Summary
Murine 원심 인공 인간의 전환 colitis, 지저분한 스트림에서 제외 콜론 세그먼트에서 주로 림프 colitis 위한 murine 모델을 제공 합니다.
Abstract
양 대 장 염 (DC)는 환자에서 발생 하는 diverting enterostomy의 결과로 지저분한 스트림에서 제외 장 세그먼트와 자주 임상 조건입니다. 이 질병의 병 인 병이 정의 남지만 크 론 병과 궤 양성 대 장 염 같은 클래식 선 동적인 장 질병의 차이가 나타납니다. 이 질병의 개발을 선도 pathophysiological 메커니즘을 해독 하기 위한 연구는 적절 한 murine 모델의 부족에 의해 심각 하 게 방해 되었습니다. 이 프로토콜은 면역 체계의 역할 및 DC의 개발에 미생물와의 상호 작용의 연구를 용이 하 게 하는 DC의 murine 모델을 생성 합니다. C57BL/6 동물을 사용 하 여이 모델에 콜론의 원심 부분 원심 인공 항문을 만들어, 약한 염증 제외 장 세그먼트에 보통의 개발 트리거링 및 인간의 전형적인 병 변 재현으로 지저분한 stream에서 제외 됩니다. 적당 한 조직의 염증 반응으로 Dc입니다. 쥐 모델 달리 많은 유전자 변형 murine 모델 C57BL/6 배경에 사용할 수 있습니다. 우리의 모델이 동물의 조합 수 있습니다 개별 cytokines, 발산, 또는 생리 활성 분자 (예를 들어, 인터 루 킨 (IL)-17;의 수용 체의 잠재적인 역할을 IL-10, chemokine CXCL13, CXCR5 및 CCR7, chemokine 수용 체 그리고 sphingosine 1 인산 염 수용 체 4) DC의 병 인에 평가. C57BL/6 백그라운드에 congenic 쥐 긴장의 가용성은 크게 다른 종류의 세포는 병 인에 관련 된 DC의 역할을 설정 하는 전송 실험 용이. 마지막으로, 모델 및 비 영향을 영향을 받는 장 세그먼트에서 점 막 면역에 지역 개입 (예를 들어, 로컬 미생물 또는 로컬 염증 치료의 수정)의 영향을 평가 하기 위해 기회를 제공 하 고는에 조직의 면역 항상성입니다.
Introduction
최근 몇 년 동안, 고아 한 선 동적인 장 질병 (IBDs; 다른 비 감염 성 대 장 염 엔터티의 상당수 즉., Crohn의 질병 또는 colitis ulcerosa)는 임상 및 histopathologically 특징 되었습니다 인간에서. 이러한 colitis 형태의 개발을 선도 병 태 생리 기계 장치는 완전히 이해 되지 부분적으로 적절 한 동물 모델은 부족 때문에. 양 대 장 염이 최근 설명된 엔터티 중 하나입니다. 기간 Glotzer1에 의해 1980 년에 화폐로 주조 되었다, 비록 비슷한 표현 형의 초기 설명 Morson2에 의해 1972 년에 주어졌다. 질병 개발 50%에 enterostomy, 우회 환자의 91%에 그리고 그것의 임상 강도 다릅니다3,4. 아메리카 합중국에서에서 약 120000 인공 환자의 연간 발생률을 감안할 때,이 질병 엔터티는 중요 한 건강 문제를 구성 합니다.
이 프로토콜을 개발의 전반적인 목표는 인간 DC에서 본 비슷한 colitis 트리거에 의존 하 고 하는 인간 질병의 기본 histopathological 기능을 재현 murine DC 모델을 제공 했다. 다른 murine colitis 모델 달리 우리의 모델에서 colitis 유도 유전자 변형된 동물 (예를 들어, 일리노이-7 유전자 변형 마우스, N cadherin 지배적인 부정적인 쥐, 또는 TGFβ/- 생쥐), 필요 하지 않습니다 응용 프로그램의 화학적 자극 물질 (예, dextran 황산 나트륨 (DSS)-유도 대 장 염, 또는 trinitrobenzene 술 폰 산 (TNBS)-유도 대 장 염), 또는 특정 세포 인구 (CD45RB높은 전송에서 면역 결핍 생쥐에서의 전송 colitis의 모델) (검토,5참조). 다른 모델과 달리 우리의 DC 모델의 그대로 면역 시스템은 면역 메커니즘의 평가 DC 개발에 관련 된 있습니다. 제외 된 장 세그먼트에 점 막 염증의 제한 위장, 창 자의 다른 면역 구획에 면역 항상성에의 다른 부분에 점 막 면역의 돌아옴의 평가 수 (예: , Peyer의 패치 및 mesenteriale 림프절), 및 전체 유 기체의 면역 항상성. 마지막으로, 우리의 모델 모두는 지역 미생물으로 영양 항 일반 로컬 환경 변화에서 발생 하는 로컬 염증 성 자극을 제어 하는 메커니즘을 조사에 적합 한 도구를 구성 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
여기에 설명 된 모든 방법 수의 정부 기관 (Landesamt에 Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit 및 Fischerei 메클렌부르크-포어 폼 머 른, (LALLF M-V))에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 수술 전 치료와 동물의 준비
- 동물 시설에 도착, 비슷한 크기의 그룹으로 동물 (C57Bl/6)를 분할 하 고 각 그룹을 함께, 케이지 그룹 실험 내내 일정 하 게 유지.
