HeJ والفئران C57BL/10ScCr مقاومة للبس التي يسببها اندوتوكسيميا21،25. وعلاوة على ذلك، أن حالة النظافة الصحية للحيوانات قد التأثير على مجرى اندوتوكسيميا في لبس. خالية من مسببات الأمراض خاصة بالحيوانات (SPF) هي الأكثر شيوعاً. هذه الفئران مجاناً من خلال قائمة محددة من مسببات الأمراض، ولكن تكوين الحجمية كاملة من هذه الحيوانات غير معروف26،27. الحيوانات عقيمة خالية من جرثومة أو أكسينيك (أي عدم إيواء الحجمية) تختلف عن منتدى جنوب المحيط الهادئ الفئران26. المحتمل، استعمار الحيوانات أكسينيك مع الكائنات الدقيقة واحدة أو مجموعة من الكائنات الحية الدقيقة (الحيوانات جنوتوبيوتيك) قد تؤثر على التعبير عن الجينات، مثل إيل-19، بعد حقن لبس مقارنة ب الحيوانات منتدى جنوب المحيط الهادئ8. وعلاوة على ذلك، قد اقترح ورقة النتيجة التي كانت تستخدم كورقة نقاط لنموذج الانتان الناجم عن حقن الحل البراز في التجويف الصفاقى24. هذا شيتكان أن تناقش مع اللجنة المحلية الرفق بالحيوان، ويمكن تكييفها مع الاحتياجات المحلية. على وجه الخصوص، المعايير المتعلقة بإنهاء الخدمة يحتاج إلى مناقشة مع اللجنة المحلية الرفق بالحيوان. أن هذه التجربة يمكن وقفها عند تحقق نقاط > 12، أو عندما يتم التوصل إلى أقصى درجة لمعلمة فردية واحدة. في هذه التجربة، وتجاوز لا الحيوان من الحيوانات ثمانية نقاط مرض من 12 بعد حقن لبس (2 ميكروغرام/غرام وزن الجسم). في هذه الدراسة، يظهر التعبير عن السيتوكينات Il6، Il1b، تنفا و Il10 في الكبد، والطحال والقولون بعد حقن لبس وتعرض نتائج. التعبير عن Il1bو تنفا Il10 بلغ ذروته ح 4 بعد حقن لبس في الطحال والكبد، والقولون، بينما التعبير Il6 ذروته ح 2 بعد حقن لبس في الطحال والقولون وح 4 بعد حقن لبس في الكبد. ضمن ح 8 التعبير Il6، Il1b، تنفا و Il10 عاد إلى مستويات خط الأساس في الطحال والكبد والقولون. شدة المرض ذروته بين ح 6 و 10 ح بعد حقن لبس عند التعبير عن Il6، Il1b، تنفا و Il10 قد عاد فعلا إلى مستويات خط الأساس التي تشير إلى أن زيادة التعبير عن Il6، Il1bو تنفا Il10 يحدث بسرعة بعد الحقن لبس، لكن أن الحركية جينات أخرى قد تظهر نمطاً مختلفاً بعد حقن لبس. ويمكن أيضا أن تحلل التعبير عن هذه السيتوكينات على مستوى البروتين في دم الحيوانات بإليزا، التي يمكن أن تعتبر بالإضافة إلى قبكر.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها للتقنية ضرورية في الحالات عندما يتم التوصل إلى نقاط > 12 مرض. ولذلك، قد جرعة لبس وضبط أفضل للسطر الماوس المستخدمة والظروف المحلية لتجنب الإنهاء السابق لأوانه للتجربة. التلاعب بالجينات عن طريق حذف منطقة الجينوم بعينها أو overexpressing جين قد تؤثر على قابلية الفئران للبس. في التجارب الأولية، وقد تيتراتيد جرعة لبس إلى الجرعة المناسبة لتجنب الضرر لا لزوم لها والموت للحيوانات في هذه التجربة. من المذكرة، قد تلوث لبس بالمنتجات المشتقة من البكتيريا وسوء الحقن الأخرى التي ينبغي تجنبها. وعلاوة على ذلك، حركية التعبير عن الجينات للفائدة بعد حقن لبس يحتاج إلى تحديد.