참고: 같은 섹스의 동물을 사용 합니다. 설명 결과 남성 쥐와 함께 얻은 했다.
참고: 남성 동물 사용 되는 경우, 케이지 그룹 함께 시작 하는 때 그들은 나이의 7 주 계층 구조를 설정할 수 있도록, 따라서 위험을 최소화 공격적인 행동의 실험 중. - 적어도 1 주일 전에 수술, 높은 에너지로 전환 (> 14 MJ/kg) 및 고 단백 (> 20%) 모든 필수 미 량 원소와 비타민을 포함 하는 피드 (자세한 자료의 목록 참조).
참고: 수술을 수행할 때 모든 마우스 무게 이상 25 g을 확신 합니다. - 케 타 민 (i.p. 87 mg/kg) 및 xylazine 염 산 염 (i.p. 13 mg/kg)의 복 주사로 마 취 및 진통 유발. 마우스는 기계적 자극, 예를 들면 발가락 피치, 모터 응답 없이 허용 될 때까지 기다립니다.
- 작업 데스크, 안정적인 작업 중 위치 및 체온의 압도적인 손실 방지를 보장에 위치 열 언더레이에 부정사 위치에 테이프와 함께 narcotized 마우스를 보안 합니다.
참고: 열 언더레이 36 ° C ~ 40 ° C;의 표면 온도가 있어야 합니다. 수술 실 온도 21 ° c.는 이어야 한다
2. 원심 인공 작업
- 복 부 머리를 면도. 시작 하기 전에 수술, 세 번 사용 하 여 알코올 70% 작업 필드와는 iodophor 소독. 무 균 조건에 대 한 보장을 작업 필드에 드러 워 진.
- 복 부 근육과는 교육에 따라 복 incising 15 m m 중간 개복 술 수행 알바, 혈액 손실이 최소화.
- 2 기금 atraumatic 집게를 사용 하 여, 신중 하 게 맹, 터미널 회장 및 오름차순 및 가로 결 장 복 막 구멍에서.
참고: 엄격 하 게 제한 mesenteric 구조에 부상을 방지 하기 위해 내장의 기계 조작에 주의 해야 합니다. - Cecal 극, 오름차순 결 장 및 작은 창 자 (그림 1a 및 1b)을 확인 합니다.
참고: 오름차순 콜론의 올바른 식별은 인공의 올바른 배치에 대 한 근본 이다. Ileocecal 지역의 해부학 모호한 경우에 Peyer의 패치의 존재 확인 소장, 그리고 형성된 된 대변의 존재는 콜론 특징. - 눈금자를 사용 하 여 미래의 인공의 위치를 결정. 그것은 배치 되어야 한다 20 mm 원심 원심 인공 ileocecal 밸브.
- 상단 오른쪽 사분면에서 복 벽에 두 번째 3-m m 절 개를 확인 합니다. 루프를 왜곡 하지 않도록 주의 되는 루프를 형성 하기 위하여이 절 개를 통해 이전 확인된 콜론 세그먼트를 당기십시오.
- 신중 하 게는 mesocolon 통해 22 게이지 유연한 i.v. 정 통과. 알아서 하지 mesenteric 혈관 구조를 손상.
- 내장 복 막 구멍을 반환 합니다.
- 간단한 스티치와 resorbable 봉합 (예를 들어, polyglactin 910 또는 polyfil 4-0 1/2 c)를 사용 하 여 피부에 유연한 튜브의 양쪽 끝을 수정 합니다.
- 개복 술을 닫기 전에 유체 소생 0.5 mL 0.9% 염 분의 복 주사를 사용 하 여 수행 합니다.
- Resorbable 봉합 (예: polyglactin 910 또는 polyfil 4-0 1/2 c)를 사용 하 여 연속 봉합으로 복 막과 근육 층을 닫습니다. 예를 들어, polyglactin 910 (polyfil 4-0 1/2 c) resorbable 봉합 사를 사용 하 여 연속 봉합으로 피부를 닫습니다.