القيود هي أن هذا الأسلوب يوفر معلومات عن النتائج المترتبة على نشر المنتجات الميكروبية إلى المضيف بعد خرق جدار الأمعاء ولكن لا يعطي معلومات عن الأحداث التي تؤدي لخرق جدار الأمعاء والأسباب أن تشغيل بنك التنمية بين الأمريكتين. وبطبيعة الحال، هذا النموذج ليست نموذجا التهاب القولون كنموذج التهاب القولون مفاجآت صيف دبي، ولكن فإنه يمكن أن تكون مفيدة بالإضافة إلى التهاب القولون نماذج للدراسة نتيجة لدخول المنتجات الميكروبية في البلد المضيف. وعلاوة على ذلك، سيتم تعطيل حقن القائمة من لبس التجويف الصفاقى، التي تقع الأمعاء الكبيرة والصغيرة. وقد يسهل نقل المنتجات البكتيرية المعوية المشتقة من التجويف الصفاقى جسد في البلد المضيف.
أهمية هذا النموذج هو حقيقة أنه يستخدم بمب محددة. في نماذج أخرى بما في ذلك القائمة حقن البكتيريا كامل أو حقن القائمة الحلول البراز24 أو نماذج التفسخ التهاب الصفاق، الذي هو التهاب الصفاق الناجم سيكل ربط وثقب28، مجموعة واسعة من الجراثيم أو بهم منتجات الحث على المرض. وعلاوة على ذلك، ضخ لبس في الفئران هو نهج غير معقد ولا يتطلب عملية جراحية كما هو الحال في التهاب الصفاق الانتانية الناجمة عن ربط سيكل وثقب.
مواصلة تطبيق هذا النموذج هي الدراسات التي تهدف إلى اندوتوكسيميا أو لبس الناجمة عن تسمم الدم في أي سياقات تتسم بنقل جسد المنتجات المشتقة من البكتيريا في البلد المضيف، مثل خرق حاجز الجلد أو خرق للتحقيق الجهاز البولي التناسلي. وفي الختام، هذا هو نموذج مباشرة التي يمكن استخدامها في كل وضع المختبر. اعتماداً على الظروف المحلية، قد يكون هناك تعديلات للاحتياجات المحلية الضرورية. على وجه الخصوص، قد كشف نقاط يجب مناقشتها مع السلطات المحلية قبل إجراء التجربة. واستخدم هذا النهج لتحاكي الآثار للمضيف عندما تدخل البكتيريا أو المنتجات المشتقة من البكتيريا المضيفة بعد حدوث خرق حاجز. قد يكون هذا وبخاصة ذات الصلة في دراسات تتناول أساسا لبنك التنمية بين الأمريكتين حيث حدوث خرق جدار الأمعاء حدث شائع في علم الأمراض بالمرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
جن معتمد من قبل "المؤسسة الوطنية السويسرية" (سنسف 310030_146290).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | K1081 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, | Applied Biosystems, Foster City, CA, USA | 4368813 | |
| RNase-Free DNase Set, | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
| LPS Escherichia coli O111:B4 | Invivogen, San Diego, CA, USA. | tlrl-eblps | |
| Omnican 50 Single-use insulin syringe | B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany | 9151125 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologie, Santa Clara, USA | not applicable | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf, Hamburg, Germany | not applicable | |
| Centrifuge Mikro 220R | Hettich, Kirchlengern, Germany | not applicable | |
| Dissection tools | Aesculap, Tuttlingen, Germany | not applicable | |
| Fast-Prep-24 5G Sample Preparation System | M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA | not applicable | |
| NanoDrop ND-1000 | NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA | not applicable | |
| TRI Reagent | Zymo Research, Irvine, CA, USA | R2050-1 |
References
- Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I.
- Abreu, M. T., et al. Mutations in NOD2 are associated with fibrostenosing disease in patients with Crohn's disease. Gastroenterology. 123, 679-688 (2002).
- Liu, Y., et al. Immunocytochemical evidence of Listeria, Escherichia coli, and Streptococcus antigens in Crohn's disease. Gastroenterology. 108, 1396-1404 (1995).