- 좋은 위를 사용 하 여 부분합 transection 수행 하 여 exteriorized 콜론 루프를 엽니다. 피하는 mesentery에 모든 부상. 콜론을 완전히 transect 하지 마십시오.
- 각 인공 여 복 하 3 단일 전체 두께 바늘을 사용 하 여 수정 하 고 monofil, 흡수 되기 쉬운 봉합 사를 사용 하 여 피부 (예를 들어, polydioxanone 또는 monofil 6-0 3/8s). 기능 끝-인공 인 성의 루프 및 점액 누 인 원심 루프 (그림 1c)이이 시점에서 명확 하 게 구분 됩니다.
참고: 작업 시간 해야 20 분 미만 유체 및 열 손실을 제한 합니다. - 후 악기 제조업체의 지시에 따라 초음파 목욕에 알데하이드 무료 살 균 솔루션을 사용 하 여 소독, 수술을 마무리.
3. 가짜 작업 (Colotomy)
- 1.1 단계를 수행 합니다. 2.4 through.
- 눈금자를 사용 하 여 미래 colotomy 위치를 결정. colotomy 실험 그룹에서 인공으로 ileocecal 밸브 로부터 같은 거리 위치 한다.
- 콜론을 열고 적어도 2/3 잘가 위를 사용 하 여 그것의 둘레.
- 닫기 단일 층으로 colotomy, 전체 두께 중단 monofil, 흡수 되기 쉬운 봉합 사를 사용 하 여 봉합 (예를 들어, polydioxanone, monofil 6-0 3/8s).
참고: 작업 시간 실험된 외과 의사, 유체 및 열 손실 제한에 대 일 분 미만 이어야 한다. - 2.10 단계를 수행 합니다. 2.11. 그리고 2.14입니다.
4. 수술 후 관리
- 그들의 감 금 소에 동물을 반환 합니다. 37 ° C (예를 들어, 적외선 램프로)의 잘 단련 된 분위기를 제공 마우스는 완전히 깨어 때까지. 다음, 온도 및 습도 통제 환경 (21 ° C, 상대습도 30% ± 10%)에서 마우스를 유지. 음식과 식 수를 무료로 이용할을 수 있습니다. 유체 이해를 촉진 하기 위하여 추가 물에 젖은 사료를 제공 합니다.
- 0.1 mg/kg 몸 무게 buprenorphine를 주입 하 여 수술 후 진통 시작 때 동물 기계적 자극에 반응을 보여 사우스 캐롤라이나. 호흡을 하지 않도록 주의 해야 합니다.
- 수술 후 첫 주 동안 지속적인된 진통에 대 한 1 mg/mL tramadol와 식 수를 보충 한다.
- 로 인해 감소 액체 섭취 량에 대 한 보상 이동성 감소, 수술 후 첫 주 동안 장에 단단한 음료 패드를 공급.
- 첫 주, 첫 달의 나머지 동안 매초 마다 하루 그리고 Kleinwort 외 에 설명 된 질병 심각도 점수를 사용 하 여 두 번째 달 동안 모든 3 일 동안 매일 동물과 동물 행동 점수를 무게 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
수술은 모두 실험 (인공), 가짜 (colotomy) 그룹에 잘 용납입니다. 수술 및 수술 관리 올바르게 수행 하는 경우 수술 사망률 10%를 넘지 말아야 한다. 첫 수술 후 주에 상당한 체중 감소 실험와 가짜 그룹에서 볼 수 있다. 가짜 그룹의 동물 달성 4 번째 수술 후 날 향해 일반적으로 그들의 체중 최하 하지만 실험 그룹의 뒷부분에 나오는 1 일 발생. 체중 감량은 초기 체중의 21.7%에 도달 하는 실험적인 그룹에 더 발음 됩니다. 반면, 가짜 동물 그들의 초기 몸 무게 (그림 2)6의 10.8%를 잃게됩니다. 수술 후 첫 주에 체중 nadir 후 몸 무게 두 실험 그룹에서 하지만 실험적인 그룹에서 느린 경사로 지속적으로 상승. (즉, 피 묻은 방전 또는 어느 실험도 가짜 그룹6에서 발생 하는 액체 배변) 심각한 장내 염증의 증상과 첫 번째 60 일 동안 총 사망률 postoperatively 이며 약 인공 그룹에서 40 %colotomy 그룹에서 약 10%. 대부분 사망자 첫 수술 후 주 (실험 그룹에서 61%, 66% 가짜 그룹에) 동안 발생합니다. 죽음의 원인 그림 3에 나와 있습니다.