- Schaffer, T., et al. Anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies (ASCA) of Crohn's patients crossreact with mannan from other yeast strains, and murine ASCA IgM can be experimentally induced with Candida albicans. Inflamm Bowel Dis. 13, 1339-1346 (2007).
- Sellon, R. K., et al. Resident enteric bacteria are necessary for development of spontaneous colitis and immune system activation in interleukin-10-deficient mice. Infect Immun. 66, 5224-5231 (1998).
- Gkouskou, K. K., Deligianni, C., Tsatsanis, C., Eliopoulos, A. G. The gut microbiota in mouse models of inflammatory bowel disease. Front Cell Infect Microbiol. 4, 28 (2014).
- Schaubeck, M., et al. Dysbiotic gut microbiota causes transmissible Crohn's disease-like ileitis independent of failure in antimicrobial defence. Gut. 65, 225-237 (2016).
- Steinert, A., et al. The Stimulation of Macrophages with TLR Ligands Supports Increased IL-19 Expression in Inflammatory Bowel Disease Patients and in Colitis Models. J Immunol. 199, 2570-2584 (2017).
- Gabele, E., et al. DSS induced colitis increases portal LPS levels and enhances hepatic inflammation and fibrogenesis in experimental NASH. J Hepatol. 55, 1391-1399 (2011).
- Saunders, S. P., et al. C-type lectin SIGN-R1 has a role in experimental colitis and responsiveness to lipopolysaccharide. J Immunol. 184, 2627-2637 (2010).
- Spadoni, I., et al. A gut-vascular barrier controls the systemic dissemination of bacteria. Science. 350, 830-834 (2015).
- Balmer, M. L., et al. The liver may act as a firewall mediating mutualism between the host and its gut commensal microbiota. Sci Transl Med. 6, 237ra266 (2014).
- Maier, R. V., Mathison, J. C., Ulevitch, R. J. Interactions of bacterial lipopolysaccharides with tissue macrophages and plasma lipoproteins. Prog Clin Biol Res. 62, 133-155 (1981).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S.
- Deng, M., et al. Lipopolysaccharide clearance, bacterial clearance, and systemic inflammatory responses are regulated by cell type-specific functions of TLR4 during sepsis. J Immunol. 190, 5152-5160 (2013).
- Kagan, J. C., et al. TRAM couples endocytosis of Toll-like receptor 4 to the induction of interferon-beta. Nat Immunol. 9, 361-368 (2008).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
- Cohen, J.
- Suffredini, A. F., et al. Effects of recombinant dimeric TNF receptor on human inflammatory responses following intravenous endotoxin administration. J Immunol. 155, 5038-5045 (1995).
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5, 143-153 (2014).
- Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282, 2085-2088 (1998).
- Hoshino, K., et al. Cutting edge: Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the Lps gene product. J Immunol. 162, 3749-3752 (1999).
- Corral, J., et al. Role of lipopolysaccharide and cecal ligation and puncture on blood coagulation and inflammation in sensitive and resistant mice models. Am J Pathol. 166, 1089-1098 (2005).
- Shrum, B., et al. A robust scoring system to evaluate sepsis severity in an animal model. BMC Res Notes. 7, 233 (2014).
- Brandwein, S. L., et al. Spontaneously colitic C3H/HeJBir mice demonstrate selective antibody reactivity to antigens of the enteric bacterial flora. J Immunol. 159, 44-52 (1997).
- Macpherson, A. J., McCoy, K. D. Standardised animal models of host microbial mutualism. Mucosal Immunol. 8, 476-486 (2015).
- Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of Mice, Dirty Mice, and Men: Using Mice To Understand Human Immunology. J Immunol. 199, 383-388 (2017).
- Wirtz, S., et al. Protection from lethal septic peritonitis by neutralizing the biological function of interleukin 27. J Exp Med. 203, 1875-1881 (2006).
Tags
علم المناعة والعدوى، العدد 135، ليبوبوليساكتشاريدي، اندوتوكسيميا، التهاب القولون، ومرض التهاب الأمعاء، وخرق حاجز، السيتوكيناتErratum
Formal Correction: Erratum: Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach
Posted by JoVE Editors on 08/04/2018.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach
One of the authors' names was corrected from:
Katarina Raduolovic
to:
Katarina Radulovic