쥐에 있는 원심 인공 인간 DC의 전형적인 조직학 특징을 재현 하는 주로 림프 colitis의 개발에 결과. 이러한 변경 장 제외 기간 증가. 암호 길이 제외 된 장 세그먼트에 크게 단축 된다. 이 단축 지저분한 전환 (그림 3a)의 14 일 후 통계적 의미에 도달합니다. 잔 셀 베어링 암호 길이 제외 장 세그먼트 (그림 3b)에서 30 일 후에 감소 된다. 절대 잔 셀 번호 14 수술 후 일 (그림 3c) 후 제외 장 세그먼트에 지하실에서 또한 크게 감소 된다. DC, 점 막, 림프 낭의 개발의 전형적인 병 변 자 편차의 더 긴 기간을 요구 한다. 림프 여 포의 수를 증가 빠르면 2 주 동안 관찰 될 수 있다, 하지만 두 달 (그림 5a-c) 후 차이 사항이 중요 합니다. 모든 histopathological 변경 하기 전에 설명 보다 발음은 제외 된 장 세그먼트의 인접 지역에 보다 말 초. 급성 염증의 표시로 전형적인 neutrophilic 침투는 일반적으로 하지 (그림 5-e) 관찰.
지역 창 자 염증의 조직 되 돌아옴의 표시로 호 중구 수는 크게 14 일 수술 후 인공 동물에 증가 됩니다. 이 차이 관찰 기간 (60 일)이 끝날 때까지 유지 됩니다. 혈소판 수는 60 일 (그림 6) 후 저 승 전환 동물에 약간 증가 했다. 헤모글로빈 수준 및 보통 14 일 후 인공 그룹에서 가짜 그룹에 비해 감소 된다.
그것은 설치류 원인에 비타민 결핍 감소 의미 미 립 자 양 (MCH)와 미 립 자 헤모글로빈 (MCV) 값7의미 표시 되었습니다. 우리의 모델에서 우리는 14, 30 일 후에 이러한 두 매개이 변수에서 초기 증가 참조 하십시오. MCV와 MCH는 더 이상 후속 (그림 7) 후 일반 값을 반환합니다. 이 원심 인공 장기 속 행 동안 임상적으로 중요 한 비타민 결핍증에 초래 하지 않습니다 보여줍니다.
그림 1: cecal 지역 및 수술 해부학. (수술 후 해부학의 a) 그래픽 표현입니다. (b) cecal 폴 및 해부학 적 랜드마크의 지형. 인공 구멍의 (c) 그래픽 표현입니다. 그림 1a 는 Kleinwort 외.6에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 몸 무게 개발. 몸 무게는 수술 전 몸 무게의 백분율로 표시 됩니다. 몸과 체중 인공의 곡선 (colotomy) 동물 공개 초기 수술 후 체중 감소 했다 (p < 0.001) 가짜 그룹에 비해 인공 그룹에서 상당히 높은 사기. 값 그룹 당 21-26 동물에 걸쳐 평균 ± 표준 오류는 (21 동물 받은 colostomies; 26 동물 가짜 그룹에 있었다). 이 그림은 Kleinwort 외.6에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 죽음의 원인. 합병증 모든 원인의 사망률의 백분율로 표시 되 고 원형 차트 ((a) 인공 그룹, (b) 가짜 그룹)에 나와 있습니다. 수술 후 합병증은 검 시에 의해 결정 되었다. 낭비 증후군은 지속적인 체중 감량 보다 큰 초기 체중의 검 시에 다른 연구 결과 33%로 정의 했다. Ileus 및 anastomotic 누설 검 시에 진단 했다. Stoma 합병증 peristomal 농 양 및 mucocutaneous 분판으로 정의 되었다. 그리고 다른 합병증 구성 상처 dehiscence 개복 술, 맹의 국 소 빈 혈의 경우 검 시에서 명확 하지. 수술 후 합병증의 분포에 중요 한 차이가 그룹 간의 보였다 (p = 0.021, 피셔 정확한 테스트를 사용 하 여 최대 6 × 6 우발 테이블의 2 면 분석을 위한 분석). 인공 그룹에서 39 동물 및 29 가짜 그룹에 있었다. 이 그림은 Kleinwort 외.6에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 암호 길이 잔 세포 인구. 암호 길이 잔 셀 숫자는 정기 산 Schiff 얼룩이 후 직장의 파라핀 섹션을 사용 하 여 결정 했다. (a) 토 굴 길이 전환 colitis (DC)와 동물의 직장에서 크게 감소 했다. (b)는 토 굴의 잔 셀 베어링 지역의 길이 측정 하 고 전체 암호 길이를 비율로 설정 되었다. 30 그리고 60 일 postoperatively, 암호 길이 베어링 잔 셀의 백분율은 DC 그룹에서 감소 했다. (c) 잔 셀 번호 DC 동물 가짜 그룹에 비해 크게 감소 했다. 그래프 (a)부터 (c)에 걸쳐 보여 줍니다 방법 및 표준 오류 그룹 당 5 ~ 9 동물 (인공 14와 30 일, 14 일 가짜: n = 8; 인공 60 일: n = 5; 30 그리고 60 일 사기: n = 9); ∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01입니다. 이 그림은 Kleinwort 외.6에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 림프 낭과 염증 성 침투. (우회 콜론 및 가짜 동물의 a) 림프 모 hematoxylin와 오신 스테인드 직장의 파라핀 섹션에 포함 되었습니다. 그래프 그룹 당 5 ~ 9 동물에서 의미와 표준 오류에 표시 (인공 14와 30 일, 14 일 가짜: n = 8; 인공 60 일: n = 5; 30 그리고 60 일 제어: n = 9), ∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01입니다. (b)과 인공 (b)와 (c) 가짜 동물 60 일의 직장의 섹션의 (c) 대표 예 postoperatively hematoxylin와 오신 스테인드. 저명한 림프 여 포 (∗) 인공 마우스의 점 막에 존재 했다. 스케일 바 대표 100 µ m. (d) 및 (e) chloroacetate와 얼룩 esterase 반응 파라핀 섹션에 호 중구 granulocytes 검색 수행 되었다. 우회 직장의 횡단면에는 급성 염증 성 neutrophilic 침투 관찰 되었다 인공 그룹 (d)에 가짜 동물 (e)에서 최대 60 일 postoperatively. 스케일 바 100 µ m을 나타냅니다. 이 그림은 Kleinwort 외.6에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: Neutrophil 및 혈소판 수. 정 맥 혈액 샘플의 혈액 수 수의 혈액학 분석기에 의해 결정 되었다. (a) 호 중구 조사에 비해 가짜 동물 최대 60 일 postoperatively 인공 그룹에서 크게 증가 했다. (b) 혈소판 수 있었다 약간 상승 된 인공 그룹에서 60 일 postoperatively. 그래프 그룹 당 5 ~ 9 동물에서 의미와 표준 오류에 표시 (인공 14와 30 일, 14 일 가짜: n = 8; 인공 60 일: n = 5; 30 그리고 60 일 사기: n = 9), ∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 적혈구 매개 변수. 정 맥 혈액 샘플의 혈액 수 수의 혈액학 분석기에 의해 결정 되었다. (a) 헤모글로빈 및 (b)가 크게 가짜 그룹에 비해 인공 그룹에서 감소 했다. (c) 하지만 말은 미 립 자 양 (MCH) 상당히 높은 14와 postoperatively 인공 그룹에서에서 30 일 가짜 그룹에 비해 60 일 후 정상으로 돌아온. (d) 의미 미 립 자 헤모글로빈 (MCV) 값 30 일 후 하지만 postoperatively 인공 그룹에서에서 60 일 동물을 사기에 비교 하는 후에 더 이상 상승 했다. 그래프 그룹 당 5 ~ 9 동물에서 의미와 표준 오류에 표시 (인공 14와 30 일, 14 일 가짜: n = 8; 인공 60 일: n = 5; 30 그리고 60 일 사기: n = 9), ∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜에 안정적으로 제공 하는 DC의 murine 모델 (예를 들어, 드 노 보 개발 염증이 대 장 세그먼트, 단축, 토 굴 및 절감 submucosa 림프 낭의 인간 DC의 histopathological 기능을 재현 잔 셀 번호)입니다. 이 이점 이외에도이 모델 매우 비슷한 트리거링 요인에 의해 유발 고 가장 영향을 받는 인간의 경우 가벼운 심각도에 온건한의 임상 과정을 선물 한다.
재현할 결과 및 허용 수술 치, microsurgical 기술에서 연습이 필요 하다. 그러나, 인공 및 가짜 작업 (colotomy) 매우 낮은 수술 mortalities 수행할 수 있습니다 (< 10%). 일부 작업 단계는 매우 중요: 1) 긍정적으로 확인 결 장 그리고 맨끝 회장. 경우 어디 명확 하지 ileocecal 지역의 해부학, Peyer의 패치의 존재에 의해 형성된 된 대변의 존재와 터미널 회장으로 콜론을 확인할 수 있습니다. 2) 때 인공 루프, exteriorizing는 mesentery 하지 뒤틀린 mesenteric 허 혈 및 기계적 ileus 피할 것을 확신 합니다. 3) 때 puncturing 유연한 튜브와 함께 mesentery, 선박 무료 분야 선택, 출혈 및 mesenteric 허 혈 방지 보장. 4) 복 벽에 작은 절 개를 만들 때 충분 한 hemostasis 확인 합니다. 필요한 경우 열 응고를 사용 하 여 근육 혈관에서 출혈을 멈추게. 5) 확신 저 승 루프 오픈 적어도 그것의 둘레의 2/3 이며 그 후부 벽은 충분히 exteriorized, 따라서 원심 창 자 세그먼트에의 자 통로의 완전 한 막힘을 보장 합니다. 6) 인공 양쪽 높은 감염 위험 또는 기계적 ileus 지저분한 스트림 종료 수 없습니다 때문에 발생 하는 복 막 구멍에 열린 통로 피하기 위해 피부에 잘 고정 되도록 하는 것을 확신 합니다. 일반적으로, 모든 외 과적 수술 현미경 또는 확대경 없이 수행할 수 있습니다. 일반적으로,이 소자의 활용 더 훈련이 필요합니다.
수술 절차의 복잡성은 보통만, 경우에 성공적으로 재현 가능한 결과와 실험 종료 간주 많은 필수 요원 및 수술 문제 있다.
마우스는 그대로 맹 영구 인공으로 장기 생존을 위해 필수적 이다. 근 colostomies ileocecal 밸브에 인접 한 있는 실험적인 그룹 돌이킬 수 없는 체중 감소 (데이터 표시 되지 않음) 때문에 수술 후 첫 주에 100%의 사망률을 보였다. 따라서, 그것은 Bauhin의 밸브에서 최소 20 mm 원심 인공 사이트를 선택 가장 중요입니다. 설치류의 소화의 생리학이이 관찰 될 수 있습니다. 맹 근 콜론에서 역행 수송이이 종에서 발생합니다. 맹은 어디 세균 microflora occurs8에 의해 영양분의 합성. 장기 후속 동안 정상 MCV와 MCH 값 나타냅니다 원심 colostomies와 동물 중요 한 비타민 결핍증에서 용납 하지 않는다. 또한, coprophagy 그들의 자연적인 환경에서 설치류의 영양 행동의 필수적인 부분입니다. 모델 때, 우리는 영양 부족, (예를 들어, 비타민 B) 될 수 있습니다 영구적인 인공의 존재 결과로 coprophagy perturbing 매우 우려 했다. 그러나, 그것은 조건 하에서 문제 영양소에 대 한 액세스는 제한 된, 이전 보였다 그의 coprophagy 물과 영양 균형 음식9 무료 초과 실험 조건에서의 영양 의미를 잃는다 . 우리의 실험 조건에서 수술 후 영양 섭취의 조건 최적화에 필수적입니다. 우리 사료 했다 높은 단백질 함량, 단백질 품질을 최적화 하 고 에너지 밀도 증가 사용 합니다. 동물 수술 하기 전에 적어도 2 주 동안이이 다이어트에 acclimatized 했다. Postoperatively, 물에 젖은 피드 광고 libidum 촉진 음식과 액체 섭취 량을 제안 했다.
실험 및 가짜 그룹 같은 섹스의 마우스를 활용 하는 것이 결정적 이다. 섹스는 크게 조직 염증의 뿐만 아니라 다양 한 화학적으로 유도 된 대 장 염 모델10,,1112장 염증의 과정에 영향을 보였다. 일반적으로, 남성 동물 큰 염증, 더 많은 암호 손상, 적은 재생, 프로 염증 성 cytokines, 그리고 무게 손실10에서 느린 회복의 상부와 더 뚜렷한 질병을 개발할 것입니다. 남성 동물을 사용 하 여의 더 이점은 초기 수술 후 체중 감소의 더 나은 보상을 이끌어 더 나은 수술 신체 나이 일치 하는 무게 이다. 그럼에도 불구 하 고, 여성 쥐 경우 사용할 수 있습니다 프로토콜에 특정 질문 (예를 들어, 섹스 다루어야 하는 DC의 형상에 호르몬의 영향. 남자 쥐를 사용 하 여 안정적인 주택 조건 유지에 더 많은 노력이 필요 합니다. 남성 쥐 더 상해 및 죽음에 지도 하는 적극적인 상호 작용 하는 경향이 있다. 남자 쥐 한 지배적인 남성 설립된 계층 구조에 살고 있습니다. 그룹에서 계층 구조 설정 되 면 덜 일반적인13,14는 계속 싸움입니다. 이러한 이유로, 우리는 수술 전에 적어도 2 주 우리의 동물 시설에 도착 후 쥐의 실험 그룹을 형성 하 고 실험 종료 될 때까지 이러한 그룹을 유지. 일반적으로, 5 ~ 7 동물의 실험적인 그룹은 한 장에 유지 했다. 안정적인 사회 및 주택 조건의 유지 보수 뿐만 아니라 실험 동물의 공격적인 행동을 최소화 하기 위해 매우 중요 했다. 주택 조건 면역 매개 변수15,,1617으로 체중 증가 영향을 보여왔다.
자화 율 화학적으로 유도 하 고 유전자 변형 colitis 모델 마우스 긴장18,,1920사이 상당히 다릅니다. 현재 프로토콜 C57Bl/6 마우스는 잘 정의 된 유전 배경과 잘 특징이 면역 시스템21,22,23 보여주는 강한 중간 마우스 스트레인에서 설립 되었다 염증 응답에는 dextran 황산 나트륨 유도 colitis 모델20 및 원형 Th1 스트레인23을 간주 됩니다. 다른 마우스 긴장의 사용은 더 심각한 질병 활동 또는 Th2 환경 필요는 여겨질 수 있다.
요약 하면, 우리의 프로토콜 다양 한 면역 세포 유형, cytokines, 발산, 및 DC의 병 인에 다른 신호 분자의 역할을 평가 하기 위한 유용한 도구를 구성 합니다. 유전자 변형 마우스 모델의 많은 C57BL/6 배경으로 사용할 수 있으며, 우리의 모델 결합 될 수 있다 (예를 들어, 일-17, 결핍 쥐 IL-10, chemokine CXCL13, chemokine 수용 체 CXCR5 및 CCR7, 및 sphingosine 1 인산 염 수용 체 4)입니다. C57BL/6 백그라운드에 congenic 쥐 긴장의 가용성은 크게 다른 종류의 세포는 병 인에 관련 된 DC의 역할을 설정 하는 전송 실험 촉진 한다. 모델에 영향을 받는 및 비-영향을 받는 장 세그먼트에서 점 막 면역 및 조직에 로컬 개입 (예를 들어, 로컬 미생물 및 로컬 염증 치료의 수정)의 영향을 평가 하기 위해 기회를 제공 하는 마지막으로, 면역 항상성입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
모든 저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.
Acknowledgments
없음
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operation material | |||
| heat underlay, 6 watt | ThermoLux, Witte + Sutor GmbH | 461265 | |
| Ethanol 70% (with methylethylketon) | Pharmacie of the University Hospital Greifswald | ||
| Wooden applicators, small cotton head onesided, wooden stick, 150 mm length | Centramed GmbH, Germany | 8308370 | for disinfection of operation field |
| Scissor | Aesculap (BRAUN) | BC064R | |
| Atraumatic DeBakey forceps | Aesculap (BRAUN) | OC021R | |
| Needle holder | Aesculap (BRAUN) | BM012R | |
| Vasofix Safety i.v. cannula 22G | Braun Melsungen AG, Germany | 4268091S-01 | |
| VICRYL Plus 4-0 violet braided; V-5 17 m 1/2c; 70 cm | ETHICON, Inc. | VCP994H | |
| PDS II 6-0 monofil; V-18 13 mm 3/8c; 70 cm | ETHICON, Inc. | Z991H | |
| BD Plastipak 1 mL (Syringes with needle with sterile interior) | BD Medical | 305501 | |
| Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin) | ANTISEPTICA, Germany | 18824-01 | disinfection of surgical instruments in ultrasonic bath |
| Medications | |||
| ketamine 10%, 100 mg/mL (ketamine hydrochloride) | selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH | 9089.01.00 | 87 mg/kg i.p. |
| Xylasel, 20 mg/mL (xylazine hydrochloride) | selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH | 400300.00.00 | 13 mg/kg i.p. |
| NaCl 0.9% | Braun Melsungen AG, Germany | 6697366.00.00 | |
| Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Bayer, Germany | PZN: 01498870 | 0.1 mg/kg s.c. |
| Tramal Drops, 100 mg/mL (tramadol hydrochloride) | Grünenthal GmbH, Germany | 10116838 | 1 mg/mL drinking water |
| Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxone) | Cephasaar GmbH, Germany | PZN: 08844252 | 25 mg/kg body weight i.p. |
| metronidazole 5 mg/mL | Braun Melsungen AG, Germany | PZN: 05543515 | 12.5 mg/kg body weight i.p. |
| Food | |||
| ssniff M-Z Ereich | ssniff, Germany | V1184-3 | |
| Solid Drink Dehyprev Vit BIO, pouches | TripleATrading, the Netherlands | SDSHPV-75 | |
| Equipment | |||
| Nikon Eclipse Ci-L | Nikon Instruments Europe BV, Germany | light microscopy | |
| VetScan HM 5 | Abaxis, USA | 770-9000 | Veterinary hematology analyzer of 50 µl venous EDTA-blood |
| Bandelin SONOREX (Ultrasonic bath) | Bandelin electronics, Germany | RK 100 H | disinfection of surgical instruments |
| Software | |||
| NIS-Element BR4 software | Nikon Instruments Europe BV, Germany | ||
| GraphPad Prism Version 6 | GraphPad Software, Inc. |
References
- Glotzer, D. J., Glick, M. E., Goldman, H. Proctitis and colitis following diversion of the fecal stream. Gastroenterology. 80, 438-441 (1981).
- Morson, B., Dawson, I. Gastrointestinal Pathology. , Blackwell Scientific Publications. London. (1972).
- Whelan, R. L., Abramson, D., Kim, D. S., Hashmi, H. F. Diversion colitis. A prospective study. Surg Endosc. 8, 19-24 (1994).
- Haas, P. A., Fox, T. A., Szilagy, E. J. Endoscopic examination of the colon and rectum distal to a colostomy. Am J Gastroenterol. 85, 850-854 (1990).
- Valatas, V., Bamias, G., Kolios, G. Experimental colitis models: Insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease and translational issues. Eur J Pharmacol. 759, 253-264 (2015).
- Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Heidecke, C. D., Schulze, T. Deviation of the Fecal Stream in Colonic Bowel Segments Results in Increased Numbers of Isolated Lymphoid Follicles in the Submucosal Compartment in a Novel Murine Model of Diversion Colitis. Biomed Res Int. 2017, 13 (2017).
- Tangjarukij, C., Navasumrit, P., Zelikoff, J. T., Ruchirawat, M. The effects of pyridoxine deficiency and supplementation on hematological profiles, lymphocyte function, and hepatic cytochrome P450 in B6C3F1 mice. J Immunotoxicol. 6, 147-160 (2009).
- Soave, O., Brand, C. D. Coprophagy in animals: a review. Cornell Vet. 81, 357-364 (1991).
- Ebino, K. Y., Yoshinaga, K., Suwa, T., Kuwabara, Y., Takahashi, K. W. Effects of prevention of coprophagy on pregnant mice--is coprophagy beneficial on a balanced diet. Jikken Dobutsu. 38, 245-252 (1989).
- Babickova, J., Tothova, L., Lengyelova, E., Bartonova, A., Hodosy, J., Gardlik, R., Celec, P. Sex Differences in Experimentally Induced Colitis in Mice: a Role for Estrogens. Inflammation. 38, 1996-2006 (2015).
- Lee, S. M., Kim, N., Son, H. J., Park, J. H., Nam, R. H., Ham, M. H., Choi, D., Sohn, S. H., Shin, E., Hwang, Y. J., et al. The Effect of Sex on the Azoxymethane/Dextran Sulfate Sodium-treated Mice Model of Colon Cancer. J Cancer Prev. 21, 271-278 (2016).
- Angele, M. K., Pratschke, S., Hubbard, W. J., Chaudry, I. H. Gender differences in sepsis: cardiovascular and immunological aspects. Virulence. 5, 12-19 (2013).
- Brown, R. Z. Social Behaviour, reproduction, and population changes in the house mouse (Mus musculus L). Eccological Monographs. 23, 788-795 (1953).
- Poole, T. B., Morgan, H. D. R. Differences in aggressive behaviour betweeen male mice (Mus musculus L.) in colonies of different sizes. Animal Behaviour. 21, 788-795 (1973).
- Pasquarelli, N., Voehringer, P., Henke, J., Ferger, B. Effect of a change in housing conditions on body weight, behavior and brain neurotransmitters in male C57BL/6J mice. Behav Brain Res. 333, 35-42 (2017).
- Langgartner, D., Foertsch, S., Fuchsl, A. M., Reber, S. O. Light and water are not simple conditions: fine tuning of animal housing in male C57BL/6 mice. Stress. 20, 10-18 (2017).
- Nicholson, A., Malcolm, R. D., Russ, P. L., Cough, K., Touma, C., Palme, R., Wiles, M. V. The response of C57BL/6J and BALB/cJ mice to increased housing density. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 740-753 (2009).
- Buchler, G., Wos-Oxley, M. L., Smoczek, A., Zschemisch, N. H., Neumann, D., Pieper, D. H., Hedrich, H. J., Bleich, A. Strain-specific colitis susceptibility in IL10-deficient mice depends on complex gut microbiota-host interactions. Inflamm Bowel Dis. 18, 943-954 (2012).
- Nakanishi, M., Tazawa, H., Tsuchiya, N., Sugimura, T., Tanaka, T., Nakagama, H. Mouse strain differences in inflammatory responses of colonic mucosa induced by dextran sulfate sodium cause differential susceptibility to PhIP-induced large bowel carcinogenesis. Cancer Sci. 98, 1157-1163 (2007).
- Mahler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, 544-551 (1998).
- Mekada, K., Abe, K., Murakami, A., Nakamura, S., Nakata, H., Moriwaki, K., Obata, Y., Yoshiki, A. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58, 141-149 (2009).
- Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Vet Pathol. 49, 32-43 (2012).
- Mills, C. D., Kincaid, K., Alt, J. M., Heilman, M. J., Hill, A. M. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. J Immunol. 164, 6166-6173 (2000).
